Влияние напряжения кислорода на работу Na+/K+АТФазы в сердце крысы

Лапина, Наталья Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние напряжения кислорода на работу Na+/K+АТФазы в сердце крысы
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние напряжения кислорода на работу Na+/K+АТФазы в сердце крысы"

На правах рукописи

ЛАПИНА Наталья Евгеньевна

ВЛИЯНИЕ НАПРЯЖЕНИЯ КИСЛОРОДА НА РАБОТУ Л^/К+АТФазы В СЕРДЦЕ КРЫСЫ

03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2005-

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор А.Г. Камкин Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук Г. В. Порядин

доктор биологических наук, старший научный сотрудник О. Д. Лопина

Ведущая организация

ГУ НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Защита диссертации состоится «_»___2005 года в_часов

на заседании диссертационного Совета Д 208.072.05 в ГОУ ВПО РГМУ Росздрава России по адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского Университета по адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

Автореферат разослан «_»__2005 года

Ученый секретарь диссертационного Совета Кандидат медицинских наук, доцент

Т.Е. Кузнецова

<Г</оЗ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Заболевание сердечно-сосудистой системы - одна из самых распространенных причин смертности и потери трудоспособности в развитых странах. Причиной гибели сердечной ткани в этих случаях является недостаток кислорода в ткани (тканевая гипоксия).

Ыа'/К* АТФаза - встроенный в плазматическую мембрану фермент, который за счет энергии гидролиза АТФ связывает ионы N0* и 1С, перенося их через мембрану против градиента концентрации со следующим соотношением:

где Ш+т входящий ион натрия, Ш+ ош - выходящий ион натрия, К'ош -выходящий ион калия, К* ,„ - входящий ион калия, Р, - неорганический фосфат. Таким образом, АТФаза, которая состоит из 3

субъединиц - а, Р и 7, присутствует во всех клетках животных, образует электрогенный обменник внутриклеточного Л/я+ на внеклеточный К*. Электрохимический градиент, создаваемый ионами, может быть использован для трансформирования энергии, а также для транспорта в клетку таких субстратов, как аминокислоты, сахара, витамины, фосфат, Са2+, //* и другие с использованием систем вторичного транспорта. Для сердца особое значение имеют следующие функции Ма^/К* АТФазьг 1) поддержание уровня внутриклеточного кальция за счет создания градиента концентрации ионов Л/я', которые необходимы для работы ЛГа+/Са2+ обменника; 2) рецепция сердечных гликозидов, которые повышают сердечную сократимость.

Необходимым субстратом для работы фермента являются: АТФ и ионы Ыа+ и АТ\ До 40 % АТФ, синтезируемой клеткой, расходуется на работу фермента. Поэтому изменение количества АТФ, которое может происходить при изменении напряжения кислорода в перфузионном

АТФ + 3 Ка+Ш + 2 К*„г АДФ +Р, + 3 Мг+ ош + 2 ¡С

растворе может повлиять на гидролитическую активность Мзг+/АГ+ АТФазы. По литературным данным показано изменение уровня АТФ в условиях ишемии в клетках, а так же снижение АТФ при инкубации кардиомиоцитов в условиях гипоксии. Изменение напряжения кислорода в перфузионном растворе влияет на количество свободных радикалов.

Цель исследования

Целью настоящей работы явилось изучение влияния величины напряжения кислорода в перфузионном растворе с учетом временного фактора на работу Ыа+/К' АТФазы и выяснения механизма влияния кислорода.

Задачи исследования

1. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на гидролитическую активность А'а*/1С АТФазы

2. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на уровень АТФ в ткани и зависимость гидролитической активности Ыа*/К* АТФазы от изменения уровня АТФ

3. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на уровень окисленной и восстановленной форм глутатиона в ткани

4. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на уровень пероксидаз в ткани

5. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на количество воды в ткани как показатель набухания и повреждения ткани

Научная новизна работы

В работе впервые показано, что изменение гидролитической активности Ыа+/К* АТФазы в ткани сердца крысы в условиях перфузии раствором с разным напряжением кислорода коррелирует с изменением окисленной и восстановленной формами глулатиона, что показывает зависимость от количества свободных радикалов и не зависит от изменения концентрации АТФ, активности пероксидаз, при этом достоверно не меняется количество воды в исследуемых образцах, что свидетельствует о том, что ткань в условиях эксперимента не повреждается.

Теоретическая и практическая значимость результатов

Изучение влияния напряжения кислорода в перфузируемом растворе на работу АТФазы имеет большое теоретическое значение для

понимания фундаментальных механизмов работы сердца в условиях изменения и открывает новые представления о механизмах воздействия на работу Л'а4//^ АТФазы в ткани сердца. Теоретическая и практическая ценность работы заключается в том, что показано влияние на гидролитическую активность свободных радикалов, что позволит осуществлять ее регуляцию.

Практическое внедрение результатов работы заключается в том, что они дают основу для разработки фармакологических препаратов, способных нивелировать влияние свободных радикалов на гидролитическую активность Ма+/К* АТФазы в ткани сердца для различного напряжения кислорода.

