Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние молочной сыворотки на свертывающую систему крови убойных животных и разработка биотехнологического способа получения протопорфирина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние молочной сыворотки на свертывающую систему крови убойных животных и разработка биотехнологического способа получения протопорфирина"

На правах рукописи

БУБЕЕВ АЛЕКСЕЙ ТРОФИМОВИЧ

ВЛИЯНИЕ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ НА СВЕРТЫВАЮЩУЮ СИСТЕМУ КРОВИ УБОЙНЫХ ЖИВОТНЫХ И РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПОРФИРИНА

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Улан - Удэ - 2006

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» Восточно-Сибирского государственного технологического университета

Научный руководитель: доктор биологических наук,

проф. Цырснов В .Ж.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

проф. Санданов Ч.М.

кандидат биологических наук, Дабалаева Г.С.

Ведущая организация: ' ФГОУ ВПО БГСХА

им. Филиппова В.Р.

Защита состоится « » /РС^ИЧ^О-^ 200бг. в часов на

заседании Регионального диссертационного совета ДМ 212.039.02 Восточно - Сибирского государственного технологического университета по адресу: 670013, г. Улан - Удэ, ул. Ключевская, 40в

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Восточно-Сибирского государственного технологического университета

Автореферат разослан «

2006г.

Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, ¡у

доктор технических наук, проф. ^

Хамнаева Н.И.

Актуальность. Среди большого числа биологически активных веществ крови, которые можно с полным правом назвать «молекулами жизни», особое место принадлежит комплексным соединениям порфиринов с рядом металлов. К числу таких металлопорфиринов относится простетическая группа гемоглобина крови - гсм.

Особые свойства металлопорфиринов, в том числе и протопорфирина обуславливают широкое применение в научных исследованиях, в промышленности красящих пигментов, полупроводников, катализаторов, биосенсеров.

Практикуемые на производстве способы выделения гема из крови убойных животных, не позволяют достичь его максимально возможного выхода и базируются на жестком физико-химическом воздействии на кровь, и не рассчитаны на переработку промышленных объемов крови. Решение этой научной и практически важной задачи можно осуществить за счет постановки исследований влияния биологических, химических и физических факторов на плазменно-коагуляиионное и

фибринолнтическое состояний крови.

Практическая значимость протопорфирина, а также отсутствие доступного способа производства его препаратов определяют актуальность разработки способа получения гема.

Цель и задачи исследован ни. Целью работы явились изучение влияния молочной сыворотки на свертывающую систему крови и разработка способа выделения гема из крови убойных животных на основе методов биотехнологии.

Для выполнения поставленной цели были определены следующие задачи:

■ исследовать изменения плазмен но-коагуля циоиного и фибринолитичсского состояний крови при внесении молочной сыворотки;

■ исследовать бактерностатическое действие молочной сыворотки;

■ оценить влияние молочной сыворотки на молекулу гемоглобина;

■ обосновать возможность использования молочной сыворотки для получения гема;

• провести оптимизацию процесса выделения гема из крови;

■ изучить физико-химические свойства гема;

■ разработать способ выделения гема из обработанной крови. Научная новизна работы. Молочная сыворотка, полученная

сквашиванием обезжиренного молока культурой Lactobacillus acidophilus 20Т? при ее внесении в кровь крупного рогатого скота изменяет процесс свертывания крови, проявляя антикоагуляционный эффект. Установлено, что проявление антикоагуляционного эффекта связано с исключением

фибриногена из системы свертывания крови под действием продуктов жизнедеятельности Lactobacillus acidophilus 20Т.

Показана возможность мобилизации защитных механизмов крови для достижения консервирующего эффекта путем понижения кислотности крови и внесения культуры клеток микроорганизмов. Доказана возможность использования культур аль ной жидкости Lactobacillus acidophilus, содержащей молочную кислоту для отщепления гема от молекулы гемоглобина. Предложен новый способ выделения гема из предварительно обработанной крови с использованием методов математического моделирования.

Практическая ценность работы. Предложен новый способ предварительной обработки кровн убойных животных, основанный на новых подходах к проведению антикоагуляционых и консервирующих процессов крови и их совмещении. В качестве антикоагулянта и консерванта использовала сыворотка, полученная в процессе культивирования молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus 20Т на обезжиренном молоке до достижения титруемой кислотности 260-270°Т и последующего его фракционирования. Достигнуто удлинение сроков хранения обработанной крови при температуре 4-6°С до 30 суток.

Апробация работы. Результаты научной работы опубликованы в материалах: Всероссийской молодежной научно-технической конференции «Молодые ученые Сибири» (Улан-Уда, 2003г.); Ш Международного конгресса «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2005г.); Всероссийской научно-практической конференции «Технология и техника агропромышленного комплекса» (Улан-Удэ, 2005г.); в журнале «Мясная индустрия» (февраль, 2006г). Получен патент РФ №2265361 «Способ предварительной обработки крови убойных животных».

В производственных условиях ООО «Алексис» (г. Усолье-Сибирское) проведена апробация консервирования и стабилизация крови молочной сывороткой.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, получен патент на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит нз введения, обзора литературы, глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Материал изложен на^^стр. машинописного текста, содержит J/ таблицу и ¿Г рисунков. Библиография представлена /У?" источниками, в том числе jSg1 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении обоснована актуальность работы, сформулирована общая направленность исследований.

Обзор_литературы. Рассмотрены свертывающая и

фиб р инолитическая системы крови и их регуляция. Показана биологическая роль и практическая ценность крови убойных животных. Дана характеристика структуры молекулы порфиринов и значение их для науки и практики. Изложены основные методы предварительной обработки крови, методы ее консервации и стабилизации в пищевой промышленности и трансфузиологии. Рассмотрены способы получения пигментов из крови. Обоснованы цель и задачи исследования.

Материалы и методы. Объектами исследований являлись: молочная сыворотка, полученная в результате фракционирования сквашенного при 37°С культурой Lactobacillus acidophilus 20Т обезжиренного молока до достижения титруемой кислотности 260-270®Т; кровь убойных животных, полученная в условиях цеха первичной переработки скота ОАО «Еурятмясопром» (г. Улан-Удэ); смеси кровь : мелочная сыворотка; сухой препарат гема и концентрат белков; посевной материал на основе обезжиренного молока и крови.

Экспериментальные исследования проводились на базе кафедры «Биотехнология», лабораторий Гематологического детского центра при БСМП (г. Улан-Удэ); Сибирского института физиологии и биохимии растений (СИФиБР) г, Иркутск, Схема проведения исследования представлена на рисунке 1.

Титруемую кислотность сыворотки определяли стандартным методом по ГОСТ 3624-22. Содержание "молочной кислоты - отгонкой и связыванием бисульфитом ее окисленных продуктов. Исследования, характеризующие плазменно-коагуляционную способность крови, проводили с помощью тестов, принятых в клинико-диагностических лабораториях. Оценку кислотно - щелочного состояния смеси кровь : молочная сыворотка' осуществляли с помощью автоматического анализатора AVL OMN1™.

Антибактериальную активность молочной сыворотки, крови и их смеси определяли методом диффузии в агар. Катал азную активность - по мангометрическому методу. Количество жизнеспособных ' клеток Lactobacillus acidophilus проводили по ГОСТ 10444,11-89. Карбонильные .соединения и спирт определяли перегонкой и титрованием гипосульфитом натрия. Гликолитическую активность - титрованием продуктов разложения сахара крови. Бактериологические исследования крови проводили согласно ОСТ 49161-80 «Кровь пищевая. Продукты из пищевой крови».

Рис. 1. Схема проведения исследований

Для оценки влияния компонентов молочной сыворотки на клетки крови проводили гистохимические исследования. Содержание гемоглобина и гема определяли гемоглобинциангидридным методом и по методу Хорнсни. Оптимизацию процесса выделения гема осуществляли методом матричного планирования. Спектры ИК поглощения гема на спектрофотометре ИКС-29.

Электрофорез белков проводили на приборе производства фирмы Cormay. Аминокислотный состав белков исследовали на анализаторе ААА-881. Общий азот определяли методом Къельдаля-Ганнига, аминный азот — формальным титрованием и колориметрическим методом. Содержание золы по общепринятой методике. Массовую долю влаги - по ГОСТ 362673.

Обработка экспериментальных данных проводилась с привлечением типового программного обеспечения QK.

Экспериментальная часть

1. Исследование продуктов жизнедеятельности Lactobacillus acidophilus на свертывающую систему крови

Исследования влияния компонентов молочной сыворотки на процесс коагуляции. Изучали возможность использования молочной сыворотки в качестве стабилизатора жидкого состояния крови. На модельных опытах установлено, что молочная кислота задерживает процесс свертывания крови в концентрации 850-1300мг%. В таблице 1 приведены данные о влиянии на процесс коагуляции концентрации молочной кислоты, содержащейся в молочной сыворотке и модельном растворе, составленных из крови и сыворотки молока в различных соотношениях. Видно, что оптимальным соотношением кровь : молочная сыворотка является значение 1,5:1,0, о чем свидетельствует отсутствие коагуляции.

