Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние модуляции пресинаптического выброса нейротрансмиттера на возбуждающую синаптическую передачу в гиппокампе крыс

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние модуляции пресинаптического выброса нейротрансмиттера на возбуждающую синаптическую передачу в гиппокампе крыс"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ Ш. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

Копаниця Максим Володимирович

УДК 577.352:612.822.3

ВПЛИВ МОДУЛЯЦІЇ ПРЕСИНАПТИЧНОГО ВИВІЛЬНЕННЯ НЕЙРОТРАНСМГТЕРА НА ЗБУДЖУЮЧУ СИП АНТИЧНУ ПЕРЕДАЧУ В ГШОКАМШ ЩУРІВ

03.00.02 - Біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фізико-хімічної біології клітинних мембран

Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор біологічних наук

КРИШТАЛЬ Олег Олександрович Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран

Офіційні опоненти: чл.-кор. НАН та АМН України, доктор медичних наук, професор

КОМІСАРОВ Ігор Васильович Донецький державний медичний університет зав. кафедрою фармакології

доктор біологічних наук

ВЕСЕЛОВСЬКИИ Микола Сергійович

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології

нервової системи

Провідне установа: Національний Університет ім. Т. Г. Шевченка, біологічний факультет,

кафедра біофізики, м. Київ

Захист відбудеться СІЬ ■ &ЛММ&'______________________________1998 р. о " годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім. О. О.

Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця

НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

Автореферат розісланий" $ " іЛМУ/72£%0__________ 1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук

Сорокіна-Маріна 3. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Сучасний розвиток методів фізико-хімічної біології у вивченні синаптичної передачі на слітинному, субклітинному та молекулярному рівнях дозволив грунтовно дослідити такі фундаментальні процеси, як синтез, депонування, викид нейромедіаторів, а також особливості їх ізаємодії з мембранними рецепторами (Комиссаров, 1986). Надзвичайна важливість синаптичних іроцесів у чисельних фізіологічних реакціях організму зумовлює необхідність докладного юсліджешія механізмів пре- та постсинаптичної модуляції синаптичної передачі, особливо іважаючи на те, що в сучасній медицині використовується велика кількість нейроактивних сполук.

Актуальність теми. Нейромедіаторна система збуджуючих амінокислот, зокрема, L-'лутамату та L-аспартату, є чільною збуджуючою системою головного мозку та відіграє важливу юль у регуляції психічних функцій, моторної активності, сприйнятті сенсорної інформації та нших фізіологічних актах (Петров и др., 1997). Довготривала потенціація синаптичної передачі та іроцеси запам’ятовування також залежать від активації рецепторів збуджуючих амінокислот bliss & Collingridge, 1993). Чисельні патологічні прояви, зокрема судомні стани, ішемічні юшкодження головного мозку, деякі харчові отруєння пов’язані з порушенням нормальної роботи 'лутаматергічної нейропередачі (Петров и др., 1997).

Особлива роль в індукціїї нейродегенеративних змін відводиться підтипу глутаматних Рецепторів, що вибірково активуються Л^-мєтил-О-аспартатом, тобто NMDA рецепторам. Унікальність цих рецепторів полягає в їх чутливості до іонів магнію, а також у здатності каналів, до входять до складу рецепторного комплексу, пропускати іони кальцію (McBain & Mayer, 1994). Зважається, що перевищення певного рівня внутрішньоклітинної концентрації Саг+, котре іідбувається завдяки активації NMDA рецепторів, запускає низку біохімічних реакцій, які згодом тризводять до загибелі нейронів (Choi, 1995; Schousboe et al., 1997). Зважаючи на вирішальну роль )ецепторів збуджуючих амінокислот у виникненні багатьох неврологічних хвороб, ліганди цих )ецепторів активно випробовуються як протисудомні, протигіпоксичні та анальгетичні засоби Muir & Lees, 1995).

Механізми, що обумовлюють нейротоксичність збуджуючих амінокислот, належним чином не і’ясовані. Теоретично порушення нормальної синаптичної передачі можуть відбуватись або при іадмірному збудженні нейронів за короткочасного впливу великих концентрацій нейромедіатору, ібо при загибелі нейронів внаслідок тривалої дії нейротрансмітера. В першому випадку, ймовірно, шникають судомні припадки, а в другому- відбуваються нейродегенеративні зміни. Дійсно, іозаклітинна концентрація глутамату та інших збуджуючих амінокислот значно зростає при шемії головного мозку та під час епілептичних припадків (Benveniste et al., 1984), хоча іідвищення концентрації глутамату навряд чи є єдиною причиною неврологічного пошкодження Obrenovitch & Urenjak, 1997). Одним із додаткових механізмів генерації патологічних змін у

функціонуванні мозку може бути підвищена ефективність збуджуючої синаїтгичної передачі Зокрема, короткотривала ішемія спричиняє довготривале зниження здатності іонів Mg2' гальмувати NMDA рецептори (Ногі & Carpenter, 1994).

Нещодавно було продемонстровано, що аноксичні умови призводять до вибіркової потенщаці активності NMDA рецепторів (Crepel et аі., 1993; Tsintsadze et al., 1996). Подібне зростання внесю NMDA компоненту в загальну збуджуючу синаптичну відповідь спостерігалось під впливо.\ блокатора аденозинових рецепторів, а також при активації протеїнкінази С форболовими ефірамі (Klishin et al., 1995; Lozovaya & Klee, 1995). Оскільки такі ефекти, можливо, пояснюютьа підвищенням пресинаптичного викиду збуджуючих амінокислот, цікаво дослідити вплив іншго модуляторів синаптичної передачі, зокрема блокаторів потенціалкерованих калієвих каналів, н; глугаматергічну нейротрансмісію.

Дослідження проводились відповідно до планів наукової роботи відділу фізико-хімічно біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України ті Міжнародного Центру молекулярної фізіології за темою “Вивчення фізіологічних механізмів, ще забезпечують включення НМДА-опосередкованого позитивного зв’язку в зоні СА1 гіпокампу з< патофізіологічних умов”.