Публикации по теме диссертации

Основной материал диссертации опубликован в 6 научных работах.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на научной конференции Института Ветеринарной Физиологии Университета Цюриха (Швейцария, 01.06.2003); на научной конференции Института Ветеринарной Физиологии Университета Цюриха (Швейцария, 06.04.2004); на XIX съезде физиологического общества в Екатеринбурге (Россия, 21.09.2004); на международной конференции "Transport Mechanisms Across Cell Membranes: Channels and Pumps" Санкт-Петербург (15.10.2004); на научной конференции Института Ветеринарной Физиологии Университета Цюриха (Швейцария, 02.11.2004); на конференции молодых ученых «Физиология и медицина» Санкт-Петербург (Россия, 14.04.2005)

Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры фундаментальной и прикладной физиологии МБФ ГОУ ВПО РГМУ, кафедры нормальной физиологии ГОУ ВПО РГМУ, кафедры биохимии ГОУ ВПО РГМУ и кафедры биохимии биологического факультета МГУ.

Структура и объем диссертации

Диссертация написана по стандартному плану и состоит из обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов с их обсуждением, выводов и списка цитируемой литературы.

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, включая 14 таблиц, 24 рисунка и список литературы из 173 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объект исследований

Работу выполняли на выделенном сердце крыс линии Wistar мужского пола, разных возрастных групп, которые формировали по массе тела. Из общего числа выполненных опытов 150 в обработку и

анализ было введено экспериментов, которые полностью соответствовали планируемому протоколу.

Для перфузии выделенного сердца крысы на протяжении экспериментов использовали солевой раствор следующего состава (тМ): 125,0 NaCl, 25,0 NaHCOs, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2, 5,0 MgCl2, 5,0 HEPES (4-(2-Гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота, 10 Глюкоза при рН=7.3. Через раствор постоянно проходили пузырьки газовой смеси переменного состава. Все реагенты были получены от фирмы Sigma.

Для выполнения поставленных задач использовали экспериментальную установку, обеспечивающую перфузию изолированного сердца раствором с заданным напряжением кислорода: 6,333, 9,062, 25,742, 34,374, 69,05, 138,11 мм. рт. ст. (Метод перфузии изолированного сердца по Лангендорффу).

Протоколы проведения перфузии сердца

Исследование влияния изменения напряжения кислорода на изучаемые показатели при перфузии изолированного сердца проводили по следующему протоколу. Каждое выделенное сердце отмывали от крови в течение 7 минут раствором 1 (Т=37±0,1 °С), содержащим Ро2 138,11 мм. рт. ст., после чего проводили перфузию разной длительности (5, 10, 15 и 45 минут) растворами с разным Ро2: 6,333, 9,062, 25,742, 34,374, 69,05, 138,11 мм. рт. ст. В качестве контрольных точек использовали отмытые вручную от крови сердца и сердца, которые перфузировали продолжительностью 5, 10, 15 и 45 минут раствором с Ро2 138,11 мм. рт. ст.

Измерение гидролитической активности, уровня АТФ, окисленной и восстановленной форм глутатиона, активность пероксидаз и количество воды в ткани сердца

После перфузии сердце разделяли на пробы, которые замораживали и хранили до момента использования пробы в жидком азоте. Проводили

измерения гидролитической активности Na^/K* АТФазы, уровня АТФ, окисленной и восстановленной форм глутатиона (GSH/GSSH), пероксидаз из надосадочной жидкости, полученной при гомогенизации проб, а так же было ли увеличение содержания воды в ткани. Пробы нормировали на количество белка в пробе или количество сырой ткани.

Гидролитическую активность Na*/К* АТФазы измеряли спектрофотометрически (660 нм) по разнице образования из АТФ неорганического фосфата (с помощью метода Ратбун и Бетлах) в пробе с и без уабаина (специфического ингибитора Na*/bC АТФазы).

Уровень АТФ оценивали с помощью АТФ-билюминесцентной тест-системы (Sigma), регистрируя хемилюминесценцию в ходе люцеферин-люциферазной реакции.

Поскольку глутатион составляет практически 95-97% небелковых тиолов в клетке количество окисленного глутатиона определяли, измеряя общее количество небелковых тиолов. Поглощение определяли спектрофотометрическим методом (412 нм) с помощью 5,5'-дитио-бис(2-нитробензойной кислоты) (ДТНБ). Для определения восстановленной формы использовали глутатион редуктазу. Долю GSSG рассчитывали как % от молярной концентрации GSH.

Активность пероксидаз измеряли спектрофотометрически (510 нм) адаптированным методом, описанным Bradley et al (1982), в основе которого лежит цветная реакция окисления аминогрупп о-дионизидин дигодрохлорида.

Белок в пробе определяли спектрофотометрически (620 нм) с помощью тест-системы BioRad (GmbH). Значение гидролитической активности и уровня пероксидаз относили к значению белка в измеряемой пробе, остальные параметры нормировали на количество сырой ткани.

Количества воды в пробе измеряли как разницу массы пробы до и после высушивания при t=80°C.

Все данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (mean±S.E.). Ряды полученных значений обрабатывали

одинаковым способом для всех изучаемых параметров. При этом использовали стандартные методы математической статистики в виде коммерческой программы Sigma-Plot, 4 версия. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменения гидролитической активности в зависимости от времени перфузии и напряжения Ог в перфузионном растворе

Изменения во времени гидролитической активности Na/К* АТФазы претерпевали флуктуационные изменения в течение 45 минут в зависимости от напряжения кислорода 9,742, 25,742, 34,374, 69,05 и 138,11 мм. рт. ст., однако через 15 минут пик гидролитической активности был на уровне 69,05 мм. рт. ст., а при 45 минутах перфузии он сместился влево на уровень 25,742 мм. рт. ст. (рисунок 1).

