Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние нуклеотидной последовательности на структуру нуклеиновых кислот в растворе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние нуклеотидной последовательности на структуру нуклеиновых кислот в растворе"

российская академия наук -институт теоретической и экспериментальной р г. « биофизики

0 ОД

на правах рукописи

Федоров Олег Юрьевич

удк 577.150.2

влияние нуклеотидной последовательности на структуру нуклеиновых кислот в растворе

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Пущино - 1994

Работа выполнена в Институте математических проблем биологии РАН.

Научные руководители - доктор физ.-мат. наук Полтев В.И. и кандидат физ.-мат. наук Чуприна В.П.

Официальные оппоненты - доктор физ.-мат. наук А. С. Заседателев;

кандидат биол. наук А. И. Петров.

Ведущая организация - Институт молекулярной генетики РАН.

Защита состоится_"_ 1994 г. в_часов

на заседании Специализированного совета Д 200.22.01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 г. Пущино, ИТЭБ.

V

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ.

Автореферат разослан_"_ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного сове

кандидат биол. наук

П.А. Нелипович

Общая характеристика диссертации

Актуальность теми. Еще в 1953 году после открытия Уотсоном и Криком структуры ДНК. одним из главных вопросов молекулярной биологии, стал следующий:: зависит ли локальная пространственная структура ДНК от последовательности? А если зависит, то каким образом. Значение этого вопроса очевидно, поскольку, в принципе, информация с ДНК может считываться к эк напрямую, через распознавание химически различных функциональных групп нуклеотидов, составляющих молекулу ДНК, так и опосредованно, через распознавание локальных структурных отличий, возникающих вследствие различия в первичной (химической) последовательности ДНК. Действительно, анализ кристаллических структур ДНК и ЦНК-белковых комплексов показывает, что молекула ДНК далеко не зохожа на жесткую и регулярную двойную спираль. Такие отклонения зт канонической В-формы, как изгиб ь даже излом оси спирали, значительные локальные вариации в угле спирального вращения, являются скорее правилом, чем исключением. Знание детальной трехмерной структуры ДНК. а также ДНК:РНКовых гибридов, которые являются промежуточными звеньями переноса генетической информации 5 процессах транскрипции и обратной транскрипции, представляется гоэтому чрезвычайно важным для пониманий молекулярных механизмов фундаментальных биологических процессов.

Единственным прямым методом для определения структуры ¡акромолекул в растворе является спектроскопия ядерного [агнитного резонанса (ЯМР) с последующи применением методов юлекулярной динамики и конформационного анализа. Применение :одобнсй методики к проблеме определения влияния нуклеотидной оследовательности на структуру двойной спирали - ДЧК и НК:РНКового гибрида и является темой данной диссертационной аботы.

В настоящей работе решались следующие научные вопросы:

1. Определение структуры ЛпГт треков в растворе. Как было становлено в ходе многочисленных исследований подобных эследовательностей, они обладают рядом свойств, отличающих их от Зычной ДНК. В настоящей работе определены информационные эстояния АпТт треков, совместимые с данными ЯМР и эоанализированы структурные факторы, ответственные за уникальные юнко-химические свойства таких трекоЕ.

2. Определение зависилости структуры двойной спирали ДНК т

нуклетидной последовательности. Целью настоящей работы являлся поиск закономерностей в спектрах ЯМР серии различных олигонуклетидов с последующим поиском связи мевду измеряемыми межпротонными расстояниями и структурными параметрами двойной спирали ДНК. В результате этого удалось установить эмпирические правила, описывающие зависимость определенных структурных параметров ДНК от последовательности.

3. Определение структуры (¡(аААТТТАААТТС)2 6 растворе методсии спектроскопии ЯМР и лолекуларной диналшш. Как следует из разработанной модели изгиба двойной спирали ДНК, в центре этой молекулы должен присутствовать изгиб оси спирали, направленный в сторону главного желоба. Кроме того, в литературе практически отсутствуют структурные данные о ТпАт последовательностях. Всё это обусловило выбор объекта исследования.

4. Определение детальной пространственной структуры ДНК:РНКового гибрида. Основной мотивацией исследования была широко распространенная неясность и обилие противоречий в литературе относительно структуры ДНК:РНК гибрида. Достигнутый за последний годы прогрес в области ЯМР спектроскопии позволяет прояснить этот вопрос. Целью данной работы являлось определение точной трехмерной структуры (ЦОТСАСАТй):г(саи^иёас) дуплекса в растворе.