Таблица 1- Влияние концентрации молочной кислоты на процесс

коагуляции крови

Соотношение Содержание молочной кислоты, мг% Коагуляция

кровь:мол. сыв-ка или р-р мол. кислоты кровь: кровь:раст

молочная вор мол. кис

сыворотка лоты

1 2 3 4

1,0:2,5 1410 - -

1 2 3 4

1,0:2,0 1250 -

1,0:1,5 1050 - - ■

1,0:1,0 850 - -

1,5:1,0 700 +1 .

2,5:1,0 630 + +

Обозначение: «+» - имеет место коагуляция крови; « - » - отсутствует коагуляция крови

Состояние свертывающей системы крови оценивали по показателям, используемых в практике гематологических лабораторий. Сравнительный анализ результатов исследования плазм енно-коагуляционного и фибринолитического состояний крови по тест-системам представлен в таблице 2.

Таблица 2- Показатели плазм енн о-коагуляцио иного и фибр и политического состояния исследуемой смеси и крови

Показатели Смесь кровь: молочная сыворотка 1,5:1,0 Кровь КРС, стабил изированная фосфатами (контр.)

1 2 3

Время рекальцифика цни, (ВР), сек Свертывание не наблюдалось 80-120

Активированное время рекальциф и каци п, (АВР), сек Удлинение 60-70

Активированное частичное тромбоплас типовое время, (АЧТВ), сек Удлинение 91,1-95,3

Протромбиновое время, (ПВ), сек Нет сгустка в течение 240 сек 56,9-64,9

Протром бш ю вы П индекс, (ПТИ), % Нет сгустка в течение 240-сек 13,7-13,6

Содержание фибриногена, г/л 1,1. 3,7-3,9

1 2 3

Продукты деградации фибрина, (ПДФ) + -

Тромби новое время, (ТВ), сек 41,1-79,9 21,8-23,4

Буферные основания, (ВО (ВВ)), ммоль/л -76 43,3

Избыток оснований, (ИО (ВЕ)), ммоль/л -31,7 -2,3

Обозначения: «+» - имеет место, «-» - не имеет место

Уровень протеина С, активируемого тромбином в присутствии Са++', оценивается по тест-системам АЧТВ и ПВ. Удлинение времени АЧТВ, ПВ и ПТИ свидетельствует о дефиците факторов: I- ибриногена, II-протромбина н X и V-компонентов протромбин азы. ПТИ свидетельствует о наличии антикоагулянта. Аитикоагуляционную активность исследуемой смеси и крови оценивали также по ВР. Добавление к опытным образцам раствора хлорида кальция (0,277% раствор) не восстанавливает коагуляционную способность, тогда как в контрольных образцах оно находится в пределах нормы. Удлинение АВР характерно также для гипокоагуляциии и может быть вызвано недостатком фибриногена и факторов, входящих в протромбиновый комплекс - XII, IX, VIII. Одновременное удлинение АВР и АЧТВ свидетельствует о снижении активности плазменных факторов свертываемости или воздействием антикоагулннта. Удлинение ТВ показывает снижение содержания фибриногена и свидетельствует о присутствии продуктов деградации фибриногена. Снижение содержания фибриногена в 2 раза в исследуемой смеси и наличие ПДФ указывает на активность протеиназ фибринолитической системы.

Исследования плаз меня о-коагуляционной и фибринолитической систем крови, позволяют сделать вывод о наличии антикоагуляционного эффекта, стабилизирующего действия компонентов молочной сыворотки на кровь. Установлено, что проявление антикоагуляционного эффекта определенно связано с исключением фибриногена из системы свертывания крови.

Уменьшение рН крови в результате обработки ее молочной Сывороткой, оказывает воздействие на ее кислотно-щелочное равновесие и водно-электролитный баланс вследствие чего нарушается активность белков и ферментов . плаз менно-коагуляцио иной и фибринолитической систем крови.

Электрофоретнческне исследования белков смеси кровь ; молочная сыворотка. Электрофорез белков смеси кровь : молочная сыворотка 1,5:1,0 проводили сразу после смешивания крови с молочной сывороткой и после 6,13,1? и 20 суток ее хранения при температуре 4-б°С. Результаты электрофоретических .исследований белков представлены на рисунке 2 и в таблице 3.

^ и. л - ■

^^ Ж ^РР

Рис. 2. Элекгрофореграммы белков смеси кровь : молочная сыворотка 1,2:1,0

О - молочная сыворотка; б — цельная кровь; время выдержки смеси кровь : молочная сыворотка: 1—0 суток; 2 — 6 суток; 3 — 13 суток; 4—17 суток; 5 -20 суток.

Из таблицы 3 видно, что фракции альбуминов, аг, с^-, р3-, у-глобулинов имеют тенденцию к уменьшению. В данном случае возможно ферментативное расщепление белков, имеющих сайты для протеаз крови. Вероятно, и молочная кислота оказывает определенное влияние на распределение белковых фракций.

Уменьшение фракций а,-, щ-, глобулинов на 70% можно связать с белками, входящими в их состав - а] -антитрипсином и макроглобулином, которые ингибируют факторы свертывания крови путем образования комплексов с плазмипогеном.

Таблица 3 — Изучение белковых фракций смеси кровь : молочная

Наиме- Содержание белковых фракций, г/л

нова- мол. кровь, сроки хранения, сут

ние сыво- стаб. 0 6 13 17 20

фрак- ротка фосфа

ции тами

1 2 3 4 5 6 7 ' 8

Альбу- 1,25± 5,6± 12,36 11,40 3,51± 2,7 8± 0,02±0,

мины 0,21 0,55 ±0,91 ±1,10 0,59* 0,55* 01*

1 2 3 4 5 6 7 8

О]-гло- 0,5 2± 0,08± 5,61 1,П 0,10± 0,13± 0,66±0,

булины 0,020 0,011 ±0,78 ±0,18* 0,02* 0,02* 07'

а2-гло- 0,25± 0,44± 6,67 1,79 11,7± 0,65± 0,29±

булины 0,050 0,060 ±0,32 ±0,06' 0,64* 0,07* 0,08*

Р)-гло- 0,3 15,97± 5,3 2,02± 14,2± 29,2± 38,13±0

булины 0,040 2,72 ±1,05 0,016* 038' 5,40* ,9*

Рг-гло- 1,07± 68,90± 21,94 2 ¡36 1,27± 1,56± 1,10±0,

булины 0,025 8,90 ±3,89 ±0,36* 0,09* 0,16* 13*

у- гло- 1,86± 6,3 5± 10,61 9,66 1,70± 2,70± 2,77±0,

булины 0,56 2,30 ±1,36 ±1,62 0,25* 0,09* 29*

белок 5,3± 97,40± 62,1 28,40 32,5 37,0± 46,2±1,

0,18 11,12 ±11,9 ±1,50* ±2,9' U7* 80*

Обозначение: *- достоверно при р< 0,05

Снижение фракции ßi- глобулинов, включающей наряду с другими белками фибриноген, согласуется с результатами исследования свертывающей системы крови, представленных в таблице 2.

Анализируя данные таблицы 3, можно констатировать локальное увеличение уровня белков, изучаемой смеси кровь : молочная сыворотка в процессе хранения. Увеличение содержания фракции рр глобулинов, вероятно, .связано с автолизом клеток Lactobacillus acidophilus и гемолизом клеток крови. Наличие гемолиза установлено на 4-е сутки, а снижение клеток Lactobacillus acidophilus на 5-е сутки. Увеличение а2-глобулинов на 13-е сутки хранения вызвано протеканием тех же процессов. Снижение у- глобулинов молочной сыворотки и исследуемой смеси в процессе хранения свидетельствует об их связывании, вероятно, с антигенными детерминантами клеток крови. Увеличение общего белка можно объяснить выходом белка из клеток в результате гемолиза крови и автолиза культуры Lactobacillus acidophilus.

Таким образом, электрофоретическая подвижность белков сыворотки крови и молочной сыворотки в результате их смешения и последующего хранения существенно изменяется.

Исследование ба «термостатического действия компонентов молочной сыворотки. Исследовали антимикробную активность крови, молочной сыворотки и их смеси я соотношении 1,5:1,0 (таблица 4). Видно, что молочная сыворотка и смесь проявляют высокую антимикробную активность к представителям культур Bacillus и Escherichia coli. Бактериостатическое действие крови ниже, чем у

сыворотки и исследуемой смеси. Установлено, что антагонистическая активность молочной сыворотки определяется в основном действием молочной кислоты, накапливающейся в процессе роста и развития L. acidophilus.

Таблица4 - Антимикробная активность крови, молочной сыворотки и их смеси при температуре хранения 4 - 6°С

Тест-культуры Зоны подавления роста, мм

мол. сыворотка кровь, стабил. фосфатами смесь кровь: молочная сыворотка 1,5:1,0

Escherichia coli М-17 23 17 34

Bacillus subtilis АТСС 6633 21 16 30

Bacillus megaterium 23 17 20

Bacillus pumilusATCC 14844 19 18 23

Bacillus my со ides R - 537 21 18 20

В смеси кровь : молочная сыворотка определена высокая каталазная активность (рисунок 3). В дефростированной крови каталазная активность развивается значительно медленнее.