"ùs

S5 •е-

о о

•е-

Ьм

1 -

—•— 9,062 мм.ртст —О— 25,742 мм рт ст —т— 34,74 мм рт ст —'V— 69,05 мм.ртст —■— 138,11 ммртст

J>2

^^ ТЗ

;_____~~

__—il

' ---~~~____ш5

Время перфузии, мин

Рисунок 1. График зависимости гидролитической активности Ыа*/1С АТФазы от времени перфузии при использовании разных Р02 в перфузионном растворе. Где линия 1 - перфузия раствором с Р02 9,062 мм. рт. ст., линия 2 - 25,742 мм. рт. ст., линия 3 - 34,374 мм. рт. ст., линия 4 - 69,05 мм. рт. ст., линия 5 - 138,11 мм. рт. ст.; п=6, * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,005.

Максимальное значение гидролитической активности при 15 минутной перфузии приходится на 69,05 мм. рт. ст., что свидетельствует об увеличении способности в данной точке к гидролизу АТФ. По данным Fuller W, et al (2004) при ишемии наблюдается снижение гидролитической активности фермента при увеличении времени ишемии.

Смещение пика гидролитической активности, которые приходились при 15 минутной перфузии на 69,05 мм. рт. ст., при 45 минутной перфузии на 25,742 мм. рт. ст., могли происходить за счет изменения сродства фермента к субстрату в условиях гипоксии. А так же за счет воздействия продуктов каскадных реакций активных форм кислорода и азота.

Изменения концентрации АТФ в зависимости от времени перфузии и напряжения О2 в перфузионном растворе

Изменения во времени уровня АТФ, который претерпевал флуктуационные изменения в течение 45 минут в зависимости от напряжения кислорода 9,742, 25,742, 34,374, 69,05 и 138,11 мм. рт. ст. (рисунок 2), однако для 10 и 45 минутной перфузии кривые аппроксимации имеют одинаковую форму. При 15 мин перфузии растворами достоверных различий в уровне АТФ нее наблюдалось.

Полученные результаты показывают, что уровень АТФ для представленных длительностей перфузии 10 и 45 минут зависит от парциального давления и не зависит от длительности перфузии. При этом не наблюдается прямой корреляции уровня АТФ и гидролитической активности. Данные хорошо коррилируют с данными, в которых показано, что нет достоверных отличий в содержании АДФ и

соотношении креатинфосфата к АТФ при рассмотрении их как функции потребления кислорода сердцем в модели in vivo на сердце собаки.

Время перфузии, мин

Рисунок 2. График зависимости уровня АТФ от времени перфузии при использовании разных Р02 в перфузионном растворе. Где линия 1 перфузия раствором с Р02 9,062 мм. рт. ст., линия 2 - 25,742 мм. рт. ст., линия 3 - 34,374 мм. рт. ст., линия 4 - 69,05 мм. рт. ст., линия 5 - 138,11 мм. рт. ст.;п=6, * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,005.

Данные для 0, 5 и 10 минутной продолжительности перфузии с разным напряжением кислорода в растворе можно соотнести с данными, которые были получены Берге С. & а1 (1994) при ишемии и аноксии той же длительности. ШгвкепЬаит Ь.А. е? а1 (1992) показали, что уровень АТФ снижался при инкубации кардиомиоцитов в условиях гипоксии (30 минут), при этом уровень криатинфосфата практически не менялся, после реоксигенации, наоборот, падал уровень креатинфосфата.

Возможное действие активных форм азота на клетки подтверждается тем, что добавление N-LAME (блокатор М?-синтазы) снижает скорость падения уровня АТФ в сердце по данным Depre С. et al (1994). Гипоксия без ацидоза (рН=7.4) снижает уровень клеточного АТФ (Aguila L. et al (2003)). Действие на уровень АТФ не оказывает NO, поскольку в работе использование NO доноров - SNAP (S-nitroso-N-acetylpenicillamine) не изменяет уровень АТФ при гипоксии без ацидоза. Скорость снижения уровня АТФ меньше изменяется в условиях ишемии с применением блокатора М?-синтазы (L-NAME) (Depre С. et al (1994)), чем при ишемии без добавления блокатора.

Изменения окисленной и восстановленной форм глутатиона в зависимости от времени перфузии и напряжения 02 в перфузионном растворе

Изменения во времени уровня GSH, которые претерпевали флуктуационные изменения в течение 45 минут в зависимости от напряжения кислорода 9,742, 25,742, 34,374, 69,05 и 138,11 мм. рт. ст., однако через 15 минут пик значения GSH был на уровне 25,742 мм. рт. ст., а при 45 минутах перфузии он сместился вправо и увеличивается достоверно начиная с 69,05 мм. рт. ст. (рисунок 3).