Мета і задачі дослідження: із застосуванням методик фіксації потенціалу ті

внутрішньоклітинного діалізу нейронів з’ясувати механізм підвищення відносного внеску NMD/ глутаматних рецепторів у загальну збуджуючу синаптичну відповідь за умов збільшено інтенсивності синаптичної передачі. Для досягнення поставленої мети, в роботі слід буле вирішити такі задачі:

1) Дослідити вплив блокаторів різних типів потенціалкерованої калієвої провідності ні збуджуючі постсинаптичні струми в гіпокамггі щурів, приділяючи особливу увагу питомт внескам NMDA та не-NMDA рецепторів до постсинаптичних струмів.

2) З’ясувати роль іонів Саї+ у спостереженому раніше підвищеному внеску NMDA рецепторі] до загальної синаптичної відповіді.

3) Вивчити можливу роль процесів зворотнього захоплювання глутамату в регуляці відносного внеску NMDATa не-NMDA рецепторів до синаптичної відповіді.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі досліджено впли блокаторів потенціалкерованих калієвих каналів: 4-амінопіридину, тетраетиламонію, а

дендротоксину на збуджуючу синаптичну передачу в гіпокампі щурів. Окрім відомої полегшуюче дії блокаторів калієвих каналів на викид глутамату, вперше показано, що під їх впливом збільшується внесок NMDA підтипу глутаматних рецепторів до загальної збуджуюча синаптичної відповіді. Неконкурентний антагоніст насосів зворотнього захоплюванні дигідрокаїнат не впливає на постсинаптичні струми за контрольних умов, що збігається :

з

літературними відомостями, але збільшує NMDA компонент постсинаптичного струму на тлі малих концентрацій 4-амінопіридину. Вперше продемонстровано, що істотне підвищення зовнішньоклітинної концентрації іонів Са5+ також збільшує питому вагу NMDA компоненту еинаптичної відповіді. Висловлено гіпотезу про те, що за умов підвищеної інтенсивності еинаптичної передачі частка NMDA компоненту зростає внаслідок активації позасинаптичних NMDA рецепторів.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Отримані результати мають теоретичну цінність, оскільки одержані принципово нові дані про можливість збуджуючих нейротрансмітерів, зокрема L-глутамату та L-аспартату, чинити вплив поза межами синаптичних щілин, в які вони вивільняються. Взаємодія нейромедіаторів із позасинаптичними рецепторами може відігравати провідну роль при патологічних станах та в процесах еинаптичної пластичності. Практична цінність результатів роботи полягає в демонстрації можливості позасинаїттичної дії протигіпоксичних та протисудомних лікарських засобів.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто виконані всі електрофізіологічні експерименти. Здобувач брав активну участь у обговоренні результатів дослідів та формулюванні висновків. Вперше здобувачем показано, що під впливом блокаторів К+ каналів, а також при значному підвищенні зовнішньоклітинної концентрації Са2+ непропорційно збільшується NMDA компонент постсинаптичного сигналу.

Приготування зрізів гіпокампу, використаних у роботі, частково виконувалось старшим науковим співробітником Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України Лозовою Н. О.. Для отримання даних та обрахування результатів експериментів використовувалось програмне забезпечення, створене Я. Бойчуком, А. Клішиним та Т. Цинцадзе.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладались та обговорювались на 5-ій щорічній зустрічі Ізраїльського нейронаукового товариства (Ейлат, 1996), ХХХПІ-му Міжнародному конгресі фізіологічних наук (Санкт-Петербург, 1997), 3-ій літній школі

5 нейрохімії (Амхерст, 1997), Міжнародному конгресі з нейрохімії (Бостон, 1997), Міжнародному :импозіумі “Drug Targets in Heart and Brain Ischemia” (Флоренція, 1997), семінарах Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця (Київ, 1996, 1997), семінарі нейробіологічного підрозділу фірми Roche Bioscience (Пало Альто, 1997).

Публікації. За результатами роботи опубліковано три статті та тези чотирьох доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та :писку використаних джерел зі 189 найменувань. Робота викладена на 91 сторінці та ілюстрована 15 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи досліджень. В експериментах використовувались білі щури лінії Вістар WAG\GSto (Москва, Росія) віком 18-30 днів, що утримувались на стандартній лабораторній дієті.

Для дослідження синаптичної передачі в гіпокампі щурів застосовувались такі методичні підходи:

а) приготування зрізів гіпокампу щурів;

б) препарування зрізів за допомогою “водоструминного ножа” для отримання доступу до клітинних тіл нейронів ділянки СА1 гіпокампу;

в) реєстрація збуджуючих постсинаптичних струмів (ЗПСС) методом “петч-кламп” у конфігурації “ціла клітина” за одночасної фіксації мембранного потенціалу.

Приготування зрізів. Після декапітації тварини обидві половинки гіпокампу швидко переносили до чашки Петрі, що містила охолоджений (+5°С) розчин такого складу (в мілімолях): NaCl 125; КаНСОз 26; КС1 5; MgCb 3; глюкоза 20. Розчин постійно насичувався газовою сумішшю Oj (95%) та СОг (5%) для підтримання pH на рівні 7,35-7,4. Зрізи завтовшки 300-600 мкм нарвали при постійному зволоженні поверхні гіпокампу, використовуючи тонке лезо. Після нарізання та відокремлення зрізи переносили до інкубаційної камери, де вони витримувались протягом 60 хвилин перед експериментом. Реєстрацію електрофізіологічних показників проводили при температурі +31°С у зовнішньоклітинному розчині такого складу (в мМ): NaCl 135; NaHCCh 18; КС1 2,7; СаСЬ 1,5; MgCb 1,5; глюкоза 20 (pH 7,35-7,4 при насиченні газовою сумішшю Ог та СОг). Гальмівні ГАМКд рецептори блокували пікротоксином або бікукуліном у концентрації 25-50 мкМ.