Научная новизна работы.

- Впервые проанализированы различные факторы, которые могут определять структурные черты и физико-химические свойства Ап последовательностей. Также определены и конформационные состояния этих последовательностей, совместимые с данными ЯМР.

- Был разработан и применен оригинальный подход к извлечению информации о структуре двойной спирали ДНК в растворе из сравнения ЯМР спектров различных олигонуклеотидов. Подобный подход позволяет избежать ряд проблем возникающих в процессе восстановления трехмерной структуры нуклеиновых кислот по данным спектроскопии ЯМР. Кроме того, лишь благодаря ему удалось установить сам факт наличия связи между нуклеотидной последовательностью и структурой ДНК в растворе. Хотя наличие подобной связи и предполагалось практически во всех работах, посвященных исследованию структуры ДНК в растворе, данная работа оказалась первой надежной демонстрацией подобной связи.

- В настоящей работе докладывается первое в мировой практике определение детальной структуры ДНК:РНКового гибрида в растворе.

Полученная структура отличается от канонических А- и В- форм и обладает рядом специфических структурных черт. На основе полученных результатов предложен механизм посредством которого фермент RHase н способен различать ДНК:РНК гибриды и чисто РНК дуплексы и специфически гидролизовать первые.

Практическая ценность диссертации заключается в определение связи между нуклеотидной последовательностью ДНК и рядом её структурных параметров, что может быть использовано для предсказания и экспериментального определения структуры любых других ДНК дуплексов с желаемой последовательностью. Особо следует отметить практическую ценность знания структуры ДНК:РНК гибрида и механизма его взаимодействия с RNase н. В последнее время растёт интерес к использованию антисмысловых олигонуклеотидов к направленной регуляции экспрессии как нормальных генов, так и различных патогенов. Это может привести к универсальному методу лечения мириада человеческих болезней. Как было установлено, фармакологическая активность олигонуклеотидов различного типа сильно зависит от их способности образовывать дуплекс с РНК , доступный для гидролиза RNase Н. Применение результатов работы позволит направленным образом модифицировать свойства олигонуклеотидов с целью улучшения их активности.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на i Советско-Германском симпозиуме "Protein-nucleic-acid interaction: structural and pharmacological aspects", Ленинград, июль 1991; " 8th conversation in biomolecular stereodynamics", Олбани, США, ишь 1991; "34 Experimental MR conference (ENC)", Сент-Луис, март 1993.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей в ведущих международных журналах.

Содержание работы

Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы. Она изложена на 110 страницах, содержит 22 рисунка и 14 таблиц. Библиография включает 122 наименования.

ГЛАВА 1. В первой главе систематизированы и кратко описаны современные представления о структуре ДНК и ДНК:РНК дуплексов по данным рентгеновского рассеяния и спектроскопии ЯМР в растворе. Показаны достижения и нерешенные вопросы в проблеме определения детальной структуры нуклеиновых кислот.

ГЛАВА 2. Во второй главе описаны использованные в работе объекты и метода исследования. Подробно описана процедура восстановления структуры макромолекул по данным двумерной спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера. Основные результаты и их обсуждение приводятся в главах три, четыре, пять и шесть.

ГЛАВА 3. Структура Ап"Гт треков в растворе '

Основываясь на измеренных ранее с помощью ЯМР межпротонных расстояниях, в ряде исследований было предложено, что пары оснований в А/Т треках характеризуются большим пропеллером пар оснований ( >19°). Проведенный конформационный анализ поли(йа) :поли(с1Т) показывает, однако, что доступным экспериментальным данным удовлетворяют низко-энергетические структуры Ап треков с зауженным минорным желобом как с большим пропеллером 20°) и малым наклоном о0) пар оснований, так и наоборот, с маленьким пропеллером 10°) и существенным наклоном (~ -7° и более) пар оснований.