Изменения во времени процентного отношения GSSG от GSH, которые претерпевали флуктуационные в течение 45 минут в зависимости от напряжения кислорода 34,374 и 138,11 мм. рт. ст. (рисунок 4), однако для напряжения кислорода 25,742 мм. рт. ст. наблюдается увеличение процентного отношения GSSG от GSH на 10 и далее на 15 минуте перфузии, при измерении на 45 минуте перфузии наблюдаем возврат практически к первоначальному уровню.

Показано, что максимальное (достоверно отличающееся) значение процентного отношения С55С от СБН при 15 минутной перфузии приходится на уровень 34,374 мм. рт. ст.

Время перфузии, мин

Рисунок 3. График зависимости от времени перфузии при использовании

разных Р02 в перфузионном растворе. Где линия 1 - перфузия раствором с Р02 9,062 мм. рт. ст., линия 2 - 25,742 мм. рт. ст., линия 3 - 34,374 мм рт. ст., линия 4 - 69,05 мм. рт. ст., линия 5 - 138,11 мм. рт. ст.; п=6, * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,005.

Возрастание процентного отношения от С5Я при перфузии 34,374 мм. рт. ст. на 10 и 15 минуте показывает накопление окисленных форм глутатиона, что свидетельствует о возрастании свободных радикалов. Полученные значения повышения процентного отношения СБЗС от СБН хорошо коррелируют со снижением восстановленной формы глутатиона при напряжении кислорода 34,374 мм. рт. ст. При

этом значение процентного отношения от СОТ при 25,742 и

138,11 мм. рт. ст. не имеет подобного соотношения окисленной и восстановленной форм глутатиона. Это может говорить о действии свободных радикалов на другие БН - связи в клетке, например на а и Р-субъединицах.

1412 -ю-|

Ё 8" </3

й «И

&о

С/Э 4.

20 -

-•— 25,742 мм.рт.ст. 34,374 мм.рт.ст 138,11 мм.рт.ст

ю 20 30

Время перфузии, мин

Рисунок 4. График зависимости процентного отношения СЖС от С?5'Н от времени перфузии при использовании разных Р02 в псрфузионном растворе Где линия 1 -перфузия раствором с Р02 25,742 мм. рт. ст., линия 2 - 34,374 мм. рт. ст., линия 3 -138,11 мм. рт. ст.; п=6, * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,005.

Показано, что максимальное (достоверно отличающееся) значение С5Я при 15 минутной перфузии приходится на 25,742 мм. рт. ст., при этом максимальное (достоверно отличающееся) значение процентного отношения СХУС от (757/ при 15 минутной перфузии приходится на 34,374 мм. рт. ст. (рисунок 5).

12 п

1,8

1,0

5 10 15 20 25

Напряжение С>2 в перфузионном растворе, мм.рт.ст.

Рисунок 5. Зависимость окисленной и восстановленной форма глутатиона от напряжения кислорода в перфузионном растворе при длительности перфузии 15 минут п=6, * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,005

Изменения уровня пероксидаз в зависимости от времени перфузии и напряжения Ог в перфузионном растворе

Показаны изменения во времени уровня активности пероксидаз, которые претерпевали сходные изменения в течение 45 минут вне зависимости от напряжения кислорода 25,742, 34,374 и 138,11 мм. рт. ст. (рисунок 6), пик активности наблюдался через 15 минут для всех значений напряжения кислорода, на 5,10 и 45 минуте перфузии значения активности пероксидаз показано практически на одном уровне.

Время перфузии, мин

Рисунок 6. График зависимости уровня пероксидаз от времени перфузии при использовании разных Рог в перфузнонном растворе. Где линия 1 - перфузия раствором с Рог 25,742 мм. рт. ст., линия 2 - 34,374 мм. рт ст , линия 3 - 138,11 мм рг. ст.; п=6, * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,005.

При 15 минутной перфузии растворами в напряжением кислорода 25,742, 34,374 и 138,11 мм. рт. ст.наблюдается пик количества пероксидаз в ткани. Нет прямой зависимости с гидролитической активностью и уровнем АТФ. Концентрация восстановленных форм глутатиона при напряжении кислорода 34,374 и 138,11 мм. рт. ст. при 15 минутной перфузии снижается, при этом при 25,742 мм. рт. ст. такой зависимости не наблюдается.

При инфаркте миокарда наблюдали повышение активности пероксидаз по сравнению с базовым уровнем Ле/епЬаскег С.Р. е! а1 (2003).

Изменение активности пероксидаз в условиях гипоксии неизвестно. Было так же показано, что использование флувастатина снижает активность пероксидаз, что свидетельствует о снижении повреждения, при этом сочетание флувастатина и ¿-А'АМЕ (блокатор УУО-синтазы) не дает эффекта по сравнению с контролем (77е/епЬаскег С.Р. е! а1 (2003))

Изменения количества воды в ткани желудочков сердца в зависимости от времени перфузии и напряжения Ог в нерфузионном растворе

Изменения во времени содержания воды претерпевали флуктационные изменения в течение 45 минут в зависимости от напряжения кислорода 9,742, 25,742, 34,374, 69,05 и 138,11 мм. рт. ст., наибольшее количество содержание воды наблюдалось через 10 минут перфузии для 25,742 мм. рт. ст., при этом нет достоверных отличий при 45 минутной перфузии. Эти данные показывают, что в ходе эксперимента не происходило набухание ткани, что свидетельствует об отсутствии сильных повреждений.