Електрофізіологічна реєстрація. Для отримання викликаних синаптичних відповідей у ділянці СА1 гіпокампу використовувалась біполярна стимуляція колатералей Шафера за допомогою склеєних та ізольованих по всій довжині, крім кінчиків, ніхромових електродів завтовшки 50 мкм. Стимуляція поштовхами струму 0,1-1 мА або напругою 3-30 мВ тривалістю 50250 мкс забезпечувалась за допомогою гальванічно ізольованого стимулятору.

Для кращої візуалізації пірамідних нейронів ділянки СА1 гіпокампу нами застосовувався метод “водоструминного ножа” (Garaschuk et al., 1992). Зріз гіпокампу прорізали між stratum pyramidale та stratum oriens тонкою струминою зовнішньоклітинного розчину, що витікав піл тиском із кінчика скляної пипетки діаметром 100-200 мікрон. Після прорізання видаляли частин) альвеусу, чим забезпечували вільний доступ до тіл пірамідних нейронів, які тепер було легке розрізнити, використовуючи інвертований мікроскоп. Препарований у такий спосіб зріз переносили до камери зі скляним дном об'ємом 0.5 мл. До камери постійно надходш зовнішньоклітинний розчин зі швидкістю 1-3 мл/хв. Зріз злегка притиснювали до дна камери дш усунення коливань внаслідок течії розчину.

Реєстрацію ЗПСС проводили методом петч-кламп (patch-clamp) у конфігурації “ціла клітина”, їикористовуючи скляні мікропипетки, що виготовлялись у дві стадії за описаною методикою Hamill et al., 1981). Фіксацію мембранного потенціалу здійснювали поданням завданої напруги на іва хлор-срібних електроди, один з яких був занурений у зовнішньоклітинний, а інший - у знутрішньоклітинний розчини. Внутрішньоклітинний розчин містив (у мМ): CsF 100; iSTaH:P04 40; HEPES-CsOH 10; Tris-Cl 10 (pH 7.3). Для блокування натрієвих спайків до складу розчину тодавали четвертинну похідну місцевого анестетику лідокаїну М-(2,б-диметил-£енілкарбамоїлметил)-триетиламоню броміду (QX-314) в концентрації 1-3 мМ. Після заповнення нікропипетки внутрішньоклітинним розчином її опір складав 1-3 мОм.

Сигнал з виходу підсилювача струму потрапляв на каскад подальшого підсилювання зі !мінним коефіцієнтом передачі (1-12) та далі - на однокаскадний активний фільтр низьких частот з іастотою зрізу 1-3 кГц. Функціонування каналів реєстрації струмів, частота та амплітуда стимуляції контролювались за допомогою комп'ютеру. Записані в пам'ять у цифровому вигляді пані переносились на твердий накопичувач за допомогою програми “SCREEN”, яка була написана :півробітником Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця к. б. н. А. Клішиним на мові Турбо Паскаль з елементами мови Асемблер для операційної системи MS-DOS. Первинну обробку даних (вимірювання амплітуди, нормалізація, тощо) проводили за допомогою програми “AaDatRa”, створеної Я. Бойчуком на мові Delphi 1.0. Статистичну обробку даних та побудову графіків виконували з використанням програмного пакету Microcal Origin 3.5 та 4.0 (Microcal Software, Inc., Northampton МА, USA). Статистичні порівняння виконували за (-тестом Стьюдента, застосовуючи зписані алгоритми (Урбах, 1964).

Результати досліджень.

Уповіїьненпя спаду ЗЛСС під впливом блокаторів ІС-каналів. Полегшуюча дія блокаторів потенціалкерованих К+ каналів на синапгичну передачу є загальновідомою і пояснюється подовженням потенціалу дії та/або індукцією повторних розрядів, що призводить до збільшення входу Са2+ до пресинаптичних терміналей. У відповідності до цих відомостей в наших експериментах 4-амінопіридин (4-АР), а-дендротоксин (а-DTx) та тетраетиламоній (TEA), що є блокаторами відповідно Id, іа та Ік типів КҐ струмів (Storm, 1993), збільшували пікову амплітуду ЗПСС (Рис. 1). Також, на відміну від контрольних умов, під впливом 4-АР, a-DTx та TEA спад ЗПСС уповільнювався із зростанням інтенсивності стимулу (Рис. 1), тобто ставав стимул-залежним. Порівнюючи відношення амплітуди ЗПСС на 50-ій мс після стимулу до пікової амплітуди (І50 мо/Ішк), слід відзначити, що збільшення амплітуди стимулюючого струму з 15 до 750 мкА майже не впливає на це відношення за контрольних умов, але значно підвищує його в присутності 4-АР (Рис. 2). Як свідчать спостереження, проведені на великій кількості (>Ю0)

б

нейронів, 4-АР викликає відносне уповільнення спаду ЗПСС майже за будь-якої величини пікової амплітуди, тобто за однакових пікових амплітуд спад ЗПСС був повільнішим у присутності 4-АР, ніж у контролі. В межах контрольних величин вимірюваних максимальних амплітуд ЗПСС (<750

Л^=

Рис. 1. Вплив блокаторів потенціалкерованих К+ каналів на збуджуючий постсинаптичний струм в ділянці СА1 гіпокампу.

Ліворуч - контрольні записи ЗПСС, отриманих у відповідь на стимуляцію колатералей Шафера імпульсами 5-30 В. Праворуч — записи ЗПСС на тих самих клітинах у відповідь на стимуляцію 3-30 В, одержані за 10-15 хв після інкубації відповідно з 50 мкМ 4-АР (А); 300 кМ а-дендротоксину (Б) та 10 мМ ТЕА (В). Кожен запис ЗПСС е усередненням 3-10 індивідуальних пробігів. Підтримуваний потенціал дорівнював -50 мВ. На врізках показані нормалізовані ЗПСС, отримані у відповідь на мінімальний та на максимальний стимул. Помітно, що за контрольних умов спад ЗПСС однаковий на слабкому (5 В) та сильному (30 В) стимулах, в той час як у присутності блокаторів К+ каналів спад ЗПСС повільніший на сильному стимулі.

пА) коефіцієнти регресії МІЖ 150 „с та Іпіх в контролі та в присутності 4-АР достовірно відрізнялись та складали відповідно 0.31 та 0.48 (Р<0.001).