В конформации ро1у(йа):ро1у(йТ) с минимальным значением конформащонной энергии меяцепочечное расстояние между Н6 аденина и Об тимина, комплементарного к соседнему с 3' основанию, составляет примерно 4.0 А и не удовлетворяет, таким образом, критерию межцепочечной трехцентровой (так называемой бифуркантной) водородной связи, установленному ранее на основе анализа кристаллографических структур. Минимизация с дополнительным ограничением на это расстояние приводит к конформации, где соответствующее растояние составляет 3-2 А. Однако дальнейшая минимизация без ограничения увеличивает расстояние до 3.5 А. Энергия при этом улучшается, но на незначительную величину: о.з кса1/то1. Таким образом, геометрия трехцентровых водородных связей не наблюдается в энергетическом миниуме.

Все доступные данные показывают, что геометрия двойной спирали ДНК, необходимая для существования бифуркантных водородных связей, не приводит к зауженному минорному жёлобу и даже не стабилизирует его. Минимизация ро1у(<Ш:ро1у(<1Т) без хребта гидратации, но с фиксированными межцепочечными расстояниями, обеспечиващими существование бифуркантных водородных связей, приводит к низкоэнергетической конформации с широким, а не с зауженным минорным жйлобом. Более того,

исследования кристаллов ДНК показали, что бифуркангные водородные связи довольно распространены и в кристаллических структурах "нормальных" последовательностей. Исходя из результатов работы, можно смело утверждать, что сами по себе бифуркантные водородные связи не являются необходимыми или определяющими для существования аномальных свойств и нетипичной структуры Ап треков. Подобным необходимым и достаточным фактором, повидимому, является хребет гидратации в минорном желобе А последовательностей.

ГЛАВА 4. Связь между шириной минорного желоба и изгибом оси двойной спирали

Точное определение детальной структуры ДНК с помощью ЯМР спектроскопии требует наличия информации о межпротонных расстояниях, чуствительных к изменениям в структуре. Наибольшее внимание исследователей в этой связи привлекли расстояния между Н2 аденина и Н1' нуклеотидов, расположенных с 3' конца этого нуклеотида и, особенно, с з1 конца комплементарного ему тимина. Для краткости мы будем далее обозначать (п)АН2-(т+1)Н1• «ежцепочечное расстояние как х и (п)АН2-(п+1 )Н1' как s. в этой главе приведены данные о зависимости этих расстояний от 1уклеотидной последовательности для 13 исследованных злигонуклеотидов (Таблица 1). Рисунок 1 показывает пример спектра ЗЭО. При этом обнаруживаются определённые согласованные тенденции.

ПщяхкиЗш-пуриновые степы. Для всех пиримидин-пуриновых зтепов (ТА и CA/TG) 'х' больше 4.5 А.

Пурин-пуриновые степы. На ga степах (и соответственно сомплементарных ТС), 'х' может быть либо большим (4.5 А), либо {алым (4.0 А). Анализ последовательностей приводит к определенным ¡аключениям о влиянии фланкирующих, и даже более удалённых по iemi, нуклеотидов на величину этого расстояния:

1. Наличие пиримидин-пуринового степа на 5' конце ga степа ши, соответственно, на 3' конце ТС степа комплементарной цепи :то есть в yga/TCR последовательности), сопряжено с увеличением 'х' на ga/tc. Вместе с наблюдением, что расстояние 'х' велико на юех известшх пиримидин-пуриновых степах, это показывает что ¡лияние пиримидин-пуринового степа распространяется и на римыкавдие с обоих концов стеш.

Таблица 1. Межцепочечные (п)АН2-(п+1)Н1* расстояния.

