Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процесс фагоцитоза бактерий и функционально-метаболическое состояние фагоцитирующих клеток

Рудик, Дмитрий Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процесс фагоцитоза бактерий и функционально-метаболическое состояние фагоцитирующих клеток
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процесс фагоцитоза бактерий и функционально-метаболическое состояние фагоцитирующих клеток"

На правах рукописи РУДИК ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ПРОЦЕСС ФАГОЦИТОЗА БАКТЕРИЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК

Спецвальность 03.00.02 — Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2006

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Тихомирова Елена Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Вашанов Геннадий Афанасьевич

доктор медицинских наук, профессор Брилль Григорий Ефимович

Ведущая организация —

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Защита состоится «ДА» июня 2006 г. в ч. на заседании

диссертационного совета Д 212.038.03 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Автореферат разослан «)£» мая 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Грабович М.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в большинстве стран мира широко используется низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) в биологических исследованиях и в практической медицине в качестве эффективного лечебного и профилактического средства (Козлов, Буйлин, 1993; Илларионов, 1992, 1997; Владимиров, 1994, 1998; Кару, 1995, 1999; Байбеков, 1996; Брилль, 1997, 2005; Клебанов, 2001; Абрамов, 2002; Tuner, Hodl, 1996). От других видов лазерного излучения НИЛИ отличается низкой энергией. Актуальность его использования обусловлена тем, что этих небольших доз излучения достаточно для получения выраженной ответной реакции живой клетки, ткани и даже всего организма (Илларионов, 1994; Головин и др., 2003).

Ежегодно в отечественной и зарубежной печати публикуется большое количество научных работ по изучению биостимулирующих эффектов НИЛИ (Байбеков и др., 1991; Илларионов, 1992; Козлов, 1993; Девятков и др., 1998; Артюхов, 1999; Брилль, 1999). Анализ этих публикаций свидетельствует о явном преобладании клинических испытаний по применению НИЛИ над экспериментальными исследованиями. Поэтому исследование молекулярных, субклеточных и клеточных механизмов, лежащих в основе всего многообразия эффектов, оказываемых НИЛИ на организм, является актуальным и имеет большое значение как для фундаментальной науки, так и для медицинской практики (Владимиров, 1994; Байбеков, 1996; Кару, 1998; Брилль, 2005; Lubart, 1997; Schindl, 2003). Изучение тонких морфофункциональных перестроек в иммунной системе, и, в частности, в системе фагоцитирующих клеток, под влиянием НИЛИ представляет научный интерес и может иметь прикладное значение (Кузник, Васильев, Цибиков, 1989; Рязанцева и др., 2001; Тихомирова и др., 2002, 2003).

Известно, что фагоцитоз является одним из главных механизмов естественной резистентности и ранним этапом специфического иммунного ответа (Ярилин, 2000; Сепиашвили, 2005). Актуальность исследований процесса фагоцитоза и факторов, стимулирующих его завершенность, связана еще с широким распространением в последнее время микроорганизмов, устойчивых к бактерицидным факторам фагоцитирующих клеток (Тихомирова, 2005). В связи с этим поиск путей достижения эффективного киллинга бактерий имеет огромное зна-

чение в практической медицине при лечении различных гнойно-воспалительных и инфекционных заболеваний. В то же время, несмотря на ■ имеющиеся в литературе данные об иммуномодулирующем действии НИЛИ на организм, в отношении влияния его на процесс фагоцитоза и функциональное состояние фагоцитирующих клеток, многое остается неясным.

Цель работы — изучить влияние НИЛИ, генерируемого полупроводниковыми лазерными диодами, in vitro на процесс фагоцитоза бактерий, цитокино-вую и функционально-метаболическую активность перитонеальных макрофагов белых мышей и нейтрофилов периферической крови человека.

Для достижения указанной цели нами были поставлены и решены следующие задачи:

1. Провести подбор оптимальных параметров НИЛИ для оценки фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов белых мышей.

2. Изучить влияние НИЛИ на процесс фагоцитоза in vitro бактерий перитоне-альными макрофагами белых мышей и нейтрофилами периферической крови человека по основным показателям: индексу адгезии (ИА), фагоцитарному индексу (ФИ) и индексу завершенности фагоцитоза (ИЗФ).

3. Определить действие НИЛИ на синтез основных провоспалительных и ре-гуляторных цитокинов (ИЛ-1, ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-4, ИЛ-8) перитонеаль-нылш макрофагами белых мышей и нейтрофилами периферической крови человека в процессе фагоцитоза in vitro бактерий.

4. Оценить влияние НИЛИ in vitro на активность кислородзависимого и ки-слороднезависимого киллинга бактерий перитонеальными макрофагами белых мышей и нейтрофилами периферической крови человека.

5. Изучить изменение метаболической активности перитонеальных макрофагов белых мышей и нейтрофилов периферической крови человека в процессе фагоцитоза in vitro бактерий на фоне действия НИЛИ.

6. Оценить характер и иммунобиологическую значимость действия НИЛИ на процесс фагоцитоза бактерий на субклеточном и клеточном уровнях.

7. Определить возможность использования различных критериев комплексного иммунологического и метаболического мониторинга функции фагоцитирующих клеток для оценки эффективности действия НИЛИ.

Научная новизна. Впервые было проведено комплексное исследование фагоцитарной, цитокиновой и функционально-метаболической активности пе-ритонеальных макрофагов белых мышей и нейтрофилов периферической крови человека под влиянием in vitro НИЛИ с различными параметрами и дозами облучения на клеточном и субклеточном уровнях. Установлено, что НИЛИ красной области спектра (681 нм) в дозах излучения 20- 160 мДж/см2 не оказывает влияние на процесс фагоцитоза бактерий макрофагами и подавляет его активность при дозах 320 - 1500 мДж/см2. ИК НИЛИ (817 и 850 нм) оказывает стимулирующее действие на все стадии фагоцитоза бактерий макрофагами и ней-трофилами.

Впервые показано влияние НИЛИ in vitro на синтез провоспалительных и регуляторных цитокинов - ИЛ-1, ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-4 и ИЛ-8 нейтрофилами и макрофагами в процессе фагоцитоза бактериальных клеток. Дана оценка состояния кислороднезависимого и кислородзависимого киллинга бактерий, метаболической активности фагоцитирующих клеток на фоне действия ИК НИЛИ (850 нм). Определен комплекс наиболее информативных показателей эффективности действия НИЛИ на функционально-метаболическую активность фагоцитирующих клеток.

Теоретическая и практическая значимость. В результате проведенной работы были отобраны наиболее информативные показатели количественных и качественных иммуноморфологических и функционально-метаболических изменений для оценки характера действия НИЛИ на функциональную активность фагоцитирующих клеток для рекомендации к применению в биологических и медицинских исследованиях. Полученные результаты могут быть использованы в клинической практике с целью выбора оптимальных параметров излучения для достижения эффекта стимуляции фагоцитарной функции организма.

метаболического состояния фагоцитирующих клеток», которое рекомендовано к печати Учебно-методической комиссией и утверждено Ученым советом биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (протокол № 5 от 23.12.05 г.). Работа выполнена в рамках НИР СГУ № 45434 «Изучение механизмов действия низкоинтенсивного лазерного излучения на функциональную активность клеток иммунной системы в норме и при инфекционной нагрузке».

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на студенческих научных конференциях биологического факультета СГУ им. Н.Г.Чернышевского (Саратов, 2001; 2002; 2003); студенческой научной конференции Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (Саратов, 2001); Ш-м Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2002); Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002); 7-ой Пущинской конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2003); V-ом Съезде иммунологов и аллергологов России (Санкт-Петербург, 2003); Симпозиумах по оптическим технологиям в биофизике и медицине «SARATOV FALL MEETING» (Саратов, 2003; 2004; 2005); Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004); IV-om Съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005); VII-ой общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Москва, 2006); Х-ом Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2006).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. НИЛИ красной области спектра (681 нм) в дозах излучения 20 — 160 мДж/см2 не оказывает влияние на процесс фагоцитоза бактерий макрофагами и подавляет его активность при дозах 320 - 1500 мДж/см2; в дозах 600 и 900 мДж/см2 вызывает гиперпродукцию ИЛ-1 при фагоцитозе бактерий и не влияет на синтез ФНО-а при всех дозах излучения.

2. ИК НИЛИ (817 и 850 нм) оказывает стимулирующее действие на все стадии фагоцитоза бактерий макрофагами и нейтрофилами; усиливает синтез про-воспалительных цитокинов.

3. ИК НИЛИ (850 нм) усиливает интенсивность «респираторного взрыва» и активность миелопероксидазы в процессе кислородзависимого киллинга бактерий в макрофагах и нейтрофилах; влияет на содержание гликогена и липидов в цитоплазме фагоцитирующих клеток.

4. Наиболее информативными показателями эффективности действия НИЛИ на фагоциты являются индекс завершенности фагоцитоза, содержание провос-папительных цитокинов - ИЛ-1, ФНО-а и ИФН-у, уровень активных форм кислорода в индуцированном НСТ-тесте и активность миелопероксидазы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 статей (в том числе 5 — в реферируемых изданиях), 4 тезисов и 1 научное издание.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы «Современное состояние проблемы (обзора литературы)», главы «Материалы и методы исследований», трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 185 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками. Список литературы содержит 239 источников, в числе которых 188 отечественных и 51 зарубежных работ.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства образования и науки РФ ведомственной научной программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (раздел № 3.3 «Развитие научно-исследовательской работы молодых преподавателей и научных сотрудников, аспирантов и студентов»),

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Современное состояние проблемы (обзор литературы)

На основе обзора отечественной и зарубежной литературы рассматриваются основные свойства лазерного излучения, использование НИЛИ в биологии и медицине, действие НИЛИ на биологическую ткань, физико-химические, биохимические и фотобиологические основы взаимодействия НИЛИ с биологическим объектом, влияние НИЛИ на различные уровни организации живой материи, механизмы фотобиологического действия НИЛИ, а также вопросы влияния НИЛИ на иммунную систему организма.

Глава 2. Материалы и методы исследований

В качестве объекта исследований были использованы нсйтрофилы из периферической крови человека и перитонеальные макрофаги белых мышей. Макрофаги выделяли из перитонеального экссудата самцов беспородных белых мышей по общепринятой методике (всего было использовано 326 животных). Нейтрофилы выделяли из периферической крови добровольцев обоего пола в возрасте 20 — 25 лет (15 человек) с помощью центрифугирования на двойном градиенте плотности фиколла-урографина (English, Andersen, 1974). Количество выделенных клеток подсчитывали в камере Горяева и определяли жизнеспособность в тесте эксклюзии трипанового синего (Практикум ..., 2001).

При постановке экспериментов использовали НИЛИ в видимом красном (681 нм) и инфракрасном (817, 850 нм) диапазонах, генерируемое полупроводниковыми лазерными диодами. Действие НИЛИ осуществляли непосредственно на клеточные взвеси фагоцитов до начала фагоцитоза в условиях in vitro. В качестве контроля использовали клетки, не подвергнутые облучению НИЛИ.

После облучения фагоцитов осуществляли моделирование процесса фагоцитоза в условиях in vitro. В качестве объекта фагоцитоза использовали культуры Escherichia coli Ca 53 и Staphylococcus aureus 100 6 из музея кафедры микробиологии и физиологии растений СГУ. После опсонизации бактерии вносили в культуральную среду 199 с макрофагами или нейтрофилами из расчёта 1 : 50 и инкубировали в термостате при 37 "С в течение 1, 3 и 6 ч. Далее из клеточных взвесей готовили фиксированные и окрашенные препараты для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов на различных этапах фагоцитоза и цитохимического анализа их функционально-метаболической активности. Активность фагоцитоза и его интенсивность на отдельных этапах учитывали путем оценки следующих показателей: индекса адгезии (ИА), фагоцитарных индексов на 1, 3 и 6ч фагоцитоза (ФИ 1,3 6), индекса-завершенности фагоцитоза (ИЗФ) (Васильева с соавт., 1987).

Содержание основных провоспалительных и регуляторных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-8, ФНО-а и ИФН-у определяли через 3 и 6 ч процесса фагоцитоза в супернатанте среды культивирования фагоцитов, подвергнутых облучению НИЛИ, методом ИФА с коммерческими тест-системами на основе моно-

клональных антител к исследуемым цитокинам (ООО «Цитокин», г. Санкт-Петербург; НПО ЗАО «Вектор-БЕСТ», г. Новосибирск).

Оценку локомоторной функции фагоцитов проводили по методу Нельсона (Nelson, Quie, Simmons, 1975) с использованием агарозного геля. Образование активных форм кислорода (АФК) регистрировали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) в двух вариантах: спонтанном и индуцированном (Долгушин, Бухарин, 2001).

Цитохимические исследования проводили через 1, 3 и 6 ч фагоцитоза бактерий с использованием стандартных тест-наборов производства НПФ «Аб-рис+» (г. Санкт-Петербург). Миелопероксидазу в фагоцитирующих клетках определяли методом Грэхема-Кнолля с использованием бензидина (Бакуев, Саи-дов, 1991). Определение содержания кислой фосфатазы проводили методом азосочетания Берстона с использованием нафтол-АЭ-фосфага (Берстон, 1965). Содержание щелочной фосфатазы оценивали методом азосочетания по Каплоу с использованием раствора а-нафтилфосфата (Kaplow, 1955; Шубич, 1965). Определение содержания гликогена в цитоплазме клеток определяли постановкой ШИК-реакции по методу Шабадаша (Шабадаш, 1949). Содержание катионных белков оценивали по методу Шубича с бромфеноловым синим (Шубич, 1974). Содержание липидов оценивали по методу Гольдмана с Суданом III (Роскин, Левинсон, 1967). На основе результатов исследований рассчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК) с использованием полуколичественного метода оценки по принципу Астальди-Верга, основанному на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски (Astaldi, Verga, 1957).

Для статистической обработки экспериментальных данных использовали непараметрические критерии Уилкоксона-Манна-Уитни и параметрический t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при вероятности ошибки Р<0,05 (Ашмарин, Васильев, Амбросов, 1974; Урбах, 1975). Для выявления возможной связи между показателями использовали корреляционный анализ. Расчёт результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0, Statgraph 2.6, MS Excel 2003.

Глава 3. Влияние ПИЛИ на активность процесса фагоцитоза бактерий

Анализ фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов на фоне действия красного ПИЛИ (681 нм) показал, что небольшие дозы излучения (20 -160 мДж/см2) не вызывали существенных изменений в основных показателях фагоцитоза по сравнению с контрольными значениями, при более высоких дозах (320 — 1500 мДж/см2) было отмечено заметное подавляющее действие на активность фагоцитоза.

При расчете ИА макрофагов через 1 ч фагоцитарного процесса было показано достоверное снижение адгезии бактерий на поверхности фагоцитов при воздействии доз излучения 640, 1280 и 1500 мДж/см2; для меньших доз излучения статистически достоверных различий с контролем выявлено не было. Оценка ФИ через 1 ч фагоцитоза показала достоверное снижение по сравнению с контролем процента активных макрофагов при воздействии доз 320, 640, 1280 и 1500 мДж/см1. К 3 ч фагоцитоза бактерий подавление активности макрофагов было более выраженным, показано статистически значимое снижение процента фагоцитирующих клеток для доз 80, 320, 640, 1280 и 1500 мДж/см2. К 6 ч фагоцитарного процесса значения ФИ при действии всех испытуемых доз НИЛИ достоверно не отличались от контрольных значений.

Расчет ИЗФ показал, что при всех испытуемых дозах красного излучения значения показателей были достоверно ниже контроля, кроме дозы 80 мДж/см2, при которой снижение ИЗФ было не достоверным. Особенно заметное снижение показателей завершенности фагоцитоза было отмечено при более высоких дозах излучения: в 1,5 раза при действии дозы 320 мДж/см2 и почти в 3 раза при воздействии дозами 640, 1280 и 1500 мДж/см2. При микроскопическом изучении препаратов было отмечено изменение морфологии макрофагов. Появлялись деформированные клетки с явными морфологическими признаками начинающегося апоптоза: отмечены в клетках уплотнения цитоплазмы, разрушение ядерного аппарата, нарушение целостности клеточной мембраны, разбухание клетки. До 70 % клеток было разрушено к 6 ч фагоцитоза при исходном действии больших доз излучения.