С МО ЯИ 300 «о 5» V»

[_' h— ttfrrt : ***** > ' ? - » - *rtДСУ* « i^|MiMj

Рис. 3. Изменение каталазной активности смеси кровь ; молочная сыворотка в процессе хранения при температуре 4 - б°С

По данным таблицы 4 н рисунка 3 можно резюмировать: смешивание крови с молочной сывороткой, содержащей клетки L. acidophilus 20Т, обеспечивает синергетическнй эффект в отношении антимикробной активности против Ё. coli и некоторых представителей споровых культур рода Bacillus.

Установлено, что клетки L. acidophilus, содержащиеся в сыворотке сохраняют свою жизнеспособность (рисунок 4).

Рис. 4. Изменение КОЕ L. acidophilus в процессе хранения молочной сыворотки и ее смеси с кровью

Как видно из рисунка 4, в молочной сыворотке, хранившейся при температуре 4 - 6"С более 5 суток, клетки L. acidophilus практически отсутствуют (50-10 КОЕ/мл), тогда как в смеси кровь : молочная сыворотка, хранившейся при тех же условиях их количество максимально (7,8 • 10s КОЕ/мл), а после 15 суток хранения их количество снижалось и составляло 3,0 — 1,9 * Ю3 КОЕ/мл.

Таким образом, молочная сыворотка пригодна для консервирования крови только при условии ее хранения не более 5-ти суток. Однако при смешивании молочной сыворотки с кровью их жизнеспособность сохраняется.

Консервирующий эффект исследуемой смеси обусловлен не только исходной концентрацией молочной кислоты и других веществ в молочной сыворотке, но и сохранением бродильной активности культурой L. acidophilus 20Т. На рисунке 5 показана динамика накопления молочной кислоты в процессе хранения смеси кровь ; молочная сыворотка 1,5 : 1,0 при температуре 4 - 6°С.

На рисунке б показано изменение гликолитической активности в смеси кровь : молочная сыворотка, максимум которой приходится на 4-5-е

к

Рис. 5. Динамика накопления молочной кислоты в смеси кровь : молочная сыворотка 1,5 : 1,0

сутки. Гликолитнческая активность дефростированной крови возрастает постепенно и достигает наибольшего значения на 15-е сутки.

В течение 30 суток хранения исследуемой смеси рН среды находится в пределах 4,5 - 4,6 , остаточный азот увеличивается незначительно до 80 мГ%, что позволяет прийти к выводу о консервирующем действии молочной сыворотки.

Рис, 6. Изменение гликолитической активности в дефростированной крови и смеси кровь : молочная сыворотка в процессе хранения при 4 -

6"С

Санитарно-показательное состояние оценивали по' общему количеству (КОЕ) мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов — контаминантов и санитарно-показательных (индикаторных) бактерий. На рисунке 7, 8 представлены данные роста КОЕ смеси кровь : молочная сыворотка и стабилизированной фосфатами крови в процессе хранения при температуре 4 - 6°С.

Рис. 7. Изменение общего микробного числа в процессе хранения крови

Iя

■ 4

!

1ж ♦>»*♦ ■ ♦

Рис. 8. Изменение общего микробного смеси кровь : молочная сыворотка 1,5 :1,0 в процессе хранения

Показано, что внесение молочной сыворотки в кровь снижает количество контаминирующей микрофлоры. Как видно из рисунка 8 рост микроорганизмов — контаминантов достигает минимума на вторые сутки, тогда как в цельной крови после двух суток хранения начинается их рост (рисунок 7). Санитарно-показательные микроорганизмы, такие как Е. coli, Proteus vulgaris, Salmonella, Clostridium perfringens не обнаружены.

Результаты исследования смеси кровь : молочная сыворотка свидетельствуют о проявлении консервирующего эффекта в ней, что позволяет удлинить сроки хранения исследуемой смеси до 25-30 суток при температуре 4 - б°С.

2. Разработка способа получения тема

Исследование влнянин молочной сыворотки па степень гемолиза клеток крови. Изучали температурное воздействие на гемолитическую, устойчивость эритроцитов в присутствии молочной сыворотки. Объектом исследования служили смесь кровь : молочная сыворотка и в качестве контроля - кровь убойных животных, стабилизированная фосфатами. Дозу молочной сыворотки варьировали в количестве от 30 до 70 % к объему крови.

Устойчивость н целостность мембраны эритроцитов оценивали по изменению количества гемоглобина в среде инкубации. Результаты исследования степени гемолиза в зависимости от концентрации молочной сыворотки представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Изменение степени гемолиза в зависимости от концентрации _молочной сыворотки_■ _

Смесь кровь: мол. сыворотка, % Конц. Время инкубации 1 сут.

мол. 1 2 3 4 11

кис- Сте- Сте- Сте- Сте- Сте-

лоты, пень пень пень пень пень

% гемо лиза, % рн гемо лиза, % рН гемо лиза, % рН гемо лиза, % рН гемо лиза, % рН

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12

1:2. 1,64 59,1 3,60± 0,056 100 3,61± 0,025 100 3,61± 0,025 too 3,57± 0,025 100 3,42± 0,06*

1 : 1,5 1,404 41,1 3,77± 0,2 100 3,79± 0,043 100 3,79± 0,043 100 3,89± 0,055 100 3,64± 0,055

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 : 1 1,17 27,5 4,18± 0,093 60,1 . 4,19:Ь 0,035 60 4,18± 0,035 99,9 4,27± 0,035 100 3,84± 0,12*

1,5: 1 0,936 25,0 4,4 8± 0,056 59,3 4,48± 0,056 51,1 4,47± 0,007 60 4,43 ± 0,11 100 4,24± 0,1 Г

2 : 1 0,702 19,7 4,82± 0,18 23,3 4,8 4± 0,074 25,0 4,8 4± 0,055 30 4,79± 0,061 100 4,8± 0,025

1:0 0 0 7,89± 0,025 0 7,89± 0,025 40 7,88± 0?061 50 7,84± 0,075 80 7,94± 0,055

Обозначение: * - достоверно при р < 0,05

Результаты исследований свидетельствуют о протекании частичного гемолиза. Влияние концентрации молочной кислоты слабо выражено. Так, только на 11-е сутки инкубации наступает 100%-ный гемолиз клеток при концентрации молочной кислоты 0,7%, на 2-е сутки — при концентрации 1,64%.

Повышение температуры инкубации исследуемой смеси в существенной степени усиливает процесс гемолиза. Так при 37°С полный гемолиз во. всех пробах протекает за 2,5 часа, а при 45-50"С - за 5-15 минут. Таким образом, чувствительность эритроцитов к кислотному гемолизу определяется не только ей концентрацией, но и температурой инкубации.

Оценка степени деградации гемоглобина. Внесение в кровь молочной сыворотки - влияет на белки и буферные системы крови. Изучали влияние молочной сыворотки на степень деградации гемоглобина крови в процессе хранения.

Рис. 9. Изменение содержания гемоглобина при хранении смеси кровь : молочная сыворотка при температуре 4 - 6"С

-кровь; смеси кровь : молочная сыворотка в соотношениях:--1:2,5;

---1:1,5; -1:1;----1,5:1; -2,5:1

Рис. 10. Динамика накопления свободного гема смеси кровь : молочная сыворотка при температуре 4 - б°С смеси кровь : молочная сыворотка в соотношениях: --1:2,5;---1:1,5; -1:1;----1,5:1; .....2,5:1

Установлено, что увеличение содержания молочной сыворотки в исследуемых смесях приводит к снижению нативного гемоглобина, в среднем от 120 до 50 г/л в процессе их хранения (рисунок 9). Молочная кислота вносит, вероятно, основной вклад в процесс разрушения гемоглобина.

Установлено, что при длительном хранении обработанной крови наблюдается увеличение содержания свободного гема (рисунок 10). Содержание свободного гема зависит от соотношения крови : молочная сыворотка в исследуемой смеси, вероятно, оно зависит от концентрации молочной кислоты. Процесс отщепления гема не достигает расчетного максимума (таблице 6).

Таблица б • Сравнительный анализ содержания гема в контрольных __■■; и опытных пробах__

Смесь кровь : молочная сыворотка Содержание гема, млнч

контроль опыт

к, к2

1,0:2,5 19743±75,7 2121,б±70,2* .961,1 ±62.80

1,0:1,5 185б,4±80,75 2245,7±77,24' 720,8±25.60

1,0:1,0 1621,1±38,б 2173,3±63,2" 516,8±43.35

1,5:1,0 1973,1±42,2 2151,1±64,9" 317,3±29.40

2,5:1,0 1995,3±52,7 - 106,9±8.62

Обозначения: К1 - контроль, определяемый методом Хорисни; Кг -контроль - модифицированный метод Хорисни; опыт - данные на 25 сутки хранения. *- достоверно при р < 0,05

Модификация метода Хорнсни заключалась в следующем: вместо соляно-кислого ацетона использовали смесь ацетона и молочной кислоты

с целью моделирования процесса (К2), в опытных пробах извлечение тема вели только с помощью органического растворителя. Модельные опыты показали возможность увеличения выхода тема из крови,

3. Разработка рациональных режимов выделения гема

Влияние условий термостатирования на степень расщепления гемоглобина в исследуемой смеси кровь : молочная сыворотка. Для увеличения выхода гема исследуемую смесь, хранившуюся при'4°С - 6°С в течение 5-10 суток, тёрмо¿татаровали при 37°С. Влияние температуры на степень распада молекулы гемоглобина показано на рисунке 11. Процесс расщепления гемоглобина протекает при 37°С значительно интенсивнее, по сравнению с таковым при 4 - б°С. Степень потерь гемоглобина увеличивается до 90% после 3-х часов выдержки при 37°С.