Достоверное увеличение содержания воды в ткани при 10 минутной перфузии раствором с напряжением кислорода 25,742 мм. рт. ст., свидетельствует о накоплении воды в ткани. Это может происходить за счет изменений в ионном составе клеток и, следовательно, набухании клеток или увеличении воды за счет межклеточного пространства. При этом в данной точке не наблюдается изменений гидролитической активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Если сравнивать напряжение кислорода в крови и перфузионном растворе, то несмотря на то, что в плазме растворимость СЬ сравнимая с раствором, количество кислорода, которое получает ткань при перфузии кровью во много раз больше, чем при перфузии раствором, пусть даже насыщенным 100% 02 При этом перфузия раствором с напряжением кислорода 138,11 мм. рт. ст. (напряжение кислорода сравнимо с показателями в артериальной крови - 120 мм. рт. ст.) дает значение гидролитической активности достоверно ниже, чем 69,05 мм. рт. ст. (показатель сравним со значением напряжения кислорода в венозной крови). При снижении напряжения кислорода от 34,374 до 9,062 мм. рт. ст. мы видим невысокие значения гидролитической активности. Это можно объяснить воздействием на Ь!а /ЬС АТФазу активных форм кислорода (АФК) и азота (АФА). АФА могут образовываться за счет выделения сосудами сердца N0, как расслабляющего сосуды фактора для увеличения потока крови (перфузионного раствора) и присутствию в среде (X Напряжение кислорода 6,333 мм. рт. ст. является критичной точкой, поскольку напряжение кислорода в ткани бьющегося сердца Татига М. & а1 (1978), показано 6 мм. рт. ст. Увеличение значение гидролитической активности в данном случае по сравнению точкой 9,062 мм. рт. ст. соответствует литературным данным.

Возможное действие активных форм азота на клетки подтверждается тем, что добавление И-ЬАМЕ (блокатор М?-синтазы) снижает скорость падения уровня АТФ в сердце по д анным Оерге С. ег а! (1994).

Гипоксия без ацидоза (рН=7.4) снижает уровень клеточного АТФ (Agullo L. et al (2003)). Действие на уровень АТФ не оказывает NO, поскольку в работе использование NO доноров - SNAP (S-nitroso-N-acetylpenicillaminé) не изменяет уровень АТФ при гипоксии без ацидоза. Скорость снижения уровня АТФ меньше изменяется в условиях ишемии с применением блокатора iVO-синтазы (L-NAME) (Depre С. et al (1994)), чем при ишемии без добавления блокатора.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при гипоксических условиях в гомогенате ткани сердца наблюдается снижение гидролитической активности Na+/K* АТФазы. Данные хорошо коррелируют с литературными данными, например Fuller et al (2004). При этом очищенный фермент (сарколеммная фракция) показывает наоборот возрастание гидролитической активности Na+/K* АТФазы. Fuller et al (2004) считают, что большое значение в активации Na*/К* АТФазы, показанной на сарколеммной фракции, играет фосфорилирование фосфолеммана (PLM). В данном случае PLM будет интегральной частью ферментативного комплекса в сердце.

Все полученные данные могут свидетельствовать, что для разного напряжения кислорода в перфузионном растворе имеют значение разные свободные радикалы (таблица 1). Для напряжения кислорода в перфузионном растворе до 34,374 мм. рт. ст. (что соответствует венозной крови) большее действие оказывают АФА, действуя на фосфорилирование, митохондриальные АФК, изменения цитоскелета клетки. При напряжение кислорода от 34,374 до 69,05 мм. рт. ст. - АФК и АФА. Далее только АФК.

Таблица 1. Возможные механизмы, влияющие на гидролитическую активность АТФазы при разных напряжениях кислорода в перфузионном растворе

N0 но нет 02, следовательно вклад реакции нитрозилирования и нитрирование в регуляцию минимален

М02 + 2Н+ + е Н20 + N0-

Реорганизация цитоскелста

Фосфорилирование (сСМР-нндуцированнос или РКС)

Митохондриальные АФК

О мм рт ст 34 мм рт ст 69 мм рт ст

Напряжение кислорода в перфузионном растворе

ВЫВОДЫ

1. Уровень АТФ в ткани практически не изменялся от продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе, следовательно, не мог влиять на изменения гидролитической активности Ыа+/К* АТФазы.

2. Гидролитическая активность АТФазы изменяется в зависимости от продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе, причем нет прямой зависимости от времени перфузии или напряжения кислорода в перфузионном растворе. Это свидетельствует о действии других факторов, изменяющихся в зависимости от этих показателей. Такими факторами могут быть активные формы кислорода и азота.

N0* О,

I I

ОЫОСМ— о2-

I I

-эыо нго2

ОН'

о2-

н2о2

/ V»

ОН' н7о

3. Уровень окисленной и восстановленной формы глутатиона в ткани изменяется в зависимости от продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе, что свидетельствует об изменении количества активных форм кислорода и азота при данных условиях.

4. Максимум уровня пероксидаз приходится на 15 минутную перфузию, при этом гидролитическая активность при 15 минутной перфузии изменяется в зависимости от напряжения кислорода в перфузионном растворе.