При оценке фагоцитарной активности макрофагов под влиянием инфракрасного НИЛИ (817 нм) показано небольшое увеличение процента макрофагов, находящихся на стадии адгезии, однако достоверное повышение значений

ИА относительно контроля отмечено только для доз излучения 80, 160, 1280 и 1500 мДж/см2. Статистически значимое увеличение активности макрофагов по сравнению с контрольным значением отмечено практически для всех испытуемых доз излучения, кроме 40 и 320 мДж/см2. Аналогичная закономерность наблюдалась и в активности макрофагов через 3 ч фагоцитоза. Статистически значимое увеличение ФИз отмечено при действии ИК НИЛИ (817 нм) с дозами 40, 80, 160, 1280 и 1500 мДж/см2. К 6 ч процесса фагоцитоза значения ФИ были достоверно выше контроля при действии излучения с дозами 160, 1280 и 1500 мДж/см2. В то же время значения ИЗФ либо не отличались от контроля (при действии доз 20, 40, 80, 160, 640 мДж/см2), либо несколько снижались относительно контрольного значения (при действии доз 320, 1280, 1500 мДж/см2).

Изучение фагоцитарной активности макрофагов под влиянием инфракрасного НИЛИ (850 нм) было показано значительное увеличение ИА относительно контроля при воздействии всех испытуемых доз излучения. Фагоцитарная активность на различных этапах фагоцитоза также значительно повышалась, увеличение дозы излучения приводило к увеличению процента активных макрофагов (табл. 1).

Таблица 1

Изменение фагоцитарной активности макрофагов при фагоцитозе S. aureus на фоне воздействия инфракрасного НИЛИ (850 нм)

Доза излучения, мДж/см2 ИА, (Р±тр%) в% Фагоцитарный индекс, (Р±т„%) в % ИЗФ, (М±т) в усл. ед.

ФИ1 ФИз ФИ6

0 (контроль) 76,3 ± 5,28 36,8 ±4,57 47,4 ± 5,21 16,0 ±4,39 0,57 ± 0,035

20 88,9 ±6,35* 42,2 ± 3,42 58,8 ±4,33* 15,1 ±3,74 0,64 ± 0,026*

40 92,3 ± 5,32* 45,7 ±4,71 59,3 ± 3,26* 16,3 ± 4,17 0,64 ± 0,034*

80 93,7 ±5,21* 46,0 ± 5,20 57,9 ± 4,40* 22,0 ± 4,27 0,52 ± 0,037

160 91,9 ±6,44* 46,8 ±4,36* 61,5 ±3,13* 23,4 ±5,12 0,50 ± 0,037

320 92,8 ± 5,78* 46,5 ± 3,22* 67,5 ± 3,34* 21,5 ±3,98 0,54 ± 0,026

640 93,4 ±5,71* 48,7 ±3,12* 69,7 ±4,71* 23,7 ± 4,36 0,51 ±0,027

1280 92,0 ±6,12* 59,2 ± 4,76* 71,2 ±4,61* 19,5 ±4,47 0,67 ± 0,036*

1500 94,8 ± 5,36* 58,4 ±3,05* 72,8 ± 3,58* 20,3 ± 4,55 0,65 ± 0,028*

Примечание: * - наличие достоверных различий по отношению к контрольной группе интактных макрофагов при уровне значимости Р<0,05.

На стадии киллинга и переваривания бактерий (3 ч) процент активно фагоцитирующих макрофагов значительно и статистически достоверно превышал контрольное значение при использовании всех испытуемых доз НИЛИ, однако к 6 ч фагоцитоза значения ФИ возвращались к контрольным. Это свидетельствовало о благоприятном завершении фагоцитарного процесса и эффективном киллинге поглощенных бактерий. Значения ИЗФ увеличивались статистически значимо при действии доз 20,40, 1280, 1500 мДж/см2.

Анализ полученных данных позволил установить выраженное стимулирующее действие ИК НИЛИ (850 нм) на активность фагоцитоза бактерий макрофагами на всех стадиях и его завершенность. При этом был установлен дозо-зависимый эффект данного воздействия через 1 и 3 ч фагоцитоза. Показано значительное усиление процессов адгезии бактериальных клеток. Полученные значения ИЗФ свидетельствуют об увеличении числа фагоцитов, завершивших процесс фагоцитоза бактерий по сравнению с контролем.

При оценке фагоцитарной активности нейтрофилов под влиянием инфракрасного НИЛИ (850 нм) установлено достоверное увеличение значений ИА при дозах выше 160 мДж/см2. Фагоцитарная активность нейтрофилов через 1 ч инкубации превышала контрольное значение только при действии доз излучения 640, 1280 и 1500 мДж/см2. Наиболее высокие значения ФИ отмечены для нейтрофилов через 3 ч процесса фагоцитоза, когда установлено достоверное увеличение процента активных нейтрофилов при действии всех испытуемых доз излучения по сравнению с контролем.

Результаты исследований позволили сделать заключение о дозозависи-мом стимулирующем характере воздействия ИК НИЛИ (850 нм) на фагоцитарную активность нейтрофилов к 1 и 3 ч процесса фагоцитоза, что совпадает с периодом наиболее активного поглощения и киллинга бактерий. Показатели ИЗФ при действии практически всех доз на нейтрофилы статистически достоверно превышали контрольное значение. Максимальное увеличение ИЗФ было отмечено для доз 640 и 1280 мДж/см2. Таким образом, ИК НИЛИ с длиной волны 850 нм усиливало процесс фагоцитоза бактерий нейтрофилами. Установлено увеличение адгезивной активности и поглотительной способности нейтрофилов, что положительно сказывалось на завершенности фагоцитарного процесса.

Глава 4. Влияние ПИЛИ на цитокиновую активность фагоцитирующих клеток

При изучении влияния НИЛИ красного диапазона (681 нм) установлено повышение синтеза ИЛ-1 макрофагами, особенно через б ч инкубации с бактериями. Концентрация этого цитокина увеличивалась по сравнению с контролем в 4 раза (при действии дозы 600 мДж/см2) и в 7 раз (при 900 мДж/см2). Такое увеличение содержания ИЛ-1 в культуральной среде с макрофагами может расцениваться как гиперпродукция данного цитокина, что может негативно сказаться на функциональном состоянии клеток-мишеней и привести к нарушению их гомеостаза. Показанное ранее подавление фагоцитарной активности макрофагов, появление клеток с нарушенной морфологией, а также разрушение клеток при увеличении дозы излучения НИЛИ красного диапазона (681 нм) можно связать с установленной гиперпродукцией ИЛ-1.

Под влиянием ИК НИЛИ (817 нм) показано статистически достоверное увеличение синтеза ИЛ-1 макрофагами к 3 ч инкубации с бактериями по сравнению с контролем на фоне действия всех испытуемых доз излучения. Анализ содержания ФНО-а в среде культивирования макрофагов с бактериями выявил достоверное увеличение к 3 и 6 ч процесса фагоцитоза.

При оценке влияния ИК НИЛИ (850 нм) установлена индукция синтеза основных провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ФНО-а. Показано дозозави-симое увеличение содержания ИЛ-1 через 3 ч инкубации макрофагов с бактериями по сравнению с контролем. Отмечено, что ИК НИЛИ оказывало значительное стимулирующее влияние на синтез ФНО-а, наибольшее содержание которого отмечено при действии дозой 1500 мДж/см2 по сравнению с контролем (рис. 2-Б). Выявлены достоверные различия в концентрации ФНО-а через 3 и 6 ч фагоцитоза при действии на макрофаги дозами 900 и 1500 мДж/см2. Концентрация ИФН-у увеличивалась в среднем в 1,5 раза по сравнению с контролем, однако это увеличение не имело дозозависимый характер. Статистически значимые различия содержания ИЛ-4 в культуральной среде с облученными и необлученными фагоцитирующими макрофагами не были обнаружены при действии всех испытуемых доз излучения. Отмечено увеличение синтеза ИЛ-8 фагоцитирующими макрофагами только через 3 ч процесса фагоцитоза.

Анализ цитокиновой активности нейтрофилов человека при действии ИК НИЛИ (850 нм) позволил выявить достоверное увеличение содержания ИЛ-1 к • 3 и 6 ч процесса фагоцитоза под влиянием всех испытуемых доз по сравнению с контролем (рис. 1-А). При этом наиболее выраженное действие оказывала доза 900 мДж/см2 через 6 ч фагоцитоза. Аналогичные данные были получены и по содержанию ФНО-а (рис. 1-Б).

| 40

120 100

Контроль 300

□ Зч

900

1500

Доза, мДж/кв.см ■ 6ч

Контроль 300

РЗч

900

1500

Доза, мДж/кв.см ■ 6ч

Контроль 300

900 1500 Доза, мДж/кв.см □ 3 ч шб ч

Контроль 300

ПЗч

900 1500

Доза, мДж/кв.см ■ 6ч

Рис. 1. Динамика продукции ИЛ-1 (А), ФНО-ot (Б), ИФН-у (В) и ИЛ-8 (Г) I процессе фагоцитоза S. aureus нейтрофилами, облученными in vitro ИК НИЛИ (850 нм)

Следует отметить, что нейтрофилы синтезировали ФНО-а более активно, чем макрофаги при тех же условиях эксперимента. Оценка продукции ИФН-у нейтрофилами показала достоверное повышение его содержания к 3 ч, и более выраженное — к б ч фагоцитоза бактерий по сравнению с контролем независимо от дозы излучения (рис. 1-В). Установлено достоверное снижение синтеза ИЛ-4

при действии всех изученных доз через 3 и б ч фагоцитоза бактерий по сравнению с контролем. На фоне действия НИЛИ (с дозами 300 и 900 мДж/см2 достоверных различий синтеза ИЛ-8 через 3 ч фагоцитоза с контрольным значением выявлено не было. При действии дозы 1500 мДж/см2 отмечено увеличение его содержания. К б ч фагоцитоза бактерий показано достоверное снижение содержания ИЛ-8 при действии всех испытуемых доз излучения по сравнению с контролем (рис. 1-Г).

Глава 5. Влияние НИЛИ на функционально-метаболическую активность фагоцитирующих клеток

Необходимым условием для завершения фагоцитарного процесса является успешный киллинг поглощенных фагоцитом микроорганизмов, обусловленный достаточной активностью различных микробоцидных факторов. В связи с этим представляло интерес изучить влияние ИК НИЛИ (850 нм) на изменение показателей кислороднезависимого и кислородзависимого киллинга бактерий фагоцитирующими клетками. Для оценки кислороднезависимого киллинга бактерий S. aureus была изучена активность кислой (КФ) и щелочной (ЩФ) фос-фатаз, а также содержание катионных белков (КБ) в цитоплазме перитонеаль-ных макрофагов и нейтрофилов крови (табл. 2).

Было отмечено стимулирующее действие некоторых доз ИК НИЛИ на активность образования КФ. Через 1 ч фагоцитоза бактерий макрофагами установлено достоверное увеличение активности КФ при действии НИЛИ дозами 900 и 1500 мДж/см ; через 3 ч — дозами 300 и 1500 мДж/см и через 6ч — дозами 900 и 1500 мДж/см2. Показано, что содержание КФ в цитоплазме неактивных нейтрофилов было достоверно выше при действии всех доз излучения по сравнению с контролем. Увеличение содержания КФ отмечено только при действии дозы 300 мДж/см2 к 3 ч фагоцитоза по сравнению с контролем.

Показан противоречивый характер влияния НИЛИ на продукцию ЩФ в неактивных макрофагах: снижение значений СЦК при действии дозой 300 мДж/см2, отсутствие достоверных различий с контролем при дозе 900 мДж/см2 и достоверное превышение контрольных значение при дозе 1500 мДж/см2. К 1 ч фагоцитоза бактерий макрофагами не было отмечено дос-

товерных различий активности ЩФ при действии НИЛИ. Определение данного фермента через 3 ч после начала фагоцитоза показало достоверное увеличение его продукции при использовании дозы излучения 300 мДж/см2 по сравнению с контролем. Через 6 ч фагоцитоза выявлено значительное подавление активности ЩФ при действии всех испытуемых доз излучения.

Таблица 2

Изменение показателей кислороднезависимого киллинга бактерий S. aureus макрофагами и нейтрофилами под влиянием ИК НИЛИ (850 нм)

Время фаго ци-тоза, ч СЦК (М±ш), усл.ед.

Доза, мДж/см2 Макрофаги Нейтрофилы

КФ ЩФ КБ КФ ЩФ КБ

К 0 1,43±0,14 0,46*0,12 1,55*0,30 0,95*0,12 1,09*0,09 1,04*0,10

1 1,25*0,15 0,60*0,21 2,38*0,10 1,54*0,10 0,51*0,08 0,19*0,04

3 1,72±0,11 0,26*0,09 1,68*0,25 2,13*0,16 1,04*0,06 1,82*0,09

6 0,92*0,09 0,82*0,19 1,14*0,20 1,89*0,14 0,11*0,10 1,81*0,13

300 0 1,60*0,13 0,16*0,05* 1,58*0,27 1,69*0,19* 0,97*0,11 1,15*0,13

1 1,41±0,12 0,68*0,15 2,25*0,19 1,48*0,09 0,23*0,10* 0,58*0,07*

3 2,29*0,10* 0,73*0,14* 1,10*0,21* 2,41*0,12* 1,03*0,11 1,78*0,11

6 1,09*0,13 0,46*0,10* 1,48*0,17 2,04*0,11 0,12*0,09 1,48*0,09*

900 0 1,37*0,13 0,34*0,12 1,54*0,21 1,87*0,07* 0,15*0,13* 0,86*0,09

1 1,92*0,11* 0,74*0,23 2,13*0,12* 1,75*0,15 0,3*0,09* 0,34*0,06*

3 1,78*0,13 0,46*0,13 1,45*0,16 1,98*0,16 1,56*0,08* 1,84*0,10

6 2,38*0,08* 0,42*0,11* 1,89*0,21* 1,89*0,11 0,95*0,13* 1,02*0,10*

1500 0 2,12*0,12* 0,76*0,17* 2,34*0,11* 1,79*0,13* 0,46*0,08* 0,50*0,06*

1 2,47*0,13* 0,59*0,15 1,67*0,32* 1,71*0,21 0,08*0,10* 0,63*0,08*

3 2,29*0,10* 0,35*0,08 1,48*0,26 1,84*0,17 0,23*0,10* 2,28*0,12*

6 2,37*0,06* 0,44*0,12* 2,05*0,22* 1,92*0,14 1,41*0,11* 0,81*0,12*

Примечания: * — наличие достоверных различий по отношению к контролю при уровне значимости Р<0,05; СЦК — средний цитохимический коэффициент; КФ — кислая фосфата-за; ЩФ - щелочная фосфатаза; КБ - катионные белки; К - контроль (без облучения НИЛИ).

Содержание ЩФ в неактивных нейтрофилах при действии НИЛИ, в отличие от содержания КФ, снижалось по сравнению с контролем. В ходе фагоцитоза бактерий через 1 ч показатели активности ЩФ оставались ниже контрольных значений, к 3 ч статистически увеличивались при действии дозы 600 мДж/см2 и значительно снижались при облучении дозой 1500 мДж/см2. Через 6 ч активность фермента была в пределах контроля под влиянием дозы 300 мДж/см2 и достоверно выше него при действии доз 600 и 1500 мДж/см2.

Оценка значений СЦК для КБ показала достоверное увеличение его содержания в цитоплазме неактивных макрофагов при использовании дозы излучения 1500 мДж/см2. Однако на фоне действия этой дозы излучения через 1 ч фагоцитоза происходило снижение содержания КБ. К 3 ч фагоцитоза значения СЦК были ниже контроля при облучении макрофагов дозой 300 мДж/см2, а через 6 ч происходило увеличение их содержания при воздействии НИЛИ дозами 900 и 1500 мДж/см2. При анализе содержания КБ в цитоплазме контрольной группы нейтрофилов отмечено снижение значений СЦК к 1 ч фагоцитоза бактерий по сравнению с показателями у нефагоцитирующих нейтрофилов. Через 3 и 6 ч процесса фагоцитоза происходило увеличение количества КБ. Показано достоверное увеличение значений СЦК через 1 ч фагоцитоза бактерий при всех испытуемых дозах излучения. Через 3 ч инкубации нейтрофилов с бактериями отмечено достоверное увеличение количества КБ при дозе 1500 мДж/см2. К б ч значения были статистически ниже контроля независимо от дозы излучения.

При изучении основных показателей кислородзависимого киллинга бактерий фагоцитами под влиянием ИК НИЛИ (850 нм) было показано, что интенсивность спонтанной и индуцированной реакций НСТ-теста у макрофагов под влиянием небольших доз НИЛИ (150 и 450 мДж/см2) мало отличалась от контроля. При увеличении дозы излучения происходило достоверное увеличение показателей СЦК у неактивированных макрофагов.

При постановке индуцированной бактериями реакции значения НСТ-теста значительно увеличивались и достигали максимальных значений при действии НИЛИ дозами 1050, 1350 и 1650 мДж/см2 (рис. 2-А). Аналогичные данные были получены при изучении изменений показателей НСТ-теста для нейтрофилов. Были выявлены достоверные различия между показателями в опытных и контрольных группах, а также отмечены различия в вариантах спонтанного и индуцированного НСТ-теста (рис. 2-Б).