(n)AH2-(m+l)H1' и внутридепочечные

Дуплекс Осно- Сайт

Ко. Последовательность вание •я' 's' рестрикции

1. 5'-ССССААТТСаСЙ А5 4.4 4.3 Ее ORI

31 —ССССТТААССйС А6 4.0 *

2. 5'-(ЗСССТТААССаС А7 >4.5 >4.5 Hpal

з'-саасААттоссй А8 4.2 4.2

3. 5 ЧЗССАААТТТССй A4 4.3 4.3

з'-састттАААсас А5 4.0 4.1

Аб 3.7 3.6

4. 5'-ОССТТТАААСвС А7 >4.5 >4.5 Ahalll

З'-СССАААТТТССО А8 4.2 4.2

А9 3.9 3-9

5. 5'-сссстАТАсаас Аб * 4.0 Snal

3'—ССССАТАТСССй А8 >4.5 4.0

6. 5 '-СССК!АТСА®ЗС Аб 4.4 3.9 Bell

З'-СОСАСТАОТССС А9 * *

7. 5'-ССАССАТССТаС A3 * * BamHI

З'-ССТССТАССАСС; Аб 4.0 3.9

8. 5'—ССССБАТССССС Аб 4.0 3.8 Bamül

З'-сассстАцссси

9. 5'-ассстесАсссс А8 >4.5 3-9 Hgikl

З'-ССССАССТСССЙ

10. 5'-ССАААААТСаС A3 4.5 4.5

З'-ОСТТТТТАССС A4 * 4.5

А5 3.9 4.5

Аб 3.8 4.1

А7 3.8 4.0

А15 3.9 4.1

11. 5'-ССААБААТССО A3 * * ííboll

З'-ссттктасс A4 * >4.5

Аб 4.0 >4.5

А7 4.0 *

А15 3.9 4.1

12. 5'-ССМТССААССС А8 4.4 * Asu.II

3' -СйСААСгСТТОСО А9 4.1 4.1

13. 5'-ССССАТАТСССС А5 4.5 3.9 EcoRV

3' -ССК1С!ЕАТАС5С Св А7 * 3.9

обозначает внутрицепочечное расстояние (п)АН2-(п+1)Н1'; п и ; определены как номера комплементарных оснований: (п-1) - это 5 сосед (п) и (т+1) - это 3' сосед (га). Таким образом, (п-1) (т+1) - это комплементарные основания, так же как и (п+1 комплементарно (т-1). '*' обозначает что соответствуй®! кросс-пик перекрыт в спектре с другим. Выделенные нуклеотид образуют сайт рестрикции соответствующей рестриктазы (крайни справа столбец).

2. Пурин-пиримидиновый АТ степ в аАТт последовательностя приводит к уменьшению 'х' на йк степе, примыкающему с 5' конца этому АТ степу (соответственно с 3* конца к ТС степу). Величт: 'х' оказывается при этом меньше 4.0 А

Рис. 1. Фрагмент двумерного ЯЭО спектра осатттАААССС олигонуклеотида. Стрелки показывают (слева направо) межцепочечные 'х' сигналы ЯЭО для А9, А8 и А7 оснований. Отметим практически отсутствие кросс-пика для А7, находящегося на 5' конце Аз трека, по сравнению с сильным А9Н2-Т5Н1' ЯЭО на 3' конце Аз трека.

3. На величину 'х' влияют замены не только оснований, прилегающих к данному степу с з* или 5' конца но, и более удалённых по цепи. Предполагается, что здесь мы наблюдаем кооперативный эффект формирования аномальной В' конформации с зауженным минорным жёлобом на АпТт треках.

Пурин-пуриновий АА степ. На всех АА/ТТ степах 'х' < 4.2 А При этом 'х' не постоянно, а может менятся в зависимости от контекста последовательности. В частности, присутствие пиримидина Суаа) или же ус> степа №аа) с 5' конца АА приводит к увеличению 'х' на АА. Интересно отметить, что отсутствие возрастания 'х' на 3' конце Ап треков коррелирует с отсутствием подобного близко расположенного степа. В то же время присутствие Тп последовательности с 3' конца АА влечет уменьшение 'х' на этом степе. К аналогичному результату приводит и наличие одновременно А с 5' конца ит, с или Ас 3' конца ('х' < 3.9 А). Представляется, что подобное уменьшение вызывается эффектом

кооперативного перехода АпТт последовательности в В' конформацию с зауженным минорным жёлобом.

Зависшость внутрицепочечного расстояния 'в' ст последовательности. Межцепочечное расстояние эвэ между (п)АН2 и (п+1 )Н1 •, то есть мевду Н2 аденина и Н1' следующего за ним по цепи остатка, определено для АТ, АС, ас и АА динуклеотидных степов. На АТ и АС степах 'б' меньше 4.2 А и находится в диапазоне от 3.6 до 4.2 А. В случае же АА и, возможно, Ай степов соответствующее расстояние всегда больше 4.0 А. Верхняя граница при этом больше 4.5 А, и не может быть точно определена при нынешнем уровне развития техники ЯМР. Как и в случае 'х<, величина 'э' зависит от последовательности окружающих оснований. Присутствие пиримидина с 5' конца АА степа приводит к 'а',-равному или большему, чем 4.5 А, а присутствие Тп-трека с з* конца к уменьшению 'э' до 4.0 А. На АТ степе 'г' имеет тенденцию к сокращению, когда этот степ расположен внутри АпТт последовательности.