5. Изменение продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе не влияло на количество воды в ткани, следовательно, не происходило набухания и повреждения ткани.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты работы могут быть использованы при исследовании влияния различных лекарственных препаратов; с целью разработки новых лекарственных средств для терапевтического применения. А так же в курсе лекций по нормальной физиологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лапина Н.Е., Schubert R., Камкин А.Г. Изучение роли 1РКА I и IPKA II в механизме вазорелаксации артерий. В сб.: Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины. Материалы научно практической конференции 20-21 ноября 2003 года, Москва РГМУ, стр. 48.

2. Лапина Н.Е., Schubert R., Камкин А.Г. Изучение роли изоформ протеинкиназы А (РКА I, РКА II) в механизме вазорелаксаци артерий. Российский физиологический журнал им. Сеченова И.М.

2004, Т.90, № 8 часть 1, стр. 485-486.

3. Лапина Н.Е., Grenache В., Gassinann М., Bogdanova А., Камкин А.Г. Кислород-чувствительная регуляция активности Na/1С АТФазы в сердце крысы. Российский физиологический журнал им. Сеченова И.М. 2004, Т.90, № 8 часть 1, стр. 468.

4. Lapina N., Grenaher В., Kamkin А., Bogdanova А. Oxygen-induced regulation of Na/K pump in rat heart. International Workshop in cell physiology. "Transport Mechanisms Across Cell Membranes: Channels and Pumps". 13-17 October 2004, St. Petersburg, Russia, p. 41.

5. Лапина H.E., Grenacher В., Gassmann M., Bogdanova А., Камкин А.Г. Зависимость работы Na+/K* АТФазы от концентрации кислорода в сердце крысы. В сб.: Вестник молодых ученых приложение к серии «Науки о жизни», Физиология и медицина,

2005, Санкт-Петербургский научный центр РАН, стр. 66.

6. Лапина Н.Е., Schubert R., Камкин А.Г. Изучение роли изоформ протеинкиназы А (РКА I, РКА II) при активации аденилатциклазы урокортином в механизме вазорелаксации артерий. Вестник Российского государственного медицинского Университета, 2005, № 9 (48), стр.

t•

РНБ Русский фонд

2007-4 6403

Тираж 100 экз.

- г » а \

Г | * '

29 НОЯ 2005

4 (

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лапина, Наталья Евгеньевна

Содержание

Список используемых сокращений

Введение

Глава I Обзор литературы

§ 1.1. Введение

§ 1.2. Строение Мг+/А^АТФазы

§ 1.2.1. Общее строение Nal/1С АТФъзы

§ 1.2.2. а - субъединица

§ 1.2.3. (3 - субъединица

§ 1.2.4. Семейство FXYD белков (у-субъединица)

§ 1.2.5. Анкирины

§ 1.3. Работа Л^+/ГАТФазы

§ 1.4. Влияние напряжения кислорода на синтез АТФ

§ 1.5. Значение уровня свободных радикалов для клетки

§ 1.6. Активность миелопероксидазы (МП) в сердце при ишемии

§ 1.7. Предполагаемые механизмы регуляции ТУйЛ/А^АТФазы в условиях разного напряжения кислорода

Глава II Материалы и методы исследований

§2.1. Объект исследований

§ 2.2. Используемые растворы и реактивы

§ 2.3. Метод изоляции сердца

§ 2.4. Метод перфузии изолированного сердца по Лангендорффу

§ 2.4.1. Цротоколы проведения перфузии сердца

§ 2.5. Приготовление проб к анализу. Гомогенизация

§ 2.5.1. Подготовка проб для измерения гидролитической активности Na+АТФгзы

§ 2.5.2. Подготовка проб для проведения измерения АТФ и

GSH/GSSH

§ 2.5.3. Подготовка проб для измерения пероксидаз

§ 2.6. Измерение гидролитической активности Nct+/t?АТФазы

§ 2.7. Измерение АТФ в гомогенате перфузйрованного сердца

§ 2.8. Измерение GSH/GSSG в гомогенате перфузйрованного сердца

§ 2.9. Измерение пероксидаз в гомогенате перфузйрованного сердца

§2.10. Определение белка

§ 2.11. Измерение количества воды в пробе сердца

§2.12. Методы обработки результатов экспериментов

Глава III Результаты и обсуждения

§ 3.1.Изменения гидролитической активности в зависимости от времени перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе

§ 3.1.1. Кислород зависимые изменения гидролитической активности Net/К* АТФ азы

§ 3.1.2. Зависимость гидролитической активности Na/KtАТФазы от напряжения кислорода в перфузионном растворе за 15 минут перфузии

§ 3.2. Изменения концентрации АТФ в гомогенате желудочков сердца при перфузии сердца в разных условиях

§ 3.2.1. Кинетические изменения концентрации АТФ в гомогенате желудочков сердца

§ 3.2.2. Зависимость концентрации АТФ в гомогенате желудочков сердца от напряжения кислорода в перфузионном растворе за 15 минут перфузии

§3.3. Изменения окисленной и восстановленной форм глутатиона в гомогенате желудочков сердца

§ 3.3.1. Кинетические изменения окисленной и восстановленной форм глутатиона в гомогенате желудочков сердца

§ 3.3.2. Зависимость уровня окисленной и восстановленной форм глутатиона в гомогенате желудочков сердца от напряжения кислорода в перфузионном растворе за 15 минут

§3.4. Кислород зависимые изменения уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца желудочков сердца