В контрольних умовах спад ЗПСС звичайно складається зі спадів “швидкого” АМРА та “повільного” КРіГОА компонентів (НеэШп еі аі., 1990). В наших експериментах т спаду фармакологічно ізольованого АМРА компоненту ЗПСС дорівнювала 12.03 + 0.6 мс (п = 10), відтак можна припустити, що після 50-ої мс амплітуда ЗПСС залежить лише від активації КМОА рецепторів. Отже, ймовірно, стимул-залежний компонент ЗПСС, який з’являється під впливом блокаторів К+ каналів, опосередкований саме NN10 А рецепторами.

У відповідності до цього припущення, прикладення 50 мкМ Б-АРУ, конкурентного антагоністу ЫМЮА рецепторів, зворотнім чином блокувало появу стимул-залежного затриманого компоненту ЗПСС, викликану 4-АР (Рис. 3). Також, порівнюючи дані, одержані на пітримуваних

Рис. 2. Залежність тривалості спаду ЗПСС від амплітуди стимулу за контрольних умов та в присутності 50 мкМ 4-АР.

(А) Записи ЗПСС, отримані від одного й того самого нейрону в контролі та в присутності 4-АР на підтримуваних потенціалах -50 мВ та +20 мВ. Врізки - як на Рис. 1.

(Б) Усереднені дані з 16 нейронів, що відображають вплив 4-АР на ЗПСС за різних амплітуд стимуляції. (Бі) Інкубація з 50 мкМ 4-АР призводить до підвищення пікової амплітуди ЗПСС. (Б2) Відношення амплітуди ЗПСС, вимірюваної на 50-ій мс після стимулу до пікової амплітуди ЗПСС, майже незмінне за контрольних умов, зростає із збільшенням амплітуди стимуляції в присутності 4-АР. Дані подані як усереднені значення + стандартна похибка вимірювання. Статистична вірогідність відмінності від контрольних умов оцінювалась за парним критерієм Стьюдента (*/’<0.05; **Р<0.01; ***Р<0.001).

потенціалах -50 та -90 мВ, спостерігали стимул-залежний уповільнений спад ЗПСС тільки на -50 мВ, що збігається з відомостями про гальмування іонами MgI+ струмів крізь NMDA рецептори при гіперполяризації нейронів (Nowak et al., 1984). Таким чином, можна дійти висновку про те, що під впливом блокаторів К* каналів частка NMDA компоненту в загальному ЗПСС зростає більше, ніж частка АМРА компоненту, що призводить до уповільнення спаду струму. Оскільки пік ЗПСС залежить майже тільки від активації АМРА рецепторів, співвідношення І;о *Лт« можна розглядати як співвідношення NMDA/AMPA компонентів. Як показано на Рис. 2, це співвідношення

залишається майже незмінним у контролі, а в присутності 4-АР питома вага №/ША компоненту ЗПСС зростає із збільшенням амплітуди стимуляції.

контроль

50 мкМ 4-АР

нормалізований вигляд

50 мкМ 4 АР + 50 мкМ АР V

50 мкМ 4-АР, відмивання від APV

20 мс

Рис. 3. Збільшення тривалості спаду ЗПСС за великої амплітуди стимулу, яке з'являється в присутності 4-АР, гальмується прикладенням антагоністу М\ГОА рецепторів Б-АРУ.

Ліворуч - записи ЗПСС отримували у відповідь на стимуляцію 3-30 мВ в контролі та в присутності 50 мкМ 4-АР. Потім прикладали 50 мкМ Б-АРУ на 15 ха і відмивали протягом ЗО хв. Праворуч -нормалізовані записи мінімальних та максимальних ЗПСС.

Підсилювання дії малих доз 4-амінопіридину на ЗПСС дигідрокаїнатом, неконкурентным блокатором зворотнього захоплювання глутамату. Нещодавно було показано, що NMDA рецептори є чутливими до більшої квантової частки вивільненого глутамату, ніж АМРА рецептори, через більшу спорідненість до нейротрансмітера, а також внаслідок перевиливу глутамату за межі синаптичних щілин, в які він викидається (Kullmann et al., 1996). Обмеження цього явища відбувається завдяки процесам зворотнього захоплювання глутамату, що в значній мірі запобігають дифузії нейротрансмітера в зовнішньоклітинний простір (Asztely et al., 1997). Для з'ясування можливої ролі перевиливу глутамату в підвищенні питомої частки NMDA компоненту в синаптичній відповіді, нами було досліджено вплив дигідрокаїнату (DHK), неконкурентного антагоністу насосів зворотнього захоплювання глутамату, на ЗПСС.

Рис. 4. Збільшення стимул-залежного КМРА компоненту ЗПСС під впливом дигідрокаїнату на тлі низької концешрації 4-АР.

(А) Прикладення 100 мкМ дигідрокаїнату, неконкурентного блокатора насосів зворотнього захоплювання майже не впливало на пікову амплітуду та спад ЗПСС за контрольних умов. (Аі) Ліворуч -записи ЗПСС, отриманих у відповідь на стимуляцію 0.1-0.75 мА в контролі та за 15 хв після інкубації з дигідрокаїнатом. Праворуч - нормалізовані мінімальні та максимальні ЗПСС. (Аг) Усереднені дані експериментів на 3 нейронах, в яких вивчався вплив дигідрокаїнату на пік ЗПСС та ЬоиЛпы.

(Б) Збільшення стимул-залежного компоненту ЗПСС дигідрокаїнатом у присутності 10 мкМ 4-АР. (БО Записи ЗПСС з одного нейрону показують, що прикладення 4-АР в концентрації 10 замість 50 мкМ призводило до слабкого уповільнення спаду ЗПСС. Водночас, додавання 100 мкМ дигідрокаїнату значно подовжувало спад ЗПСС. (Бг) Усереднені дані з 6 експериментів, аналогічних до Бі. Статистичні порівняння даних з дигідрокаїнатом (парний тест Стьюдента) проводились відносно даних, отриманих у ггоисугності 4-АР. а не відносно контосльних оезультатів.