Динамика содержания гема в исследуемой смеси, представленная на рисунке 12, не коррелирует с данными по потери гемоглобина при тех же условиях выдержки. Показано, что температура 37°С значительно влияет на скорость распада гемоглобина. Так, за три часа термостатирования исследуемой смеси, хранившейся в течение суток при температуре 4 -6°С, содержание гемоглобина составило 10% от исходного, а гема - 41% от значений, полученных в модельных экспериментах.

I t

-S—

±Е±

-I----

Рис. 11. Влияние температуры на содержание гемоглобина в исследуемой смеси

Рис. 12. Влияние температуры на содержание свободного гема в смеси кровь : молочная сыворотка в соотношении 1,5:1,0

Изучали возможность наиболее полного разрушения гемоглобина за счет увеличения в исследуемой смеси кровь : молочная сыворотка концентрации клеток Lactobacillus acidophilus 20Т путем внесения посевного материала. Для приготовления посевного материала использовали питательную среду, состоящую из крови и обезжиренного молока. Ацидофильную культуру вносили в количестве 3% (2,0-3,0 * 10*

КОЕ/мл). Из рисунка 13 видно, что продолжительность протекания процесса зависит от концентрации крови в обезжиренном молоке.

НИ

►1:1

Рис. 13. Влияние соотношений кровь : обезжиренное молоко на образование молочной кислоты клетками Lactobacillus acidophilus

Выбрана следующая схема подготовки посевного материала: Lactobacillus acidophilus 2ОТ культивировали на питательной среде кровь: обезжиренное молоко в соотношении 1:4 (20:80%) в течение 2-х суток при температуре 37°С. Доза внесения Lactobacillus acidophilus составляет 3% .(8,0*106- 1,0 * 107 КОЕ/мл). Полученный посевной материал вводили в исследуемую смесь кровь: молочная сыворотка в количестве 5,10 и 20% с последующим культивированием при 37°С. В процессе культивирования контролировали содержание гемоглобина и гема (рисунки 14,15).

Установлено, что доза посевного материала оказывает значительное влияние на процесс расщепления гемоглобина. Так, внесение 5% посевного материала уменьшает содержание гемоглобина за 3 часа культивирования, 10% - за 2,5 часа, 20% - за 1,5 часа. Содержание гема

1

Рис, 14. Влияние дозы посевного материала на содержание гемоглобина в смеси кровь : молочная сыворотка 1,5:1,0

Рис. 15. Влияние дозы посевного материала на содержание свободного гема в смеси кровь:молочная сыворотка 1,5:1,0

интенсивно увеличивается за 30 мин. и составляет 838,7 и 566,7 млн."1 ■ ч при внесении соответственно 10, 20% посевного материала и далее увеличивается незначительно.

Можно предположить, что отсутствие корреляции между содержанием гемоглобина и выходом гема объясняется тем, что часть свободного гема связывается с другими белками крови.

Внесение посевного материала в количестве 20% способствует в наибольшей степени накоплению свободного гема в исследуемой смеси. Однако внесение больших доз посевного материала является менее целесообразным с экономической точки зрения. Протекание процесса накопления свободного гема за 2 часа при внесении 10% посевного материала является приемлемым по временному фактору.

Оптимизация процесса получения препарата гема крови. Распад молекулы гемоглобина под воздействием молочной сыворотки обуславливает возможность получения препарата гема. Фракционирование компонентов крови проводили в три этапа: на первом - для лучшего извлечения пигмента и компонентов крови уменьшали ионную силу добавлением воды; на втором - проводили денатурацию белков и экстракцию гема с помощью ацетона; на третьем - повышали ионную силу путем внесения ЫаС1 и добивались четкого разделения крови на фракции:

1) ацетоновый раствор гема крови; 2) прозрачный водный раствор, дающий положительную реакцию на биуретовый реактив; 3) рыхлый светло-кремовый осадок белков.

Поиск оптимальных концентраций выбранных компонентов для фракционирования крови н их сочетания осуществляли с помощью скрипи нговых экспериментов. Для реализации плана факторного эксперимента ПФЭ2* в качестве критериев выбраны: содержание ацетона, натрия хлорида, воды. Выходным параметром служило остаточное содержание гема в 1г белка. Влияние компонентов на выделение гема крови исследовалось в диапазоне: ацетон - от 1 до 11 мл; натрия хлорид -от 0 до 0,66г; вода — от ] ,4 до 5,2 мл на 1г обработанной крови.

Установлено, что оптимальным вариантом является соотношение ацетон : вода 18 : 19 и концентрация поваренной соли 1,6 г. При этом достигается максимальный выход гема крови и минимальный расход ацетона.

4. Исследование аминокислотного состава выделенных белков смеси кровь : молочная сыворотка

Данные по аминокислотному составу выделенных белков (ОБ) и биостабилизированной крови (БСК) представлены в таблице 7.

Таблица 7 — Аминокислотный состав белков, выделенных из смеси кровь :

молочная сыворотка (ОБ) и биостабилизиро ванной крови (БСК)

Аминокислота Содержание аминокислот, г/ЮОг

белок ФАО/ВОЗ цельная кровь глобин крови ОБ БСК

Лизин 5,5 10,4 4,4 9,1 10,5

Гистидии - 6,4 1,7 5,0 5,3

Аргинин - 5,2 3,2 4,8 4,2

Ас пара ги новая кислота - 10,4 5,9 10,4 8,1

Триптофан - 1.4 0,7 - -

Треонин 4,0 6,8 4,0 5,0 4,9

Серии - 5,6 - 4,2 4,4

Глутаминовая кислота - 9,8 4,4 12,0 11,9

Пролин • 3,6 - 4,0 3,9

Глицин - 4,4 - 4,0 5,2

Алании - 8,6 - 7,5 7,7

Цистеин + цистин - 2,4 0,5 - -

Валин 5,0 7,2 5,4 13,1 12,7

Метионин 1,7 2,2 0,9 0,2 0,05

Изолейцин 4,0 1.4 - 1,41 1,4

Лейцин 7,0 10,2 9,8 13,0 12,2

Тирозин 6,0 3,4 1,7 0,5 0,6

Фенилаланин 6,8 3,1 6,7 ■ 6,9

Белки ОБ и БСК по химическому составу практически одинаковы. Сравнительный анализ аминокислотного состава БСК и ОБ с таковым эталонного белка ФАО/ВОЗ показал сохранение дефицита по двум незаменимым аминокислотам - изолейцину и метиошшу.

Увеличение таких аминокислот, как глютамнновая кислота, пролин, валин н лейцин по сравнению с цельной кровью происходит, вероятно, в результате их пополнения из пула свободных аминокислот и белков молочной сыворотки.

Показано, что практически все белки смеси концентрируются в осадке. Предлагаемый способ выделения гема позволяет наиболее полно осадить белки крови и молочной сыворотки.

5. Сравнительный анализ разработанного способа получения гема с методом Шалфея -Ненекого

Близким по сущности разработанному способу получения гема является общепринятый метод Шалфея — Ненекого. В таблице 8 представлены данные сравнения результатов применения предлагаемого нами метода и метода Шалфея-Ненекого.

Таблица 8 - Сравнительный анализ методов получения гема

Показатели Метод Шалфея — Ненекого Разработанный способ

Выход гема, г/100г крови 3,0-3,5 4,8-5,0

Содержание фрак ций белков в виде осадка +

Органическая кислота Ледяная уксусная -реактив, ч.д.а. Молочная кислота- продукт жизнедеятел ь ности Lactobacillus acidophilus

Раствор поваренной соли Насыщенный 3,8%

Соотношение кислота: кровь 5:1 1,0:1,5

Исходная концен > трация орган и ческой кислоты, % 100 0,85

Выделение гема Горячим фильтро ванием, t =90-95"С 50% -ный ацетон

Обозначение: «+» - есть осадок; «-» - нет осадка

Как водно из таблицы 8, разработанный способ позволяет увеличить выход гема в 1,5 раза, выделить белки крови и молочной сыворотки в виде осадка, не используя при этом агрессивные реактивы, такие как ледяная уксусная кислота, и значительно снизить концентрацию поваренной соли. Метод Шалфея — Ненекого для выделения гема предусматривает горячее фильтрование. В предлагаемом методе данная

стадия заменена гидрофобной экстракцией. В качестве экстр агента используется ацетон, объемы 50%-ного раствора которого в 4 раза меньше объемов 80-94%-ных растворов ацетона, применяемых в практике гидрофобных методов извлечения пигментов крови.

Выводы:

1. На основании исследований плазменно-коагуляционного состояния смеси кровь : молочная сыворотка в соотношении 1,5:1,0 и электрофоретнческой подвижности ее белков, установлено наличие антикоагуляционного эффекта компонентов молочной сыворотки, связанного с исключением из системы свертывания крови фибриногена.

2. Показана возможность применения в качестве биообъекта для биотехнологической обработки крови культуры молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus.