§ 3.4.1. Кинетические изменения уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца

§ 3.4.2. Зависимость уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца от напряжения кислорода в перфузионном растворе за 15 минут

§3.5. Кинетические изменения количества воды в ткани желудочков сердца

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние напряжения кислорода на работу Na+/K+АТФазы в сердце крысы"

JVaVi^ АТФаза - встроенный в плазматическую мембрану фермент, который за счет энергии гидролиза АТФ связывает ионы Na и К", перенося их через мембрану против градиента концентрации со следующим соотношением:

АТФ + 3 Nain + 2 lC0Ut= АДФ +Pi + 3 Na out +2 1С in. где Na+in входящий ион натрия, Na+ out - выходящий ион натрия, 1Сout - выходящий ион калия, 1С т - входящий ион калия, Р, -неорганический фосфат.

Таким образом, Na+/lCАТФаза, которая присутствует во всех клетках животных, образует электрогенный обменник внутриклеточного Na+ на внеклеточный 1С. Na+/lCАТФаза состоит из 3 субъединиц - а, р и у.

В исследованиях предыдущих лет уделяли большое внимание строению и функциям фермента, теперь все больше вопросам регуляции и активности Na+/fCАТФазы в различных условиях.

В сердце Na+/lC АТФаза непосредственно участвует в стабилизации трансмембранного градиента. Энергия, необходимая для совместного транспорта трех молекул Na+ из внешней среды во внутреннюю и двух молекул 1С из внутренней во внешнюю среду, обеспечивается гидролизом одной молекулы АТФ. Соотношение 3 Na : 2 1С, необходимое для работы фермента, было показано в ткани сердца на различных видах животных [133, 134]. Электрохимический градиент, создаваемый ионами, может быть заново использован для трансформирования энергии, а также для транспорта в клетку таких субстратов как аминокислоты, сахара, витамины, фосфат, Са2\ Н* и другие с использованием систем вторичного транспорта.

Содержание кислорода в крови человека (у крысы оно практически такое же, поскольку содержание гемоглобина близкое) составляет при р02 20 кРа или 120 мм рт ст (20% 02), то есть 20 объемных процентов (20,2 мл 02 на 100 мл крови), а в водном растворе при 37,7°С эта величина примерно в 100 раз меньше (0,3 объемных процента). Это значит, что хотя в плазме растворимость 02 такая же, как в любом растворе, количество кислорода, которое получает ткань при перфузии кровью, во много раз больше, чем при перфузии раствором, пусть даже насыщенным 100% 02. Поэтому результаты, полученные в рамках данной работы, могут быть взяты за базовые исследования с целью дальнейших разработок в данном направлении, но уже применительно к человеку.

Транспортная и гидролитическая активность AfoViT1" АТФазы в нейронах, эритроцитах, гепатоцитах зависит от уровня кислорода в ткани [16]. Ишемия сердца также сопровождается понижением гидролитической активности Л^аУЛГ1" АТФазы в ткани сердца [54]. Тридцатиминутная ишемия снижает уровень миокардиальной АТФ на 50% [153]. Ишемия сопровождается изменением количества синтезируемого АТФ в клетках [54]. При этом по данным исследований, проведенным на сердце для поддержания должного количества АТФ и обеспечения необходимой работы синтез АТФ перестраивается. Многие проводимые исследования посвящены работе и регуляции Na /1САТФазы в условиях ишемии [54, 19, 15] при этом работа и регуляция фермента в условиях гипоксии до сих пор остается не достаточно выясненной. В связи с этим остается непонятным значение недостатка кислорода в механизме изменения гидролитической активности Na/}CАТФазы.

Цель настоящей работы заключалась в изучении влияния величины напряжения кислорода в перфузионном растворе с учетом временного фактора на работу Ncf/K* АТФазы и выяснения механизма влияния кислорода.

Задачи работы:

1. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на гидролитическую активность Na/K* АТФазы

2. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на уровень АТФ в ткани и зависимость гидролитической активности Na+/lCАТФазы от изменения уровня АТФ

4. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на активность пероксидаз в ткани

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Лапина, Наталья Евгеньевна

Выводы

2. Гидролитическая активность Na+/K* АТФазы изменяется в зависимости от продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе, причем нет прямой зависимости от времени перфузии или напряжения кислорода в перфузионном растворе. Это свидетельствует о действии других факторов, изменяющихся в зависимости от этих показателей. Такими факторами могут быть активные формы кислорода и азота.

§ 3.6. Заключение

По данным Houston ct al [70] напряжение кислорода в ткани изолированного сердца при перфузии кровью составляет около 35 мм. рт. ст., при ишемии снижается практически до 0, после восстановления циркуляции крови напряжение восстанавливается до первоначального уровня.