В наших експериментах інкубація зі 100 мкМ DHK не призводила до значних змін в амплітуді та спаді ЗПСС (Рис. 4 А), що співпадає з наявними літературними даними (Hestrin et а)., 1990). Проте за умови, коли кількість вивільненого нейротрансмітера збільшувалась за допомогою малої (10 мкМ) концентрації 4-АР, прикладення DHK викликало значне уповільнення спаду ЗПСС та збільшення співвідношення Iso мсЛтк (Рис. 4 Б), подібне до того, що спостерігалося під впливом 50 мкМ 4-АР (Рис. 1,2). Таким чином, при збільшенні рівня викиду глутамату гальмування процесів зворотнього захоплювання нейротрансмітера викликає появу стимул-залежного NMDA компоненту ЗПСС.

Поява затриманого компоненту ЗПСС під впливом підвищеної зовпішньоклітинної концентрації Са2+. Відомо, що поява стимул-залежного NMDA компоненту ЗПСС спостерігалась під впливом В-циклопентил-1,3-диметалксантину (СРТ), антагоніста аденозинових рецепторів типу А1 (Klishin et al., 1995). Спільною рисою дії цієї сполуки та блокаторів К+ каналів є полегшуючий вплив на пресинапгичне вивільнення нейротрансмітера. Дня з'ясування питання, чи є зростання кількості вивільненого глутамату необхідною умовою для появи стимул-залежного компоненту ЗПСС, ми дослідили вплив підвищення зовнішньоклітинної концентрації CaJ+. Оскільки будь-які пресинаптичні модуляції викиду трансмітера опосередковуються через зміни в концентрації Саг+ в пресинаптичних терміналах, підвищення зовнішньоклітинної концентрації Са2+ має викликати наслідки, подібні до впливів блокаторів К+ каналів. Дійсно, як показано на Рис. 5, зміна зовнішньоклітинної концентрації Са2+ з 1.5 до 5 мМ призводить до появи стимул-залежного компоненту ЗПСС, чутливого до блокатора NMDA рецепторів D-APV. Отже, необхідною та достатньою умовою появи стимул-залежного NMDA компоненту ЗПСС під впливом блокаторів К+ каналів є зростання кількості вивільненого глутамату завдяки збільшенню надходження Са*+ до пресинаптичних терміналей.

Обговорення результатів досліджень.

Електрофізіологічні дослідження свідчать про те, що зміни у ймовірності викиду нейротрансмітера викликають пропорційне збільшення або зменшення відношення між АМРА та NMDA компонентами ЗПСС (Garaschuk et al., 1992; Hestrin et al., 1990). Такі дані схиляють до думки, що вивільнення глутамату з пресинаптичних терміналей відбувається за принципом “все або нічого” (Perkel & Nicoll, 1993). За цією гіпотезою в синаптичну щілину вивільняється вміст тільки однієї везикули з кожної пресинаптичної терміналі, а зміни в амплітуді постсинаптичних сигналів пов’язані зі зміною кількості функціонуючих терміналей. В такій моделі передбачається, що концентрація медіатору в індивідуальних синаптичних щілинах приблизно однакова. Отже, оскільки АМРА та NMDA рецептори спільно розташовуються на постсинаптичних ділянках (Bekkers & Stevens, 1989) та, ймовірно, повністю насичуються медіатором за нормальних умов

викиду (Clements, 1996), збільшення або зменшення кількості синхронно працюючих терміналей призвело б до відповідних пропорційних змін АМРА та NMDA компонентів. Втім, як показано в роботі Tong & Jahr (1994) на нейронах гіпокампу в культурі, концентрація нейротрансмітера в синаптичній щілині змінюється під впливом баклофену, 4-амінопіридину та аденозину, що, напевне, свідчить про наявність “мультивезикулярного” викиду медіатору з індивідуальних пресинагггичних терміналей.

контроль

^ . пі нормалізований вигляд

5 мМ Са2+ + 50 мкМ D-APV

5 шМ Са2+, відмивання від D-APV

А

¥

і

10 мс

Рис. 5. Поява стимул-залежного \МОА рецептор-опосередкованого компоненту ЗПСС викликаного збільшенням зовшшньоклітинної концентрації Са2* з 1.5 до 5 мМ.

ЗПСС реєструвались у відповідь на стимуляцію колатералей Шафера імпульсами 5-30 В. Ліворуч -усереднені записи 3-10 індивідуальних пробігів. Праворуч - нормалізовані мінімальні та максимальні ЗПСС. Записи при високій концентрації Са2т отримували за 10 хв після зміни розчину. О-АРУ прикладали на 15 хв та відмивали протягом ЗО хв.

В наших експериментах на пірамідних нейронах ділянки СА1 гіпокампу прикладенню блокагорів потенціалкерованих К+ каналів викликало відносно більше зростання NMDA, ній АМРА компоненту ЗПСС, в залежності від сили прикладеного стимулу (Рис. 1, 2). З цьогс випливає, що в присутності блокаторів К+ каналів частка вивільненого нейротрансмітера ста< доступнішою для деякої популяції NMDA рецепторів, аніж для АМРА рецепторів. Отже, постаї цілком логічне питання про механізм активації та локалізацію цих NMDA рецепторів.

Затриманий спад ЗПСС під впливом 4-АР описаний для нейронів гіпокампу ділянки СА: (Rutecki et al., 1987). Автори зауважили, що подібна уповільненість спаду ЗПСС може буті зумовлена активацією зворотних збуджуючих синапсів. Насправді, рекурентні збуджуючі зв’язкі є характерними для ділянки САЗ гіпокампу (Miles & Wong, 1987). Схоже непропорційне збільшення NMDA компоненту ЗПСС у ділянці СА1 гіпокампу спостерігалось за умов блокади А' аденозинових рецепторів (Klishin et al., 1995), що також пов’язувалось із активацією рекурентню збуджуючих синапсів.