3. Показана возможность совмещения процессов антикоагуляции и консервирования крови. Установлен срок хранения смеси кровь : молочная сыворотка при температуре 4 - б°С до 30-ти суток,

4. Определены оптимальные условия для отделения гема от гемоглобина. Максимальное содержание гема в предлагаемой системе кровь ; молочная сыворотка достигается за счет внесения посевного материала в количестве не менее 10% от объема крови,

5. Определены оптимальные условия для выделения препарата гема и разработан биотехнологический способ его получения из крови крупного рогатого скота.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Бубеев А.Т., Данилова Т.Е., Цыренов ВХ Влияние молочной кислоты на жизнедеятельность клеток крови // Материалы Всероссийской молодежной научно-технической конференции <(Молодые ученые Сибири». Улан-Удэ, 2003. C.37-3S.

2. Иванова Е.Б., Бубеев А.Т., Данилова Т.Е., Цыренов В,Ж. Исследование физико-химических показателей процессов биологической утилизации яичной скорлупы // Материалы Всероссийской молодежной научно-технической конференции «Молодые ученные Сибири». Улан-Удэ, 2003. С 22.

3. Бубеев А.Т., Данилова Т.Е., Цыренов В.Ж. Биотехнологический способ получения металлопорфнрннов из крови И Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М., 2005. С.319-320.

4. Бубеев А.Т., Данилова Т.Е., Цыренов В.Ж. Технология получения основы микробиологических питательных сред // Материалы III

Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М, 2005. С.320-321.

5. Бубеев А.Т., Данилова Т.Е., Цыренов В.Ж. Новый способ обработки боенской крови // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Технология и техника агропромышленного комплекса». Улан-Удэ, 2005. C.I58-160.

6. Бубеев А.Т., Данилова Т.Е., Тарнуева Н.М. Биотехнологический способ предварительной обработки крови // Мясная индустрия. 2006. №2.

7. Пат. РФ №2265361. Способ предварительной обработки крови убойных животных / Т.Е. Данилова, А.Т.- Бубеев, Тарнуева, Н.М. В.Ж. Цыренов. Опубл. 10. 12. 2005, Бюл. №34,

С.51-54,

Подписано в печать 8.11.06г. Формат 60x84 1/16.

Усл.п.л.1,16. Тираж 100 экз. Заказ 239._

Отпечатано в типографии ВСГТУ. г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 42.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бубеев, Алексей Трофимович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Биохимические основы действия фибринолитической и свертывающей систем крови

1.1.1. Современные представления о механизме свертывания крови и тромбообразования

1.1.2. Фибринолитическая система крови

1.2. Предварительная обработка крови убойных животных

1.2.1. Стабилизация крови

1.2.2. Консервирование крови

1.2.3. Совмещенные способы стабилизации и консервирования крови

1.3. Прикладные аспекты использования крови на лечебные и пищевые цели

1.3.1. Биологическая ценность крови убойных животных

1.3.2. Биологические препараты из крови

1.4. Металлопорфирины

1.4.1. Строение металлопорфиринов

1.4.2. Способы получения порфиринов и металлопорфиринов 41 1.4.2.1. Гем крови как источник порфиринов 42 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ЛИТЕРАТУРНОМУ ОБЗОРУ 50 Цель и задачи исследования

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования и схема проведения эксперимента

2.2. Методы исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 61 3.1. Исследование влияния продуктов жизнедеятельности Lactobacillus acidophilus на свертывающую систему крови

3.1.1. Теоретические предпосылки использования молочной сыворотки в качестве антикоагулянта и консерванта

3.1.2. Исследование влияния компонентов молочной сыворотки на процесс коагуляции крови

3.1.3. Электрофоретические исследования белков смеси кровь : молочная сыворотка

3.1.4. Исследование бактериостатического действия молочной сыворотки

3.2. Разработка способа выделения гема

3.2.1. Исследование влияния молочной сыворотки на степень гемолиза клеток крови

3.2.2. Оценка степени деградации гемоглобина

3.3. Разработка рациональных режимов выделения гема

3.3.1. Влияние условий термостатирования на степень расщепления гемоглобина исследуемой смеси кровь : молочная сыворотка

3.3.2. Оптимизация процесса получения препарата гема крови

3.4. Исследование аминокислотного состава выделенных белков смеси кровь : молочная сыворотка

3.5. Сравнительный анализ разработанного способа получения гема с методом Шалфея -Ненского

3.6. Идентификация гема крови методом ИК-спектроскопии 118 ВЫВОДЫ 120 ПРИЛОЖЕНИЯ 121 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние молочной сыворотки на свертывающую систему крови убойных животных и разработка биотехнологического способа получения протопорфирина"

Кровь, как внутренняя среда организма выполняет весьма важные функции - транспорт газов, питательных веществ, конечных продуктов обмена, координацию и регуляцию биохимических процессов гемостаза и другие. Наличие в крови ответственных за эти процессы белков, ферментов, гормонов и других физиологически активных веществ обуславливает ее высокую биологическую ценность и специфические свойства. Поэтому кровь сельскохозяйственных животных относится к перспективным сырьевым источникам для производства пищевой, кормовой, медицинской и технической продукции.

Среди большого числа биологически активных веществ крови, которые можно с полным правом назвать «молекулами жизни», особое место принадлежит комплексным соединениям порфиринов с рядом металлов. К числу таких металлопорфиринов, в первую очередь, относится простетическая группа гемоглобина крови - гем или протопорфирин.

Особые свойства металлопорфиринов, в том числе и протопорфирина нашли широкое применение в разнообразных областях научных исследований, в промышленности красящих пигментов, полупроводников, катализаторов, биосенсеров.

Успехи в области практического использования, в частности, гема в значительной степени определяются способами его получения или выделения из крови. Практикуемые в настоящее время способы выделения гема из крови убойных животных, не позволяют достичь его максимально возможного выхода, и базируются на жестком физико-химическом воздействии на кровь, и не рассчитаны на переработку больших объемов крови. В последнем контексте проблемными становятся процессы разрушения гема до билирубина в результате порчи крови как микробиологической, так и автолитической, а также процессы предпочтительной ее механической стабилизации.

Практическая значимость гема, а также отсутствие доступного способа его производства определяют актуальность разработки способа получения гема на основе комплексного подхода к процессам стабилизации, консервирования крови убойных животных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Бубеев, Алексей Трофимович

ВЫВОДЫ

1. На основании исследований плазменно-коагуляционного состояния смеси кровь : молочная сыворотка в соотношении 1,5:1,0 и электрофоретической подвижности ее белков, установлено наличие антикоагуляционного эффекта компонентов молочной сыворотки, связанного с исключением из системы свертывания крови фибриногена.

2. Показана возможность применения в качестве биообъекта для биотехнологической обработки крови культуры молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus.

3. Показана возможность совмещения процессов антикоагуляции и консервирования крови. Установлен срок хранения смеси кровь : молочная сыворотка при температуре 4 - 6°С до 30-ти суток.

4. Определены оптимальные условия для отделения гема от гемоглобина. Максимальное содержание гема в предлагаемой системе кровь : молочная сыворотка достигается за счет внесения посевного материала в количестве не менее 10% от объема крови.

5. Определены оптимальные условия для выделения препарата гема и разработан биотехнологический способ его получения из крови крупного рогатого скота.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ЛИТЕРАТУРНОМУ ОБЗОРУ

Анализируя литературные данные, можно сделать вывод, что кровь убойных животных является биологически ценным сырьем, богатым БАВ, такими как белки, ферменты, гормоны, витамины и другие. Однако, получение биологически активных веществ из крови затруднено в силу ее специфических свойств, наиболее выраженными из которых является способность свертываться при ее изъятии из кровеносных сосудов и быстро контаминироваться микроорганизмами окружающей среды.

В настоящее время существуют разнообразные способы предварительной обработки крови убойных животных, где в качестве антикоагулянтов и консервантов используют химические и биологические вещества. Химическая природа и механизм их действия на свертывающую систему крови различны. Механизм ингибирования некоторых факторов свертывания крови в деталях до сих пор еще неясен. В живом организме действует эффективный противосвертывающий компонент - плазмин, разрушающий фибрин.

Используемые способы предварительной обработки крови имеют свои преимущества и недостатки. Важным этапом в развитии проблемы использования крови и ее компонентов для практических целей остается поиск новых и эффективных веществ, совмещающих процессы ее стабилизации и консервирования. Перспективными источниками БАВ, обладающими данными свойствами считаются микроорганизмы. Однако, таких разработок на данный период времени не так много. Использование химической активности микроорганизмов позволит увеличить объемы дешевых антикоагулянтов и консервантов, которые смогут расширить область применения крови как источника различных БАВ. Одним из таких веществ является гем крови, важные и сложные биологические и физико-химические функции которого, выполняемые в организме указывают на его уникальность и убеждают в его значимости для новых направлений науки и техники, таких как нанотехнология и биомедицина, что в свою очередь позволяет поставить его в один ряд с белками, нуклеиновыми кислотами, углеводами и липидами.

В настоящее время синтез металлопорфиринов осуществляется из готовых лигандов и солей металлов. Порфириновые лиганды получают либо из природных источников, либо методами химического синтеза. Последние используются в основном для получения фталоцианина.

В основе способов получения порфириновых лигандов из крови лежат механизмы разрушения кооперативной укладки гидрофильной и гидрофобной частей гемоглобина. При этом используются агрессивные среды, и выход гема составляет 50-60% от содержания его в крови.