Для характеристики другого кислородзависимого механизма киллинга бактерий была изучена активность миелопероксидазы (МПО). При действии НИЛИ на макрофаги не было выявлено достоверных различий в продукции МПО до начала фагоцитоза (рис. 3-А). В интактных нейтрофилах через 1 ч фагоцитоза происходило резкое снижение активности МПО, а к 6 ч ее восстановление до контрольных значений (рис. 3-Б).

450 750 1050 1350 1650 Доза излучения, мДж/кв.см

750 1050 1350 1650 Доза излучения, мДж/кв.см

а спонтанный ■ индуцированный Рис. 2. Активность образования АФК в перитонеальных макрофагах (А) и нейтрофилах крови (Б) в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте при действии ИК НИЛИ (850 нм)

Через 1 ч фагоцитоза бактерий отмечено достоверное увеличение активности МПО при действии доз 900 и 1500 мДж/см2 на макрофаги и дозы 1500 мДж/см2 на нейтрофилы. К 3 ч фагоцитоза активность МПО в макрофагах оставалась на том же уровне, а в нейтрофилах статистически значимо увеличивалась при действии дозой 900 мДж/см2. К б ч фагоцитоза бактерий макрофагами значения активности МПО были на уровне контроля, в нейтрофилах активность МПО увеличивалась под влиянием НИЛИ дозами 900 и 1500 мДж/см2.

3 6

время фагоцитоза, ч

3 6

время фагоцитоза, ч

□ Контроль н300мДЖ1кВШ и900мдж/1<в.см ш1500ыДжЛсв.СМ

Рис. 3. Активность образования миелопероксидазы при фагоцитозе бактерий перитоне-альиыми макрофагами (А) и нейтрофилами крови (Б) под влиянием ИК НИЛИ (850 нм)

Цитохимический анализ на содержание гликогена и липидов в цитоплазме перитонеальных макрофагов и нейтрофилов крови человека проводился с целью оценки активности процессов катаболизма на фоне действия ИК НИЛИ с длиной волны 850 нм. Анализ полученных данных показал, что содержание гликогена в неактивированных макрофагах не изменялось, а в процессе фагоцитоза бактерий снижалось через 1 ч при действии всех испытуемых доз излучения, через 3 и 6 ч — под влиянием доз 900 и 1500 мДж/см2.

Установлено небольшое увеличение содержания гликогена при действии НИЛИ дозой 1500 мДж/см2 в неактивных нейтрофилах и снижение через 1 и б ч фагоцитоза. Под влиянием доз НИЛИ 900 и 1500 мДж/см2 значения СЦК снижались через 3 ч фагоцитоза бактерий нейтрофилами.

Показано небольшое увеличение липидов в макрофагах через 1 ч фагоцитоза бактерий при действии излучения с дозой 900 мДж/см2 и снижение в процессе фагоцитоза при действии дозой 1500 мДж/см2 по сравнению с контролем. В неактивных нейтрофилах на фоне действия НИЛИ содержание липидов не отличалось от контроля. Через 1 ч процесса фагоцитоза отмечено достоверное увеличение данных метаболитов при действии всех испытуемых доз НИЛИ. К 3 ч происходило увеличение СЦК при действии доз 300 и 1500 мДж/см2. Через б ч отмечено снижение количества липидов под влиянием всех доз НИЛИ.

Таким образом, на субклеточном и клеточном уровнях показаны изменения функционально-метаболической активности фагоцитирующих клеток на фоне действия НИЛИ. В результате проведенных исследований были отобраны наиболее информативные показатели эффективности действия НИЛИ па фагоциты: ИЗФ, содержание провоспалительных цитокинов - ИЛ-1, ФНО-а и ИФН-у, уровень образования АФК в индуцированном НСТ-тесте и активность миелопероксидазы. Комплекс этих показателей позволяет судить о характере и иммунобиологической значимости изменений в фагоцитирующих клетках и может быть использован для оценки эффективности действия НИЛИ при лазеротерапии инфекционных заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. НИЛИ красной области спектра (681 нм) в дозах излучения 20 -160 мДж/см2 не вызывало достоверных изменений основных показателей фагоцитоза бактерий макрофагами, в дозах 320 - 1500 мДж/см2 подавляло процесс фагоцитоза по сравнению с контролем. Дозы 600 и 900 мДж/см2 вызывали гиперпродукцию ИЛ-1 макрофагами при фагоцитозе бактерий, но не оказывали достоверного влияния на продукцию ФНО-а.

2. ИК НИЛИ (817 нм) оказывало стимулирующее действие на все стадии фагоцитоза бактерий макрофагами и усиливало синтез провоспалительных ци-токинов ИЛ-1 и ФНО-а независимо от дозы излучения.

3. ИК НИЛИ (850 нм) имело дозозависимый эффект усиления всех стадий фагоцитоза бактерий и синтеза ИЛ-1 и ФНО-а и дозонезависимый - синтеза ИФН-у и ИЛ-8 перитонеальными макрофагами белых мышей.

4. Действие ИК НИЛИ (850 нм) на нейтрофилы человека приводило к дозо-зависимому усилению хемотаксиса, адгезии и поглощения бактерий и синтеза ИЛ-1, ФНО-а и ИФН-у в процессе фагоцитоза. Продукция ИЛ-8 фагоцитирующими нейтрофилами была достоверно выше контрольных значений только на фоне действия дозы 1500 мДж/см2.

5. ИК НИЛИ (850 нм) оказывало влияние на активность кислороднезависи-мого киллинга бактерий. Показано достоверное увеличение активности кислой фосфатазы в макрофагах и в интактных нефагоцитирующих нейтрофилах. Отмечено фазное изменение содержания катионных белков в цитоплазме макрофагов: увеличение до начала фагоцитоза и через 6 ч, и снижение через 1 и 3 ч фагоцитоза бактерий. Для нейтрофилов, напротив, показано снижение в неактивных и фагоцитирующих клетках через 6 ч, и увеличение через 1 и 3 ч фагоцитоза бактерий.

6. Установлено стимулирующее действие ИК НИЛИ (850 нм) на кислород-зависимый киллинг бактерий в макрофагах и нейтрофилах. Отмечена значительная активация миелопероксидазы и увеличение образования активных форм кислорода по показателям индуцированного НСТ-теста.

7. Показано уменьшение количества гликогена в цитоплазме фагоцитирующих макрофагов и нейтрофилов под влиянием ИК НИЛИ (850 им) и отсутствие достоверных изменений в содержании липидов в макрофагах. Содержание ли-пидов в нейтрофилах увеличивалось через 1 и 3 ч фагоцитоза бактерий, но достоверно снижалось к 6 ч по сравнению с контрольными значениями.

8. Наиболее информативными показателями эффективности действия НИЛИ на фагоцитирующие клетки являются: индекс завершенности фагоцитоза, содержание провоспалительных цитокинов — ИЛ-1, ФНО-а и ИФН-у, уровень образования активных форм кислорода в индуцированном НСТ-тесте и активность миелопероксидазы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рудик Д.В., Тихомирова Е.И., Науменко Г.Ю. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на активность процесса фагоцитоза / Сб. статей молод, ученых и специалистов «Науки о человеке». — Томск, 2002. - С. 188 - 189.

2. Тихомирова Е.И., Бугаева И.О., Науменко Г.Ю., Рудик Д.В. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на активность клеток иммунной системы / Матер, науч.-практич. конф. «Окружающая среда и здоровье». - Саратов, 2002.-С. 123-124.

3. Рудик Д.В., Тихомирова Е.И., Бугаева И.О. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на активность процесса фагоцитоза // Международная Информационная Система по Резонансным Технологиям. - 2002. — Сборник № 27 / Электронный ресурс: http://ikar.udm.ru/mis-rt.htm.

4. Тихомирова Е.И., Бугаева И.О., Рудик Д.В. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на активность фагоцитоза // Межрегион, сб. науч. работ «Проблемы физической биомедицины». — Саратов, 2003. — С. 137 - 142.

5. Рудик Д.В. Продукция цитокинов перитонеальными макрофагами в условиях облучения низкоинтенсивным лазерным излучением in vivo и in vitro // Сб. тезисов 7-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века». - Пущино, 2003. - С. 39.

6. Рудик Д.В. Динамика синтеза цитокинов макрофагами при фагоцитозе энте-ропатогенной Escherichia coli на фоне действия НИЛИ in vivo и in vitro / Сб. науч. тр. «Студенческие исследования в биологии». - Саратов, 2003. -Вып. 1,-С. 36-40.

7. Rudik D.V., Tikhomirova E.I., Bugaeva I.O. Influence of low level laser irradiation to phagocytosis activity and pro inflammation cytokins production // Proceedings of SPIE. - USA, Washington, 2004. - V. 5474. - P. 389-395.

8. Рудик Д.В., Тихомирова Е.И., Бугаева И.О. Фагоцитарная активность макрофагов и синтез цитокинов на фоне действия НИЛИ in vitro и in vivo // Russian Journal of Immunology. — 2004. - V. 9. - Sup. 1. - P. 47.

9. Рудик Д.В., Тихомирова Е.И., Тучина E.C. Функциональная активность ней-трофилов крови человека при действии различных доз инфракрасного лазерного излучения // Сб. тезисов IV Съезда фотобиологов России. - Саратов, 2005. - С. 171 - 174.

10. Рудик Д.В., Тихомирова Е.И. Методы изучения процесса фагоцитоза и оценки функционально-метаболической активности фагоцитирующих клеток. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2006. - 112 с.

11. Тихомирова Е.И., Рудик Д.В., Тучина Е.С. Оценка некоторых показателей киллинга бактерий нейтрофилами периферической крови человека под влиянием инфракрасного низкоинтенсивного лазерного излучения // Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, № 2 - 3 . - С. 35 - 36.

12. Рудик Д.В., Тучина Е.С., Тихомирова Е.И., Сенотов А.С. Оценка функционально-метаболического статуса фагоцитирующих клеток под действием низкоинтенсивного лазерного излучения ИК-диапазона (850 нм) Н Фундаментальные исследования. — 2006. — № 5. — С. 100 — 101.

13. Rudik D.V., Tikhomirova E.I., Tuchina E.S. The cytokine production by neutrophils and macrophages in time of phagocytosis under the influence of infrared low-level laser irradiation // Proceedings of SPIE. - USA, Washington, 2006. - V. 6162 rP.JIi-Xfi.

14. Рудик Д.В., Тихомирова Е.И. Исследование функциональной активности макрофагов перитонеального экссудата мышей при воздействии низкоинтенсивного лазерного излучения в системах in vitro и in vivo И Биофизика. -

2006-7:^-^3.

Рудик Дмитрий Владимирович

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 25.05.2006. Формат 60x84 '/is. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать офсетная. Объем 1 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ №

Типография Издательства Саратовского университета. 410012, Саратов, Астраханская, 83.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рудик, Дмитрий Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Основные понятия о лазерах и лазерном излучении.

1.2. Основные свойства лазерного излучения.

1.3. Использование лазерного излучения в медицине и биологии.

1.4. Взаимодействие НИЛИ с биологической тканью.

1.5. Физико-химические, биохимические и фотобиологические основы взаимодействия

НИЛИ с биологическим объектом.

1.6. Влияние НИЛИ на различные уровни организации живой материи.

1.7. Механизмы фотобиологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения. ф 1.8. Влияние НИЛИ на иммунную систему организма.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Параметры использованного НИЛИ.

2.2. Объекты исследования и постановка экспериментов.

2.3. Методы выделения фагоцитирующих клеток.

2.4. Моделирование процесса фагоцитоза в условиях in vitro и оценка активности и завершенности фагоцитарного процесса.

2.5. Изучение цитокиновой активности фагоцитирующих клеток.

2.6. Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток.

2.7. Цитохимическая оценка функциональнометаболического состояния фагоцитов.

2.8. Методы статистической обработки результатов.

Глава 3. ВЛИЯНИЕ НИЛИ НА АКТИВНОСТЬ ПРОЦЕССА

ФАГОЦИТОЗА БАКТЕРИЙ.

3.1. Подбор оптимальных параметров НИЛИ для оценки действия на фагоцитирующие клетки.

3.2. Оценка фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов под влиянием НИЛИ.

3.2.1. Влияние красного НИЛИ с длиной волны 681 нм на активность процесса фагоцитоза бактерий перитонеальными макрофагами.

3.2.2. Влияние инфракрасного НИЛИ с длиной волны 817 нм на активность процесса фагоцитоза бактерий перитонеальными макрофагами.

3.2.3. Влияние инфракрасного НИЛИ с длиной волны 850 нм на активность процесса фагоцитоза бактерий перитонеальными макрофагами.

3.2.4. Влияние инфракрасного НИЛИ с длиной волны 850 нм на активность процесса фагоцитоза бактерий нейтрофилами периферической крови человека.

3.3. Сравнительная характеристика влияния различных видов НИЛИ на фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов.

3.4. Установление дозозависимых эффектов влияния

НИЛИ различных параметров на основные показатели фагоцитарной активности.

Глава 4. ВЛИЯНИЕ НИЛИ НА ЦИТОКИНОВУЮ АКТИВНОСТЬ

ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК.

4.1. Влияние красного НИЛИ (681 нм) на индукцию провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 и ФНО-а) в процессе фагоцитоза бактерий макрофагами.

4.2. Влияние ИК НИЛИ (817 нм) на индукцию ф провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 и ФНО-а) в процессе фагоцитоза бактерий макрофагами.

4.3. Влияние ИК НИЛИ (850 нм) на индукцию провоспалительных и регуляторных цитокинов в процессе фагоцитоза бактерий макрофагами.

4.4. Влияние ИК НИЛИ (850 нм) на индукцию провоспалительных и регуляторных цитокинов в процессе фагоцитоза бактерий нейтрофилами человека.

Глава 5. ВЛИЯНИЕ НИЛИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК.

5.1. Изменение локомоторной активности макрофагов и нейтрофилов под влиянием ИК НИЛИ (850 нм).

5.2. Влияние ИК НИЛИ (850 нм) на активность киллинга бактерий фагоцитирующими клетками.

5.2.1. Изменение основных показателей кислороднезависимого киллинга бактерий фагоцитами под влиянием ИК НИЛИ (850 нм).

Ф 5.2.2. Изменение основных показателей кислородзависимого киллинга бактерий фагоцитами под влиянием ИК НИЛИ (850 нм).

5.3. Изменение основных показателей

9 метаболического состояния фагоцитирующих клеток под влиянием ИК НИЛИ (850 нм).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процесс фагоцитоза бактерий и функционально-метаболическое состояние фагоцитирующих клеток"

Актуальность проблемы. В настоящее время в большинстве стран мира широко используется низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) в биологических исследованиях и в практической медицине в качестве эффективного лечебного и профилактического средства (Ohshiro, Calderhead, 1988; Lubart et al., 1990; Козлов, Буйлин, 1993; Илларионов, 1992, 1997; Владимиров, 1994, 1998; Кару, 1995, 1998; Байбеков, 1996; Tuner, Hodl, 1996; Брилль, 1997, 2005; Скобелкин, 1997; Применение лазеров 1999; Абрамов, 2002; Клебанов, 2003; Черенков и др., 2005). От других видов лазерного излучения НИЛИ отличается низкой энергией. Актуальность его использования обусловлена тем, что этих небольших доз излучения достаточно для получения выраженной ответной реакции живой клетки, ткани и даже всего организма (Илларионов, 1994; Головин и др., 2003).

Ежегодно в отечественной и зарубежной печати публикуется большое количество научных работ по изучению биостимулирующих эффектов НИЛИ (Байбеков и др., 1991; Илларионов, 1992; Козлов, Буйлин, 1993; Непомнящих и др., 1994; Гримблатов, 1996; Tuner J., Hodl L., 1996; Артемьев, Ецко, 1997; Каплан, 1997; Кибисов, 1997; Девятков и др., 1987; Утц С.Р., Волнухин В.А., 1998; Артюхов и др., 1999; Брилль, 1999, 2005; Бугаева и др., 2004). Анализ этих публикаций свидетельствует о явном преобладании клинических испытаний по применению НИЛИ над экспериментальными исследованиями. Поэтому исследование молекулярных, субклеточных и клеточных механизмов, лежащих в основе всего многообразия эффектов, оказываемых НИЛИ на организм, является актуальным и имеет большое значение как для фундаментальной науки, так и для медицинской практики (Девятков, 1987; Владимиров, 1994; Байбеков, 1996; Гладких, 1996; Брилль, 1997; Lubart et al., 1997; Кару и др., 1998; Schindl et al., 2003).