Певним свідченням проти участі рекурентних зв’язків у генерації стимул-залежного NMD/ компоненту ЗПСС є експерименти з підвищеною зовнішньоклітинною концентрацією іонів Са2 (Рис. 5). Відомо, що підвищення концентрації дивалентних катіонів, зокрема Mg2* та Са2+, блокуі полісинаптичні явища, в тому числі й рекурентні взаємодії (Crepel & Веп-Агі, 1996). В наїлю дослідах підвищення концентрації іонів Са2+ не гальмувало, а навпаки, спричиняло появу стимул залежного NMDA компоненту (Рис. 5). Слід зазначити, що морфологічні дослідження ділянкі СА1 також підтверджують, що кількість збуджуючих зворотніх зв’язків у цій зоні дуже мал: (Deuchars & Thomson, 1996).

Зростання NMDA відносно АМРА компоненту може бути пов’язане зі змінами в провідност каналів NMDA рецепторів в присутності 4-АР. В літературі ми не знайшли відомостей пр< модуляцію кінетики NMDA струмів блокаторами К+ каналів. Тим часом можна вважати, щ< механізм генерації стимул-залежного NMDA компонента є пресинаптичним, оскільки в нашк експериментах постсинаптичне пригнічення NMDA рецептор-опосередкованого ЗПСС малими (5

7 мкМ) концентраціями D-APV не прискорювало затриманий компонент струму.

При обговоренні питання, яким чином пресинаптичне збільшення кількості вивільненоп нейромедіатору призводить до непропорційного зростання NMDA компоненту ЗПСС, елі зауважити, що нещодавно, в роботах Kullmann et al. (1996) з'ясовано, що постсинаптичні NMD^ рецептори відчувають більшу квантову частку вивільненого трансмітера, ніж АМРА рецептори. L дослідники вважають, що NMDA рецептори здатні активуватись молекулами глутамату, як дифундують із сусідніх синаптичних щілин, в той час як АМРА рецептори не братимуть участь ; подібній міжсинапгичній сигналізації через низьку спорідненість до трансмітера (Patneau & Мауеі 1990). Подальші дослідження показали, що перевилив трансмітера за межі синаптичних щілин,

які він вивільняється, регулюється насосами зворотнього захоплювання глутамату (Asztely et al., 1997). Це явище підсилювалось прикладенням DHK, антагоністом насосів зворотнього захоплювання, але гальмувалося при підвищенні температури зовнішньоклітинного розчину через інтенсивнішу роботу насосів. В наших експериментах прикладення 100 мкМ DHK не впливало на ЗПСС у контролі (Рис. 4 А), що підтверджує незначний вплив процесів зворотнього захоплювання на перебіг ЗПСС за нормальних умов (Hestrin et al., 1990). Проте DHK значно уповільнював спад ЗПСС на тлі невеликих концентрацій 4-АР (Рис. 4 Б), що свідчить про підвищення ролі зворотнього захоплювання глутамату в умовах зростання кількості вивільненого трансмітера, викликаного 4-АР. Таким чином, можна дійти висновку, що спостережений стимул-залежний NMDA компонент ЗПСС зумовлюється перевиливом глутамату та активацією так званих “екстрасинаптичних” (Kullmann et al., 1996) NMDA рецепторів.

Постає цікаве питання про розташування таких '‘екстрасинаптичних” рецепторів, адже ними можуть бути рецептори, що локалізуються в постсинаптичних ділянках нефункціонуючих синапсів або ж несинаптичних ділянках дендритів. Відомо, що сусідні збуджуючі синапси з різними пре- та постсинаптчними елементами часто знаходяться на відстані біля 1 мкм один від одного в ділянці СА1 гіпокампу (Sorra & Harris, 1993). Теоретичні обчислення передбачають, що молекули глутамату, які вивільняються з однієї синаїггичної везикули та дифундують на таку відстань, здатні активувати NMDA, але не АМРА рецептори (Wahl et al., 1995). Оскільки за підвищеного рівня викиду нейротрансмітера в присутності блокаторів К+ каналів синаптичні NMDA рецептори, ймовірно, насичуються, можна припустити, що певна частка стимул-залежного NMDA компоненту ЗПСС обумовлена активацією саме несинаптичних рецепторів.

Позасинаптичне розташування рецепторів класичних нейротрансмітерів вельми поширене в ЦНС. Несинаптичне дифузне розташування NMDA рецепторів виявлене, зокрема, в нейронах гіпокампу (Benke et al., 1993) та зорової кори (Aoki et al., 1994). На користь можливих позасинаптичних впливів глутамату свідчать дослідження Coco et al. (1997) та Tanaka et al. (1997), в яких показано, що переносники глутамату, ЕААС1 та ЕААТ4, локалізуються виключно за межами збуджуючих синапсів відповідно гіпокампальних нейронів та клітин Пуркін’є.

На підставі отриманих в нашій роботі результатів можна запропонувати схему (Рис. 6), що пояснює непропорційне збільшення NMDA компоненту ЗПСС при збільшенні ймовірності вивільнення глутамату.

Можлива участь несинаптичних NMDA рецепторів у збудженні нейронів підтверджує висловлені нещодавно гіпотези про позасинаптичні ефекти класичних нейротрансмітерів та їх участь у, так званій, об’ємній передачі інформації в ЦНС (Bach-y-Rita, 1993). Позасинаптичні рецептори нейротрансмітерів можуть бути мішенями для нових лікарських засобів. Як зазначають Herkenham (1987) та Vizi (1984), багато лікарських препаратів, що їх створено за концепцією

пресинаптичної модуляції нейротрансмісії, насправді діють не на пресинаптичні, а нг позасинаптичні рецептори. Дійсно, лікарським речовинам складніше потрапити всередин) синапсів і дуже ймовірно, що вони взаємодіють з більш доступними позасинаптичнимк рецепторами. Також блокатори глутаматних рецепторів, що запобігають ішемічним проявам, можливо, взаємодіють з вдзасинаптичними рецепторами глутамату. Таким чином, можнг

Рис 6. Схема перевиливу глутамату та активації позасинаптичних ЫМОА рецепторів.