Существующие методы выделения гема, протопорфирина и его производных из крови убойных животных не рассчитаны на их получение в промышленных масштабах.

Цель и задачи исследования

Целью работы явились изучение влияния молочной сыворотки на свертывающую систему крови и разработка способа выделения гема из крови убойных животных на основе методов биотехнологии.

Для выполнения поставленной цели были определены следующие задачи: исследовать плазменно-коагуляционное и фибринолитическое состояния крови при внесении молочной сыворотки; исследование бактериостатического действия молочной сыворотки; оценить влияние молочной сыворотки на молекулу гемоглобина; обосновать возможность использования молочной сыворотки для получения гема; провести оптимизацию процесса выделения гема из крови; изучить физико-химические свойства гема; разработать способ выделения гема из обработанной крови.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования и схема проведения эксперимента

Исходным сырьем для получения гема и комплекса белков служили:

1 - вторичное сырье мясоперерабатывающих предприятий - кровь крупного рогатого скота;

2 - вторичное сырье молокоперерабатывающих предприятий -обезжиренное молоко;

3 - культура молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus 20Т.

Молочную сыворотку получали путем фракционирования сквашенного при 37°С чистыми культурами Lactobacillus acidophilus обезжиренного молока до достижения титруемой кислотности 260-270°Т. Выход сыворотки составлял 70%.

Молочнокислые продукты как правило вырабатываются с кислотностью 80-120°Т. Превышение допустимых пределов титруемой кислотности регламентируется НТД. В связи с чем, молочную сыворотку титруемой кислотностью 260-270°Т относят к некондиционному сырью. В таблице 5 представлены экспериментальные данные по химическому составу молочной сыворотки с титруемой кислотностью 260-270°Т.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бубеев, Алексей Трофимович, Улан-Удэ

1. Аграненко В.А., Федорова Л.И. Замороженная кровь и ее клиническое применение. М.: Медицина, 1983. - 96с.

2. Адлер Ю.П., Маркова Е.В., Грановский Ю.В. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий. М.: Наука, 1976. - 279с.

3. Алиев С.А., Салаватуллина P.M. Использование молочных белков при производстве мясных продуктов. М.: Мясная промышленность, 1981. -24с.

4. Антимикробная активность штаммов молочнокислых бактерий из кисломолочных продуктов «Наринэ», «Каринэ» и «Мацун» // А.О. Мартиросян, Ш.Л. Миджоян, Л.М. Чарян, Л.Г. Акопян, М.Н. Никищенко / Прикладная биохимия и микробиология, 2004, т.40, №2, с. 210-213

5. Антипова Л.В. Биотехнологические аспекты рационального использования вторичного сырья мясной промышленности. М.: Пищевая промышленность, 1991. - 128с.

6. Антипова Л.В. и др. Прикладная биотехнология. Санкт-Петербург: Медицина, 2003, с. 181-185.

7. Антипова Л.В., Глотова И.А., Рогов И.А. Методы исследования мяса и мясных продуктов. М.: КолосС, 2004. - 571с.

8. Антипова Л.В, Жеребцова Н.А. Биохимия мяса и мясных продуктов: Учеб. пособие. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1991. - 184с.

9. Ашмарин И.П., Мюльберг А.А., Садикова Н.В., Сытинский И.А. Химия белка. Ленинград: ЛОЛГУ, 1968, ч.1. - 196с.

10. Балаховский С.Д., Балаховский И.С. Методы химического анализа крови. -М.: Медгиз, 1953.-750с.

11. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Томск. 1980.

12. Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы.- 2-е изд., перераб. и доп.- М.: Медицина, 1988.- 528с.

13. Беккер М.Е. Введение в биотехнологию. М.: Пищевая промышленность, 1978, с. 223-225.

14. Биологическая оценка кормовой муки, полученная по новой технологии/ (П.С. Гаевой, А.И. Сницарь, Э.Г Стинчук и др.). Мясная индустрия СССР, 1974, №5, с. 38-39.

15. Биохимические методы исследования в клинике (справочник) / Под ред. акад. АМН СССР, проф. А.А. Покровского. М.: Медицина, 1969. - 317с.

16. Биохимия мяса. Павловский П.Е. Пальмин В.В. М.: Пищевая промышленность, 1975, 345с.

17. Бородкин В.Ф. Химия красителей. М.: Наука, 1981. - 21с.

18. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов / Перевод с англ. В.Д. Цырендамбаева; под. ред. М.Н. Запрометова. М.: Мир, 1986. - 422с.

19. Быховский В.Я., Жимина Т.Н. Прикладная биохимия и микробиология. -М.: Наука, 1983.- 103с.

20. Гершанович В.Н. Биохимические и генетические основы переноса углеводов в бактериальной клетке. -М.: Медицина, 1973. 123с.

21. Гершанович В.Н. Транспорт аминокислот, полипептидов и органических кислот у бактерий. М.: Медицина, 1997. - 184с.

22. Голубчиков О.А., Березин Б.Д. Координационная химия сольватационных солей переходных металлов. М.: Наука, 1987. - 324с.

23. Горбатов В.М. Использование крови за рубежом. М.: Пищевая промышленность, 1981, 153 с.

24. Горбатов В.М. Сбор, обработка и использование крови на пищевые цели. М.: Пищевая промышленность, 1971, 174с.

25. Горбатов В.М., Мамонов Н.Д. Обработка и использование крови на пищевые цели. М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1979, с. 22.

26. Горбатов В.М., Попов В.А. Использование крови за рубежом. М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1981, с. 16.

27. Горбатова К.К. Химия и физика молока. Учебник для ВУЗов. СПб.: ГИОРД, 2003.-288с.

28. Грачев Ю.П. Математические методы планирования экспериментов. -М.: Пищевая промышленность, 1979. 200с.

29. Гусев М.В. Микробиология. М.: Академия, 2003. - 464с.

30. Данилова Т.Е. и др. Методические указания к практикуму по курсу «Общая биотехнология». У-Удэ: ВСГТУ, 2000. - 82с.

31. Евстафьева Е.А., Миталева С.И., Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д. / Выделение белков боенской крови с оптимальным аминокислотным составом. Мясная индустрия. - №10,2001. - 15-16с.

32. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учебник. М.: Изд-во МГУ, 1994.-512с.

33. Жибурд Е.Б. Трансфузиология. Санкт-Петербург: Медицина, 2002, 685с.

34. Житенко П.В. Переработка и хранение продуктов животноводства. М.: Пищевая промышленность, 1986. - 201с.39Журавская Н.К., Алехина Л.Т., Отряшенкова JI.M. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов. М.: Агропромиздат, 1985. -296с.

35. Зайцев К.П., Подсобляева JI.A. Переработка отходов мясокомбинатов методом биосинтеза. ЦНИИТЭИмясомолпром, (Экспресс-информация мясной промышленности) 1982, №2, с. 10.

36. Залашко М.В. Биотехнология молочной сыворотки. М.: Наука, 1990. -197с.

37. Заривчацкий М.Ф. Основы трансфузиологии. Пермь: Издательство Пермского университета, 1995, 220с.

38. Землянухин А.А. Малый практикум по биохимии: Учеб. пособие. -Воронеж: Изд-во ВГУ, 1985. 128с.

39. Зубаиров Д.М., Свинтенок Г.Ю.и др. Нарушение липидной ассиметрии при термогемолизе эритроцитов человека// Гематология и трансфузиология. 2003. - т.48. - №3. - с. 33-35.

40. Ильина А.В., Варламов В.П. Гидролиз хитозана в молочной кислоте / Прикладная биохимия и микробиология, 2004, т.40, №3. 354-358с.

41. Инихов Г.С., Врио Н.П. Методы анализа молока и молочных продуктов. -М.: Пищевая промышленность, 1971. 423с.

42. Иоффе Б.В., Костюков P.P. Физические методы определения органических соединений. М.: Высш. школа, 1984. - 336с.

43. Иржак Л.И. Гемоглобины и их свойства. М., Наука, 1975г., 240с.

44. Исследование системы крови в клинической практике (Под ред. Г.И. Козинца и В.А. Макарова). М.: Триада - X, 1997. - 480с.

45. Источники пищевого белка. М.: Колос, 1979, с. 302.

46. Кауфман О.И. Порфирины: структура, свойства, синтез. М.: Наука, 1985.-257с.

47. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. М.: Наука, 1975,384с.

48. Квасников J1.B. Метаболизм молочнокислых бактерий. М.: Наука, 1980. -225с.

49. Клинико-диагностическое значение лабораторных показателей / Долгов В., Морозова В., Марцишевская Р., Мадрала А., Якубовский 3., Кабата И., Каменовский Л., Щепаньская-Конкель М., Ангельский С. М.: Центр, 1995.-223с.

50. Козинец Г.И. и др. Кровь и инфекции. М.: Триада - фарм, 2001.- 456с.

51. Костенко Ю.Г., Нецепляев С.В., Гончарова Л.А. Основы микробиологии, гигиены и санитарии на предприятиях мясо- и птицеперерабатывающей промышленности. -М.: Легкая пищевая промышленность, 1984. 173с.

52. Криштафович В.И., Жебелева И.А., Колобов С.В., Любов А.В. Потребительские свойства белков на основе крови Мясная индустрия. -№6, 2003. -20-22с.