Изучение тонких морфофункциональных перестроек в иммунной системе, и, в частности, в системе фагоцитирующих клеток, под влиянием НИЛИ представляет научный интерес и может иметь прикладное значение

Кузник, Васильев, Цибиков, 1989). Известно, что фагоцитоз является одним из главных механизмов естественной резистентности и ранним этапом специфического иммунного ответа (Ярилин, 2000; Сепиашвили, Шубич, Дорофеева, 2003).

Актуальность исследований процесса фагоцитоза и факторов, стимулирующих его завершенность, связана еще с широким распространением в последнее время микроорганизмов, устойчивых к бактерицидным факторам фагоцитирующих клеток (Тихомирова, 2005). В связи с этим поиск путей достижения эффективного киллинга бактерий имеет огромное значение в практической медицине при лечении различных гнойно-воспалительных и инфекционных заболеваний.

В то же время, несмотря на имеющиеся в литературе данные об имму-номодулирующем действии НИЛИ на организм, в отношении влияния его на функциональное состояние фагоцитирующих клеток, многое остается неясным, что и предопределило направление наших исследований.

Цель работы - изучить влияние НИЛИ, генерируемого полупроводниковыми лазерными диодами, in vitro на процесс фагоцитоза бактерий, цито-киновую и функционально-метаболическую активность перитонеальных макрофагов белых мышей и нейтрофилов периферической крови человека.

Для достижения указанной цели нами были поставлены и решены следующие задачи:

2. Изучить влияние НИЛИ на процесс фагоцитоза in vitro бактерий пери-тонеальными макрофагами белых мышей и нейтрофилами периферической крови человека по основным показателям: индексу адгезии (ИА), фагоцитарному индексу (ФИ) и индексу завершенности фагоцитоза (ИЗФ).

3. Определить действие НИЛИ на синтез основных провоспалительных и регуляторных цитокинов (ИЛ-1, ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-4, ИЛ-8) перитонеальными макрофагами белых мышей и нейтрофилами периферической крови человека в процессе фагоцитоза in vitro бактерий.

4. Оценить влияние НИЛИ in vitro на активность кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга бактерий перитонеальными макрофагами белых мышей и нейтрофилами периферической крови человека.

Научная новизна. Впервые было проведено комплексное исследование фагоцитарной, цитокиновой и функционально-метаболической активности перитонеальных макрофагов белых мышей и нейтрофилов периферической крови человека под влиянием in vitro НИЛИ с различными параметрами и дозами облучения на клеточном и субклеточном уровнях. Установлено, что л

НИЛИ красной области спектра (681 нм) в дозах излучения 20- 160 мДж/см не оказывает влияние на процесс фагоцитоза бактерий макрофагами и подавляет его активность при дозах 320 - 1500 мДж/см . ИК НИЛИ (817 и 850 нм) оказывает стимулирующее действие на все стадии фагоцитоза бактерий макрофагами и нейтрофилами.

Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций общих (иммунология, микробиология) и специальных (современные методы иммунологических исследований, молекулярная иммунология) курсов студентам биологического факультета СГУ. Полученные результаты использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета СГУ. По материалам данной работы было опубликовано научное издание «Методы изучения процесса фагоцитоза и функционально-метаболического состояния фагоцитирующих клеток», которое рекомендовано к печати Учебно-методической комиссией и утверждено Ученым советом биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (протокол № 5 от 23.12.05 г.). Работа выполнена в рамках НИР СГУ № 45434 «Изучение механизмов действия низкоинтенсивного лазерного излучения на функциональную активность клеток иммунной системы в норме и при инфекционной нагрузке».

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

- студенческих научных конференциях биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г.Чернышевского (Саратов, 2001; 2002; 2003);

- студенческой научной конференции Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (Саратов, 2001);

- Ш-м Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2002);

- Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002);

- 7-ой Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003);

- V-ом Съезде иммунологов и аллергологов России (Санкт-Петербург, 2003);

- Симпозиумах по оптическим технологиям в биофизике и медицине «SARATOV FALL MEETING» (Саратов, 2003; 2004; 2005);

- Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004);

- IV-ом Съезде фотобиологов России (Саратов, 2005);

- Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005);

- VII-ой общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Москва, 2006);

- Х-ом Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2006).

Положения, выносимые на защиту:

• НИЛИ красной области спектра (681 нм) в дозах излучения 20 -160 мДж/см2 не оказывает влияние на процесс фагоцитоза бактерий макрофагами и подавляет его активность при дозах 320 -1500 мДж/см2; в дозах 600 и 900 мДж/см2 вызывает гиперпродукцию ИЛ-1 при фагоцитозе бактерий и не влияет на синтез ФНО-а при всех дозах излучения.

• ИК НИЛИ (817 и 850 нм) оказывает стимулирующее действие на все стадии фагоцитоза бактерий макрофагами и нейтрофилами; усиливает синтез провоспалительных цитокинов.

• ИК НИЛИ (850 нм) усиливает интенсивность «респираторного взрыва» и активность миелопероксидазы в процессе кислородзависимого киллинга бактерий в макрофагах и нейтрофилах; влияет на содержание гликогена и липидов в цитоплазме фагоцитирующих клеток.

• Наиболее информативными показателями эффективности действия НИЛИ на фагоциты являются индекс завершенности фагоцитоза, содержание провоспалительных цитокинов - ИЛ-1, ФНО-а и ИФН-у, уровень активных форм кислорода в индуцированном НСТ-тесте и активность миелопероксидазы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ: 9 статей (в том числе 5 - в реферируемых изданиях), 4 тезисов и 1 научное издание.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Рудик, Дмитрий Владимирович

выводы

НИЛИ красной области спектра (681 нм) в дозах излучения 20 — 160 мДж/см не вызывало достоверных изменений основных показателей л фагоцитоза бактерий макрофагами, в дозах 320 - 1500 мДж/см подавляло процесс фагоцитоза по сравнению с контролем. Дозы 600 и 900 мДж/см вызывали гиперпродукцию ИЛ-1 макрофагами при фагоцитозе бактерий, но не оказывали достоверного влияния на продукцию ФНО-а. ИК НИЛИ (817 нм) оказывало стимулирующее действие на все стадии фагоцитоза бактерий макрофагами и усиливало синтез провоспалитель-ных цитокинов ИЛ-1 и ФНО-а независимо от дозы излучения. ИК НИЛИ (850 нм) имело дозозависимый эффект усиления всех стадий фагоцитоза бактерий и синтеза ИЛ-1 и ФНО-а и дозонезависимый — синтеза ИФН-у и ИЛ-8 перитонеальными макрофагами белых мышей. Действие ИК НИЛИ (850 нм) на нейтрофилы человека приводило к до-зозависимому усилению хемотаксиса, адгезии и поглощения бактерий и синтеза ИЛ-1, ФНО-а и ИФН-у в процессе фагоцитоза. Продукция ИЛ-8 фагоцитирующими нейтрофилами была достоверно выше контрольных значений только на фоне действия дозы 1500 мДж/см . ИК НИЛИ (850 нм) оказывало влияние на активность кислороднезависимого киллинга бактерий. Показано достоверное увеличение активности кислой фосфатазы в макрофагах и в интактных нефагоцитирующих нейтрофилах. Отмечено фазное изменение содержания катионных белков в цитоплазме макрофагов: увеличение до начала фагоцитоза и через 6 ч, и снижение через 1 и 3 ч фагоцитоза бактерий. Для нейтрофилов, напротив, показано снижение в неактивных и фагоцитирующих клетках через 6 ч, и увеличение через 1 и 3 ч фагоцитоза бактерий. Установлено стимулирующее действие ИК НИЛИ (850 нм) на кислород-зависимый киллинг бактерий в макрофагах и нейтрофилах. Отмечена значительная активация миелопероксидазы и увеличение образования активных форм кислорода по показателям индуцированного НСТ-теста.

Показано уменьшение количества гликогена в цитоплазме фагоцитирующих макрофагов и нейтрофилов под влиянием ИК НИЛИ (850 нм) и отсутствие достоверных изменений в содержании липидов в макрофагах. Содержание липидов в нейтрофилах увеличивалось через 1 и 3 ч фагоцитоза бактерий, но достоверно снижалось к 6 ч по сравнению с контрольными значениями.

Наиболее информативными показателями эффективности действия НИЛИ на фагоцитирующие клетки являются: индекс завершенности фагоцитоза, содержание провоспалительных цитокинов - ИЛ-1, ФНО-а и ИФН-у, уровень образования активных форм кислорода в индуцированном НСТ-тесте и активность миелопероксидазы.

146 . ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из наиболее перспективно развивающихся направлений совре-® менной биофизики является лазерная биофизика, основной задачей которой является изучение эффектов, оказываемых лазерным излучением на биологическую систему на всех уровнях организации живой материи. Особый научный интерес представляет исследование влияние НИЛИ на биологические объекты в связи с тем, что оно нашло широкое применение в различных областях медицины для достижения выраженного терапевтического эффекта.

Многими авторами было отмечено, что лазерное воздействие с низкой энергией активизирует многие метаболические процессы в организме, повышает энергетический обмен, оказывает анальгезирующий эффект и противовоспалительное действие, стимулирует репаративные процессы, а также нормализует общий иммунитет и повышает резистентность организма (Глейм, 1981; Кару и др., 1983; Кузьмина, 1984; Кузник, 1989; Байбеков и др., 1991; Козлов, Буйлин, 1995; Брискин и др., 1996). При этом НИЛИ практически не имеет противопоказаний и лишено побочного действия (Головин и 1 др., 2003; Ибадова и др., 1995). Несмотря на столь необычайную широту терапевтических эффектов НИЛИ, до настоящего времени остается не выясненным вопрос о причинах его терапевтической эффективности и о механизмах его влияния на биологическую систему.

По мнению некоторых авторов, терапевтическая эффективность лазерного излучения с низкой интенсивностью основана на многофакторном воздействии излучения на все уровни организации живой материи (Крюк, 1986; Ohshiro, Calderhead, 1988; Илларионов, 1992; Брискин и др., 1996). Так на молекулярном и субклеточном уровнях происходит возбуждение молекул, их * стереохимическая перестройка, увеличение скорости синтеза белка, АТФ,

РНК, ДНК и, как следствие, активация ядерного аппарата и биосинтетических процессов (Байбеков и др., 1991; Козлов, Буйлин, 1995). Наблюдается ф изменение кислородного баланса и активация окислительновосстановительных процессов, подавление перекисного окисления липидов

ПОЛ) и образование свободных радикалов, потенцирование действия анти-оксидантов (Доровских, Бородин, 1998). При этом происходит повышение активности каталазы, пероксидазы, активация других ферментативных систем клетки, в частности, сукцинат-дегидрогеназы, НАД-Н2, НАДФ-Н2, АТФазы, альдолазы, кислой и щелочной фосфатаз (Девятков и др., 1987; Горбатенкова, Владимиров, 1989). Ряд концепций, объясняющих биологические эффекты НИЛИ, базируются на его способности изменять структуру и конформационную подвижность элементов биомембран (Тучин, 1998), а также возможности изменения структуры мезоморфной жидкокристаллической матрицы (Минц, Скопинов, 1989; Захаров и др., 1989а).

На клеточном уровне наблюдается изменение заряда электрического поля и мембранного потенциала клетки (Wilander, Oberg, 1986; Коновалов и др., 1989). На фоне стимуляции функций ядерного аппарата повышается ми-тотическая активность клетки, активизируются процессы размножения, пролиферации и дифференцировки, а также физиологической и репаративной регенерации (Lubart et al., 1990; Karu et al., 1991; Козлов, Буйлин, 1993; Бри-скин и др., 1996).

На тканевом уровне повышается поглощение тканями кислорода, изменение рН межклеточной жидкости, морфо-функциональной активности, значительное расширение микроциркуляторного русла, противоотечное и противовоспалительное действие (Глейм, 1981; Дуденко, Залюбовский, 1982; Мамонтова, 1996; Schindl et al.,1997,2002).

На организменном уровне повышается адаптационная устойчивость, стабилизируется нервно-психический статус, отмечается иммуномо-дулирующий эффект (Кузьмина, Варижников, 1984; Панков, 2000).

Г.И. Клебанов (1999) указывал на то, что существует некое общее звено в патогенезе всех нозологических форм заболеваний, в терапии которых благотворно проявляется лазеротерапия. Это подразумевает наличие единого общего механизма действия НИЛИ применительно ко всем патологиям, а не множества разнообразных индивидуальных реакций для каждого конкретного заболевания. Наиболее вероятно, что таким связующим звеном является универсальный патологический процесс, а именно - воспаление, которое встречается во многих случаях применения лазеротерапии, и либо играет роль ведущего патогенетического звена, либо носит реактивный характер (Seymor et al., 1978; Клебанов и др., 1998; Клебанов, Владимиров, 1999).

Клинические и экспериментальные исследования различных авторов показывают, что при определенных параметрах лазерный свет может оказывать стимулирующее действие на состояние гуморального и клеточного иммунитета (Мороз, 1980; Крюк, 1983; Купин, 1985; Гладкова и др., 1989).

Мы полагаем, что в основе многих наблюдаемых эффектов НИЛИ лежит, в первую очередь, его модулирующее воздействие на процесс фагоцитоза и связанные с ним реакции воспаления, конкретные механизмы действия которых, к сожалению, на сегодня остаются гипотетическими.

Базой для развертывания специфических иммунных процессов, являются реакции, связанные с воспалением. Поскольку они присутствуют в любом организме до начала агрессии, их называют естественными (Галактионов, 2004). При этом основными свойствами естественного в отличие от приобретенного иммунитета всегда считалась быстрая реакция на чужеродные агенты и полное отсутствие какой-либо специфичности ответа. Данные, полученные в последние годы, заставляют совершенно по-новому взглянуть на роль механизмов естественной резистентности, лежащих в основе врожденного иммунитета (Ройт и др., 1995). На настоящий момент стало совершенно очевидно, что эффекторы естественной резистентности способны различать свои и потенциально опасные для организма чужеродные структуры (Luster, 2002). Доказано также, что система естественной резистентности выполняет инструктивную функцию, определяя в каком направлении будет развиваться приобретенный иммунитет (Fearon, Locksley, 1996).

Фагоцитоз занимает особое место среди факторов естественной резистентности. Явление фагоцитоза стало предметом изучения, а затем и методом исследования функции фагоцитирующих клеток, благодаря работам И.И. Мечникова (1883 - 1892).

Известно, что способностью к фагоцитозу обладают две популяции клеток: микрофаги (нейтрофилы) и макрофаги (моноциты крови и тканевые мононуклеары). Первыми на антигены, проникшие в организм или собственного организма, реагируют нейтрофильные лейкоциты, которые по определению И.И. Мечникова «являются наиболее деятельными клетками организма». Не менее важная роль в осуществлении фагоцитоза принадлежит моно-нуклеарной фагоцитарной системе, которая включает моноциты мозга и крови, свободные и фиксированные тканевые макрофаги (Фрейдлин, 1984; То-толян, Фрейдлин, 2000).

Расширение представлений о функциях фагоцитирующих клеток в последние годы было, в первую очередь, связано с разработкой учения о секреторной активности этих клеток (Тотолян, Фрейдлин, 2000; Долгушин, Бухарин, 2001). Известно, что в механизме активации иммунной системы определяющую роль играет усиление пролиферативной функции фагоцитов и им-мунокомпетентных клеток. За последние годы значительно расширились знания об иммунорегуляции моноцитов/макрофагов, лимфоцитов и нейтрофилов посредством продукции цитокинов, спектр и механизм действия которых значительно расширился (Кетлинский, Симбирцев, Воробьев, 1992; Кетлинский, Калинина, 1995; Симбирцев, 2004). Цитокины обеспечивают интеграцию функциональной активности фагоцитов, от которых в значительной степени зависит активация, пролиферация и дифференцировка иммуноком-петентных клеток.

Известно, что взаимодействие НИЛИ с клетками вызывает изменения их функциональной активности, нарушения в стационарном состоянии клеточного гомеостаза, усиление синтеза сигнальных и регуляторных молекул (Медуницин, Литвинов, Мороз, 1980; Кузник, Васильев, Цыбиков, 1989). В связи с этим изучение особенностей продукции цитокинов, с помощью которых осуществляются процессы авторегуляции функций воспалительных и иммунных процессов, представляет особый научный интерес. Наиболее важной группой цитокинов, принимающих участие в регуляции воспаления и фагоцитоза, являются провоспалительные цитокины, такие как ИЛ-1, ИЛ-6,

ФНО-а, ИЛ-8, ИФН-у и некоторых других, которые опосредуют общие гематологические сдвиги, характерные для неспецифического ответа макроорганизма на инфекцию (Ярилин, 1997; Хаитов, Игнатьева, Сидорович, 2000). Они играют центральную роль в развитии острой фазы воспаления, вызываемого проникновением инфекционного агента и повреждением тканей (Кетлинский, Калинина, 1995; Хаитов и др., 2000; Демьянов, Котов, Симбир-цев, 2003).