(А) За контрольних умов глутамат, що викидається з пресинаїггичних терміналей, взаємодіє здебільшого з АМРА та ІЧ'МОА рецепторами на відповідних постсинаптичних ділянках. Дифузії глутамату до сусідніх синаптичних зон та позасинаптичних ділянок запобігають системи гліального та нейронального зворотнього захоплювання.

(Б) При значному збільшенні кількості вивільненого нейротрансмітеру насоси зворотнього захоплювання насичуються, отже певна частка глутамату дифундує за межі синаптичних щілин та активує рецептори на сусідніх постсинаптичних ділянках та/або на позасинаптичній мембрані дендритів. Слід очікувати, що “перевилитий” глутамат активуватиме головним чином NMDA рецептори, оскільки вони набагато чутливіші до глутамату, аніж АМРА рецептори. Таким чином, переважна активація екстрасинаптичних НМДА рецепторів призводить до спостереженого збільшення внеску ЫМОА рецепторів у ЗПСС.

рипустити, що механізм гіперактивації рецепторів збуджуючих амінокислот, зокрема КМОА ецепторів, спостережений в даній роботі, нагадує процеси, що відбуваються в головному мозку ід час епілептичних припадків або післягіпоксичних станів.

. ВИСНОВКИ

1. Переважна більшість електрофізіологічних досліджень свідчить про спільне розташування іМРА та ИША рецепторів у збуджуючих синапсах, імовірно, в сталому відношенні, раховуючи моносинаптичність збуджуючих входів до ділянки СА1 гіпокампу, зміна ггенсивності подразнюючої стимуляції не повинна викликати непропорційних змін внеску АМРА і NN10А рецепторів до синаптичних сигналів.

Для вивчення особливостей модуляції АМРА та ТШІЗА компонентів збуджуючого остсинаптичного струму за умов підвищеного рівня вивільнення нейротрансмітера, методами ііксації потенціалу та внутрішньоклітинного діалізу досліджено вплив антагоністів К+ каналів на зуджуючу синаптичну передачу в зрізах гіпокампу щурів. Блокатори потенціалкерованих К+ грумів Іо, Ід та Ік типів, відповідно, 4-амінопіридин, а-дендротоксин та тетраетиламоній ідвищують пікову амплітуду збуджуючого постсинаптичного струму в ділянці СА1 та повільнюють його спад, пропорційно інтенсивності стимуляції. Відношення амплітуди зуджуючого постсинаптичного струму на 50-ій мс до його пікової амплітуди Ізо мсЛ™*, тобто ідношення ИМОА/АМРА компонентів, яке не змінюється в контролі, значно зростає під впливом -амінопіридину при збільшенні амплітуди стимуляції.

2. Стимул-запежний, затриманий компонент збуджуючого постсинаптичного струму, триманий за присутності блокаторів потенціалкерованих КГ струмів, пригнічується антагоністом ІМОА рецепторів О-АРУ у концентрації 50 мкМ та при зміні підтримуваного потенціалу з -50 на 90 мВ. Таким чином, уповільнення спаду збуджуючого постсинаптичного струму відбувається їв дяки підвищенню питомого внеску ХМОА рецепторів у загальний синаптичний сигнал.

3. Підвищення зовнішньоклітинної концентрації іонів Са:+ з 1.5 до 5 мМ призводить до ростання пікової амплітуди збуджуючого постсинаптичного струму та до стимул-залежного одовження тривалості його спаду.

4. Постсинаптичне гальмування уповільненого І^ІМЛА компоненту за допомогою О-АРУ не ризводить до прискорення спаду збуджуючого постсинаптичного струму, отже механізм гнерації цього компоненту під впливом блокаторів К+ каналів є пресинаптичним.

5. Прикладення неконкурентного антагоністу насосів зворотнього захоплювання глутамату, игідрокаїнату, в концентрації 100 мкМ не впливає на збуджуючий постсинаптичний струм за онтрольних умов, але значно уповільнює спад струму на тлі 10 мкМ 4-амінопіридину, Ідвищуючи відношення ІЗОмс/Іігіх.*

6. Підвищення кількості вивільненого нейротрансмітера внаслідок інкубації зрізів а блокаторами К+ каналів або в середовищі з підвищеною концентрацією іонів Са2+ призводить де збільшення амплітуди збуджуючого постсинаптичного сигналу, а також до зростання питомогс внеску NMDA рецепторів у збуджуючий постсинаптичний струм. Непропорційне зростанш NMDA відносно АМРА компоненту, ймовірно, пояснюється активацією позасинаптичних NMD/> рецепторів внаслідок перевиливу нейротрансмітера за межі індивідуальних синаптичних щілин.

Перелік опублікованих праць здобувана за темою дисертацій Статті:

1. Лозовая Н. А., Цинцадзе Т. Ш., Копаниця М. В., Бойчук, Я. А., Крьшіталь О. А. Увеличен» вклада рецепторов Л'-метил-О-аспартата в синаптическую передачу в зоне СА1 гиппокамп; крыс после кратковременных периодов гипоксии/агликемии // Нейрофизиология, - 1997. - т 29. -№. 1.-е. 7-13.

2. Kopanitsa М. V., Lozovaya N. A., Boychuk Ya. A., Krishtal О. A. Effects of blockers of voltage-operated potassium channels on an NMDA component of excitatory synaptic transmission in the CA1 subfield of the rat hippocampus // Нейрофизиология. - 1997. - т. 29. -№>. 4/5. - с. 307-311.

3. Копаниця М. В. Позасинаптично розташовані рецептори нейротрансмітерів: поширення механізми активації та фізіологічна роль // Нейрофізіологш. - 1997. -т. 29. - №. 6. - с. 448-458.

Тези доповідей:

1. Kopanitsa М. V., Lozovaya N. A., Boychuk Y. A., Krishtal О. A. Recurrrent excitatory NMD-'5 receptor-mediated circuits in CA1 subfield of rat hippocampus as revealed by blockers of voltage operated K*-channels // Israel J. Med Sci. - 1996. - v. 32. - suppl. - S26.

2. Kopanitsa М. V., Lozovaya N. A., Boychuk Y. A., Krishtal O. A. 4-Aminopyridine reveals recurren exicitatory NMDA receptor-mediated circuits in CA1 area of rat hippocampus // J. Neurochem. -1997.-v. 69. -suppl. -S65D.