Корреляция между АН2-Н1 э расстояниями и структурным, параметрами в В-форме ДНК. Представляется интересным узнать, как межпротонные расстояния связаны со структурными параметрами ДНК. Для достижения этой цели были проанализированны 7 доступных кристаллографических структур ДНК высокого разрешения (2.0 А или лучще). Было обнаружено, что существует очень хорошая корреляция (коэффициент корреляции 0.95) между 'х' и межцепочечным расстоянием между ближайшими Н1 • атомами противоположных цепей. Это расстояние является хорошей мерой ширины минорного желоба вблизи его дна. Существует также и хорошая корреляция (коэффициент 0.796) с межцепочечным Р-Р расстоянием, традиционно использующимся как определение ширины жёлоба. ' Внутрицепочечное расстояние 'в' также коррелирует с шириной минорного жёлоба, хотя коэффициенты корреляции и меньше, чем в случае 'х', а именно: 0.7 для Н1'-Н1' и о.б для Р-Р. Корреляции 'э' с какими-нибудь ещё структурными параметрами найдено не было.

Возможный механизм связи между последовательностью и структурой ДНК. Довольно просто проинтерпретировать изменения в 'х', поскольку они хорошо коррелируют с шириной минорного жёлоба. Также были установлены по крайней мере три фактора, вызывающий изменения в 'х', а именно - пиримидин-пуриновый степ, пурин-пиримидиновый (по крайней мере в АпТт последовательностях) и кооперативное формирование В' структуры в АпТт

последовательностях. Первый и второй эффекты получены для некоторых конкретных последовательностей на основе конформационных расчетов, из которых следует, что пиримидин-пуриновые степы приводят к расширению минорного жёлоба. Для двух степов, содержащих те же самые основания, энергетически выгоднее конформация с зауженным минорным жёлобом на пурин-пиримидиновом, чем на пиримидин-пуриновом степе. В этой главе также показано, что данный эффект обуславливается главным образом энергией стэкинга.

ГЛАВА 5. Структура фрагмента ДНК, содержащего изгиб оси двойной спирали, по данным спектроскопии ЯМР

Изложенные в главе 4 результаты не затрагивают напрямую вопроса об изгибе оси двойной спирали ДНК. В то же время они свидетельствуют о зависящих от последовательности вариациях ширины минорного жёлоба. Кроме того, проведенный конформационный анализ показал наличие сопряжения изменений ширины минорного жёлоба и степени изгиба ДНК.

Как оказалось, целый ряд структур с различной общей конформацией удовлетворяет экспериментальным данным одинаково хорошо. Ряд из них характеризуется значительным изгибом в сторону главного жёлоба на ТА степе, другие же практически прямые с углом изгиба близким к о.

Рисунок 2 показывает две различные структуры в качестве примера. Таким образом, сам факт соответствия вычисленного по структуре спектра экспериментальному не позволяет прямо различить прямые и изогнутые структуры. Для прямого исследования этого вопроса было проведено подробное исследование структуры сКСААТТТАААТТС)г дуплекса методами ЯМР и молекулярной динамики.

Дополнительные данные могут быть в принципе использованы для определения степени изгиба оси двойной спирали. Результаты анализа кристаллических структур (глава 4) указывают на наличие корреляции между доступным для измерения методом ЯМР межцепочечным расстоянием 'т' и шириной минорного жёлоба (кратчайшие межцепочечные расстояния Н1'-Н' и р-р). Эти дополнительные ограничения на межатомные расстояния можно использовать в программах молекулярной динамики. В свою очередь, угол изгиба может быть оценен из его корреляции с Н1'(п+1)-Н1•(га+1) и Р(п+2)-р(т+2) расстояниями (рисунок 3).

Рис. 2.

Стереоизображения изогнутой (а) и прямой структур СААТТТАААТТС дуплекса. Обе структуры были получены с использованиеш одного и того же набора экспериментальных ограничений на межпротонные расстояния и имеют согласующиеся с экспериментальным спектры ЯЭО.