Фагоцитоз начинается с взаимодействия между клеткой-фагоцитом и микроорганизмом. Это взаимодействие происходит по типу рецептор - ли-ганд и инициирует процесс поглощения, активируя локомоторную функцию фагоцита. Взаимодействие микроорганизма с цитоплазматической мембраной фагоцитирующей клетки инициирует образование псевдоподий, которые, окружая микроорганизм, сливаются между собой, формируя фагосому. Дальнейшие киллинг и переваривание микроорганизмов происходят именно в фагосомах при условии, что последние успешно сливаются с лизосомами, образуя фаголизосому (Ройт и др., 2000). Имеющиеся в литературе научные данные свидетельствуют о том, что фагоциты обладают мощными системами кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга бактерий. Компоненты первой действуют неспецифично, разрушают грамположительные и гра-мотрицательные бактерии, вирусы и клетки организма-хозяина, включая сами фагоциты. Вторая система состоит из множества белков и пептидов, обладающих в разной степени выраженной антимикробной активностью по отношению к различным клеткам-мишеням. Неферментные катионные белки являются одним из мощных факторов неспецифической защиты организма, так как обладают сильным антибактериальным действием и выполняют функцию нейтрализации и умерщвления фагоцитированных бактерий (Тото-лян, Фрейдлин, 2000).

К другим белкам, обладающим антимикробным действием, относится фермент миелопероксидаза. Это железосодержащий фермент, который вместе с перекисью водорода и галоидами образует мощную миелопероксидаз-ную систему фагоцитов. Существует несколько концепций о системах регенерации перекиси водорода в покоящихся и фагоцитирующих нейтрофилах. Согласно одной из них, ведущей системой регенерации перекиси водорода является НАДФ-Нг-оксидазная система (Ройт и др., 2000).

Следует отметить также, что кроме антибактериального действия мие-лопероксидазная система обладает и антитоксической функцией. Таким образом, фагоциты имеют на вооружении «мощную миелопероксидазную систему с многогранным спектром действия». Исследованию состояния микро-боцидных систем уделяется в последние годы особое внимание, поскольку показана их важная роль в обеспечении фагоцитарной реакции, а также определенные возможности в диагностике и прогнозировании инфекционной и неинфекционной патологии (Коротяев, Бабичев, 2002).

В связи с вышеизложенным представляло интерес оценить характер воздействия НИЛИ, генерируемого полупроводниковыми лазерными приборами, на функционально-метаболическую активность фагоцитирующих клеток, а также оценить иммунобиологическую значимость изменений в процессе фагоцитоза.

В проведенных исследованиях было изучено влияние НИЛИ с различными параметрами и дозами на активность процесса фагоцитоза бактерий, цитокиновую и функционально-метаболическую активность перитонеальных макрофагов белых мышей и нейтрофилов периферической крови человека.

На первом этапе работы был осуществлен отбор наиболее оптимальных параметров и доз НИЛИ для использования в экспериментах по оценке функционально-метаболической активности фагоцитов. Анализ данных позволил остановиться на использовании красного (681 нм) и двух видов инфракрасного (817 и 850 нм) НИЛИ, генерируемых полупроводниковыми лазерными диодами в непрерывном режиме с различными дозами излучения. При выборе дозы излучения мы руководствовались методическими указаниями по применению НИЛИ в медицинской практике при проведении лазеротерапии. В связи с этим наш выбор остановился на варьировании дозы излучения от 20 до 1500 мДж/см2.

Далее было проведено изучение влияния НИЛИ с отобранными параметрами и дозами на активность процесса фагоцитоза бактерий клинического штамма S. aureus 100 б in vitro перитонеальными макрофагами белых мышей и нейтрофилами периферической крови человека.

Было показано, что действие небольших доз излучения (20 - 160 мДж/см ) существенных изменений в основных показателях фагоцитоза по сравнению с контрольными значениями не вызывает, при более высоких дол зах (320 - 1500 мДж/см ) было отмечено подавляющее действие данного вида излучения на активность процесса фагоцитоза. Кроме того, снижалась адгезивная активность макрофагов по сравнению с контролем. При действии дол зами 640, 1280 и 1500 мДж/см на макрофаги было выявлено состояние незавершенного фагоцитоза, что связано с активным внутриклеточным размножением бактерий внутри фагоцита. Такое состояние может быть вызвано подавлением бактерицидной активности фагоцитирующих клеток. При микроскопическом изучении препаратов было отмечено изменение морфологии макрофагов. Появлялись деформированные клетки с явными морфологическими признаками начинающегося апоптоза. Отмечены в клетках такие цитологические изменения, как уплотнение цитоплазмы, разрушение ядерного аппарата, нарушение целостности клеточной мембраны, разбухание клетки. При увеличении дозы излучения к 6 ч фагоцитоза до 70 % клеток были разрушены.

Возможно, это связано с прямым воздействием НИЛИ (681 нм) на работу ядерного аппарата клетки, поскольку известно, что для молекул ДНК характерен максимум спектральной чувствительности именно в данном диапазоне длин волн. Все приведенные факты явно свидетельствуют о негативном влиянии красного НИЛИ (681 нм) на фагоцитарную активность макрофагов.

Анализируя характер действия ИК НИЛИ с длиной волны 817 нм на активность процесса фагоцитоза можно сделать заключение об его стимулирующем действии на все стадии фагоцитарного процесса, а также на активность самих макрофагов. Однако это увеличение активности было незначительным и не всегда носило достоверный характер. При этом дозозависимого эффекта действия данного вида излучения отмечено не было. На фоне общего увеличения активности фагоцитов отмечена пролонгированность фагоцитарного процесса.

При изучении влияния ИК НИЛИ с длиной волны 850 нм на перитоне-альные макрофаги было установлено выраженное стимулирующее действие данного излучения на активность фагоцитоза на всех его стадиях, на завершенность этого процесса, а также на фагоцитарную активность самих фагоцитов. Показано, что данный вид излучения приводил к значительному усилению процессов адгезии бактериальных клеток на макрофагах. Установлено л также, что увеличение дозы излучения до 1500 мДж/см вызывало значительное повышение активности макрофагов на 1, 3 и 6 ч фагоцитоза. При этом был выявлен дозозависимый эффект данного воздействия, особенно через 1 и 3 ч фагоцитоза. Полученные значения ИЗФ свидетельствуют об увеличении числа фагоцитов, завершивших процесс фагоцитоза микроорганизмов по сравнению с контролем (при Р<0,05).

Детальная микроскопия полученных препаратов с фагоцитирующими макрофагами позволила установить, что инфракрасное излучение значительно усиливает стадию адгезии. Через 1 ч после облучения и начала фагоцитоза мы наблюдали так называемый эффект «облепленных бактериями макрофагов». В микропрепаратах явно было видно увеличение количества активно фагоцитирующих макрофагов по сравнению с контролем. Через 3 ч после лазерного воздействия в значительной степени усиливались процессы поглощения и киллинга бактерий. В подтверждение этого в мазках было обнаружено присутствие в достаточно большом количестве крупных, раздутых макрофагов с цитоплазмой, буквально «нафаршированной» бактериями. Однако в препаратах, приготовленных через 6 ч фагоцитоза, были отмечены разрушенные макрофаги. Это может свидетельствовать о том, что они завершили фагоцитоз и, истощив свой бактерицидный и метаболический потенциал, погибли. Такое поведение обычно не свойственно макрофагам, так как они относятся к группе долгоживущих клеток, способных многократно осуществлять свои эффекторные функции. Гибель после завершения киллинга и переваривания больше характерна нейтрофильным гранулоцитам крови, которые ведут себя как клетки-«камикадзе». Причиной разрушения макрофагов, вероятно, может быть то, что они безудержно растрачивают свой энергетический резерв за счет достаточно сильной биоактивации лазерным излучением.

При изучении влияния НИЛИ инфракрасной области спектра (850 нм) на фагоцитарную активность нейтрофилов было сделано заключение о дозо-зависимом стимулирующем характере воздействия данного излучения на фагоцитарную активность нейтрофилов через 1 и 3 ч процесса фагоцитоза, что совпадает периодом наиболее активного поглощения и киллинга бактерий.

Показатели ИЗФ при действии практически всех доз данного излучения на нейтрофилы статистически достоверно превышали контрольное значение, что свидетельствует о благоприятном влиянии на завершенность процесса фагоцитоза.

Таким образом, было показано, что ИК НИЛИ (850 нм) инфракрасного диапазона оказывает непосредственное стимулирующие влияние на процессы фагоцитоза бактерий нейтрофилами in vitro, что выражается в интенсификации адгезии, захвата и переваривания микроорганизмов.

При сравнительном анализе установлено, что ИК НИЛИ с длиной волны 850 нм приводило к дозозависимой активации фагоцитарных функций как макрофагов перитонеального экссудата белых мышей, так и нейтрофилов периферической крови человека. Это может свидетельствовать о едином механизме или механизмах фотоактивирующего действия данного вида излучения на оба типа клеток. По-видимому, эффект усиления фагоцитарной активности на фоне действия ИК НИЛИ связан с усилением функционально-метаболической активности этих клеток. Повышение показателей ИЗФ свидетельствует об эффективном киллинге бактерий, что можно объяснить активизацией «респираторного взрыва» - образованием продуктов частичного восстановления кислорода, свободных радикалов, перекисей и других продуктов, обладающих высокой антимикробной активностью.

Воздействие на макрофаги и нейтрофилы РЖ НИЛИ на фоне стимуляции фагоцитарной активности, вероятно, сопровождалось повышением их секреторной и функционально-метаболической активности, что приводило к более активному образованию бактерицидных субстанций (продуктов метаболизма кислорода и азота, ферментов). В связи с этим дальнейшие наши исследования были посвящены изучению влияния ИК НИЛИ на индукцию основных провоспалительных и регуляторных цитокинов макрофагами и нейтрофилами в процессе фагоцитоза бактерий, а также хемотактическую активность, показатели кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга бактерий и на метаболическое состояние фагоцитов.

На следующем этапе работы было изучено влияние НИЛИ различных параметров и доз на продукцию провоспалительных и регуляторных цитокинов нейтрофилами и макрофагами в процессе фагоцитоза бактериальных клеток Е. coli Са 53 или S. aureus 100 б. Было установлено влияние красного (681 нм) и ИК (817 нм) НИЛИ с различными дозами на динамику продукции перитонеальными макрофагами ИЛ-1 и ФНО-а в процессе фагоцитоза бактерий, а также влияние ИК НИЛИ с длиной волны 850 нм в трех различных дозах на динамику продукции ИЛ-1, ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-4 и ИЛ-8 перитонеальными макрофагами белых мышей и нейтрофилами периферической крови человека в условиях in vitro.

Определение уровня продукции провоспалительных и регуляторных цитокинов является необходимым условием при оценке влияния НИЛИ на фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов, так как позволяет оценить уровень их функциональной активности при фагоцитозе на фоне лазерного воздействия по сравнению с интактными клетками.

Обнаруженная динамика продукции различных цитокинов во время фагоцитоза бактериальных клеток макрофагами и нейтрофилами под влиянием НИЛИ позволяет сделать заключение о его модулирующем влиянии на цитокиновую активность фагоцитов. Для большинства изученных цитокинов это влияние носило стимулирующий характер. Причем в некоторых случаях был отмечен дозозавнсимый эффект действия НИЛИ на продукцию цитокинов.

Рассуждая о причинах изменения цитокиновой активности клеток под влиянием НИЛИ следует отметить, что снижение или увеличение синтеза цитокинов может быть следствием как прямого действия лазерного света, так и косвенного. В результате прямой активации продукции цитокинов возможны варианты, когда НИЛИ либо оказывает действие на экспрессию цитоки-новых генов (регуляторные или структурные гены, промоторы цитокинов), либо приводят к переходу неактивных форм цитокина (молекул-предшественников) в биологически активную форму. Вариантов косвенного влияния может быть достаточно много. Увеличение цитокиновой активности фагоцитов может быть следствием активации генетического аппарата клетки, белок-синтезирующей системы, ферментного комплекса. С другой стороны, показанное ранее повышение фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов под влиянием ИК НИЛИ может быть как причиной увеличения цитокиновой активности данных клеток, так и следствием этого процесса.

Наши результаты показали, что НИЛИ различных параметров (681,817 и 850 нм) оказывало стимулирующее влияние, главным образом, на синтез ИЛ-1. Продукция ФНО-а значительно увеличивалась при действии только ИК НИЛИ (817 и 850 нм), красное же излучение (681 нм) к достоверным изменениям синтеза данного цитокина не приводило. Следует отметить, что в наших экспериментах увеличение продукции ИЛ-1 как макрофагами, так и нейтрофилами под влиянием ИК НИЛИ (850 нм) значительно коррелировало с увеличением продукции ФНО-а. Этот факт может быть объяснен тем, что ФНО-а является сильным стимулирующим агентом для продукции ИЛ-1 (Хаитов и др., 2000). Так, повышение содержания ФНО-а в среде культивирования фагоцитов могло привести к увеличению продукции ИЛ-1.

Также показано, что ИК НИЛИ (850 нм) при действии всеми испытуемыми дозами на фагоцитирующих макрофагов и нейтрофилов приводило к значительному увеличению продукции ИФН-у как к 3, так и к 6 ч фагоцитоза.

При изучении образования ИЛ-4 под влиянием ИК НИЛИ (850 нм) в процессе фагоцитоза было установлено, что в среде культивирования пери-тонеальных макрофагов его содержание не изменялось. В культуральной среде с нейтрофилами крови человека отмечено небольшое его увеличение по сравнению с контролем.

Противоречивые данные были получены по синтезу ИЛ-8 макрофагами и нейтрофилами в процессе фагоцитоза бактерий при действии ИК НИЛИ (850 нм). Так, для перитонеальных макрофагов показано достоверное увеличение данного цитокина только через 3 ч фагоцитоза, к 6 же часам значения его продукции были на уровне контроля. С другой стороны в среде культивирования нейтрофилов крови человека через 3 ч фагоцитоза бактерий на фоне действия ИК НИЛИ (850 нм) содержание ИЛ-8 было достоверно выше л контроля только при облучении клеток дозой 1500 мДж/см , к 6 ч фагоцитоза концентрации данного цитокина достоверно уменьшались ниже контрольного значения при действии всех испытуемых доз излучения. Мы полагаем, что к 6 ч инкубации клеток происходит связывание ИЛ-8 с соответствующими рецепторами на поверхности нейтрофилов.

Следует отметить, что определение цитокиновой продукции является очень информативным показателем при оценке функциональной активности макрофагов и фагоцитов на фоне действия НИЛИ. Так, уровень секреторной активности этих клеток отражается на уровне их фагоцитарной активности, течении самого процесса фагоцитоза и его завершенности.

В связи с этим изучение и понимание процессов, связанных с цитокиновой активностью фагоцитирующих клеток должно лежать в основе грамотного применения НИЛИ с различными дозами в медицинской практике при использовании низкоинтенсивной лазерной терапии. Особенно это важно при лечении воспалительных и инфекционных заболеваний.

На заключительном этапе работы были проведены исследования функционально-метаболической активности фагоцитирующих клеток, под влиянием ИК НИЛИ с длиной волны 850 нм, заключающиеся в оценке локомоторной активности макрофагов и нейтрофилов, механизмов кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга бактерий фагоцитами и их метаболического состояния. Показано стимулирующее действие данного вида НИЛИ в испытуемом диапазоне доз облучения на функционально-метаболическое состояние неактивных и активированных бактериями фагоцитов.

При оценке локомоторной активности нейтрофилов установлено дозо-зависимое усиление хемотаксиса под влиянием ИК НИЛИ (850 нм), для макрофагов подобного эффекта показано не было. Увеличение хемотактической активности нейтрофилов можно связать с повышение секреторной активности данных клеток. В частности была показана индукция синтеза данным видом излучения одного из ключевых хемоаттрактантов для нейтрофилов - ин-терлейкина-8.

Далее было изучено влияние ИК НИЛИ (850 нм) на активность киллинга бактерий макрофагами и нейтрофилами в процессе фагоцитоза. Определяли в цитоплазме фагоцитов активность щелочной и кислой фосфатаз, содержание катионных белков в процессе фагоцитоза бактериальных клеток S. aureus.

Установлено, что при действии НИЛИ на макрофаги происходило достоверное увеличение активности кислой фосфатазы в различные сроки фагоцитарного процесса. В то же время, данное излучение приводило к активации КФ только в интактных нефагоцитирующих нейтрофилах, но не оказывало достоверного влияния на активность данного фермента при фагоцитозе бактерий.

Получены противоречивые данные о влиянии ИК НИЛИ на активность ЩФ как в макрофагах, так и в нейтрофилах. Различные дозы излучения приводили либо к увеличению, либо снижению активности данного фермента в фагоцитах. Это может быть связано с тем, что часть ЩФ регистрируется вместе с КФ, так как она обладает широким диапазоном рН активности (Шубич, Нестерова, 1980).