3. Kopanitsa, М. V,, Lozovaya N. A., Boychuk, Krishtal O. A. Effects of 4-aminopyridine oi excitatory synaptic transmission in CA1 area of rat hippocampus // Proc. Adv. Sch. Neurochem. -Boston (USA). - 1997. - p. 31-32.

4. Lozovaya N. A., Tsintsadze T. S., Kopanitsa М. V., Boychuk Y. A., Krishtal O. A. Extrasynapti spill-over of glutamate activated by anoxic-aglycaemic episodes И Abstr. Int. Symp. Drug Targets ii Heart and Brain Ischemia. - Florence (Italy). - 1997 - p. 51.

Копаниця М. В. Вплив модуляції пресинаптичного вивічьнення нейротрансмітера на 5уджуючу сипаптичну передачу в гіпокампі щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю

3.00.02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ, 1998. Дисертацію присвячено вивченню модуляції збуджуючої синаптичної передачі в зрізах

іпокампу щурів за умов збільшеного пресинаптичного викиду нейротрансмітера. Показано, що ід впливом блокаторів потенціалкерованих К каналів 4-аміношридину (50 мкМ), етраетиламонію (5-10 мМ), а-дендротоксину (300 нМ), а також при підвищенні овшшньоклітинної концентрації Са:+ з 1.5 до 5 мМ збільшується пікова амплітуда збуджуючого остсинаптичного струму (ЗПСС) та уповільнюється його спад. За таких умов спад ЗПСС повільнюється із зростанням амплітуди стимулу, в той час як у контролі спад струму не залежить ід інтенсивності стимуляції. Установлено, що стимул-залежний компонент ЗПСС зумовлювався ктивацією глутаматних рецепторів Л-метил-О-аспартату (КРуГОА), З’ясовано, що гальмування роцесів зворотнього захоплювання глутамату за допомогою 100 мкМ дигідрокаїнату не впливає а перебіг ЗПСС у контролі, але значно уповільнює спад ЗПСС на тлі 10 мкМ 4-амінопіридину. Іисловлено гіпотезу про те, що непропорційне зростання внеску Ы\ША рецепторів у загальну инаптичну відповідь під впливом блокаторів К+ каналів обумовлене перевиливом вивільненого лутамату за межі синаптичних щілин та подальшою активацією позасинаптичних М\ША ецепторів.

Ключові слова: збуджуюча синаптична передача, механізми вивільнення нейромедіатору, ІМДА рецептори, калієві канали, зворотне захоплювання, перевилив нейротрансмітера, озасинаптичний вплив.

Копаниця М. В. Влияние модуляции пресипаптического выброса нейротрансмиттера на побуждающую синаптическую передачу в гиппокампе крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности

3.00.02 - биофизика. - Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев, 1998. Диссертация посвящена изучению модуляции возбуждающей синаптической передачи в срезах

иппокампа крыс в условиях увеличенного пресинаптического выброса нейротрансмиттера, [оказано, что под влиянием блокаторов потенциалзависимых К* каналов 4-аминопиридина (50 псМ), тетраэтиламмония (5-10 мМ), а-дендротоксина (300 нМ), а также при повышении неклеточной концентрации Са2+ с 1.5 до 5 мМ увеличивается пиковая амплитуда возбуждающего остсинаптического тока (ВПСТ) и замедляется его спад. В данных условиях спад ВПСТ амедляется с увеличением амплитуды стимула, тогда как в контрольных экспериментах спад тока :е зависит от интенсивности стимуляции. Установлено, что стимул-зависимый компонент ВПСТ

обусловлен активацией глутаматных рецепторов Л^метил-Б-аспартата (NMDA). Выяснено, чт ингибирование процессов обратного захвата медиатора при помощи 100 мкМ дигидрокаината н влияет на ВПСТ в контроле, но значительно замедляет его спад в присутствии 10 мкМ 4 аминопиридина. На основе полученных результатов высказана гипотеза о том, чт непропорциональное увеличение вклада NMDA рецепторов в синаптический ответ под влияние] блокаторов К+ каналов связано з переливом высвобожденного глутамата за предел1 синаптических щелей и последующей активацией внесинаптических NMDA рецепторов.

Ключевые слова: возбуждающая синаптическая передача, механизмы высвобождени нейромедиатора, НМДА рецепторы, калиевые каналы, обратный захват, перели нейротрансмиттера, внесинаптическое влияние.

Kopanitsa М. У. The influence of modulation ofpresynaptic release of the neurotransmitter on th excitatory synaptic transmission in rat hippocampus. - Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.02 - biophysics. - Bogomoletz Institute с Physiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.

The dissertation is devoted to the investigation of the modulation of the excitatory synapti transmission in hippocampal slices under conditions of enhanced neurotransmitter release. In the presenc of blockers of voltage-operated K+ channels, 4-aminopyridine (50 цМ), tetraethylammonium (5-10 mM a-dendrotoxin (300 nM), as well as when raising extracellular Ca2+ concentration from 1.5 to 5 mM, it i shown that peak amplitude of the excitatory postsynaptic current (EPSC) increased and its decay become significantly prolonged. Under such conditions, the EPSC decay slows with the increase in stimulatio strength, while control rate of the EPSC decay is constant at all stimulus intensities. It is demonstrate that the stimulus-dependent EPSC component is carried out via NMDA receptor-coupled channels. Th inhibition of glutamate uptake by 100 цМ dihydrokainate does not affect EPSC parameters in contri conditions but significantly prolongs EPSC decay in the presence of 10 цМ 4-aminopyridine. It i suggested that unproportional increase in NMDA receptor contribution into synaptic event under К channel blockers may be explained by the spill-over of the excessively released glutamate beyon synaptic clefts and subsequent activation of extrasynaptic NMDA receptors.

Key words: excitatory synaptic transmission, mechanisms of neurotransmitter release, NMD. receptors, potassium channels, uptake, neurotransmitter spill-over, extrasynaptic action.