Представленные данные демонстрируют эту корреляцию между углом изгиба и шириной минорного жёлоба на ТА степе. Использованные структуры соответсвуют данным ЯМР и были сгенерированы с применением различных ограничений на Н1'(п+1)-Н1'(т+1) или Р(п+2)-р(т+2) расстояния на центральном ТА степе. Были использованы различные процедуры вычислений, потенциальные функции и стартовые конформации. Оказалось, что угол изгиба не зависит от стартовой конформации, то есть структуры с одним и тем же углом изгиба получаются как из прямой, так и изогнутой структуры, ссли используются одни и те же ограничения на Н1'-Н1' и Р-Р расстояния.

НГ-НГ(Д) Р-Р (А)

Рис. з. Корреляция между углом изгиба (р) и (п+1)Н1'-(т+1)Н1• (слева) и (п+2)Р-(т+2)Р (справа) межцепочечными расстояниями на центральном та степе (оаатттаааттс)2 дуплекса.

Если мы рассмотрим вместе корреляцию между АН2(п)-Н1'(ш+1) и Н1 •(п+1)-Н1•(ш+1) или Р(п+2)-Р(ш+2) расстояниями, выявленную зависимость АН2(п)-Н1•(т+1) расстояния от последовательности и, с другой стороны, обнаруженную корреляцию между шириной минорного жёлоба (то есть Н1 • (п+1 )-Н1 • (т+1) и Р(п+2)-Р(т+2) расстояниями) и углом изгиба, мы приходим к выводу, что структура СААТТТАААТТС дуплекса в растворе должна быть изогнутой на центральном ТА степе в направлении главного ¡г.ёлоба.

ГЛАВА 6. Структура ДНК:РНКового гибрида в растворе

В качестве объекта исследования был выбран сКСТСАСАТО):г(саи^ас) дуплекс, система нумерации оснований которого приводится ниже:

2 4 6 8 5'-с1( О I С А 0 4 Т (!) г( с а г и 6 и а с)-5' 16 14 12 10

Заглавные буквы были выбраны для обозначения оснований ДНК, а строчные - для обозначения остатков РНК. Процедура итерационного уточнения структуры с помощью методов молекулярной динамики и сравнения расчитанного спектра ЫбЕБУ с экспериментальным описана во второй главе данной работы. Потребовалось провести несколько итерационных вычислений, прежде чем было достигнуто хорошее согласие структуры с экспериментальными данными, в каждом независимом случае уточнения ас (стандартная а-форма), вс (стандартная В-форма) и не (структура поли-га:поли-ат в волокнах)

стартовых структур, таблице 2.

Результаты уточнения структур приведены в

Таблица 2. Стандартные отклонения и к-факторы финальных Аф, вф, Нф и стартовых ас (стандартная А-форма), вс ' (стандартная В-форма), не (конформация полу-гА:шлу-с1Т в волокнах) структур оКотсасатс):г(саи^игас) дуплекса.

г.ш.э.с!. (А)

ЯЭО ГНфактор

НФ Аф Вф НС АС ВС (а) (в)

Нф *** 0.372 0.301 1 .313 1 .732 3. .752 0.286 0.281

Аф *** 0.200 1.154 1.623 3-525 0.311 о.зю

ВФ 1.136 1.671 3-505 0.292 0.287

Не 1.302 3-161 0.523 0.457

Ас *#* 3-683 1.630 2.057

Вс *** 1.056. 0.928

кросс-пиков; (в) - ЯЭО Е-фактор только для внутрицепочечных кросс-пиков ДНК-цепи.

Внутрицепочечные ЯЭО Е.-факторы для различных конформаций ДНК-цепи показывают, что структура этой цепи очень сильно отличается как от геометрии Внформы, так и от А-формы, и что ДНК-цепь находится в промежуточной конформащш, близкой к обнаруженной при исследовании рассеяния на волокнах модельной структуры не, что подтверждает вывод, сделанный из визуального анализа спектра ЯЭО.

Рис. 4. Стереоизображение двух наложенных друг на друга финальных структур ДНК:РНК октамера.

Попарное среднеквадратичное отклонение между всеми финальными структурами (Af, Bf и Hf) ~ 0.3 А и намного меньше разницы между тремя стартовыми структурами. Более того, сравнение среднеквадратичных отклонений свидетельствует, что все финальные структуры существенно ближе к Не, чем к Ас или Вс стартовым структурам. То же самое заключение можно сделать и на основе ЯЭО R-факторов.' Действительно, R-факторы, измеренные для Ас и Вс структур, намного больше чем R-факторы Не и финальных структур.