53. Крылова Н.Н., Лясковская Ю.Н. Физико-химические методы исследования продуктов животного происхождения. М.: Наука, 1961. -134с.

54. Кудряшов Б.А. Биологические проблемы регуляции жидкого состояния крови и ее свертывания. -М.: Медицина, 1975. 488с.

55. Лабораторные методы исследования системы гемостаза / Под ред. Е.Д. Гольдберга. Томск: Б. и., 1980.- 313с.

56. Либерман С.Г. Переработка крови убойных животных на мясокомбинатах. -М.: Пищевая промышленность, 1980, 350с.

57. Либерман С.Г., Пожариская Л.С., Файвишевский М.Л. Переработка крови убойных животных на мясокомбинатах. М.: Пищевая промышленность, 1980, с. 3,9,13.

58. Лукачевский Б.П. и др. Немецкие пищевые фосфаты на российском рынке //Мясная индустрия. М. 1999. №8, с. 23-24

59. Любченко В.И., Прянишников В.В., Лебедева Е.Ю., Шефов Д.А., Лобанова Н.Б., Озимовски П. Новые животные белки, поставляемые фирмой «Могунция» Мясная индустрия. - №2,2002. - 39-41с.

60. Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы технологии микробиологических производств. М.: Агропромиздат, 1990. - 272с.

61. Математические модели и ЭВМ в микробиологической практике / Ю.Р. Малашенко, Ф.В. Мучник, В.А. Романовская, Ю.С. Садовников. Киев.: Наук, думка, 1980,- 196с.

62. Мдинарадзе Т.Д. и др. Получение обесцвеченных белков из форменных элементов крови. Мясная индустрия СССР, 1983, №5, с. 21-23.

63. Мдинарадзе Т.Д., Салаватулина P.M., Масхулия A.M. Получение обесцвеченных белков из форменных элементов крови. Мясная индустрия СССР, 1983, №5, с. 21-23.

64. Медведев В.В., Волчек Ю.З. Клиническая лабораторная диагностика. Справочник для врачей. СПб.: Гиппократ, 1995. - 532с.

65. Меньшикова В.В. Руководство по клинической лабораторной диагностике. М.: Медицина, 1982. - 104с.

66. Месхи А.И. Биохимия мяса, мясопродуктов и птицепродуктов. М.: Наука, 1994.- 128с.

67. Метаболизм микроорганизмов: Учеб. пособие/ Под ред. Н.С. Егорова. -М.: Изд-во Моск. ун-та, 1986. 256с.

68. Методы исследования фибринолитической системы крови / (Г.В. Андреенко, М.Н. Карабасова, Л.В. Лютова и др.); Под. ред. Г.В. Андреенко. М.: Изд-во МГУ, 1981. - 132с.

69. Овчинников А.И., Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов. Ленинград, Изд-во Ленинградского университета, 1974.- 242с.

70. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981.-288с.

71. Пальмин В.В., Петрова О.Н. Получение пищевого альбумина из крови животных. Мясная индустрия СССР, 1972, №3, с. 33-35.

72. Патент №2063971, Ениилокопян

73. Передера Б.Я. Препараты крови. Киев: Урожай, 1980. - 102с.

74. Пожариская J1.C. Кровь убойных животных и ее переработка. М.: Агропромиздат, 1971,416с.

75. Пожариская JI.C., Либерман С.Г., Горбатов В.М. Кровь убойных животных и ее переработка. -М.: Пищевая промышленность, 1971.-423 с.

76. Порфирины: спектроскопия, электрохимия, применение. (К.А. Аскаров, Березин Б.Д., Е.В. Быстрицкая и др.); Отв. ред. Н.С. Ениилокопян; АН СССР, Ин-т хим. физики. М.: Наука, 1987. - 382,1.с.

77. Порфирины: структура, свойства, синтез / (Аскаров К.А., Березин Б.Д., Евстигнеева Р.П. и др.). Отв. ред. Н.С. Енилокопян. М.: Наука, 1985. -333с.

78. Пособие по трансфузиологии /Под ред. O.K. Гаврилова. М.: Медицина, 1980.- 159с.

79. Поцелуева Н.В. и др. В поддержку натуральных красителей/ Мясная индустрия, 2003, №12, С. 13.

80. Практикум по физико-химическим методам анализа / Под ред. О.М. Петрухина. М.: Химия, 1987. - 248с.

81. Рафалес Ламарка Э.Э., Николаев В.Г. Некоторые методы планирования и математического анализа биологических экспериментов. - Киев: Наукова думка, 1971. - 93с.

82. Роберте Д.Д. и др. Основы органической химии. М.: Мир, 1978. - 126с.

83. Рогов Н.К., Журавская Н.К. и др. Современные тенденции, использования белковосодержащего сырья животного и растительного происхождения при производстве мясных продуктов. М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1981. -32с.

84. Роговин В.В. и др. Пероксидазосомы / В.В. Роговин, J1.A. Пирузян, Р.А. Муравьев. М.: Наука, 1977с. - 205с.

85. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учеб. пособие / Под ред. Н.С. Егорова. -3-е изд., перераб. и доп. М.: Изд - во МГУ, 1995.-224с.

86. Руководство по клинической лабораторной диагностике / Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1982. - 576с.

87. Русанов В.М., Скобелев Л.И. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови. М.: Медицина, 1983. - 224с.

88. Салаватулина Р.И. Рациональное использование сырья в колбасном производстве. М.: Агропромиздат, 1985, 287с.

89. Санитарная микробиология / Н.В. Билетова, Р.П. Корнелаева, Л.Г. Кострикина и др. Под ред. С.Я. Любашенко. М.: Пищевая промышленность, 1980.-352с.

90. Слюсаренко Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств. М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1984. - 97с.

91. Смирнов Б.Р. Порфирины: спектроскопия, электрохимия, применение. — М.: Наука, 1987.-126с.

92. Смит А. Прикладная ИК-спектроскопия. М.: Мир, 1982. - 328с.

93. Современные методы сбора и переработки крови за рубежом / (C.F. Либерман, М.Л. Файвишевский, Т.Д. Гринберг и др.). М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1979, с. 1-26.

94. Современные тенденции и использование крови за рубежом / (В.А Алексахина, М.Л. Файвишевский, Т.Д. Мдинарадзе и др.). М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1982,39 с.

95. Соловьев К.Н. Гладков Л. Л. Спектроскопия порфиринов: колебательные состояния. М.: Наука, 1989. - 350с.

96. Стародуб Н.Ф., Назаренко В.И. Гетерогенная система гемоглобина: Структура, свойства, синтез, биологическая роль / АН УССР, Ин-т молекул, биологии и генетики. Киев: Наук, думка, 1987. - 198, 2.с.

97. Судаков Н.В. Переработка и использование крови убойных животных. М.: Агропромиздат, 1986. - 79с.

98. Сухая осветленная кровь и белковая смесь на ее основе как дополнительный источник пищевого белка / (П.М. Майструк, Г.И. Соломко, Н.Ф. Осадчая и др.). К.: Здоровье, 1980, вып. 15, с. 10.

99. Трансфузионная гематология / Под ред. д.м.н., проф. В. Серафимова -Димитрова/ София: Медицина и физкультура, 1974, 402с.

100. Ужанский Я.Г. Физиологические механизмы регенерации крови. М.: Медицина, 1968. - 265с.

101. Файвишевский M.JI. Переработка крови убойных животных М., Агропромиздат, 1988,254с.

102. Файвишевский M.JL, Войнов А.В. Новое в технологии и технике переработки крови в СССР и за рубежом. М.: АгроЦНИИТЭИММП,1986.-34с.I

103. Файвишевский M.JL, Кузьменко Н.П. Новый способ переработки технической крови Мясная индустрия. - №6, 2001. - 29-30с.

104. Файвишевский М.Л., Либерман С.Г. Производство животных кормов. -М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. 327 с.

105. Филатов А.Н., Богомолова Л.Г., Андрианова И.Г. Сухая плазма крови и ее применение с лечебной целью. М.: Медицина, 1964. - 145с.

106. Хилль Г.Н., Пархомчук М.А. Красители для пищевых продуктов. М.: Мир, 1989.-5с,

107. Шурыгин А.Я. Биотехнологические аспекты рационального использования вторичного сырья мясной промышленности. М.: Пищевая промышленность, 1991. - 128с.

108. Эффективное использование крови / (В.М. Горбатов, P.M. Салаватулина, Т.М. Овсянникова и др.). Мясная индустрия СССР, 1978, №3, с. 17-20.

109. Ярцев Е.И. Порфирины: спектроскопия, электрохимия, применение. -М.: Наука, 1987.-202с.

110. Agerholm-Larsen L, Raben A, Austrup A. Effect of 8 week intake of probiotic milk products on risk factors for cardiovascular deseases. Eur J Clin Nutr. 2000 Apr; 54(4): 288-97.

111. Ajioka RS, Phillips JD, Kushner JR. Biosynthesis of heme in mammals. Biochim Biophys Acta. 2006. Jul; 1763(7):712-24.

112. Aleman EA, Rajesh CS, Ziegler CJ, Mondarelli DA. Ultrafast spectroscopy of free-base N-confused tetraphenylporphyrins. J Phys Chem A Mol Spectrosc Kinet Environ Gen Theory. 2006 Jul 20; 110(28): 8605-12.