При определении катионных белков в цитоплазме фагоцитов установлены достоверные изменения в их содержании в зависимости от дозы излучения и этапа фагоцитоза. Показано, что облучение макрофагов ИК НИЛИ (850 нм) способствовало увеличению содержания КБ в цитоплазме неактивных клеток до начала фагоцитоза и через 6 ч фагоцитоза, к 1 и 3 ч процесса, напротив, отмечено увеличение количества данных белков. Обратная картина наблюдалась при облучении нейтрофилов при тех же условиях: в неактивных и фагоцитирующих клетках через 6 ч инкубации содержание КБ было меньше, чем в контроле, а через 1 и 3 ч фагоцитоза — выше. Вероятно, такие противоречивые данные связаны с неравноценным образованием и расходованием данного микробоцидного продукта у макрофагов и нейтрофилов. Известно, что КБ представляют собой гетерогенную группу различных соединений (бактонектины, индолицитин, калпротектин L-1 и другие), состав и содержание которых отличается у разных типов фагоцитирующих клеток (То-толян, Фрейдлин, 2000; Долгушин, Бухарин, 2001).

Для оценки кислородзависимого киллинга определяли активность миелопероксидазы и уровень образования АФК по показателям спонтанного и индуцированного НСТ-теста в макрофагах и нейтрофилах в процессе фагоцитоза in vitro бактериальных клеток. Показано, что при воздействии ИК НИЛИ (850 нм) происходило увеличение активности миелопероксидазы в фагоцитирующих макрофагах и нейтрофилах во все сроки фагоцитоза, однако на неактивные фагоциты достоверного влияния данное излучение не оказывало.

В наших исследованиях отмечено значительное увеличение образования АФК при «респираторном взрыве» как у макрофагов, так и нейтрофилов на фоне действия ИК НИЛИ (850 нм) по сравнению с контрольными значениями. Причем наиболее выраженное влияние данное излучение оказывало на показатели индуцированного НСТ-теста по сравнению с показателями спонтанного НСТ-теста. Следует отметить, что установленная закономерность носила дозозависимый характер.

Таким образом, достоверно установлено стимулирующие действие ИК НИЛИ (850 нм) на интенсивность «респираторного взрыва» и активацию миелопероксидазозависимого киллинга бактерий в макрофагах и нейтрофилах в процессе фагоцитоза.

Для оценки влияния НИЛИ на метаболическую активность макрофагов и нейтрофилов были проведены эксперименты по определению содержания гликогена и липидов в цитоплазме данных клеток в процессе фагоцитоза бактерий. Установлено снижение количества гликогена в цитоплазме макрофагов и нейтрофилов под влиянием ИК НИЛИ (850 нм), что свидетельствует об усилении катаболизма этих клеток. Полученные данные коррелируют с результатами, полученными при постановке НСТ-теста, поскольку известно, что при активации кислородзависимого метаболизма фагоцитов происходит активный расход гликогена, который используется в процессе гликолиза и в реакциях гексозомонофосфатного шунта (Долгушин, Бухарин, 2001). Липиды также являются дополнительным источником энергии в фагоцитирующих клетках. Установлено, что содержание жировых запасов в макрофагах практически не отличалось от контроля при действии ИК НИЛИ (850 нм) и лишь некоторые дозы излучения приводили к их снижению. Содержание липидов в нейтрофилах на фоне действия НИЛИ не отличалось в неактивных клетках, но увеличивалось через 1 и 3 ч фагоцитоза и достоверно снижалось к 6 ч по сравнению с контрольными значениями.

Полученные факты свидетельствуют об активации некоторых бактерицидных факторов кислоронезависимой системы, выраженном усилении ки-слородзависмого киллинга и о снижении энергетических резервов в макрофагах перитонеального экссудата белых мышей и нейтрофилах периферической крови человека. Следовательно, можно сделать заключение о стимулирующем характере действия ИК НИЛИ с длиной волны 850 нм на функционально-метаболическую активность данных клеток, что в свою очередь способствует более активному уничтожению и разрушению поглощенных бактерий и обеспечивает успешное завершение фагоцитоза.

Мы полагаем, что положительный эффект действия ИК НИЛИ обусловлен специфическим взаимодействием данного вида излучения с неким гипотетическим хромофором (или несколькими хромофорами), который непосредственно связан с ключевыми ферментами фагоцитирующих клеток. Активация этих ферментов, в свою очередь, приводит к повышению общего метаболического состояния, что проявляется в усиление фагоцитарной, адгезивной, цитокиновой и киллинговой активности этих клеток.

Важно, что интенсификация всех перечисленных процессов в комплексе положительно сказывается на эффективности протекания острой воспалительной реакции в организме локально в месте внедрения инфекционного агента. Это находит свое отражение в эффективности использования ИК НИЛИ при лечении и профилактике острых и хронических инфекционных заболеваний.

В результате проведенных исследований были отобраны наиболее информативные показатели эффективности действия НИЛИ на фагоциты: индекс завершенности фагоцитоза, содержание провоспалительных цитокинов - ИЛ-1, ФНО-а и ИФН-у, уровень активных форм кислорода в индуцированном НСТ-тесте и активность миелопероксидазы. Комплекс этих показателей позволяет судить о характере и иммунобиологической значимости изменений в фагоцитирующих клетках и может быть использован для оценки эффективности действия НИЛИ при лазеротерапии инфекционных заболеваний.

Данные, полученные при оценке хемотаксиса фагоцитов, активности щелочной фосфатазы и содержания липидов оказались не показательными и зачастую носили противоречивый характер.

Таким образом, на субклеточном и клеточном уровнях проведены исследования функционально-метаболической активности фагоцитирующих клеток на фоне действия НИЛИ. Однако это не означает, что обнаруженные эффекты фотоактивации фагоцитов не приводят к изменениям на других уровнях организации биосисистемы: тканевом, системном и организменном. Очевидно, что активация лазерным светом фагоцитов, помимо того, что приводит к более эффективному фагоцитозу, она повышает секреторную активность данных клеток. Это подтверждается в усилении продукции основных провоспалительных цитокинов, которые обладают рядом системных эффектов, таких как усиление воспалительной реакции, ангиогенеза, гиперимии, микроциркуляции сосудов, улучшение кровоснабжения тканей и снижение гипоксии, повышение прокоагулянтной активности, проницаемости капилляров и активации других клеток. Кроме того, усиливается образование других биологически активных веществ - медиаторов воспаления, белков острой фазы, компонентов комплемента. Усиление эффекторных функций фагоцитирующих клеток и успешный киллинг поглощенных бактерий способствуют более активному формированию адаптивного иммунитета.

В связи с этим, полученные результаты обосновывают перспективы для дальнейшего изучения биологической эффективности низкоинтенсивного лазерного излучения на уровне всего организма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рудик, Дмитрий Владимирович, Саратов

1. Абрамов, М.В. Низкоинтенсивная лазерная терапия воспалительных заболеваний переднего отдела глаза / М.В. Абрамов // Клиническая офтальмология. 2002. - Т. 3, № 1. - С. 18 - 21.

2. Авруцкий, М.Я. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на основные биологические процессы и гомеостаз больных / М.Я. Авруцкий, Д.Г. Катковский, Л.В. Мусихин, Т.Ю. Гусейнов // Анестезиология и реа-ниматоогия. 1991. - № 5. - С. 74 - 79.

3. Активность натуральных киллеров в мышиной селезенке при действии низкоинтенсивного лазерного излучения в норме и в течение опухолевого роста / Д.А.Черенков и др. // Биофизика. 2005. - Т. 50, № 1. -С. 107-112.

4. Арнхольд, Ю. Свойства, функции и секреция миелопероксидазы человека / Ю. Арнхольд // Биохимия. 2004. - Т. 69, №1. - С. 8 - 15.

5. Артемьев, В.Е. Влияние лазерного облучения крови на состояние фетоп-лацентарной системы у беременных с инфекционно-воспалительными заболеваниями / В.Е. Артемьев, Л.А. Ецко // Российс. вестн. перинатоло-гии и педиатрии. 1997. - № 2. - С. 64 - 66.

6. Арутюнян, А.В. Методы оценки свободнорадикального окисления и ан-тиоксидантной системы организма: Методические рекомендации / А.В. Арутюнян, Е.Е. Дубинина, Н.Н. Зыбина. СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000. -78 с.

7. Афифи, А. Статистический анализ. Подход с использованием ЭВМ / А. Афифи, С. Эйзен. М.: Мир, 1982. - 488 с.

8. Ашмарин, И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов / И.П. Ашмарин, Н.Н. Васильев, В.А. Амбросов. -Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1974. — 76 с.

9. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. Л.: Гос. изд-во мед. лит-ры, 1962.-180 с.

10. Бадалов, Р.К. Применение лазеротерапии в комплексном лечении туберкулеза легких у детей подростков / Р.К. Бадалов // Проблемы туберкулеза.- 1990.-№ 2.-С. 41 -43.

11. Байбеков, И.М. Морфологические аспекты лазерного воздействия / И.М. Байбеков, Ф.Г. Назыров. Ташкент: Изд-во им. Ибн-Сины, 1996. -208 с.

12. Байбеков, И.М. Морфологические основы низкоинтенсивной лазеротерапии / И.М. Байбеков, А.Х. Касымов, В.И. Козлов. Ташкент: Изд-во им. Ибн-Сины, 1991.-223 с.

13. Бакуев, М.М. Особенности секреции миелопероксидазы и хемилюми-несцентного ответа нейтрофилов человека при контакте со стимуляторами различной природы / М.М. Бакуев, М.З. Саидов // Иммунология. -1991.-Вып. 1.-С. 15-18.

14. Березовский, В.А. Биофизические характеристики тканей человека: Справочник / В.А. Березовский, Н.Н. Колотилов. Киев: Наукова думка, 1990.-235 с.

15. Берстон, М. Гистохимия ферментов / М. Берстон. М.: Мир, 1965. -215 с.

16. Боголюбов, В.М. Общая физиотерапия: Учебник / В.М. Боголюбов, Г.Н. Пономаренко. М.: Медицина, 2003. - 432 с.

17. Брилль, Г.Е. Гуанилатциклаза и NO-синтаза возможные первичные акцепторы энергии низкоинтенсивного лазерного излучения / Г.Е. Брилль, А.Г. Брилль // Лазерная медицина. - 1997. - Т. 1, № 1. - С. 39 - 42.

18. Брилль, Г.Е. Итоги 10-летних исследований влияния излучения гелий-неонового лазера на геном клетки / Г.Е. Брилль, Н.П. Панина // Применение лазеров в медицине и биологии: матер. XIV Межд. науч.-практич. конф. Харьков, 2000. - С. 6.

19. Брилль, Г.Е. Механизмы терапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения / Г.Е. Брилль, Л.В. Гаспарян // IV съезд фотобиологов России: сб. тезисов. Саратов, 2005. - С. 14.

20. Брискин, Б.С. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на метаболические и репаративные процессы в организме / Б.С. Брискин, А.К. Полонский, И.М. Алиев // Клин, медицина. 1996. — № 1. - С. 54 - 55.

21. Бугаева, И.О. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на кинетику клеточных популяций брызжеечных лимфатических узлов: авто-реф. дис. канд. мед. наук / И.О. Бугаева. Саратов, 1996. - 24 с.

22. Буйкис. И.М. Гистохимическое определение активности щелочной фос-фатазы методом одновременного азосочетания / И.М. Буйкис, Ю.Ф. Рубенс // Вопросы лейкозологии. Рига. - 1969. - № 1. - С. 369 - 376.

23. Буйлин, В.А. Низкоинтенсивная лазерная терапия с применением матричных импульсных лазеров / В.А. Буйлин. М.: ТОО Фирма «Техника», 1996. - 118 с.

24. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий / О.В. Бухарин. М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 1999.-356 с.

25. Владимиров, Ю.А. Три гипотезы о механизме действия лазерного облучения на клетки и организм человека. В кн.: Эфферентная медицина / Ю.А. Владимиров. М.: ИБМХ РАМН, 1994 - С. 51 - 67.

26. Влияние лазерного излучения на фагоцитарную активность лейкоцитов / Е. Мештер и др. // Докл. АН БССР. 1979. - Т. 23, № 8. - С. 749 - 752.

27. Влияние липофильных антиоксидантов на фотосенсибилизированную производными гематопорфирина пероксидацию липосомальных мембран при облучении гелий-неоновым лазером / Г.И. Клебанов и др. // Биол. мембраны. 1996. - Т. 13, № 2. - С. 133 - 137.

28. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на функциональный потенциал лейкоцитов / Г.И. Клебанов и др. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1997. - Т. 123, № 4. - С. 395 - 398.

29. Влияние эндогенных фотосенсибилизаторов на лазер-индуцированный прайминг лейкоцитов крови / Г.И. Клебанов и др. // Биол. мембраны. -1998. Т. 15, № 3. - С. 273 - 285.

30. Воздействие низкоинтенсивного красного света на показатели иммунной системы периферической крови при ряде патологических состояний / Н.Р. Гладкова и др. // Действие низкоэнергетического лазерного излучения на кровь. Киев, 1989. - С. 74 — 75.

31. Галактионов, В.Г. Иммунология: Учеб. для студ. вузов / В.Г. Галактионов. -М: Издательский центр «Академия», 2004. 528 с.

32. Гамалея, Н.Ф. Лазеры в эксперименте и клинике / Н.Ф. Гамалея. М.: Медицина, 1972.-276 с.

33. Гаспарян, Л.В. Низкоинтенсивное лазерное излучение красного диапазона стимулирует ангиогенез in vitro / Л.В. Гаспарян, Г.Е. Брилль // IV съезд фотобиологов России: сб. тезисов. Саратов, 2005. — С. 27 - 30.

34. Герасимов, И.Г. Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека: генерация активных форм кислорода / И.Г. Герасимов, Д.Ю. Игнатов // Цитология. 2001. - № 43 (5). - С. 432 - 436.

35. Глейм, Г.К. Изменение коагуляционных и реологических свойств крови после лазерного облучения in vitro / Г.К. Глейм // Применение прямого лазерного облучения в экспериментальной клининической кардиохирургии. Новосибирк, 1981. - С. 63 - 70.

36. Гордиенко, С.М. Сравнительная оценка результатов восстановления нитросинего тетразолия при микроскопическом и спектрофотометриче-ском вариантах метода с различными солями тетразолия / С.М. Гордиенко // Лабораторное дело. 1983. - № 2. - С. 21 - 24.

37. ГОСТ Р 50723-94: Лазерная безопасность. Общие требования безопасности при разработке и эксплуатации лазерных изделий. М.: Издательство стандартов, 1995. - 34 с.

38. Грибковский, В.П. Полупроводниковые лазеры / В.П. Грибковский. М.: Университетское, 1988.-304 с.

39. Гримблатов, В.М. Современная аппаратура и проблемы низкоинтенсивной лазерной терапии / В.М. Гримблатов // Применение лазеров в биологии и медицине. Киев, 1996. - С. 123 - 127.

40. Демьянов, А.В. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике / А.В. Демьянов, АЛО. Котов, А.С. Сим-бирцев // Цитокины и воспаление. 2003. - № 3. - С. 13-24.

41. Денисов, И.М. Применение низкоинтенсивных лазеров в медицине / И.М. Денисов. М.: МЛЦ «Даксима», 2001. - 167 с.

42. Джалилов, К.Д. Низкоинтенсивное гелий-неоновое лазерное излучение при лечении острого бруцеллеза / К.Д. Джалилов // Мед. журнал Узбекистана. 1994. - № 2. - С. 47 - 49.

43. Долгушин, И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И. Долгушин, О.В. Бухарин. Екатеринбург: УрО РАН, 2001. - 284 с.

44. Доршел, К. Лазерное излучение / К. Доршел // В кн.: Прикладная лазерная медицина: учебное и справочное пособие. Под ред. Х.П. Берлиена,к*

45. Г.И. Мюллера. Перевод с нем. под ред. Н.И. Коротеева, О.С. Медведева. М.: Центр лазерной и медицинской технологии, 1997. - 273 с.

46. Дуденко, Г.И. Влияние лазеротерапии на реологические свойства крови при лечении острых тромбофлебитов и трофических язв / Г.И. Дуденко,

47. B.И. Залюбовский // Немедикаментозные методы лечения в клинической медицине. 1982. - С. 75 - 76.

48. Жуков, Б.Н. Лазерное излучение в экспериментальной и клинической ангиологии / Б.Н. Жуков, Н.А. Лысов. Самара: Самарский дом печати, 1996.-168 с.

49. Закревский, Г.И. Лазеротерапия при гнойно-воспалительных заболеваниях у детей / Г.И. Закревский, Н.М. Василевич // Клин, хирургия. -1980.-№6.-С. 61-62.