Общее сходство между структурой в растворе и моделью структуры в волокнах скрывает тот факт, что ряд структурных параметров ЯМР-структуры, даже усредненных по всем остаткам, отличается от аналогичных параметров структуры в Еолокнах. Более того, существуют значительные вариации индивидуальных параметров между остатками. В общих чертах, структура ДНК:РНК гибрида в растворе принадлежит к общему А-классу и характеризуется отрицательным смещением от оси спирали вдоль короткой оси пары (то есть в сторону минорного :кблоба), маленьким шагом вдоль оси спирали и положительным наклоном пар оснований. Наклон оснований в ДНК- и ГНК-цепях слегка различен, что вызывает регулярный излем пар оснований. Интересно отметить, что ДНК-цепь показывает больше вариации в параметрах, связанных с вращением вдоль длинной оси пары (tip и roll), в то время как РНК-цепь - в параметрах связанных с вращением вокруг короткой оси (tilt и inclination). Несмотря на сходство многих геометрических черт, структура ДНК:РНК дуплекса отличается от стандартной А-фюрмы в таких фажных структурных параметрах, как ширина минорного желоба и расстояние между соседними фосфатами внутри полинуклеотидной цепи. Рисунок 5 показывает, что расстояние между соседними фосфатами очень различно для ДНК- и РНК-цепей и представляется независящим от состава противоположной цепи. Действительно, р-р расстояние в ДНК-цепи близко к найденному в классической В-форме, основной структурной морфологии ДНК в растворе, в то время как РНК-цепь имеет Р-Р расстояние, типичное для классической А-формы, единственному типу структуры РНК дуплексов. Можно было бы предположить, что промежуточная 04'-эндо конформация дезоксирибозы должна привести Р-Р расстояние также до некоторого промежуточного между А- и В-формой значения. Однако это не так, и Р-Р расстояние ДНК-цепи исследованного гибрида даже слегка больше, чем аналогичное расстояние в В-форме. Наконец, ширина минорного жёлоба зависит от конформации обеих цепей, и,

следовательно, является величинами А- и В-формы.

7.0

прмежуточной между аналогичными

5 7 я п I'ilosphoms

Рис. 5. Внутрицепочечное (слева) и межцепочечное (справа) Р-Р расстояния для финальных структур ДНК:РНК октамера по сравнению с аналогичными параметрами стандартной А-формы (пунктирная линия) и В-формы (сплошная линия). Хорошо видно (правый рисунок) , что ширина минорного жёлоба ДНК:РНК гибрида является промежуточной между соответствующими величинами чисто ДНК (В-форма) и чисто РНК (А-форма) дуплексов.

Таким образом, форма молекулы ДНК:РНК гибрида отличается от структуры как чисто ДНК дуплексов, так и от чисто РНК дуплексов и может влиять на взаимодействие ДНК:РНК гибридов с различными компонентами систем транскрипции и репликации.

■ Наиболее важные, даже критичные, основания ДНК, присутствие которых необходимо для гидролиза противоположной цепи РНК ферментом RWase н, находятся точно через минорный жёлоб от места разрыва цепи. Как следствие, наблюдение, что на самом деле минорный жёлоб ДНК:РНК гибрида уже, чем таковой в А-форме (РНК дуплекс), но шире, чем в В-форме (ДНК дуплекс), представляется чрезвычайно важным для понимания механизма действия RNase н. Моделирование комплекса между ДНК:РНК гибридом и RNase Н показало, что использование полученной нами структуры гибрида приводит к многочисленным контактам между белком и сахаро-фосфатным остовом ДНК-цепи. При этом, в частности, присутствуют прямые взаимодействия (водородные связи) между фосфатами и боковыми цепями Asnl6 и Asn45, наиболее важными по данным мутагенеза аминокислотами для стабилизации комплекса. Проверка модели комплекса с гибридом в А-фэрме показала, что в данном случае подобные взаимодействия невозможны из-за большей ширины минорного жёлоба. Таким образом, именно структурные черты ДНК:РНК гибрида, его промежуточная между А- и В-формой ширина минорного жёлоба и нестандартная конформация ДНК-цепи приводят к

строгому связыванию с Шаэе Н. Способность йМазе Н расщеплять в строго определённом месте химерные ДНК-РНК дуплексы всего лишь с двумя последующими в одной цепи остатками ДНК, предполагает, что эти нуклеотиды могут легко принимать промежуточную од'-эндо конформацшо, приводя таким образом к структуре с локально зауженным минорным жёлобом. Последнее делает дуплекс доступным для гидролиза Рнказой Н. Подобный структурный переход невозможен в случае чисто РНК:РНК или 2*-о-метил-РНК:РНК дуплексов из-за присутствия 2'-заместителей с большим ван дер ВаальсоЕским радиусом, которые фиксируют сахара рибозы в геометрии А-типа.

ВЫВОДЫ

1. В настоящей работе были определены конформационные состояния а Т треков, совместимые с данными ЯМР, и

п ш

проанализированы структурные факторы, ответственные за уникальные физико-химические свойства таких последовательностей. На основе конформационных расчетов и анализа экспериментальных данных показано, что бифуркантные водородные связи в главном желобе ДНК, предложенные ранее в литературе, не являются основным фактором стабилизации аномальной В' структуры. Предполагается, что подобным фактором является хребет гидратации в минорном желобе двойной спирали ДНК

2. Впервые надежно показана зависимость структуры двойной спирали ДНК от нуклетидной последовательности. В настоящей работе производился поиск закономерностей в спектрах ЯМР серии различных олигонуклетидов с последующим поиском связи между измеряемыми межпротонными расстояниями и структурными параметрами двойной спирали ДНК. В мировой практике подобный подход является оригинальным. Благодаря применению этого метода удалось установить правила, описыващие зависимость изменений в ширине минорного желоба ДНК от последовательности.

3. Проведен структурный анализ сКоаатттаааттс)2 олигонуклеотида методами спектроскопии ЯМР и молекулярной динамики. Показано наличие изгиба оси двойной спирали в цетре этой последовательности. Полученные результаты являются экспериментальным подтверждением теории изгиба оси двойной спирали ДНК, разработанной ранее в Институте математических проблем биологии РАН

4. Впервые определена детальная пространственная структура ДНК:РНКового гибрида. Как было устанрвлено, полученная структура отличается от канонических А- и В- фэрм и обладает уникальными структурными чертами. Особо следует выделить геометрические параметры минорного жёлоба гибрида, величины которых являются промежуточными между соответствующими величинами чисто ДНК:ДНК и РНК:РНК дуплексов.

5. На основе определенной структуры разработана модель взаимодействия ДНК'.РНКового гибрида с белком RNase Н. Эта модель согласуется со всеми доступными биохимическими и генно-инженерными данными.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Chuprina V.P., Fedoroff, O.Yu. and Reid, B.R. "New insights into the structure of Ад tracts and B'-B' bends in DMA" , Biochemistry, 30, 561-568, 1991.

2. Chuprina V.P., Lipanov, A.A., Pedoroff, O.Yu., Kirn, S.-G., Kintanar, A. & Reid, B.R. "Sequence effects on local DHA topology", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9087-9091, 19913. Chou, S.-H., Cheng, J.-W., Pedoroff, O.Yu., Chuprina, V.P. and Reid, B.R. "Adjacent G:A mismatch base contain В phosphodiesters in solution", J. Am. Chem. Soc., 114, 3114-3115,

1992.

4. Chuprina V.P. , Sletten E. and Pedoroff O.Yu., "Investigation of solution structure of d(GAATWAAATTC)2 by 1H NMR, molecular dynamics, mechanics, refinement by back-calculation of the NOESY spectrum and analysis of this structure using X-ray data", J.Biom. Str&Dyn., 10, 693-707, 1993.

5- Salazar, M. , Pedoroff, O.Yu., Miller, J. !.'., Ribeiro, M.S. and Reid, B.R. "The DNA strand in ША:ША hybrid duplexes is neither B-form nor A-form in solution", Biochemistry, 32, 4207-4215,

1993.

6. Pedoroff, O.Yu., Salazar, M. and Reid, E.R. "Structure of a DJJA:RNA hybrid duplex: Why Rliase H does not cleave pure RNA", J. Mol. Biol., 233, 509-523, 1993.