113. Alontaga AY, Bunce RA< Wilks A, Rivera M. 13C NMR spectroscopy of core heme carbons as a simple tool to ekucidate the coordination state of ferric high-spin heme proteins. Inorg Chem. 2006 Oct 30;45(22): 8876-81

114. Anderson KE, Collins S. Open-label study of hemin for acute porphyria: clinical practice implications. Am J Med. 2006 Sepl 19(9):801.

115. Aranda R4th, Levin EJ, Schotte F, Anfinrud PA, Phillips GN Jr. Time-dependent atomic coordinates for the dissociation of carbon monoxide from myoglobin. Acta Crysstallogr D Biol Crisstallogr. 2006 Jul; 62 (Pt7):776-83.

116. Asayama S, Kawamura E, Nagaoka S, Kawakami H. Design of manganese porphyrin modified with mitochondrial signal peptide for a new antioxidant. Mol Pharm. 2006 Jul-Aug;3(4):468-70

117. Awan MA, Tarin SA. Review of photodynamic therapy. Surgeon. 2006 Aug; 4(4):669-76

118. Barannik TV, Inshina Nm, Kaliman PA. Free heme pool and activity of key enzyme of heme synthesis in the rat liver under action of agents affecting reduced glutathione level. Ukr. Biochim Zh. 2005 Sep-Oct;77(5): 120-2

119. Bleau C, Lamontagne L, Savard R. New Lactobacillus acidophilus isolates reduce the release of leptin by murine adipocytes leading to lower interferon-gamma production. Clin Exp Immunol. 2005 Jun; 140(3): 42-35

120. Braig T.W. Food ingredient alternatives in milk substitutes American diary review, 1975, 37 №2, pp. 40-43.

121. Budagov RS, Ulianova LP, Pospelova VV. The protective activity of a new variant of the probiotic Acilact in exposure to ionizing radiation and anticancer chemotherapy under experimental conditiones. Vestn Ross Akad Med Nauk. 2006;(2):3-5.

122. Challa JR, Gunaratne TC, Simpson MC. State preparation and excited electronic and vibrationakl behavior in hemes. J Phys Chem В Condens Matter Surf Interfaces Biophys. 2006 Octl2; 110 (40): 19956-65.

123. Chen J, Collier CP. Noncovalent functionalization of single-walled carbon nanotubes with water-soluble porphyrins. J Phys Chem В Condens Matter Mater Surf Interfaces Biophys. 2005 Jul 28;109 (16):7605-9.

124. Chen Y, Liang Q, Arciero DM, Hooper AB, Timcovich R. Heme crevice disorder after sixth ligand displacement in the cytochrome c-551 family. Arch Biochem Biophys. 2006 Okt 16.

125. Chiavarino В, Crestoni ME, Fornarini S, Rovira C. Protonated Heme. Chemistry. 2006 Oct 16.

126. Clancy RL, Gleeson M, Cox A. Reversal in fatigued athletes of a defect in interferon gamma secretion after administration of Lactobacillus acidophilus. Br J Sports Med. 2006 Apr; 40(4):351-4.

127. Cukovic-Cavka S, Likic R., Francetic I., Rustemovic N, Opacic M., Vucelic B. Lactobacillus acidophilus as a cause of liver abscess in a NOD2/CARD15-positive patient with Crohn's disease. Digestion. 2006; 73 (2-3):357-66.

128. Cunstone J. Usury blood plasma. The national provisioner. 1980, 1982, №23, p. 20.

129. Ermens AAM, Wild P., Vader H.L., et all. Four Agglutination Assay Evaluated for Measurement of Von Willebrand Factor (Ristocetin cofactor activity). Clin. Chem, 1995,41,4, 510-514.

130. Estive F, Grimaux M, Migand-Fressart M., et all. Individual and Quantitative Rapid Testing of D-dimer Using an Automated Sistem. Fibrinolysis. 1996, 10, suppl. 3, 95.

131. Grunvald EW, Richards MP. Mechanizms of heme protein-mediated lipid oxidation using hemoglobin and myoglobin variants in raw and heated washed muscle. J Agric Food Chem. 2006 Oct 18;54 (21):8271-80.

132. Haider P, Trent JT3rd, Hargrove MS. Influence of protein matrix on intramolecular histidin ligation in ferric an d ferrous hexacoordinate hemoglobins. Proteins. 2006 Oct 16.

133. Ivanov I.I. (1999) Biochim. Biophys. 1415, 349-360.

134. Janosi L, Kostzin I, Damjanovic A. Theoretical prediction of spectral and optical properties of bacteriochlorophylls I n thermally disordered LH2 antenne complexes. J Chem Phys. 2006 Jul 7;125(1):014903.

135. Larsen J, Bruggemann B, Polivka T, Sundstrom V. Energy transfer within Zn-porphyrin dendrimers: study of the singlet annihilation kinetics. J Phys Chem A Mol Spectrosc Kinet Environ Gen Theory. 2005 Dec 1; 109.

136. Lewis SJ, Burmeister S. A double-blind placebo-controlled study of the effects of Lactobacillus acidophilus on plasma lipids. Eur J Clin Nutr. 2005 Jun; 59(6): 776-80.

137. Li W. Wang YB, Yang LY, Kiefer W. Spectroscopic and computational studies on the coordination-driven self-assembly complexes (ZnL)2 and (NiL)2. J Phys Chem В Condens Matter Mater Surf Interfaces Biophys. 2006 Nov 2:110 (43):21958-65.

138. Li WL, Brackett BG, Halper J. Culture supernatant of Lactobacillus acidophilus stimulates proliferation of embryonic cells. Exp. Biol Med (Maywood). 2005 Jul; 230(7) 494-500.

139. Liao MS, Watts JD, Huang MJ. Fe(II) in different macrocycles: electronic structures and properties. J Phys Chem A Mol Spectrosc Kinet Environ Gen Theory. 2006 Sep 8; 110(35): 7988-8000.

140. Lim AR, Sishta BR Graunt Mauk A. Contribution of the heme propionate groups to the electronic transfer and electrostatic properties of myoglobin. J Inorg Biochem. 2006 Sep 20.

141. Marshall-Jones Z.V., Baillon M.L., Croft J.M., Butterwick R.F. Effects of Lactobacillus DSM 13241 as a probiotic in healthy adult cats. Am J Vet Res. 2006 Jun; 67(6); 1005-12.

142. Mdinaradze T.D., Davidova E. S., N.N. Nadashvili and Aleksidze H.G. Isolation properties and usage of bleached blood cell protein and its prospective use for feed and food production. USSR. August 1981, pp. 109-116.

143. Могу Т., Takeya H., Nishiora J., et all. G2 Glucoprotein I modulates the Anticoagulant Activity of Activated-Protein С on Phospholipid Surface, Thromb. Haemost., 1996, 75, 1,49-55.

144. Parknutik V, Chirvony V, Matveyeva E. Optical properties of porphyrin molecules immobilbzed in nanoporous silicon. Biomol Eng/ 2006 Jun2.

145. Perdigon G., Maldonado Galdeano C., Valdez J.C., Medici M. Interaction of lactic acid bacteria with the gut immune system. Eur. J. Clin. Nutr. 2002. Dec.; 56. Suppl 4:S21-6.

146. Pestka J. J., Ha CI, Warner R. W., Lee J.H., Ustunol Z. Effects of ingestion of yogurts containing Bifidobacterium and Lactobacillus acidophilus on spleenand Peyer's patch lymphocyte populations in the mouse. J. Food Prot. 2001. Mar.;64(3):392-5.

147. Popescu R, Mispelter J, Gallay J. Molecular dynamics assignment of NMR correlation times to specific motions in a 'basket-handle porphyrin' heme. J Phys Chem В Condens Matter Mater Surf Interfaces Biophys. 2005 Feb 24; 109 (7):2995-307.

148. Sanders M.E., Klaenhammer T.R. Invited review: the scientific basis of Lactobacillus acidophilus NCFM functionality as a probiotic. J Dairy Sci. 2001 Feb; 84 (2) :319-31. Review.

149. Silva AM, Lacerda PS, Tome AC, Neves MG. Porphyrins in 1.3-dipolar cycloaddition reactions. Synthesis of new porphyrin-chlorin and porphyrin-tetraazachlorin dyads. J Org Chem. 2006 Oct 27;71(22):8352-6.

150. The conformational dynamics of the tetramer hemoglobin molecule vas revealed by hydrogen exchange. Influence of the heme removal. Mol. Boil (Mosk). 2006 Sep-Oct; 40(5): 900-9. Russian.

151. Vilaichone R.K., Mahachai V., Tumwasorn S., Nunthapisud P., Kullavanijaya P. Inhibitory effect of Lactobacillus acidophilus on Helicobacter pylori in peptic ulcer patients: in vitro study. J. Med. Assoc. Thai/ 2002. Jun.; 85 Suppl l:S79-84.

152. Youn H, Conrad M, Chong SY, Roberts GP. Roles of the heme and heme ligands in the activation of CooA, the СО-sensing transcriptional activator. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Sep 22:348(2):245-50.

153. Zhuang J, Reddi AR, Khodaverdian B, Hegg EL. Evaluation the roles of the heme a side chains in cytocrome с ozidase using designed heme proteins. Biochemistry. 2006 Oct 17;45(41):12530-8.i I