50. C.А. Скопинов, В.М. Чудновский. М.: МЗ СССР, 1989. - С. 81 - 82. (в)

51. Зверева, К.В. Отрицательные эффекты низкоинтенсивной лазерной терапии при ревматоидном артрите / К.В. Зверева, Е.А. Грунина // Тер. архив. 1996. - № 5. - С. 22 - 24.

52. Земцев, И.З. Механизмы очищения поверхности биомембран от токсических веществ при лазерном облучении крови и других биотканей / И.З. Земцев, В.П. Лапшин // Новые направления лазерной медицины: матер. между нар. конф. -М., 1996. С. 323 - 325.

53. Идрисова, Р.С. Ближайшие результаты действия лазерной терапии при заболеваниях детей вирусным гепатитом / Р.С. Идрисова // Проблемы биоэнергетики организма и стимуляция лазерного излучения. Алма-Ата, 1976.-С. 77-78.

54. Изменение спектра поглощения монослоя живых клеток после низкоинтенсивного лазерного облучения / Т.И. Кару и др. // Докл. АН. 1998. -Т. 360,№2.-С. 267-270.

55. Илларионов, В.Е. Концептуальные основы физиотерапии в реабилитоло-гии (новая парадигма физиотерапии) / В.Е. Илларионов. М.: ВЦМК «Защита», 1998. - 96 с.

56. Илларионов, В.Е. Основы лазерной терапии / В.Е. Илларионов. М.: Респект, 1992.-122 с.

57. Илларионов, В.Е. Техника и методики процедур лазерной терапии: Справочник / В.Е. Илларионов. М.: 1994. - 180 с.

58. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т. Hro, G. Lenhoff. Пер. с англ. -М.: Мир, 1990.-444 с.

59. К вопросу о механизме лечебного действия низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения / Г.И. Клебанов и др. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2001. - Т. 131, № з. с. 321 - 349.

60. Каплан, М.А. Лазерная терапия механизмы действия и возможности / М.А. Каплан // Лазер и здоровье: материалы 1-го междунар. конгресса. -М.: Фирма «Техника», 1997. - С. 88 - 92.

61. Каримов, М.Г. Лечебное действие монохролматического красного света при дегенеративно-дистрофических заболеваниях позвоночника / М.Г. Каримов, И.И. Камалов // Лазер в травматологии и ортопедии. Л., 1979.-С. 919.

62. Кару, Т.Й. Цитохром-С-оксидаза как первичный фотоакцептор при лазерном воздействии света видимого и ближнего ИК-диапазона на культуру клеток / Т.Й. Кару, Н.И. Афанасьева // Докл. АН. 1995. - Вып. 342.-С. 693-695.

63. Кетлинский, С.А. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакций воспаления и иммунитета / С.А. Кетлинский, Н.М. Калинина // Иммунология. 1995. - № 3. - С. 30 - 44.

64. Кетлинский, С.А. Эндогенные иммуномодуляторы // С.А. Кетлинский,

65. A.С. Симбирцев, А.А. Воробьев. СПб.: Гиппократ, 1992. - С. 255.

66. Кибисов, Р.К. К механизму лазерной терапии / Р.К. Кибисов // Тезисы межд. конф. «Laesr Health'97>>. М.: Фирма «Техника», 1997. - С. 8.

67. Клебанов, Г.И. Клеточные механизмы прайминга и активации фагоцитов / Г.И. Клебанов, Ю.А. Владимиров // Успехи современной биологии. -1999. Т. 119, № 5. - С. 462 - 475.

68. Клебанов, Г.И. Низкоинтенсивное лазерное облучение вызывает priming лейкоцитов / Г.И. Клебанов // Использование лазеров для диагностики и лечения заболеваний. М.: Изд-во ЛАС, 1996. - С. 11-14.

69. Клебанов, Г.И. Первичные и вторичные молекулярно-клеточные механизмы квантовой терапии / Г.И. Клебанов // Проблемы физической биомедицины: межрег. сб. науч. работ. Саратов: Изд-во Сарат. мед. ун-та, 2003.-С. 42-53.

70. Клодченко, Н.Н. Влияние излучения гелий-неонового лазера на свертывающую систему крови больных острой пневмонией / Н.Н. Клодченко // Действие низкоэнергетического лазерного излучения на кровь. Киев, 1989. - С. 100-101.

71. Козель, А.И. Механизмы действия лазерного облучения на тканевом и клеточном уровнях / А.И. Козель, Г.К. Попов // Вестник РАМН. 2000. -№3.-С. 41-43.

72. Козлов, В.И. Взаимодействие лазерного излучения с биотканями /

73. B.И. Козлов // Применение низкоинтенсивных лазеров в клинической медицине. М., 1997. - С. 24 - 34.

74. Козлов, В.И. Лазеротерапия / В.И. Козлов, В.А. Буйлин. М.: Медицина, 1993.-149 с.

75. Козлов, В.И. Лазеротерапия с применением АЛТ «Мустанг». В кн.: Лазеротерапия в помощь практическому врачу / В.И. Козлов, В.А. Буйлин. -М.: Аспект-пресс, 1995. 142 с.

76. Комплексное исследование фагоцитарного звена иммунитета при первичных иммунодефицитных состояниях / М.З. Саидов и др. // Журнал микроб., эпидем. и иммунол. 1991. -№ 5. - С. 44-47.

77. Кончугова, Т.В. Иммуномодулирующие эффекты низкоинтенсивного лазерного излучения / Т.В. Кончугова, С.Б. Першин, А.А. Миненков // Вопросы курортной физиотерапии и лечебной физической культуры. М., 1997.-№ 1.-С. 42-45.

78. Коротяев, А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед. вызов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. СПб.: СпецЛит, 2002.-591 с.

79. Красновский, А.А. Первичные механизмы фотодинамического действия: развитие представлений и современное состояние исследований / А.А. Красновский // IV съезд фотобиологов России: сб. тезисов. Саратов, 2005.-С. 94-96.

80. Красный свет гелий-неонового лазера реактивирует супероксиддисмута-зу / Е.А. Горбатенкова и др. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1989. - Т. 57, №3.-С. 302-305.

81. Крейман, М.З. Низкочастотная лазеротерапия / М.З. Крейман, И.Ф. Удалый. Томск: Изд-во Томского ун-та, 1992. - 297 с.

82. Кузник, Б.И. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма / Б.И. Кузник, Н.В. Васильев, Н.Н. Цыбиков. М.: Медицина, 1989.-280 с.

83. Кузьмина, В.Е. Динамика форменных элементов белой крови при действии лазерного излучения / В.Е. Кузьмина, Д.А. Варижников // Биологическое действие лазерного излучения: межвуз. сб. Куйбышев, 1984. -С. 51-60.

84. Купин, В.И. Влияние лазера на систему иммунитета / В.И. Купин // Сов. медицина. 1985. - № 7. - С. 8 - 12.

85. Лабораторные методы оценки иммунопатологических процессов и метаболизма гормонов надпочечников: справочник / Ю.Ю. Елисеев и др.. -Саратов: Изд-во Сарат. мед. ун-та, 2004. 60 с.

86. Лазерная биостимуляция как самоорганизующийся неравновесный процесс / А.Н. Малов и др. // Проблемы лазерной медицины: тезисы IV межд. конгресса. Москва-Видное, 1997. - С. 278 - 279.

87. Лазеры в клинической медицине: Руководство / Под ред. С.Д. Плетнева.- М.: Медицина, 1996. 432 с.

88. Лаптева, P.M. Системная реакция компонентов иммунитета на низкоинтенсивное лазерное излучение / P.M. Лаптева, С.А. Баишева, Т.С. Фря-зинова // Новое в лазерной медицине и хирургии: сб. науч. тр. — М., 1990. -Ч. 2.-С. 51-52.

89. Ларюшин, А.И. Низкоинтенсивные лазеры в медико-биологической практике / А.И. Ларюшин, В.Е. Илларионов. Казань: Абак, 1997.- 276 с.

90. Лецкий, В.Б. Цитохимические исследования лейкоцитов: Метод, рекомендации / В.Б. Лецкий. Л.: МЗ СССР, 1970. - 20 с.

91. Лисиенко, В.М. Альтерация биологических жидкостей при лазеротерапии у хирургических больных / В.М. Лисиенко, Г.И. Минц, С.А. Скопи-нов // Применение лазеров в хирургии и медицине: тез. докл. межд. симп. М.: МЗ СССР, 1989. - С. 529 - 530.

92. Мазинг, Ю.А. Оценка надежности лизосомально-катионного теста для лабораторной диагностики / Ю.А. Мазинг, И.Я. Старосельская // Лабораторное дело, 1981.-№ 10.-С. 582-584.

93. Мазуров, Д.В. Оценка внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитометрии / Д.В. Мазуров, С.В. Дамбаева, Б.В. Пинегин // Иммунология. 2000. - № 2. -С. 57-59.

94. Мамонтова, Л.И. Лазерная терапия крови / Л.И. Мамонтова // Калужский лазер. -1996. -№ 11 (32).-С.3.

95. Ю4.Маслова, М.Г. Низкоэнергетическое лазерное излучение в эксперименте и клинике / М.Г. Маслова, В.М. Черток. Владивосток, 1991. - 199 с.

96. Маянский, А.Н. Клинические аспекты фагоцитоза / А.Н. Маянский, О.И. Пикуза. Казань: Магариф, 1993. - 122 с.

97. Маянский, А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский. Новосибирск: Наука, 1989. - 254 с.

98. Маянский, А.Н. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетразолия: метод.рекомендации / А.Н. Маянский, М.К. Виксман. Казань: Изд-во Казан, мед. ун-та, 1979. - 11 с.

99. Медведев, А.Н. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза /

100. A.Н. Медведев, В.В. Чаленко // Лабораторное дело. 1991. - № 2. -С. 19-20.

101. Медицинская микробиология: учеб. пособие / Под ред. A.M. Королюка и

102. B.Б. Сбойчакова. СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2002. - 267 с.

103. Медуницин, Н.В. Медиаторы межклеточного иммунитета и клеточного взаимодействия / Н.В. Медуницин, В.Н. Литвинов, A.M. Мороз. М., 1980.-С. 57-63.

104. Методические рекомендации при лазеротерапии / С.Н. Головин и др.. -(http://www.psoriasis.cc/laser/index251 .html).

105. Методы изучения и механизм действия лазерного излучения на эритроциты с участием молекулярного кислорода. В кн.: Методы лазерной биофизики и их применение в биологии и медицине / С.Д. Захаров и др.. Тарту, 1989. - С. 59 - 92. (б)

106. М.Миненков, А.А. Применение гелий-неоновых лазеров в реабилитации больных / А.А. Миненков, Т.В. Крычугова, Д.Б. Кульчицкая // Вопросы курортологии. 1992. - С. 11 - 14.

107. Минц, Р.И. Действие электоромагнитного излучения на биологические объекты и лазерная медицина / Р.И. Минц, С.А. Скопинов. Владивосток, 1989.-102 с.

108. Москвин, С.В. Низкоинтенсивная лазерная терапия / С.В. Москвин, В.А. Буйлин //- М.: ТОО Фирма «Техника», 2000. 142 с.

109. Мусабаев, Э.И. Терапевтическая эффективность внутрисосудистого лазерного облучения крови у больных вирусным гепатитом В / Э.И. Мусабаев, А.А. Спицина // Актуальные вопросы острых кишечных инфекций. Ташкент, 1993. - С. 93 - 94.

110. Назарова, Д.Р. Изучение содержания гликогена в лейкоцитах крови в процессе фагоцитоза у больных острой дизентерией / Д.Р. Назарова, Б.В. Вапидов//Лабораторное дело. 1980.-№ 4. - С. 210-212.

111. Назиров, Ф.Г. Чрескожное лазерное облучение крови в комплексной терапии осложненных форм цирроза печени / Ф.Г. Назиров, М.Х. Вакка-сов, И.М. Байбеков // Мед. журн. Узбекистана. 1994. - № 4. -С. 20-22.

112. Щ 122. Некоторые показатели иммунологического статуса больных с нагноительными заболеваниями легких и плевры на фоне лазеротерапии / Э.С. Исламбеков и др. // Мед. журн. Узбекистана. 1994. - № 3. -С. 40-42.

113. Непомнящих, Г.И. Влияние некогерентного лазерного света на пролифе-ративную и метаболическую активность эпителия гастродуоденальной системы / Г.И. Непомнящих, Г.А. Лажей, Л.М. Непомнящих // Бюлл.эксп. биол. и мед. 1994.-№ 5 - С. 187-198.

114. Ньюсхолм, Э. Регуляция метаболизма / Э. Ньюсхолм, К. Старт. М.: Мир, 1977.-407 с.

115. Обросов, А.Н. О теориях рефлекторного механизма действия физиче-^ ских факторов и функциональных систем организма / А.Н. Обросов //

116. Вопросы курортологии. 1985. -№ 3. - С. 46-48.

117. Ойвин, В.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований / В.А. Ойвин // Журнал патологической физиологии и экспериментальной терапии. 1960. - № 4. - С. 84-95.

118. Основы лазерной физио- и рефлексотерапии / В.И, Козлов и др.. Са-£ мара - Киев: Здоров'я, 1993. - 341 с.

119. Оценка вирулентности штаммов чумного микроба по индексу завершенности фагоцитоза / Г.И. Васильева и др. // Журн. микроб., эпидем. и иммунол. — 1987. — N2 6. — С. 117-118.

120. Пагава, К.И. Функциональные сдвиги, обусловленные воздействием низкоинтенсивного лазерного излучения на организм ребенка / К.И. Пагава // Педиатрия. 1989. - № 7. - С. 109 - 110.

121. Панков, О.П. Низкоинтенсивная лазерная терапия / О.П. Панков. М., 2000.-С. 647-648.

122. Паркер, Ч.В. Нейтрофилы. В кн.: Иммунология: в 3-х тт. / Ч.В. Паркер. -М.: Мир, 1989.-Т. 3.-179 с.

123. Пасынков, Е.И. Физиотерапия / Е.И. Пасынков. М.: Медицина, 1975. -151 с.

124. Попов, В.Д. Современные аспекты квантовой теории в клинической медицине / В.Д. Попов. Киев, 1996. - 133 с.

125. Практикум по иммунологии: учеб. пособие / Под ред. И.А. Кондратьевой, В.Д. Самуилова. М.: Изд-во МГУ, 2001. - 224 с.

126. Прикладная лазерная медицина: учебное и справочное пособие / Под ред. Х.-П. Берлиена, Г.Й. Мюллера: Пер. с нем. под ред. Н.И. Коротеева, О.С. Медведева. -М.: АО «Интерэксперт», 1997. 356 с.

127. Применение лазеров в медицине и биологии / Б.Н. Жуков и др.. -Харьков, 1999. С. 22 - 23.

128. Применение низкоинтенсивных лазеров в клинической практике / Под. ред. O.K. Скобелкина. М.: 1997. - 302 с.

129. Ройт, А. Иммунология: Пер. с англ. / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. -М.: Мир, 2000. 592 с.

130. Роскин, Г.И. Микроскопическая техника / Г.И. Роскин, Л.Б. Левинсон. -М., 1967.-257 с.

131. Рубин, А.Б. Биофизика/ А.Б. Рубин. -М.: Высшая школа, 1987.-303 с.

132. НЗ.Саидов, М.З. Спектрофотометрический способ определения активности миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках / М.З. Саидов, Б.В. Пине-гин // Лабораторное дело. 1991. - № 3. - С. 56 - 60.

133. Санитарные нормы и правила устройства и эксплуатации лазеров №5804-91.

134. Сепиашвили, Р.И. Открытие фагоцитоза и обоснование фагоцитарной теории в историко-научном освещении / Р.И. Сепиашвили, М.Г. Шубич, И.В. Дорофеева // Аллергология и иммунология. — 2003. Т. 4, № 3. -С. 10-14.

135. Мб.Симбирцев, А.С. Цитокины: классификация и биологические функции / А.С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. 2004. - Т. 3, № 2. -С. 16-22.

136. Справочник по лазерам / Под ред. A.M. Прохорова. М., 1978. - 344 с.

137. Справочник по лазерной технике / Под ред. А.В. Петрова. М.: Энерго-атомиздат, 1991. - 544 с.

138. Стресс-модулирующие эффекты лазеротерапии у больных ишемической болезнью сердца / О.Л. Барбараш и др. // Тер. архив. 1996. - № 12. -С. 50-53.

139. Стригина, Л.П. Действие лазерного облучения на процессы регенерации костной ткани / Л.П. Стригина // Здравоохранение Казахстана: сб. научн. работ.- 1988.-№ 1.-С. 48-50.