Если сравнивать напряжение кислорода в крови и перфузионном растворе, то несмотря на то, что в плазме растворимость Oi такая же, как в любом растворе, количество кислорода, которое получает.ткань при перфузии кровью во много раз больше, чем при перфузии раствором, пусть даже насыщенным 100% 02. При этом перфузия раствором с напряжением кислорода 138,11 мм., рт. ст. (напряжение кислорода сравнимо р показателями в артериальной крови - 120 мм. рт. ст.) дает значение гидролитической активности достоверно ниже, чем 69,05 мм. рт. ст. (показатель сравним со значением напряжения кислорода в венозной крови). При. снижении напряжения кислорода от 34,374 до 9,062 мм. рт. . ст. мы видим невысокие значения гидролитической активности. Это можно объяснить воздействием на Net/1С АТФазу активных форм кислорода и азота. АФА могут образовываться за счет выделения сосудами сердца NO, как расслабляющего сосуды фактора для увеличения потока крови (перфузионного раствора) и присутствию в среде О2- Напряжение кислорода 6,333 мм. рт. ст. является критичной точкой, поскольку напряжение кислорода в ткани.бьющегося сердца показано 6 мм.рт. ст. [145]. Увеличение значение гидролитической активности в данном случае по сравнению точкой 9,062 мм. рт. ст. соответствует литературным данным, когда все ресурсы клетки направлены на поддержание внутриклеточного ионного состава.

Возможное действие АФА на клетки подтверждается тем, что добавление N-LAME (блокатор Ж>-синтазы) снижает скорость падения уровня АТФ в сердце [35]. Действие на уровень АТФ не оказывает NO [1], поскольку в работе использование NO доноров -SNAP (S-nitroso-N-acetylpenicillamine) не изменяет уровень АТФ при гипоксии без ацидоза. Скорость снижения уровня АТФ меньше изменяется в условиях ишемшг с применением блокатора М?-сшггазы (L-NAME) [35], чем при ишемии без добавление блокатора.

Мы получали значения для грубого гомогената ткани сердца, который показывал, что при гипоксических условиях наблюдается снижение гидролитической активности. Данные хорошо коррелируют с литературными данными [54]. При этом очищенный фермент (сарколеммная фракция) показывает наоборот возрастание гидролитической активности Na^/fCАТФазы. Fuller et al [54] считают, что большое значение в активации Nct/K?АТФазы, показанной на сарколеммной фракции, играет фосфорилирование PLM. *В данном случае PLM будет интегральной частью ферментативного комплекса в сердце.

Все полученные данные могут свидетельствовать, что для разного напряжения кислорода в перфузионном растворе имеют значение разные клеточные радикалы (таблица З.1.). Для напряжения кислорода в перфузионном растворе до 34,374 мм. рт. ст. (что соответствует венозной крови) большее действие оказывают АФА, действуя на фосфорилирование, митохондриальные АФК, изменения цитоскелета клетки. При напряжение кислорода от 34,374 до 69,05 мм. рт. ст. - АФК и АФА. Далее только АФК. цитоскелета клетки. При напряжение кислорода от 34.374 до 69.05 мм. рт. ст. - АФК и АФА. Далее только АФК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лапина, Наталья Евгеньевна, Москва

1. Agullo L., Garicia-Dorado D., Escalona N., Ruiz-Meana M., Inserte J., Solder-Solder J. Effect of Iscemia on soluble and particulate guanylyl Cyclase-mediated cGMP synthesis in cardiomyocytes AmJ. Physiol Heart Circ Physiol 284, H2170-21176, 2003

2. Albers R.W. Biochemical aspect of active transport. Annual Review of Biochemistry 36, 727-756, 1967 # ;

3. Allan G., Bhattacherjee P., Brook C.D., Read N.G., Parke A.J.,

4. Andersen J.P., Vilsen B. Overview: subunit interaction and conformational states. Ca-ATPase and Na,K-ATPase compared Prog Clin Biol Res. 268A:603-22, 1988

5. Andriambeloson E., Witting P.K. Chemical regulation of nitric oxide: a1 role for intracellular myoglobin? Redox Report, 1, 3, H131-H135, 2002,

6. Arystarkova E., Wetzer R., Asinovski N.K., Sweadner J. The gamma subunit modulates Na(+) and K(+) affinity of the renal Na,K-ATPase. J Biol Chem., 274 (47), 33183-33185, 1999

7. Askari A., in Na,K ATPase and Related ATPases pp 17-26, 2000 j

8. Aufricht C., Bidmon В., Ruffingshofer D., Regele H., Herkner K., SiegelI

9. N.J., Kashgarian M., Van Why S.K. Ischemic conditioning prevents Na,KI

10. ATPase dissociation from the cytoskeletal cellular fraction after repeat renalischemia in rats. Pediatr Res. Jun;51(6):722-7, 2002

11. Axelsen K.B., Plamgren M.G. Evolution of substrate specificities in the P-type ATPase superfamily J. Mol Evol 46, 84-101, 1998 ,

12. Balaban R.S. Cardiac Energy Metabolism Homeostasis: Role of Cytosolic Calcium, J Mol Cell Cardiol 34, HI259 -H1271, 2002s

Информация о работе

Лапина, Наталья Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Влияние напряжения кислорода на работу Na+/K+АТФазы в сердце крысы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Влияние напряжения кислорода на работу Na+/K+АТФазы в сердце крысы ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние напряжения кислорода на работу Na+/K+АТФазы в сердце крысы"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лапина, Наталья Евгеньевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние напряжения кислорода на работу Na+/K+АТФазы в сердце крысы"

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Лапина, Наталья Евгеньевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лапина, Наталья Евгеньевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние напряжения кислорода на работу Na+/K+АТФазы в сердце крысы
ВАК РФ 03.00.13, Физиология