140. Структурные и функциональные аспекты прямого взаимодействия бактерий с фагоцитами / А.Н. Маянский и др. // Журн. микроб., эпидем. и иммунол. 1986. - № 4. - С. 90 - 96.

141. Суворов, Н.В. Адаптивное регулирование клеточной активности в ходе эксперимента с обратной связью / Н.В. Суворов, В.В. Трубачев // Биологическая и медицинская электроника: матер. 4-ой всесоюзной конференции. Свердловск, 1972. - Ч. 2. - С. 18 - 19.

142. Суслов, A.JI. Роль мононуклеарных фагоцитов в деструкции клеток опухолей / A.JI. Суслов // Итоги науки и техники. Сер. Онкология. ВИНИТИ.- 1984.-Т. 13.-С. 142-210.

143. Сюч, Н.И. Сравнительная оценка использования бактериальных и ла-тексных объектов фагоцитоза для изучения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови / Н.И. Сюч, В.Б. Бейлина // Журн. микроб., эпидем. и иммунол. 1995. -№ 6. - С. 70 - 71.

144. Терапевтическая эффективность низкоинтенсивного лазерного излучения / А.С. Крюк и др.. Минск: Наука и техника, 1986. - 231 с.

145. Титов, Л.П. Влияние лазерного излучения на состояние иммунитета / Л.П. Титов, Г.Д. Харитоник. // Использование лазерного излучения в лечебных целях: сб. науч. тр. Душанбе, 1984. - С. 29 - 30.

146. Тихомирова, Е.И. Эколого-иммунологические аспекты резистентности при инфекции и иммунизации: дис. . докт. биол. наук / Е.И. Тихомирова. Саратов, 2005. - 375 с.

147. Тотолян, А.А. Клетки иммунной системы / А.А. Тотолян, И.С. Фрейд-лин. СПб.: Наука, 2000. - 231 с.

148. Трапезников, Н.Н. Потенцирующее действие лазерного излучения на показатели клеточного и гуморального иммунитета / Н.Н. Трапезников,

149. B.И. Купин, З.С. Кадагидзе // Вопросы онкологии. 1985. - Т. 31, № 6.1. C. 115-116.

150. Тучин, В.В. Лазеры и волокнистая оптика в биомедицинских исследованиях. Саратов: Изд. Сарат. ун-та, 1998. - 384 с.

151. Урбах, В.Ю. Статистический анализ в биологических исследованиях / В.Ю. Урбах. -М.: Медицина, 1975.-259 с.

152. Утц, И.А. Чрескожная лазерная биостимуляция крови. Новые возможности патогенетической терапии хронического громелуронефрита у детей / И.А. Утц // Педиатрия. 1996. - № 2. - С. 59 - 62.

153. Утц, С.Р. Низкоинтенсивная лазеротерапия в дерматологии / С.Р. Утц, В.А. Волнухин. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1998. - 92 с.

154. Федоров, Б.Ф. Лазеры. Основы устройства и применение / Б.Ф. Федоров. -М.: ДОСААФ, 1988. 190 с.

155. Физико-химические механизмы биологического действия лазерного излучения / Н.Д. Девятков и др. // Успехи современной биологии. 1987. -Т. 103,№ 1. -С. 31 -43.

156. Фотогенерация синглетного молекулярного кислорода компонентами производного гематопорфирина / С.Ю. Егоров и др. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1999. -Т. 108, № Ю. - С. 23 -36.

157. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей основных локализаций с препаратами фотогем и фотосенс (результаты трёхлетних наблюдений) / В.В. Соколов и др. // Вопросы онкологии. 1995. - Т. 41, № 1.-С. 134-138.

158. Фотореактивация церулоплазмина как один из механизмов действия гелий-неонового лазера на кровь. В кн.: Лазеры и медицина / М.С. Жуман-кулов и др.. М., 1989. - С. 73 - 74.

159. Фрейдлин, И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека: учеб. пособие / И.С. Фрейдлин. Л.: Наука, 1986.-37 с.

160. Фрейдлин, И.С. Система мононуклеарных фагоцитов / И.С. Фрейдлин. -М.: Медицина, 1984. 272 с.

161. Хаитов, P.M. Взаимодействие клеток иммунной системы: физиологические и медицинские аспекты иммунитета / Хаитов P.M. // Аллергия и клиническая иммунология. 1999. - № 1. - С. 6 - 20.

162. Хаитов, P.M. Иммунология / P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидоро-вич. М.: Медицина, 2000. - 432 с.

163. Хаитов, P.M. Некоторые избранные проблемы функциональной активности макрофагов / P.M. Хаитов, В.М. Земсков // Журнал микробиологии. -1995. -№3.- С. 27 -32.

164. Хаитов, P.M. Основные задачи клинической иммунологии по изучению функциональной активности фагоцитирующих клеток / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. 1995. - № 3. - С. 6 - 10.

165. Хаитов, P.M. Современные подходы к оценке основных этапов фагоцитарного процесса / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. 1995. -№ 3. - С. 3 -8.

166. Хаитов, P.M. Экологическая иммунология / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин. -М.: ВНИРО, 1995.-325 с.

167. Хейфец, Л.Б. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности фиколл-верографин / Л.Б. Хейфец, В.А. Абалакина // Лабораторное дело. 1973.-№ 10.-С. 579-581.

168. Хейхоу, Т.Г. Гематологическая цитохимия: Пер. с англ. / Т.Г. Хейхоу, Д. Кваглино -М: Медицина, 1983.-465 с.

169. Шабадаш, A.JT. Проблемы гистохимического исследования гликогена нормальной нервной системы / A.JI. Шабадаш. М.: Медицина, 1949. -324 с.

170. Шварева, Т.И. О механизмах лазерогемотерапии / Т.И. Шварева // Действие низкоэнергетического лазерного излучения на кровь. Киев, 1989. -С. 169- 170.

171. Шубич, М.Г. Выявление катионного белка в цитоплазме лейкоцитов с помощью бромфенолового синего / М.Г. Шубич // Цитология. 1974. -Т. 16, № 10.-С. 1321-1322.

172. Шубич, М.Г. О специфичности цитохимического выявления кислой фосфатазы в нейтрофильных лейкоцитах / М.Г. Шубич, И.В. Нестерова // Лабораторное дело. 1980. - № 3. - С. 150 - 154.

173. Шубич, М.Г. Цитохимическое определение щелочной фосфатазы лейкоцитов / М.Г. Шубич // Лабораторное дело. 1965. - № 1. - С. 10-14.

174. Шубич, М.Г. Щелочная фосфатаза в норме и при патологии / М.Г. Шубич, Б.С. Нагоев. -М.: Медицина, 1980. 41 с.

175. Электроника: Энциклопедический словарь. М.: Сов. энциклопедия, 1991.-688 с.

176. Ярилин, А.А. Основы иммунологии / А.А. Ярилин. М.: Медицина, 2000. - 608 с.

177. Ярилин, А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии / А.А. Ярилин // Иммунология. 1997. - № 5. -С. 7-14.

178. A possible mechanism of low level laser-living cell interaction / R. Lubart et al. // Laser Ther. -1990. V. 2, № 1. - P. 65 - 68.

179. Astaldi, G. The glycogen content of the cells of lymphatic leukamia / G. Astaldi, L. Verga // Acta hamatologie. 1957. - V. 17. - P. 911 - 928.

180. Bonnet, R. Singlet oxygen in the photooxidation of bilirubin in hydroxylic solvents / R. Bonnet, J. Stewart // J. Biochem. 1972. - № 130. - P. 895 -897.

181. Boyden, S. The chemotactic of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leukocytes / S. Boyden // J. Exp. Med. 1962. - V. 115. - P. 453 -466.

182. Change in calcium transport in mammalian sperm mitochondria and plasma membranes caused by 780 nm irradiation / R. Lubart et al. // Lasers in Surgery and Medicine. 1997. - V. 21, № 5. - P. 493 - 499.

183. Direct stimulatory effect of low-intensity 670 nm laser irradiation on human endothelial cell proliferation / A. Schindl et al. // Br. J. Dermatol. 2003. -V. 148,№2.-P. 334-366.

184. Dougherty, T.J. Use of hematoporphyrin in photodynamic therapy / T.J. Dougherty // Photochem. Photobiol. 1993. - V. 58 (6). - P. 895 - 900.л I

185. Effect of Low Level Laser Irradiation on Cytosolic Ca in Human Neutro-phyls in vitro / H. Loevshall et al. // Lasers in Life Sci. 1998. - V. 8, № 1. -P. 127-136.

186. Effect of wavelength on low-intensity laser irradiation-stimulated cell proliferation in vitro / P. Moore et al. // Lasers in Surgery and Medicine. 2005. -V. 36, № 1. - P. 8 - 12.

187. Effects of low power laser-irradiation on differential blood count and body temperature in endotoxin-preimmunized rabbits / L. Schindl et al. // Life Sci. 1997. - V. 60, № 19. - P. 1669 - 1677.

188. English, D. Single step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll-hypaque / D. English, B.R. Andersen // J. Immunol. Methods. 1974. - V. 5. - P. 249.

189. Ernst, E. Low-dose laser therapy: critical analysis of clinical effects / E. Ernst, V. Fialka // Schweiz-Med-Wochenschr. 1993. - V. 123. - P. 949 - 954.

190. Fearon, D.T. The instructive Role of Innate Immunity in the Acquired Immune Response / D.T. Fearon, R.M. Locksley // Science. 1996. - V. 272. -P. 50-53.

191. Fine, S. Ultraviolet lasers / S. Fine, E. Klein // Ptroc. first, conf. on the bio- . logical effects of ultraviolet radiation. Philadelphia. 1966. - V. 1. — P. 312 — 322.

192. Funk, J.O. Cytokine production after helium-neon laser irradiation in cultures of human peripheral blood mononuclear cells / J.O. Funk, A. Kruse, H. Kirchner // J. Photochem. Photobiol. 1992. - V. 16, № 3 - 4. - P. 347 -355.

193. Gallin, J.T. Granulocyte chemotaxis: an improved in vitro assay employing 51 Cr-labeled granulocytes / J.T. Gallin, R.A. Clark, H.R. Kimball // J. Immunol. 1973. - V. 110. - P. 233 - 240.

194. Gemert, M.J. Tissue Optics for a Slab Geometry in the Diffusion Approximation / M.J. Gemert, A.J. Welch, W.M. Star // Lasers Med. Sci. 1988. - № 2. -P. 1-18.

195. Gentle, T.A. Neutrophil function tests in clinical immunology / T.A. Gentle, R.A. Thompson // Clinical Immunology A Practical Approach. Ed. Gooi H.G., Chapel H. New York: Oxford University Press, 1990. - P. 57 - 59.

196. Helium-neon laser irradiation induces effects on cytokine production at the protein and the mRNA level / J.O. Funk et al. // Exp. Dermatol. 1993. -V. 2, № 2. - P. 75-83.

197. He-Ne laser irradiation effect on antioxidant activity of blood in vitro / M.S. Zhumankulov et al. // Biomed Aspect: Int. Conf. Regulation Free Rad Reactions. Varna, 1989.-P. 130.

198. Hillesberg, R. Current Status of Photodynamic Therapy in Oncology / R. Hil-lesberg, W.J. Kost, J.H.P. Wilson // Drugs. 1994. - V. 48, № 4. - P. 510 -524.

199. In vivo and in vitro HeNe laser effects on phagocyte functions / G. Ricevuti et al. // Inflammation. 1989. - V. 13, № 5. - P. 507 - 527.

200. Javurek, J. Fototerapie biolaserem / J. Javurek. Praha: GRADA Publishing, 1995.-205 p.

201. Kao, M. Biological effects of low irradiation on cultured C-6 glioma cells / M. Kao, J. Tsai, T. Jou // Lasers in Surgery and Medicine. 1988. - № 8. -P. 176.

202. Kaplow, L. A histochemical procedure for localizing and evaluating leukocyte alkaline phosphatase activity in smears of blood and marrow / L. Kaplow // Blood.- 1955.-V.10,№ 10.-P. 1023-1029.

203. Karu, T. Long-term and Short-term Responses of human Lymphocytes to He-Ne Laser Irradiation / T. Karu, N. Smolyaninova, A. Zelenin // Laser in Life Sci. 1991. - V. 4, № 3. - P. 167 - 178.

204. Karu, T. Photobiological fundamentals of low-level laser therapy / T. Karu / IEEE J. Quant. Elect. 1987. - V. QE-23. - P. 1703 - 1717.

205. Karu, T. Photobiological fundamentals of low-power laser therapy / T. Karu // Laser Health: abstr. of the 1-st international congress. Limawssol, 1997. -P. 207-210.

206. Karu, T. Primary and secondary mechanisms of action of visible and near infra red radiation on cells / T. Karu // J. Photochem. Photobiol. 1999. - V. 49, № l.-P. 1-17.

207. Keller, H.U. Studies on chemotaxis. Specific chemotaxis in rabbit polymorphonuclear leukocytes and mononuclear cells / H.U. Keller, E. Sorkin // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1967. - V. 31 (6). - P. 575 - 586.

208. Khadra, M. The effect of low level laser irradiation on implant-tissue interaction. In vivo and in vitro studies / M. Khadra. // J. Swed. Dent. 2005. -№ 172.-P. 1-63.

209. Klebanov, G.I. Low Power Laser Irradiation Induces Leukocyte Priming / G.I. Klebanov // Gen. Physiol. Biophys. 1998. - V. 17, № 4. - P. 365 - 376.

210. Kogelnik, H. Laser beams and resonators / Kogelnik H., Li T. // Proceedings of the IEEE. -1966. -V. 54, № 10. P. 421 - 444.

211. Lipopolysacharide Priming of Human Neutrophyls for an Enhanced Respiratory Burst / J.R. Forehand et al. / J. Clin. Invest. 1989. - V. 83, № 1. -P. 74-83.

212. Low energy doses of visible (633 nm) and near infrared (780 nm) Lasers Change intracellular Ca concentration in fibroblasts / R. Lubart et al. // Proc. of SPIE. 1996. - V. 2929, № 9. - P. 12 - 17.

213. McPhail, L.C. The NADPH-oxidase of human polymorphnonuclear leukocytes. Evidence for regulation by multiple signals / L.C. McPhail, C.C. Clayton, R. Snyderman // J. Biol. Chem. 1984. - V. 259, № 9. - P. 5768 - 5775.

214. Morel, F. The superoxide-generating oxidase of phagocytic cells. Physiological, molecular and pathological aspects / F. Morel, J. Doussiere, P.V. Vignais // Eur. J. Biochem. 1991. - V. 201, № 3. - P. 523 - 546.

215. Ohshiro, T. Low Lever Laser Therapy: a practical Introduction / T. Ohshiro, R.G. Calderhead. Chichester. - New-York. - 1988. - 125 p.

216. Parrish, J.A. Photomedicine: Potential for Lasers. In: Lasers in Photomedicine and Photobiology. Eds. Pratesi R., Sacchi C.A. / J.A. Parrish. Berlin, Springer, - 1980.-22 p.

217. Pass, H.I. Photodynamic Therapy in Oncology. Mechanism and Clinical Use / H.I. Pass // J. Natl. Cancer Inst. 1993. - V. 85, № 6. - P. 443 - 456.

218. Priming of phagocytes by cytokines and water-soluble products of lipid peroxidation / L.V. Kovalchuk et al. // Biomed. Sci. 1991. - V. 2, № 3. -P. 11-21.

219. Seymor, J. The Neutrophil: Function and Clinical Disorders / J. Seymor, G.I. Klebanov, R.A. Clark. North-Holland Publ. Company. Amsterdam. -N.Y. - Oxford, 1978. - P. 5 - 28,

220. Systemic effects of low-intensity laser irradiation on skin microcirculation in patients with diabetic microangiopathy / A. Schindl et al. // Microvasc. Res.- 2002. V. 64, № 2. - P. 240 - 246.

221. Thannickal, V.J. Reactive oxygen species in cell signaling / V.J. Thannickal, B.L. Fanburg // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2000. - V. 279, № 6. - P. L1005 - L1028.

222. Tomson, A. Physiotherapy / A. Tomson, A. Skinner. Twelfth edition. -London: Butterworth - Heinemann Ltd., 1991. - 501 p.

223. Verhoev, J. Opsonic requirements for staphylococcal phagocytosis. Heterogeneity among strains / J. Verhoev, P.K. Peterson, P. Quie // J. Immunol. Meth.- 1977.-V. 14.-P. 303.

224. Wilander, L. Laser He-Ne Light exposure of red blood cells / L. Wilander, P.A. Oberg // Med. and Biol. Eng. and Comput. 1986. - V. 24, № 5. - P. 558-569.

Информация о работе

Рудик, Дмитрий Владимирович
кандидата биологических наук
Саратов, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процесс фагоцитоза бактерий и функционально-метаболическое состояние фагоцитирующих клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы