Влияние местной стимуляции врожденного иммунитета липополисахаридом Salmonella typhi на репарацию раневых дефектов кожи

Костарной, Алексей Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние местной стимуляции врожденного иммунитета липополисахаридом Salmonella typhi на репарацию раневых дефектов кожи
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние местной стимуляции врожденного иммунитета липополисахаридом Salmonella typhi на репарацию раневых дефектов кожи"

На правах рукописи

005047634

КОСТАРНОИ Алексей Викторович

Влияние местной стимуляции врожденного иммунитета лппополпсахаридом Salmonella typhi на репарацию раневых

дефектов кожи

03.02.03 - микробиология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О ДЕК 2012

Москва-2012

005047634

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Народицкий Борис Савельевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Наровлянский Александр Наумович,

заведующий лабораторией цитокинов ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

кандидат медицинский наук, Жуховицкий Владимир Григорьевич,

заведующий клинико-диагностической лабораторией Государственного бюджетного учреждения здравоохранения города Москвы Городская клиническая больница имени С.П. Боткина Департамента здравоохранения города Москвы

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится а » 2012 г. в 11.00 часов на

заседании диссертационного совета Д 208.130.01 ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Автореферат разослан« » ЬоОуЛ^}^ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Русакова Екатерина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Раны различной этиологии, ожоги и язвы кожи и слизистых оболочек являются трудно разрешаемой медико-социальной проблемой современного общества. Особую актуальность изучение вопросов репарации ран кожного покрова приобретает в связи с постоянным ростом ран различного генеза вследствие ожогов, операций, механических травм. Терапия трофических язв, диабетических ран, пролежней, вялогранулирующих инфицированных ран, требует применения широкого арсенала лекарственных средств в течение длительного времени, во многих случаях вызывает необходимость стационарного лечения и зачастую оказывается недостаточно эффективным.

Микробная флора является обязательным участником процесса заживления ран кожи. Полагают, что микроорганизмы, способствуя воспалению и лизису омертвевших тканей, играют важную роль в очищении от них раневого дефекта; вместе с тем известно, что контаминация раны микроорганизмами может отрицательно сказываться на течении раневого процесса (Раны и раневая инфекция / Под ред. М. И. Кузина, Б. М. Костюченок, 1990). В целом, влияние микрофлоры на раневый процесс определяется характером повреждения, вирулентностью и количеством микробов, контаминировавших рану и особенностями иммунной системы макроорганизма (Edwards and Harding, 2004).

Известно, что ключевую роль в процессах репарации играет система врожденного иммунитета (Park and Barbul, 2004, Kluwe et al., 2009, Ioannou et al., 2010). Паттерн-распознающие рецепторы врожденного иммунитета, в отличие от Т- и В-клеточных рецепторов адаптивного иммунитета, распознают не уникальные структуры антигенных эпитопов, а высоконсервативные молекулярные структуры, характерные для микроорганизмов и вирусов (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) (Medzhitov and Janeway, 1997), a также структуры молекул, высвобождаемых или секретируемых в ответ на повреждение ткани (Danger-associated molecular patterns, DAMPs) (Bianchi, 2007). Активация То11-подобных рецепторов (TLRs), одного из основных семейств рецепторов врожденного иммунитета, приводит к запуску биохимических каскадов, приводящих к активации ряда транскрипционных факторов (NF-kB, IRF3, 5, 7, АР-1), регулирующих секрецию спектра цитокинов, хемокинов, антимикробных пептидов, молекул адгезии и других факторов, которые могут влиять на процесс репарации.

Рецепторы врожденного иммунитета (в частности То11-подобные рецепторы) экспрессируются широким спектром клеток, образующихся или присутствующих в коже: фибробластами, адипоцитами, кератиноцитами, эндотелиальными клетками, а также клетками иммунной системы, включая моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, клетки Лангерганса, тучные клетки, Т- и В-лимфоциты (Miller and Modlin, 2007).

TLR3) наблюдается значительно худшее заживление ран кожи, ассоциированное с уменьшенным уровнем ангиогенеза раневого дефекта (Macedo et al., 2007). Репарация ран кожи у мышей, нокаутных по гену TLR3, замедлена, и ассоциирована с уменьшенным уровнем секреции хемокинов и худшей инфильтрацией нейтрофилов и альтернативно активированных макрофагов в области раневого дефекта (Lin et al., 2011).

Недавно опубликованные данные позволяют утверждать, что местная стимуляция врожденного иммунитета лигандами То11-подобных рецепторов, являющихся структурными компонентами бактерий или вирусов, способна стимулировать репарационные процессы в коже. Так, Deiters и соавт. установили высокую эффективность терапии диабетических ран агонистом TLR2 -макрофаги-активирующим липопептидом-2 (MALP-2): местное применение MALP-2 усиливало секрецию хемокина МСР-1 и способствовало инфильтрации раны макрофагами (Deiters et al., 2004). Sato и соавт. показали, что местное нанесение лиганда TLR9, CpG олигонуклеотида, значительно ускоряло заживление ран кожи, способствовало фиброплазии и ранней эпителизации раневых дефектов (Sato et al., 2010). Нанесение на раневую поверхность poli 1:С, лиганда TLR3, стимулировало ангиогенез, способствовало инфильтрации раны макрофагами и приводило к ускорению репарации (Lin et al., 2012).

Однако к настоящему моменту отсутствуют данные, касающиеся влияния местного нанесения одного из наиболее активных лигандов TLRs, бактериального липополисахарида (лиганда TLR4) на процесс репарации ран кожи. Учитывая, что TLR4 экспрессирован большинством клеток кожи, известен обширный перечень DAMPs лигандов этого рецептора, опубликован ряд данных, полученных in vitro, показывающих участие этого рецептора в активации фибробластов, эпителиальных клеток, клеток эндотелия сосудов, можно предположить, что местная стимуляция TLR4 может оказывать существенное влияние на процессы репарации кожи in vivo.

Цель работы: Изучение влияния местной стимуляции врожденного иммунитета бактериальным липополисахаридом (ЛПС), лигандом То11-подобного рецептора 4, на репарацию ран кожи.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать физико-химические, иммунобиологические и токсикологические свойства используемого в работе липополисахарида Salmonella typhi.

2. Изучить влияние местного нанесения ЛПС S. typhi на скорость заживления, процессы воспаления, ангиогенеза, коллагенообразования и эпителизации в области раневого дефекта.

3. Провести полногеномное изучение изменения экспрессии генов при местном нанесении на раневый дефект бактериального ЛПС S. typhi.

4. Изучить кинетику секреции хемокинов, провоспалительных цитокинов и факторов роста, индуцированных местным нанесением ЛПС S. typhi.

5. Определить влияние местного применения ЛПС S. typhi на инфильтрацию макрофагов и нейтрофилов в области раневого дефекта.

6. Провести доклинические исследование разработанной по результатам исследования лекарственной формы для местного применения, содержащей ЛПС S. typhi.

Научная новизна.

1. Впервые показана способность низкотоксичного липополисахарида S. typhi при местном нанесении стимулировать заживление ран кожи in vivo, дозозависимо стимулировать ангиогенез и увеличение количества фибробластов на ранних сроках раневого процесса; уменьшать продолжительность воспалительной фазы раневого процесса и стимулировать процесс коллагенообразования и эпителизацию раны.

2. Впервые установлено, что местное нанесение ЛПС S. typhi на область раны увеличивает экспрессию ряда генов, в том числе генов факторов, участвующих в биохимическом каскаде активации транскрипционного фактора NF-кВ; генов цитокинов, хемокинов, и их рецепторов; генов молекул адгезии; генов, кодирующих белки, вовлеченные в антибактериальный, противовирусный иммунный ответ и иммунный ответ против простейших.

3. Впервые установлено, что местное нанесение ЛПС S. typhi на раневую поверхность приводит к избирательному повышению секреции спектра медиаторов, вовлеченных в процесс репарации, в том числе хемокинов, провоспалительных цитокинов и факторов роста.

4. Впервые показано, что местное нанесение ЛПС S. typhi приводит к увеличению количества макрофагов в тканях раны на ранних стадиях раневого процесса, а на более поздних стадиях приводит к уменьшению инфильтрации раны нейтрофилами.

Практическая значимость. Работа представляет не только научный интерес, заключающийся в более глубоком понимании механизмов влияния структурного компонента бактерий (ЛПС) на процесс репарации, но и обладает потенциалом практического использования. Созданная по результатам исследования лекарственная форма запатентована (Патент РФ № 2447082) и успешно прошла доклинические испытания (отчеты № 244/11, 251/11, 252/11 лаборатории биологических испытаний ФИБХ РАН, г. Пущино). В настоящее время в рамках Государственного контракта № 12411.1008799.13.112 проходят клинические исследования разработанной лекарственной формы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» имени академика В.И.Иоффе (Санкт-Петербург, 2011г.), международном симпозиуме International Endotoxin and Innate Immunity Society Meeting 2012/Homeostatic Inflammation Symposium (IEIIS2012) (Токио, 2012).

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции отдела медицинской микробиологии, отдела иммунологии и отдела генетики и

молекулярной биологии бактерий ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России 18 мая 2012 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 патент и 2 публикации в сборниках конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на /¿S страницах машинописного текста и включает Введение и 4 главы: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение результатов», а также Выводы, Список используемой литературы (240 источников, из которых -/ff отечественных и ¿¿¿^иностранных). Работа содержит 3 таблицы и /6 рисунков.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Местное нанесение липополисахарида S. typhi на область раневого дефекта стимулирует репарацию ран кожи, влияет на процессы воспаления, ангиогенеза, фиброплазии, коллагенообразования и эпителизации.

2. Нанесение ЛПС S. typhi на область раны увеличивает экспрессию ряда генов, в том числе генов факторов, участвующих в процессах репарации.

3. Нанесение ЛПС S. typhi на область раневого дефекта приводит к избирательному повышению секреции спектра медиаторов, вовлеченных в процесс репарации: цитокинов, хемокинов, факторов роста.

4. Местное нанесение ЛПС S. typhi влияет на инфильтрацию лейкоцитов в тканях раны, а именно увеличивает количество макрофагов на ранних стадиях раневого процесса, а на более поздних стадиях приводит к уменьшению инфильтрации раны нейтрофилами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2010 по 2012 годы в лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Бактериальный липополисахарид был выделен и очищен в производственном филиале «Медгамал» ФГБУ «НИИЭМ им.. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России из Salmonella typhi (Salmonella enterica enterica серовар typhi) штамм Ty2 4446. Также в работе использовался бактериальный липополисахарид Е. coli, штамм 0111 :В4 (Sigma-Aldrich, США).

В работе была использована клеточная линия HEK293-hTLR4/CD14-MD2 (клетки эмбриональной почки человека, содержащие ген b-галактозидазы под контролем NF-кВ-зависимого промотора и экспрессирующие TLR4 человека, а также молекулы MD2 и CD 14), любезно предоставленная д.б.н., проф. A.B. Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, Баффало, США).

В работе были использованы аутбредные мыши ICR обоего пола, весом 1820 г, мыши линии BALB/c, самцы, весом 18-20 г (Питомник лабораторных животных «Столбовая» РАМН), аутбредные мыши CD-I обоего пола, аутбредные

крысы CD обоего пола, весом 250-300 г (НПП «Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН», г. Пущино). Содержание лабораторных животных и проведение экспериментальных исследований проводилось согласно санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию вивариев N 1045-73.

Анализ активности транскрипционного фактора NF-кВ в клетках проводили спектрофотометрически по реакции на ß-галактозидазу и методом иммуноблоттинга. Для оценки распределения молекулярных масс ЛПС использовали электрофорез в полиакриламидном геле; для оценки распределения молекулярных масс полисахаридных фрагментов молекул ЛПС использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию; для определения степени ацилирования липидов А исследуемых ЛПС использовали MALDI-масс-спектрометрию. Биомеханические исследования проводили на тензиометре Instron 5848 MicroTester (Instron, Великобритания). Определение концентрации цитокинов проводили при помощи проточного цитофлуориметра Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc., США) с использованием коммерческих наборов FlowCytomixTM (eBioscience, США); с использованием флуориметра Bio-Plex System и коммерческих наборов (Bio-Rad, США); методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов. Полногеномное исследование экспрессии генов в области раневого дефекта проводилось с использованием оборудования, реактивов и расходных материалов производства Affymetrix, США. Иммуногистохимические исследования проводили с использованием моноклональных первичных антител к Ly6G мыши (Novus Biologicals Inc., США), к F4/80 мыши (Acris-Antibodies, США), а также вторичных антител к IgG крысы (Acris-Antibodies, США). Статистическую обработку проводили, используя программу Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США). Значимость отличий значений контрольной и экспериментальной групп оценивали с использованием дисперсионного анализа (ANOVA), различия считались значимыми при р<0.05. Значения LD50 были определены с использованием метода пробит-анализа в программе BioStat 2008 (AnalystSoft Inc, США).

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с П.Г. Ганчевой, к.б.н. Л.В. Верховской, к.б.н. Д.В. Щебляковым, н.с. П.В. Куданом, н.с. П.А. Метальниковым - сотрудниками лаборатории молекулярной биотехнологии; д.б.н., Д.Ю. Логуновым, к.б.н. А.И. Тухватулиным - сотрудниками лаборатории клеточной микробиологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России; н.с. М.А. Бобровым - сотрудником ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского; Т.П. Малофеевой, В.А. Колесниковой, Н.Е. Филипповой - сотрудниками филиала «Медгамал» ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, которым автор выражает глубокую благодарность за помощь и поддержку. Автор выражает глубокую благодарность к.б.н. Кобец Н.В., д.б.н. Гудкову A.B., к.б.н. Ветковой Л.Г., к.т.н. Просвирнину Д.В., к.б.н. Сахарову Д.А. за плодотворные дискуссии и помощь в проведении экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительное изучение физико-химических, иммунобиологических и токсикологических свойств липополисахаридов S. typhi Ту2 4446 и Е. coli

0111 :В4

Для проведения экспериментов, направленных на изучение влияния местного нанесения бактериального липополисахарида на процесс репарации кожи, на начальном этапе было необходимо исследовать физико-химические и иммунобиологические свойства используемого в работе липополисахарида S. typhi штамм Ту2 4446, произведенного и очищенного в производственном филиале «Медгамал» ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. В качестве контроля во всех экспериментах на данном этапе использовался липополисахарид Е. coli штамм Oil 1:В4 (Sigma-Aldrich, США), классический лиганд TLR4.

Для оценки способности исследуемых ЛПС активировать TLR4, были проведены эксперименты с использованием клеток линии HEK-293hTLR4/MD2-CD14 (клетки эмбриональной почки человека), экспрессирующих TLR4 человека, а также молекулы MD2 и CD 14, необходимые для распознавания ЛПС. Данная модель позволяет оценить уровень активации транскрипционного фактора NF-кВ, опосредованного активацией TLR4 как качественно, так и количественно. Для количественного определения в клетки был введен ген ß-галактозидазы под контролем NF-кВ-зависимого промотора.

Известно, что при активации NF-кВ перемещается из цитоплазмы в ядро. Анализ методом иммуноблота цитоплазматических и ядерных фракций клеток, стимулированных ЛПС, показал, что ЛПС S. typhi и ЛПС Е. coli обладают сравнимой способностью активировать NF-кВ через TLR4 (рис. 1 А.).

Для количественного определения способности ЛПС S. typhi активировать TLR4, к клеткам HEK293-hTLR4/CD14-MD2 были добавлены ЛПС Е. coli и ЛПС S. typhi в диапазоне концентраций от 1 нг/мл до 100 нг/мл; уровень активности ß-галактозидазы определяли спектрофотометрически по конверсии о-нитрофенил-ß-Д-галактопиранозида. В соответствии с результатами проведенного эксперимента, ЛПС S. typhi Ту2 4446 и Е. coli Olli:В4 не отличаются по способности активировать NF-кВ через TLR4 (рис. 1Б.).

Количественная оценка активности исследуемых ЛПС также была проведена с использованием турбидиметрического варианта классического фармакопейного метода ЛАЛ-тест (рис. 1Б.). Полученные результаты подтвердили данные предыдущих экспериментов: статистически значимых отличий в активности ЛПС S. typhi штамм Ту2 4446 и Е. coli Olli :В4 обнаружено не было.

А.

Цитоплазматические экстракты

Ядерные экстракты

Контроль ЛПС ЛПС Контроль ЛПС ЛПС Е. coli S. typhi Е. coli S. typhi

p65

GAPDH

□ ЛПС E. coli ■ ЛПС S. typhi

Контроль

нг/мл

100 нг/мл

г <

810° 6106 4-106 2106 0

ЛПС ЛПС Е. coli S. typhi

Рисунок 1. Изучение специфической активности ЛПС S. typhi штамм Ту2 4446 и Е. coli 0111:В4 in vitro.

(А). Анализ методом иммуноблота цитоплазматических и ядерных экстрактов клеток HEK-hTLR4/CD14-MD2, стимулированных ЛПС (1 мкг/мл) в течение 30 мин. Использовались антитела к р65, субъедипице NF-кВ, а также к глицеральдегид-З-фосфат-дегидрогеназе (GAPDH), для дополнительного контроля концентрации общего белка. (Б.) Количественное определение Т1Л*4-зависимой NF-kB активирующей способности ЛПС с использованием клеток HEK-hTLR4/CDI4-MD2.

(В.) Определение активности ЛПС методом ЛАЛ-тест (кинетический турбидиметрический тест).

С тем, чтобы провести сравнительную оценку активности исследуемых ЛПС in vivo, было проведено сравнительное изучение двух известных эффектов, индуцируемых эндотоксинами: секреции провоспалительных медиаторов при парентеральном введении и токсичности.

Для определения уровня секреции провоспалительных факторов, индуцированных ЛПС мышам линии BALB/c, внутримышечно был введен раствор ЛПС S. typhi Ту2 4446 или Е. coli Olli :В4; доза на одно животное составляла 10 мкг. В сыворотках крови была определена концентрация 1L-6, МСР-1, М1Р-1а методом проточной цитофлуориметрии. В соответствии с результатами эксперимента, при внутримышечном введении ЛПС 5. typhi уровень секреции провоспалительного цитокина 1L-6, а также хемокинов МСР-1

и MlP-la был значительно меньше, чем уровень, индуцируемый ЛПС Е. coli (рис. 2А.).

Токсичность ЛПС определяли с использованием аутбредных мышей ICR. Значение LD50 при внутрибрюшинном введении ЛПС S. typhi в 2 два раза превышало LD50, определенное при введении ЛПС Е. coli 0111:В4, что свидетельствует о сниженной токсичности ЛПС S. typhi (рис. 2Б.).

А.

log10 (Доза, мг/кг)

Рисунок 2. Сравнительная оценка свойств ЛПС S. typhi Ту2 4446 и Е. coli Olli: В4 in vivo. (А.) Определение концентрации IL-6, МСР-1 и MlP-la в сыворотке крови мышей в различные временные точки после внутримышечного введения ЛПС S. typhi Ту2 4446 и Е. coli Olli: В4 (контроль - фосфатно-солевой буфер, ФСБ).*-/)<0,05.

(Б.) Определение LD50 ЛПС S. typhi Ту2 4446 и Е. coli Olli: В4. Результаты, полученные методом пробит-аналмза, представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было показано, что ЛПС 5. typhi Ту2 4446 и Е. coli Olli :В4 обладают практически одинаковой функциональной активностью. Оба исследованных ЛПС в равной степени индуцируют активацию транскрипционного фактора NF-кВ, опосредованную То11-подобным рецептором. Однако в исследованиях in vivo ЛПС Е. coli 0111:В4 проявлял большую токсичность, и являлся более мощным индуктором провоспалительных медиаторов, чем ЛПС S. typhi Ту2 4446.

Мы предположили, что обнаруженный факт может быть обусловлен отличиями в химической структуре исследуемых ЛПС.

Прежде всего, мы определили соотношение низкомолекулярных и высокомолекулярных фракций ЛПС в препаратах. Для этого был использован

метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, а также, в дополнительной серии экспериментов, в присутствии деоксихолата натрия (рис.ЗА.). Деоксихолат натрия известен как один из наиболее эффективных агентов, способствующих диссоциации мицелл ЛПС на отдельные молекулы. Полученные электрофореграммы являются типичными для ЛПС энтеробактерий, и представлены характерной «лестницей». По результатам исследования можно сделать вывод, что в составе как ЛПС S. typhi Ту2 4446, так и Е. coli Olli:В4 присутствуют высоко- и низкомолекулярные фракции, при этом доля высокомолекулярных фракций больше в ЛПС S. typhi Ту2 4446.

Для более точной оценки распределения молекулярных масс, а также для определения степени ацилирования липида А, липополисахариды были подвергнуты кислотному гидролизу по кетозидной связи, соединяющей кор с липидом А, и разделены ультрацентрифугированием на две фракции: полисахаридную и липидную.

Для оценки распределения молекулярных масс в полисахаридной фракции, был использован эксклюзионный вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии. Исследуемая смесь полисахаридов была нанесена на колонку TSKgel GMPWXL, 7,8x30,0 см, предварительно откалиброванную набором стандартов, представляющих собой полиэтиленгликоли/полиэтиленоксиды с известной молекулярной массой. В соответствии с результатами эксперимента, полисахариды ЛПС S. typhi Ту2 4446 и ЛПС Е. coli Oil 1:В4 содержат высоко- и низкомолекулярные фракции, при этом доля высокомолекулярных фракций больше в полисахаридной фракции, выделенной из ЛПС S. typhi Ту2 4446 (рис. ЗБ.).

Строение липида А ЛПС было определено методом MALDI-масс спектрометрии с использованием полученной после кислотного гидролиза липидной фракции. В дополнительной серии экспериментов масс-спектрометрическому анализу были подвергнуты продукты аммонолиза липидной фракции, с целью уточнить расположение кислотных остатков в липидных фрагментах ЛПС. Используя полученные в этих экспериментах данные, а также принимая во внимание известные структуры липидов А энтеробактерий, было определено, что исследуемые образцы липидов А отличаются степенью ацилирования (рис. ЗВ.). Следует отметить, что в ЛПС, выделенных из бактерий, присутствует некоторое количество гипоацилированных (вследствие незавершенного синтеза) липидов A (Tirsoaga А et al., 2007). В нашем случае доля гексаацилированных форм, обладающих максимальной биологической активностью, была существенна выше в липидах А, выделенных из ЛПС Е. coli Olli:В4, в то время как липиды А, выделенные из S. typhi Ту2 4446 были представлены, в основном, гипоацилированными формами; доля гексаацилированных липидов в этом случае была минимальна.

Полученные данные позволили объяснить, почему, проявляя одинаковую способность активировать То11-подобный рецептор 4, ЛПС Е. coli Olli:В4 и S. typhi Ту2 4446 обладают различной токсичностью и способностью индуцировать секрецию медиаторов воспаления. Так, известно, что пентаацилированные ЛПС

являются лигандами ТЬЯ4, однако обладают значительно меньшей способностью индуцировать реакции, характерные для эндотоксинов (Ше1зс11е1 е1 а!., 1993).

А.

Б.

Калибровочная смесь

Sg fil

1600

3000

Липиды А Е. coli

Минуты

Полисахариды Е. coli

LiLiiilil,J.,..l„l

Минуты

4500-

5 3500

Полисахариды S. typhi

« се

1400 1600 1800

ш/z, отношение массы к заряду

Липиды A S. typhi

»uiaiiü..........uuL

JÜ.

1200 1400 1600 1800

Минуты тп/z. отношение массы к заряду

Рисунок 3. Изучение физико-химических свойств ЛПС S. typhi Ту2 4446 и Е. coli 0)11 :В4.

A. Электрофорез исследуемых ЛПС в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (слева) и деокенхолата натрия (справа). Нагрузка на трек составляла 100 мкг ЛПС. Трек 1 - ЛПС S. typhi Ту2 4446, трек 2 - Е. coli 0111 :В4.

Б. Оценка распределения молекулярных масс в полисахаридных фракциях исследуемых ЛПС методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием рефрактометрического детектирования.

B. Присутствие форм различной степени ацилирования в липидных фракциях, выделенных нз исследуемых ЛПС. Представлены репрезентативные спектры, полученные методом MALDl-масс-спектрометрии. Обозначения: 1 -тетраацилированные формы, 2 - иентаацнлированные формы, 3 - гексаацилированные формы.

Определение влияния местного нанесения ЛПС на скорость репарации ран кожи биомеханическим методом

Задача следующего этапа исследования заключалась в определении влияния местного нанесения ЛПС S. typhi на процесс репарации ран кожи. В качестве интегрального показателя, характеризующего эффективность процесса репарации, была выбрана механическая прочность раны.

После моделирования резаной раны (рис. 4А.), животные были разделены на четыре группы. Начиная с первого постоперационого дня, на область раневого дефекта ежедневно в течение 21 дня наносилось по 0,15 г геля, состоящего из натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, глицерина и воды, свободной от эндтоксинов, и содержащего ЛПС в концентрации 0,2 мг/г, 2 мг/г, 10 мг/г или геля-плацебо (содержащего все компоненты, за исключением ЛПС). Механическая прочность раневых дефектов была определена с использованием тензиометра Instron 5848 Microtester (Instron, Великобритания) в соответствии с известной методикой (Muehlberger et al., 2005). Максимальная сила, достигаемая до потери целостности раневого дефекта, фиксировалась автоматически в ньютонах (Н).

Нами было установлено, что при местном нанесении ЛПС механическая прочность раневых дефектов дозозависимо увеличивается. При нанесении на рану геля ЛПС концентрации 2 мг/г и 10 мг/г на всех сроках наблюдения было выявлено статистически значимое отличие механической прочности ран контрольной и опытной групп, при этом наибольшие отличия зафиксированы при обработке раны гелем ЛПС концентрации 10 мг/г (рис. 4Б.). Однако при нанесении на рану геля ЛПС концентрации 0,2 мг/г отсутствовало статистически значимое отличие механической прочности ран контрольной и опытной групп.

■ Плацебо В ЛПС 0,2 мг/г

□ ЛПС 2 мг/г

□ ЛПС 10 мг/г

Дни

Рисунок 4. Влияние местного применения ЛПС на прочность раневого дефекта. (А.) Моделирование резаной рапы.

(Б.) Местное применение ЛПС дозозависимо увеличивает прочность раневого дефекта. */><0.05, по сравнению с группой плацебо. Временные точки представлены с момента первого нанесения препаратов. Сила, необходимая для разрыва интактной (неповрежденной) кожи составляла 8.29 ± 1.05 II.

Исследование влняния местного нанесения ЛПС на процесс воспаления и инфильтрацию лейкоцитов

Для определения влияния местного нанесения ЛПС на течение раневого процесса на тканевом уровне, была проведена серия экспериментов, целью которых было оценить процессы воспаления, ангиогенеза, фиброплазии и эпителизации с использованием гистологических срезов раневых дефектов, окрашенных гематоксилином и эозином, а также процесса колагенообразования с использованием гистологических срезов, окрашенных по Массону.

В соответствии с полученными результатами, местное нанесение ЛПС способствовало быстрому завершению процесса воспаления (по сравнению с группой плацебо) (рис. 5А.). Так, через семь дней после начала терапии, в группе плацебо наблюдалась более интенсивная инфильтрация полиморфноядерных клеток, отмечались отечные явления.

С тем, чтобы оценить интенсивность и кинетику лейкоцитарной инфильтрации в области раневого дефекта, гистологические срезы были иммуногистохимически окрашены с использованием моноклональных антител к Ly6G (маркеру нейтрофилов) или F4/80 (маркеру макрофагов) (рис. 5Б.). Морфометрический анализ состоял в оценке численной плотности F4/80 и Ly6G положительных клеток в пяти полях зрения в области раневого дефекта при увеличении х400. В соответствии с полученными результатами, местное применение ЛПС стимулировало раннюю инфильтрацию макрофагов в края раны (рис. 5Г.). Через сутки после первого нанесения препаратов, количество макрофагов в поле зрения в экспериментальной группе было примерно вдвое больше, чем в контрольной. К 3-ему и 7-му дням инфлюкс макрофагов в обеих группах был сходным. Пик инфильтрации нейтрофилами приходился на первые сутки. В экспериментальной группе количество нейтрофилов начало уменьшаться на 3-й день, а к 7-му дню их количество было незначительным. В контрольной группе инфильтрация области раны нейтрофилами на 3-й и 7-й день была более интенсивной, при этом различия между группами были статистически значимыми. Возможно, обнаруженная более интенсивная инфильтрация тканей раневого дефекта макрофагами при нанесении ЛПС является одним из факторов, опосредующих ускоренную репарацию. Полагают, что макрофаги играют ключевую роль в раневом процессе и являются его регуляторами (Park and Barbul, 2004). Их функция заключается в предупреждение инфекции и в деструкции некротического дебриса за счет фагоцитоза, секреции активных радикалов кислорода и азота, антимикробных пептидов и протеолитических ферментов, а так же стимуляции процессов образования новых капилляров, фиброплазии и эпителизации. Макрофаги секретируют широкий спектр цитокинов, которые действуют паракринно или способствуют рекрутированию и активации фибробластов, эндотелиальных, эпителиальных клеток, и некоторых других клеточных популяций (Mahdavian-Delavary et al., 2011).

Исследование влияния местного нанесения ЛПС на процессы коллагенообразования и эпителизацнн раневых дефектов кожи

Местное применение ЛПС положительно влияло на процесс эпителизации (рис. 5А.). Так, уже через неделю после нанесения ран в экспериментальной группе отмечалась полная эпителизация раневого дефекта акантотически утолщенным эпидермисом, в то время как в группе плацебо наблюдались язвенные дефекты эпидермиса. К концу второй недели эксперимента в экспериментальной группе количество слоев эпидермиса составляло 2-3 слоя, что соответствует толщине эпидермиса интактных животных, тогда как в группе плацебо отмечалось наличие акантотически утолщенного эпидермиса. К третьей неделе количество слоев эпидермиса во всех группах составляло 2-3 слоя, что соответствовало толщине эпидермиса интактных животных.

Морфология и интенсивность окраски коллагеновых волокон в области раневого дефекта была оценена на гистологических срезах, окрашенных по Массону (рис. 5В.). На образцах первой недели интенсивность окраски коллагеновых волокон снижена для всех групп. На образцах второй недели для экспериментальной группы отмечалось появление больших по диаметру, расположенных параллельно поверхности эпидермиса коллагеновых волокон, имеющих более интенсивную окраску по Массону, по сравнению с группой плацебо. На образцах экспериментальной группы к третьей неделе при окраске по Массону отмечалось наличие коллагеновых волокон, имеющих одинаковую с волокнами дермы вне раневого дефекта интенсивность окраски и толщину. Примечательно, что объем рубцовой ткани при нанесении ЛПС был значительно меньше, чем в группе плацебо.

Исследование влияния местного нанесения ЛПС на ангиогенез и количество фибробластов в области раневого дефекта

Оценка ангиогенеза и количества фибробластов в области раневого дефекта была выполнена с использованием гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином. Морфометрический анализ состоял в оценке численной плотности фибробластов, а также капилляров в пяти произвольно выбранных полях зрения в области раневого дефекта при увеличении х400. Кровеносный сосуд не учитывался в качестве капилляра, если имел эластиновую мембрану, клетки гладкой мускулатуры или более трех эритроцитов в просвете (Ваэи е1 а!., 2009).

Согласно полученным данным, местное нанесение ЛПС способствовало увеличению количества фибробластов на ранних сроках заживления ран (первая неделя), при этом на второй и третьей неделе отмечалось резкое уменьшение количества фибробластов (рис. 6А.). При нанесении плацебо максимум численной плотности фибробластов приходился на вторую неделю, при этом количество фибробластов к концу третьей неделе оставалось высоким, что может свидетельствовать о задержке процесса репарации.

Местное нанесение ЛПС дозозависимо стимулировала процесс ангиогенеза на ранних сроках заживления ран, в то время как при терапии плацебо

максимальное количество капилляров в раневом дефекте наблюдалось только через две недели после нанесения раны (рис. 6Б.). Следует отметить, что интенсивность ангиогенеза является одним из маркеров эффективности репарации, поскольку новообразованные капилляры снабжают клетки грануляционной ткани кислородом и питательными веществами.

А. Б.

Плацебо ЛПС Плацебо ЛПС

ч « + _

о ч

ОС о ^ 1= и. СС

20 15 10

□ ЛПС

Плацебо

ИМ

3 7 13

Дни Дни

Рисунок Гистологические исследования влияния местного нанесения ЛПС на процесс воспаления, инфильтрацию лейкоцитов, коллагенообразование и эпнтелизацию раневых дефектов. Временные точки представлены с момента первого нанесения препаратов. Использовали гель е концентрацией ЛПС 10 мг/г и гель плацебо.

(А.) Репрезентативные фотографии гистологических срезов, окрашенных гематоксилин-эозином. Линия масштаба равна 500 мкм.

(Б.) Репрезентативные фотографии гистологических срезов, окрашенных с использованием антител к 14/80 и I.>(>(;. Линия масштаба равна 40 мкм. (В.) Репрезентативные фотографии гистологических срезов, окрашенных по Массону. Линия масштаба равна 100 мкм.

(Г.) Анализ чнсленной плотности 1-4/80 положительных клеток (макрофагов) и ЬубС положительных клеток (нейтрофилов) в области раневого дефекта. */><0.05

200

150

I неделя

2 неделя

3 неделя

-Плацебо ЛПС 0.2 мг/г О ЛПС 2 мг/г

1 неделя

г1-|

А?

пЬ

1 неделя 2 неделя 3 неделя

- Плацебо -А- ЛПС 0,2 мг/г ЛПС 2 мг/г -♦-ЛПС 10 от/г

неделя

Г+1 г+1

.О-" Л

■Ф # *

Нп

Рисунок 6. Исследование местного нанесения ЛПС на количество фнбробластов (А.) и процесс ангиогенеза (Б.) в области раневых дефектов. Временные точки представлены с момента первого нанесения препаратов. */><0.05, по сравнению с группой плацебо.

Полногеномное изучение изменения экспрессии генов в области раневого дефекта

Для детального изучения влияния местного применения ЛПС на раневый процесс, нами был проведен анализ изменения спектра экспрессии генов (около 35000 генов) в области раневого дефекта с использованием микрочипов и оборудования фирмы Affymetrix, США. В эксперименте использовали гель, содержащий ЛПС в концентрации 10 мг/г, и гель плацебо (в качестве контроля). Биоптаты кожи, содержащей раневые дефекты, были отобраны через 2,5 часа и через 48 часов после нанесения препаратов. Проведенный анализ полученных результатов показал, что нанесение ЛПС на раневую поверхность приводит к достоверному увеличению экспрессии в 1,5 раза и более свыше 300 генов (временная точка 2,5 часа) и 150 генов (временная точка 48 часов).

В таблице 1 приведен перечень генов, экспрессия которых может оказывать влияние на процесс репарации кожи.

Прежде всего, следует отметить повышение экспрессии генов, кодирующих белки семейства NF-кВ, а именно NFkbl, NFkb2, Reib и Reí. Примечательно, что повышается экспрессия генов факторов, участвующих в активации NF-кВ как по каноническому, так и по неканоническому пути. Так же повышается экспрессия генов ряда факторов, участвующих в активации NF-kB.

Наряду с увеличением экспрессии генов молекул, свидетельствующих об активации NF-кВ, отмечено повышение экспрессии генов факторов, на разных этапах биохимического каскада ингибирующих активацию NF-кВ, в том числе генов, кодирующих белки 1кВ.

Примечательно, что через 48 часов после первого нанесения ЛПС только два гена, вовлеченные в биохимический каскад активации NF-кЬ, демонстрировали повышенную экспрессию: Tnf и Tifab.

Отмечено повышение ряда провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, и хемокинов, принадлежащих к СС- и СХС-семействам, а также некоторых рецепторов цитокинов. Также повышена экспрессия супрессоров сигнальных путей, активируемых цитокинами: Socsl, Socs3 и Cish, обеспечивающих отрицательную регуляцию секреции провоспалительных цитокинов (в частности, цитокинов семейства IL-6). Через 48 часов после первого нанесения ЛПС повышена экспрессия гена Tnf (кодирующего TNF-a), и ряда хемокинов (преимущественно СС-семейства).

Отмечено повышение уровня экспрессии генов молекул адгезии, играющих существенную роль в рекрутировании лейкоцитов из циркулирующей крови в ткань к месту повреждения.

Другую группу генов, экспрессия которых повышалась в ответ на нанесение ЛПС на раневую поверхность, составляют гены, кодирующие белки, вовлеченные в антибактериальный, противовирусный иммунный ответ и иммунный ответ против простейших.

Таблица 1. Изменение экспрессии генов в области раневого дефекта в ответ

на нанесение ЛПС*.

Временная точка: 2,5 часа Временная точка: 48 часов

Краткое название гена Краткое название гена

Гены белков семейства NF-kB

Nfkbl, Nfkb2, Reib, Rel (c-Rel)

Гены белков семейства 1кВ

Nfkbia, Nfkbie, Nfkbiz, Bcl3

Гены белков, участвующих в активации или ингибирующих активацию NF-kB

Tlr2, Nod2, Tnfrsflb, Cd40, Ltb, Tnf (Tnfa), Tifa, ТгаП, Irak2, Irak3, Ikbke, Tnipl, Tnfaip3 (A20) Tlr9, Tnf (Tnfa), Tifab

Гены хемокинов, цитокинов и их рецепторов

Сс12, Сс14, Сс15, Сс17, Сс112, Cxcll, Схс19, CxcllO, Cxcll 1, CsO, Ilia, Illf9, 116,1110, Il Юга, 1115,1119,1123а, 1127 CcI2, Ccl5, Cell 1, Cell2, Ccl21a„ Cxcl9, CxcllO, Csf2ra, Tnfrsn4, IllOra, Vegfa

Гены супрессоров сигнальных путей, активируемых цитокинами

8осз1 ЗосвЗ СгвЬ

Гены молекул адгезии

1сат1, Усаш1, 8е1е, 8е1р |

Гены, кодирующие белки, вовлеченные в антибактериальный, противовирусный иммунный ответ и иммунный ответ против простейших

Ncfl, Nos2 (¡NOS), Cybb, Mxl, Mx2, Irgm2, Iigpl, Ifi47, Gbpl, Gbp2, Gbp3, Gbp4, Gbp5, Gbp6, Gbp9 Mxl, Mx2, Irgml, Gbp5

*Краткие названия генов приведены в соответствии с общепринятой номенклатурой (Guidelines for Nomenclature of Genes, Genetic Markers, Alleles, and Mutations in Mouse and Rat, 2011); в скобках указаны синонимы.

Изучение кинетики секреции цитокинов, хемокинов и ростовых факторов в области раневого дефекта при нанесенин ЛПС

Полногеномное изучение изменения экспрессии генов в ответ на местное нанесение ЛПС позволило детально оценить ответ макроорганизма на присутствие в области раневого дефекта эндотоксина. На следующем этапе исследования было необходимо изучить локальные изменения уровня секреции и кинетики секреции медиаторов, вовлеченных в процессы иммунного ответа и репарации кожи.

В соответствии с полученными данными, представленными на рисунке 7А., уровень секреции хемокинов а-семейства (СС-хемокинов), в частности, ССЬ2/МСР-1, ССЬЗ/М1Р-1а, ССЬ7/МСР-3, и ССЬ5/ЯА1МТЕ8 в экспериментальной группе был значительно выше, чем в контрольной; вместе с

тем, статистически значимых отличий в уровне секреции хемокинов р-семейства (СХС-хемокинов) между двумя группами обнаружено не было.

Известна ключевая роль провоспалительных цитокинов в раневом процессе. Кроме того, хорошо известно, что ЛПС является одним из наиболее мощных индукторов секреции провоспалительных цитокинов (Werner and Grose, 2003). Согласно полученным данным, местное нанесение ЛПС статистически значимо увеличивало уровень секреции LIF и IL-ip только в начальный, достаточно короткий период после первого нанесения ЛПС (временные точки 4 часа, LIF; и 4 часа и 10 часов, IL-ip). Секреция IL-6 в экспериментальной группе была статистически значимо повышена вплоть до 3-х суток после начала терапии (рис. 7Б.).

Обнаружено повышение уровня секреции ростовых факторов в области раневого дефекта: TGF-pi, FGF2, VEGF, EGF, регулирующих процессы ангиогенеза, фиброплазии, синтеза коллагена, эпителизации (рис. 7В.)

Доклиническое изучение безопасности местного накожного применения лекарственного средства, содержащего ЛПС

На заключительном этапе мы поставили перед собой задачу выяснить, насколько безопасным является местное применение ЛПС. Для этого были произведены опытные партии геля, содержащего ЛПС, в условиях производства, удовлетворяющего требованиям GMP (ЗАО «Фармацевтическое научно-производственное предприятие «Ретиноиды», г. Москва). С использованием произведенных опытных партий, были проведены доклинические исследования в филиале Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, г. Пущино. Спектр доклинических исследований был ограничен, и включал исследования острой и хронической токсичности, так как используемый активный компонент (ЛПС S. typhi штамм Ту2 4446) является действующим компонентом зарегистрированного препарата «Пирогенал». Исследования были проведены в соответствии со стандартными методиками (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева, 2005).

В результате проведенных доклинических исследований геля, содержащего ЛПС S. typhi в концентрации 10 мг/г, было показано, что при его местном нанесении на неповрежденную кожу, а также на кожу с раневым дефектом токсические реакции отсутствуют; токсические реакции проявляются лишь при нанесении ЛПС на раневый дефект в дозах, в 70 раз превышающих дозы, использованные в наших экспериментах.

А.

М1Р-1а

4ч 10ч 24ч Зд 7д 10д Временная точка

4ч 10 ч 24ч Зд 7д 10д Временная точка

4ч 10ч 24ч Зд 7д [Од Временная точка

э 100

—О— лпе

- -О - Плацебо

4ч 10ч 24ч Зд 7д Юл Временная точка

Рисунок 7. Изменение кинетики секреции хемокипов (Л.), ировоспалительных цптокппов (Б.) и факторов роста (В.) в области раневого дефекта в ответ па местное нанесение ЛПС. Временные точки представлены с момента первого нанесения препаратов.*/><0.05.

Таким образом, в результате работы была впервые показана способность бактериального липополисахарида при местном нанесении на область раневого дефекта кожи индуцировать широкий спектр реакций, приводящих, в конечном итоге, к стимуляции процесса репарации. Полученные результаты расширяют знания о роли врожденного иммунитета в репаративных процессах.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы физико-химические, иммунобиологические и токсикологические свойства используемого в работе липополисахарида S. typhi штамм Ту2 4446. Показано, что ЛПС S. typhi штамм Ту2 4446 представлен преимущественно гипоацилированными формами и обладает сниженной токсичностью, в два раза меньшей, чем классический ЛПС Е. coli.

2. Показано, что местное нанесение липополисахарида 5. typhi на область раневого дефекта стимулирует процессы репарации кожи: дозозависимо увеличивает механическую прочность раневого дефекта, дозозависимо стимулирует ангиогенез и способствует увеличению количества фибробластов на ранних сроках раневого процесса; стимулирует коллагенообразование, уменьшает продолжительность воспалительной фазы раневого процесса и ускоряет эпителизацию раны.

3. Проведено полногеномное изучение изменения экспрессии генов при аппликации бактериального ЛПС S. typhi на раневый дефект кожи. Показано, что местное нанесение ЛПС на область раны увеличивает экспрессию свыше 300 генов, в том числе генов факторов, участвующих в биохимическом каскаде активации транскрипционного фактора NF-кВ; генов цитокинов, хемокинов, и их рецепторов; генов молекул адгезии; генов, кодирующих белки, вовлеченные в антибактериальный, противовирусный иммунный ответ и иммунный ответ против простейших.

4. Показано, что местное нанесение ЛПС S. typhi приводит к избирательному повышению секреции (до 30 раз) спектра медиаторов, вовлеченных в процесс репарации, в том числе хемокинов СС-семейства, провоспалительных цитокинов и факторов роста в области раневого дефекта; определена кинетика секреции указанных медиаторов.

5. Показано, что местное нанесение ЛПС S. typhi увеличивает в 2 раза количество макрофагов в тканях раны на ранних стадиях раневого процесса, а на более поздних стадиях приводит к уменьшению инфильтрации раны нейтрофилами.

6. По результатам доклинических исследований разработанной лекарственной формы показано, что нанесение ЛПС S. typhi не приводит к развитию системных токсических эффектов в использованных в исследовании дозах, при нанесении на неповрежденную и поврежденную кожу.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Костарной A.B., Логунов Д.Ю., Тухватулин А.И., Колесникова В.А., Малофеева Т.П., Филиппова Н.Е., Народицкий Б.С. Возможности эффективной регенерации кожи при местной стимуляции врожденного иммунитета // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2011.-№ 10. - С. 62-65.

2. Костарной A.B., Логунов Д.Ю., Верховская Л.В.,Ганчева П.Г., Народицкий Б.С. Влияние липополисахарида S. typhi на эпителизацию ран кожи и секрецию эпидермального фактора роста // Медицинская иммунология. - 2012. - том 14. -№ 3. - С. 223-226.

3. Костарной А. В., Голубицкий Г. Б., Басова Е. М., Будко Е. В., Иванов В. М. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для анализа многокомпонентных лекарственных препаратов // Журнал аналитической химии. - 2008. - том 63. - № 6. - С. 566-580.

4. Костарной A.B., Ганчева П.Г., Логунов Д.Ю., Филиппова Н.Е., Народицкий Б.С., Влияние местного применения бактериального липополисахарида на процессы регенерации кожи // Материалы XIV-го Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». — В журн.: Медицинская иммунология, . — 2011.-том 13. -№4-5.-С. 318-319.

5. Kostarnoy AV, Gancheva PG, Logunov DY, Verkhovskaya LV, Scheblyakov DV, Tukhvatulin AI, Filippova NE, Naroditsky BS, Gintsburg AL. Influence of topical bacterial lipopolysaccharide application on injured skin on inflammatory reactions and wound healing // Program & Abstracts of Endotoxin and Innate Immunity Society Meeting 2012 / Homeostatic Inflammation Symposium (IEIIS2012). - Tokyo. -2012. -P. 153.

6. Патент 2447082 Российская Федерация, МПК С07К14/195. Способ стимуляции регенерации дефектов кожи и слизистых оболочек и лекарственное средство для его реализации / Костарной A.B., Логунов Д.Ю., Малофеева Т.П., Колесникова В.П., Тухватулин А. И., Токарская Е.А., Филиппова Н.Е., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. - № 2010153012/10; заявл. 19.01. 11; опубл. 10.04.12, Бюл. № 10-22 е.: ил.

Подписано в печать. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 103 Экз. Заказ № 2721 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Костарной, Алексей Викторович

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Бактериальные липополисахариды: структура, распознавание 14 иммунной системой, применение в медицине

1.1.1 Структура бактериальных липополисахаридов.

1.1.2 Распознавание ЛПС иммунной системой и процесс передачи 21 сигнала от TLR4.

1.1.3 Применение препаратов ЛПС в медицине.

1.2 Участие врожденного иммунитета в репаративных процессах.

1.2.1 Стадии раневого процесса.

1.2.2 Участие клеток иммунной системы в репарации ран кожи.

1.2.3 Участие То11-подобных рецепторов в процессах репарации.

1.2.4 Участие То11-подобных рецепторов в репарации ран кожи.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1 Бактериальные липополисахариды

2.1.2 Клеточные линии

2.1.3. Другие реактивы

2.1.4. Лабораторные животные

2.1.5. Лабораторное оборудование

2.2. Методы

2.2.1. Измерение активности ß-галактозидазы в культуре клеток

2.2.2. Иммуноблотинг

2.2.3 ЛАЛ-тест

2.2.4 Определение уровня секреции IL-6, МСР-1, М1Р-1а при 53 внутримышечном введении ЛПС

2.2.5 Определение LD

2.2.6 Электрофорез ЛПС в полиакриламидном геле в 54 присутствии до деци л сульфата натрия или деоксихолата натрия

2.2.7 Кислотный гидролиз ЛПС

2.2.8 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) 55 полисахаридов

2.2.9 Определение степени ацилирования липида А методом 56 MALDI-масс-спектрометрии

2.2.10 Приготовление гелей, содержащих ЛПС, для 56 исследований in vivo

2.2.11 Моделирование резаной раны.

2.2.12 Биомеханические исследования

2.2.13 Исследование влияния местного нанесения ЛПС на 58 процесс воспаления и инфильтрацию лейкоцитов, процессы колагенообразования и эпителизации

2.2.14 Исследование влияния местного нанесения ЛПС на ангиогенез и количество фибробластов в области раневого дефекта

2.2.15 Изготовление гистологических срезов

2.2.16 Окрашивание гистологических срезов гематоксилин- 59 эозином и по Массону

2.2.17 Иммуногистохимическое окрашивание.

2.2.18 Гистологическое исследование микропрепаратов

2.2.19 Схема эксперимента, направленного на полногеномное 62 исследование экспрессии генов в ответ на местное нанесение ЛПС

2.2.20 Выделение РНК из ткани.

2.2.21 Полногеномное исследование экспрессии генов

2.2.22 Изучение кинетики секреции цитокинов, хемокинов и 64 ростовых факторов в области раневого дефекта при нанесении ЛПС

2.2.23 Выделение белка из ткани

2.2.24 Иммуноферментный анализ

2.2.25 Измерение концентрации цитокинов на проточном 65 цитофлуориметре СуЮтюБ БС

2.2.26 Измерение концентрации цитокинов на флуориметре Bio- 65 Plex System

2.2.27 Доклинические исследования

2.2.28 Статистическая обработка

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Сравнительное изучение физико-химических, 67 иммунобиологических и токсикологических свойств липополисахаридов S. typhi Ту24446 и Е. coli Oil 1:В

3.2 Определение влияния местного нанесения ЛПС на скорость 74 репарации ран кожи биомеханическим методом

3.3 Исследование влияния местного нанесения ЛПС на 76 репарацию ран на тканевом уровне.

3.3.1 Исследование влияния местного нанесения ЛПС на 77 процесс воспаления и инфильтрацию лейкоцитов.

3.3.2 Исследование влияния местного нанесения ЛПС на 78 процессы коллагенообразования и эпителизации раневых дефектов кожи

З.З.ЗИсследование влияние местного нанесения ЛПС на ангиогенез и количество фибробластов в области раневого дефекта

3.4 Полногеномное изучение изменения экспрессии генов в 83 области раневого дефекта.

3.5 Изучение кинетики секреции цитокинов, хемокинов и 94 ростовых факторов в области раневого дефекта при нанесении ЛПС.

3.6 Доклиническое изучение безопасности местного накожного 97 применения лекарственного средства, содержащего ЛПС.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние местной стимуляции врожденного иммунитета липополисахаридом Salmonella typhi на репарацию раневых дефектов кожи"

1. АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

Раны различной этиологии, ожоги и язвы кожи и слизистых оболочек являются трудно разрешаемой медико-социальной проблемой современного общества. Особую актуальность изучение вопросов репарации ран кожного покрова приобретает в связи с постоянным ростом ран различного генеза вследствие ожогов, операций, механических травм. Терапия трофических язв, диабетических ран, пролежней, вялогранулирующих инфицированных ран, требует применения широкого арсенала лекарственных средств в течение длительного времени, во многих случаях вызывает необходимость стационарного лечения и зачастую оказывается недостаточно эффективным.

Микробная флора является обязательным участником процесса заживления ран кожи. Полагают, что микроорганизмы, способствуя воспалению и лизису омертвевших тканей, играют важную роль в очищении от них раневого дефекта; вместе с тем известно, что контаминация раны микроорганизмами может отрицательно сказываться на течении раневого процесса [8]. В целом, влияние микрофлоры на раневый процесс определяется характером повреждения, вирулентностью и количеством микробов, контаминировавших рану и особенностями иммунной системы макроорганизма [44].

Известно, что ключевую роль в процессах репарации играет система врожденного иммунитета [87, 103, 159]. Паттерн-распознающие рецепторы врожденного иммунитета, в отличие от Т- и В-клеточных рецепторов адаптивного иммунитета, распознают не уникальные структуры антигенных эпитопов, а высоконсервативные молекулярные структуры, характерные для микроорганизмов и вирусов (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) [132] а также структуры молекул, высвобождаемых или секретируемых в ответ на повреждение ткани (Danger-associated molecular patterns, DAMPs) [17]. Активация То11-подобных рецепторов (TLRs), одного из основных семейств рецепторов врожденного иммунитета, приводит к запуску биохимических каскадов, приводящих к активации ряда транксрипционных факторов (NF-кВ, IRF3, 5, 7, АР-1), регулирующих секрецию спектра цитокинов, хемокинов, антимикробных пептидов, молекул адгезии и других факторов, которые могут влиять на процесс репарации.

Рецепторы врожденного иммунитета (в частности То11-подобные рецепторы) экспрессируются широким спектром клеток, образующихся или присутствующих в коже: фибробластами, адипоцитами, кератиноцитами, эндотелиальными клетками, включая клетки иммунной системы, такие как моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, клетки Лангерганса, тучные клетки, Т- и В-лимфоциты [137].

Важность проведения сигнала через То11-подобные рецепторы для заживления ран была показана с использованием генетически модифицированных животных. Так, у мышей, нокаутных по гену цитозолыюго белка MyD88, необходимого для передачи сигнала от большинства TLRs (кроме TLR3) наблюдается значительно худшее заживление ран кожи, ассоциированное с уменьшенным уровнем ангиогенеза раневого дефекта на [128]. Репарация ран кожи у мышей, нокаутных по гену TLR3, замедлена, и ассоциирована с уменьшенным уровнем секреции хемокинов и худшей инфильтрацией нейтрофилов и альтернативно активированных макрофагов в области раневого дефекта [118].

TLR2 - макрофаги-активирующим липопептидом-2 (MALP-2): местное применение MALP-2 усиливало секрецию хемокина МСР-1 и способствовало инфильтрации раны макрофагами [38]. Sato и соавт. показали, что местное нанесение лиганда TLR9, CpG олигонуклеотида, значительно ускоряло

10 заживление ран кожи, способствовало фиброплазии и ранней эпителизации раневых дефектов [188]. Нанесение на раневую поверхность poli 1:С, лиганда TLR3, стимулировало ангиогенез, способствовало инфильтрации раны макрофагами и приводило к ускорению репарации [119].

Однако к настоящему моменту отсутствуют данные, касающиеся влияния местного применения одного из наиболее активных лигандов TLR, бактериального липополисахарида (лиганда TLR4) на процесс репарации ран кожи. Учитывая, что TLR4 экспрессирован большинством клеток кожи, известен обширный перечень DAMPs лигандов этого рецептора, опубликован ряд данных, полученных in vitro, показывающих участие этого рецептора в активации фибробластов, эпителиальных клеток, клеток эндотелия сосудов, можно предположить, что местная стимуляция TLR4 может оказывать существенное влияние на процессы репарации кожи in vivo.

2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель работы: Изучение влияния местной стимуляции врожденного иммунитета бактериальным липополисахаридом (ЛПС), лигандом Toll-подобного рецептора 4, на репарацию ран кожи.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1. Охарактеризовать физико-химические, иммунобиологические и токсикологические свойства используемого в работе липополисахарида Salmonella typhi.

3. НАУЧНАЯ НОВИЗНА

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Работа представляет не только научный интерес, заключающийся в более глубоком понимании механизмов влияния структурного компонента бактерий (ЛПС) на процесс репарации, но и обладает потенциалом практического использования. Созданная по результатам исследования лекарственная форма запатентована (Патент РФ № 2447082) и успешно прошла доклинические испытания (отчеты № 244/11, 251/11, 252/11 лаборатории биологических испытаний ФИБХ РАН, г. Пущино). В настоящее время в рамках государственного контракта № 12411.1008799.13.112 проходят клинические исследования разработанной лекарственной формы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Костарной, Алексей Викторович

выводы

2. Показано, что местное нанесение липополисахарида S. typhi на область раневого дефекта стимулирует процессы репарации кожи: дозозависимо увеличивает механическую прочность раневого дефекта, дозозависимо стимулирует ангиогепез и способствует увеличению количества фибробластов на ранних сроках раневого процесса; стимулирует коллагенообразование, уменьшает продолжительность воспалительной фазы раневого процесса и ускоряет эпителизацию раны.

3. Проведено полногеномное изучение изменения экспрессии генов при аппликации бактериального ЛПС S. typhi на раневый дефект кожи. Показано, что местное нанесение ЛПС па область раны увеличивает экспрессию свыше 300 генов, в том числе генов факторов, участвующих в биохимическом каскаде активации транскрипционного фактора NF-kB; генов цитокинов, хемокинов, и их рецепторов; генов молекул адгезии; генов, кодирующих белки, вовлеченные в антибактериальный, противовирусный иммунный ответ и иммунный ответ против простейших.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Костарной, Алексей Викторович, Москва

1. Государственная фармакопея РФ. 12-е изд. - М.,. 2007. - Ч. 1. - 704 с.

2. Кабанов Д.С., Прохоренко И.Р. Структурный анализ липополисахаридов грамм-отрицательных бактерий // Биохимия. 2010. - 75(4) — С.469-491.

3. Книрель Ю. А., Кочетков Н. К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. II. Структура области кора // Биохимия. -1993.-58 (2).-С. 182-201.

4. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов//Биохимия. -1994. -59(12). -С. 1784- 1851.

5. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А // Биохимия. 1993. - 58 (2). -С. 166-181.

6. Раны и раневая инфекция /Под ред. М. И. Кузина, Б. М. Костюченок. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1990. -592 с

7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией члеп-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева. -2 изд., перераб. и доп. М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. -832 с.

8. Ю.Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Народицкий Б.С., Гудков А.В., Гинцбург АЛ. То11-подобные рецепторы и их адаптерные молекулы. // Биохимия. 2011. - 75(9). -С.1098-114.

9. Adachi Y, Moore LE, Bradford BU, Gao W, Thurman RG. Antibiotics prevent liver injury in rats following long-term exposure to ethanol // Gastroenterology. -1995.108(1).-C. 218-24.

10. Barrientos S, Stojadinovic O, Golinko MS, Brem H, Tomic-Canic M. Growth factors and cytokines in wound healing // Wound Repair Regen. -2008.-16(5). -C. 585-601.

11. Basu S, Kumar M, Chansuria JP, Singh ТВ, Bhatnagar R, Shukla VK. Effect of Cytomodulin-10 (TGF-betal analogue) on wound healing by primary intention in a murine model // Int J Surg. 2009. -7(5). -C. 460-5.

12. Basu S, Radziejewska Lebrecht J, Mayer H. Lipopolysaccharide of Providencia rettgeri. Chemical studies and taxonomical implications // Arch Microbiol. -1986. 144.-C. 213-218.

13. Baume P. Pyrogenicity of 'Pyromen' // Nature. -1968. -217(5132). -C. 970.

14. Bianchi ME. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger // J Leukoc Biol. 2007. -81(1). -C. 1-5.

15. Bjarnason I, Peters TJ, Wise RJ. The leaky gut of alcoholism: possible route of entry for toxic compounds // Lancet. -1984. 1(8370). -C. 179-82.

16. Bowie AG, Haga IR. The role of Toll-like receptors in the host response to viruses // Mol Immunol. -2005. 42(8). -C. 859-67.

17. Brade H, Brade L, Nano FE. Chemical and serological investigations on the genus-specific lipopolysaccharide epitope of Chlamydia // Proc Natl Acad Sci USA. -1987. 84(8). -C. 2508-12.

18. Brancato SK, Albina JE. Wound macrophages as key regulators of repair: origin, phenotype, and function // Am J Pathol. -2011. -178(1). -C. 19-25.

19. Brint EK, Xu D, Liu H, Dunne A, McKenzie AN, O'Neill LA, Liew FY. ST2 is an inhibitor of interleukin 1 receptor and Toll-like receptor 4 signaling and maintains endotoxin tolerance // Nat Immunol. -2004. -5(4). -C. 373-9.

20. Burke JP, Cunningham MF, Watson RW, Docherty NG, Coffey JC, O'Connell PR. Bacterial lipopolysaccharide promotes profibrotic activation of intestinal fibroblasts // Br J Surg. -2010. -97(7). C. 1126-34.

21. Carty M, Goodbody R, Schroder M, Stack J, Moynagh PN, Bowie AG. The human adaptor SARM negatively regulates adaptor protein TRIF-dependent Toll-like receptor signaling // Nat Immunol. -2006. -7(10). C. 1074-81.

22. Chang L, Karin M. Mammalian MAP kinase signalling cascades //Nature. -2001. —410(6824). C. 37-40.

23. Chiang CL, Kandalaft LE, Coukos G. Adjuvants for enhancing the immunogenicity of whole tumor cell vaccines // Int Rev Immunol. -2011. -30(2-3).-C. 150-82.

24. Chuang TH, Ulevitch RJ. Triad3A, an E3 ubiquitin-protein ligase regulating Toll-like receptors // Nat Immunol. -2004. -5(5). C. 495-502.

25. Christofidou-Solomidou M, Murphy GF, Albelda SM. Induction of E-selectin-dependent leukocyte recruitment by mast cell degranulation in human skin grafts transplanted on SCID mice // Am J Pathol. -1996. -148(1). C. 177-88.116

26. Coley W.B. The treatment of malignant tumors by repeated inoculations of erysipelas: with a report of ten original cases // Am J Med Sei. -1893. -105. -C. 487-511.

27. Courts C, Madea B. Micro-RNA A potential for forensic science? // Forensic Sei Int. -2010. -203(1-3). -C. 106-11.

28. Covert MW, Leung TH, Gaston JE, Baltimore D. Achieving stability of lipopolysaccharide-induced NF-kappaB activation // Science. -2005. -309(5742).-C. 1854-7.

29. Daley JM, Brancato SK, Thomay AA, Reichner JS, Albina JE. The phenotype of murine wound macrophages // J Leukoc Biol. -2010. -87(1). -C. 59-67.

30. Daley JM, Reichner JS, Mahoney EJ, Manfield L, Henry WL Jr, Mastrofrancesco B, Albina JE. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils // J Immunol. -2005. -174(4). -C. 2265-72.

31. Deiters U, Barsig J, Tawil B, Miihlradt PF. The macrophage-activating lipopeptide-2 accelerates wound healing in diabetic mice //Exp Dermatol. -2004. -13(12).-C. 731-9.

32. Diegelmann RF, Evans MC. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing // Front Biosci. -2004. -9. -C. 283-9.

33. DiPietro LA, Burdick M, Low QE, Kunkel SL, Strieter RM. MIP-1 alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair // J Clin Invest. -1998. -101(8).-C. 1693-8.

34. Dovi JV, He LK, DiPietro LA. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice // J Leukoc Biol. -2003. -73(4). -C. 448-55.

35. Edwards R, Harding KG. Bacteria and wound healing // Curr Opin Infect Dis. -2004. -17(2). -C. 91-6.

36. Egozi EI, Ferreira AM, Burns AL, Gameiii RL, Dipietro LA. Mast cells modulate the inflammatory but not the proliferative response in healing wounds // Wound Repair Regen. 2003. -11(1). -C. 46-54.

37. Erridge C, Bennett-Guerrero E, Poxton IR. Structure and function of lipopolysaccharides // Microbes Infect. 2002. - 4(8). -C. 837-51.

38. Fearns C, Pan Q, Mathison JC, Chuang TH. Triad3A regulates ubiquitination and proteasomal degradation of RIP1 following disruption of Hsp90 binding //J Biol Chem. -2006. 281(45). -C. 34592-600.

39. Finzi L, Shao MX, Paye F, Housset C, Nadel JA. Lipopolysaccharide initiates a positive feedback of epidermal growth factor receptor signaling by prostaglandin E2 in human biliary carcinoma cells // J Immunol. 2009. -182(4). -C. 2269-76.

40. Fitzgerald KA, McWhirter SM, Faia KL, Rowe DC, Latz E, Golenbock DT, Coyle AJ, Liao SM, Maniatis T IKKepsilon and TBK1 are essential components of the IRF3 signaling pathway // Nat Immunol. 2003. - 4(5). - C. 491-6.

41. Fukuoka S, Brandenburg K, Müller M, Lindner B, Koch MH, Seydel U. Physico-chemical analysis of lipid A fractions of lipopolysaccharide from Erwinia carotovora in relation to bioactivity // Biochim Biophys Acta. 2001. -1510(1-2).-C. 185-97.

42. Galanos C., Lüderitz O., Westphal O. Preparation and properties of a standardized lipopolysaccharide from salmonella abortus equi (Novo-Pyrexal) // Zentralbl Bakteriol Orig A. 1979. -243. - C. 226-244.

43. Gallant-Behm CL, Hildebrand KA, Hart DA. The mast cell stabilizer ketotifen prevents development of excessive skin wound contraction and fibrosis in red Duroc pigs // Wound Repair Regen. 2008. - 16(2). - C. 226-33.

44. Gillitzer R, Goebeler M. Chemokines in cutaneous wound healing // J Leukoc Biol.-2001.-69(4).-C. 513-21.

45. Gioannini TL, Weiss JP. Regulation of interactions of Gram-negative bacterial endotoxins with mammalian cells // Immunol Res. 2007. - 39(1-3). - C. 24960.

46. Goede V, Brogelli L, Ziehe M, Augustin HG. Induction of inflammatory angiogenesis by monocyte chemoattractant protein-1 // Int J Cancer. 1999. -82(5). - C.765-70.

47. Gordon S, Taylor PR. Monocyte and macrophage heterogeneity // Nat Rev Immunol. 2005. -5(12). - C. 953-64.

48. Gordon S. Alternative activation of macrophages // Nat Rev Immunol. 2003. -3(1). -C. 23-35.

49. Granger DN, Kubes P. The microcirculation and inflammation: modulation of leukocyte-endothelial cell adhesion // J Leukoc Biol. 1994. - 55(5). - C. 66275.

50. Green S, Fortier A, Dijkslra J, Madsen J, Swartz G, Einck L, Gubish E, Nacy C. Liposomal vaccines // Adv Exp Med Biol. 1995. - 383. - C. 83-92.

51. Gruber BL, Marchese MJ, Kew RR. Transforming growth factor-beta 1 mediates mast cell chemotaxis // J Immunol. 1994. - 152(12). - C. 5860-7.

52. Gurtner GC, Werner S, Barrandon Y, Longaker MT. Wound repair and regeneration // Nature. 2008. - 453(7193). - C. 314-21.

53. Guo B, Cheng G. Modulation of the interferon antiviral response by the TBKl/IKKi adaptor protein TANK // J Biol Chem. 2007. - 282(16). - C. 11817-26.

54. Haller O, Stertz S, Kochs G. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins // Microbes Infect. 2007. - (14-15). - C. 1636-43.

55. Haslett C. Macrophage phagocytosis of aging neutrophils in inflammation. Programmed cell death in the neutrophil leads to its recognition by macrophages //J Clin Invest. 1989. - 83(3). - C. 865-75.

56. He Z, Zhu Y, Jiang H. Toll-like receptor 4 mediates lipopolysaccharide-induced collagen secretion by phosphoinositide3-kinase-Akt pathway in fibroblasts during acute lung injury // J Reccpt Signal Transduct Res. 2009. - 29(2). - C. 119-25.

57. Henry SC, Daniell X, Indaram M, Whitesides JF, Sempowski GD, Howell D, Oliver T, Taylor GA. Impaired macrophage function underscores susceptibility to Salmonella in mice lacking Irgml (LRG-47) // J Immunol. 2007. -179(10). -C. 6963-72.

58. Hoebe K, Du X, Georgel P, Janssen E, Tabeta K, Kim SO, Goode J, Lin P, Mann N, Mudd S, Crozat K, Sovath S, Han J, Beutler B. Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88-independent TIR signaling // Nature. 2003. -424(6950).-C. 743-8.

59. Honda K, Taniguchi T. IRFs: master regulators of signalling by Toll-like receptors and cytosolic pattern-recognition receptors // Nat Rev Immunol. -2006. 6(9). - C. 644-58.

60. Hong KH, Ryu J, Han KH. Monocyte chemoattractant protein-1-induced angiogenesis is mediated by vascular endothelial growth factor-A // Blood. -2005. 105(4). - C. 1405-7.

61. Horng T, Barton GM, Flavell RA, Medzhitov R. The adaptor molecule TIRAP provides signalling specificity for Toll-like receptors // Nature. 2002. -420(6913).-C. 329-33.

62. Horng T, Barton GM, Medzhitov R. TIRAP: an adapter molecule in the Toll signaling pathway // Nat Immunol. 2001. - 2(9). - C. 835-41.

63. Huang C, Sali A, Stevens RL. Regulation and function of mast cell proteases in inflammation // J Clin Immunol. 1998. - 18(3). - C. 169-83.121

64. Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists // Nucleic Acids Res. 2009. - 37(1). - C. 1-13.

65. Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources // Nature Protoc. -2009.-4(1).-C. 44-57.

66. Hunt TK, Knighton DR, Thakral KK, Goodson WH 3rd, Andrews WS. Studies on inflammation and wound healing: angiogenesis and collagen synthesis stimulated in vivo by resident and activated wound macrophages. // Surgery. -1984.- 96(1). -C. 48-54.

67. Iba Y, Shibata A, Kato M, Masukawa T. Possible involvement of mast cells in collagen remodeling in the late phase of cutaneous wound healing in mice // Int Immunopharmacol. 2004. - 4(14). - C. 1873-80.

68. Jahr TG, Sundan A, Lichenstein HS, Espevik T. Influence of CD14, LBP and BPI in the monocyte response to LPS of different polysaccharide chain length // Scand J Immunol. 1995.-42(1).-C. 119-27.

69. Kato H, Haishima Y, lida T, Tanaka A, Tanamoto K. Chemical structure of lipid A isolated from Flavobacterium meningosepticum lipopolysaccharide // J Bacteriol. 1998. - 180(15). - C. 3891-9.

70. Katsuyama M. NOX/NADPH oxidase, the superoxide-generating enzyme: its transcriptional regulation and physiological roles // J Pharmacol Sci. -2010. -114(2). C. 134-46.

71. Kauhanen P, Kovanen PT, Reunala T, Lassila R. Effects of skin mast cells on bleeding time and coagulation activation at the site of platelet plug formation // Thromb Haemost. 1998. - 79(4). - C. 843-7.

72. Kawai T, Adachi O, Ogawa T, Takeda K, Akira S. Unresponsiveness of MyD88-deficient mice to endotoxin // Immunity. 1999. - 11(1). - C. 115-22.

73. Khanna S, Biswas S, Shang Y, Collard E, Azad A, Kauh C, Bhasker V, Gordillo GM, Sen CK, Roy S. Macrophage dysfunction impairs resolution of inflammation in the wounds of diabetic mice // PLoS One. 2010. - 5(3). - C. 9539.

74. Kim MH, Liu W, Borjesson DL, Curry FR, Miller LS, Cheung AL, Liu FT, Isseroff RR, Simon SI. Dynamics of neutrophil infiltration during cutaneous wound healing and infection using fluorescence imaging // J Invest Dermatol. -2008. 128(7). - C. 1812-20.

75. Kim BH, Shenoy AR, Kumar P, Das R, Tiwari S, MacMicking JD. A family of IFN-y-inducible 65-kD GTPases protects against bacterial infection //Science. 2011. - 332(6030). - C. 717-21.

76. Kluwe J, Menem A, Schwabe RF. Toll-like receptors, wound healing, and carcinogenesis // J Mol Med (Berl). 2009. - 87(2). - C. 125-38.

77. Kobayashi K, Hernandez LD, Galan JE, Janeway CA Jr, Medzhitov R, Flavell RA.IRAK-M is a negative regulator of Toll-like receptor signaling //Cell. 2002. - 110(2). - C. 191-202.

78. Koff JL, Shao MX, Kim S, Ueki IF, Nadel JA. Pseudomonas lipopolysaccharide accelerates wound repair via activation of a novel epithelial cell signaling cascadc // J Immunol. 2006. - 177(12). - C. 8693-700.

79. Koh TJ, DiPietro LA. Inflammation and wound healing: the role of the macrophage // Expert Rev Mol Med. 2011. - 13. - C. 23.

80. Komuro T, Galanos C. Analysis of Salmonella lipopolysaccharides by sodium deoxycholate-polyacrylamide gel electrophoresis // J Chromatogr. -1988.-450(3).-C. 381-7.

81. Kondo T, Ishida Y. Molecular pathology of wound healing // Forensic Sci Int. 2010. - 203(1-3). - C. 93-8.

82. Kulshin VA, Zahringer U, Lindner B, Frasch CE, Tsai CM, Dmitriev BA, Rietschel ET. Structural characterization of the lipid A component of124pathogenic Neisseria meningitidis //J Bacterid. 1992. - 174(6). - C. 1793800.

83. Kurt-Jones EA, Sandor F, Ortiz Y, Bowen GN, Counter SL, Wang TC, Finberg RW. Use of murine embryonic fibroblasts to define Toll-like receptor activation and specificity // J Endotoxin Res. 2004. - 10(6). - C. 419-24.

84. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - 227(5259). - C. 680-5.

85. Lavorgna A, De Filippi R, Formisano S, Leonardi A. TNF receptor-associated factor 1 is a positive regulator of the NF-kappaB alternative pathway // Mol Immunol. 2009. - 46(16). - C. 3278-82.

86. Leibovich SJ, Ross R. The role of the macrophage in wound repair. A study with hydrocortisone and antimacrophage serum // Am J Pathol. 1975. -78(1). -C. 71-100.

87. Li J, Bauer SI-I, Mansson M, Moxon ER, Richards JC, Schweda EK. Glycine is a common substituent of the inner core in Haemophilus influenzae lipopolysaccharide // Glycobiology. 2001. - 11(12). - C. 1009-15.

88. Lin Q, Fang D, Fang J, Ren X, Yang X, Wen F, Su SB. Impaired wound healing with defective expression of chemokines and recruitment of myeloid cells in TLR3-deficient mice // J Immunol. 2011. - 186(6). - C. 3710-7.

89. Lu P, Li L, Wu Y, Mukaida N, Zhang X. Essential contribution of CCL3 to alkali-induced corneal neovascularization by regulating vascular endothelial growth factor production by macrophages // Mol Vis. 2008. - 14. - C. 161422.

90. Lu YC, Yeh WC, Ohashi PS. LPS/TLR4 signal transduction pathway // Cytokine. 2008. - 42(2). - C. 145-51.

91. Lucas T, Waisman A, Ranjan R, Roes J, Krieg T, Mtiller W, Roers A, Eming SA. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair // J Immunol. 2010. - 184(7). - C. 3964-77.

92. Lukacova M, Barak I, Kazar J. Role of structural variations of polysaccharide antigens in the pathogenicity of Gram-negative bacteria // Clin Microbiol Infect. 2008. - 14(3). - C. 200-6.

93. Lye E, Mirtsos C, Suzuki N, Suzuki S, Yeh WC. The role of interleukin 1 receptor-associated kinase-4 (IRAK-4) kinase activity in IRAK-4-mediated signaling // J Biol Chem. 2004. - 279(39). - C. 40653-8.

94. Ma X, Becker Buscaglia LE, Barker JR, Li Y. MicroRNAs in NF-kappaB signaling // J Mol Cell Biol. 2011. - 3(3). - C. 159-66.

95. Macedo L, Pinhal-Enfield G, Alshits V, Elson G, Cronstein BN, Leibovich SJ. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors // Am J Pathol. -2007.-171(6).-C. 1774-88.

96. Mahdavian Delavary B, van der Veer WM, van Egmond M, Niessen FB, Beelen RH. Macrophages in skin injury and repair // Immunobiology. -2011. -216(7).-C. 753-62.

97. Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes // Trends Immunol. 2002. - 23(11). - C. 549-55.

98. Medzhitov R, Jane way CA Jr. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition //Cell. 1997. - 91(3). - C. 295-8.

99. Meszaros A J, Reichner JS, Albina JE. Macrophage-induced neutrophil apoptosis //J Immunol. 2000. - 165(1). - C. 435-41.

100. Meszaros AJ, Rcichner JS, Albina JE. Macrophage phagocytosis of wound neutrophils // J Leukoc Biol. 1999. - 65(1). - C. 35-42.

101. Meylan E, Burns K, Hofmann K, Blancheteau V, Martinon F, Kelliher M, Tschopp J. RIP1 is an essential mediator of Toll-like receptor 3-induced NF-kappa B activation // Nat Immunol. 2004. - 5(5). - C. 503-7.

102. Miller LS, Modlin RL. Toll-like receptors in the skin // Semin Immunopathol. 2007. - 29(1). - C. 15-26.

103. Miller LS. Toll-like receptors in skin // Adv Dermatol. 2008. - 24. - C. 7187.

104. Mirza R, DiPietro LA, Koh TJ Selective and specific macrophage ablation is detrimental to wound healing in mice // Am J Pathol. 2009. - 175(6). - C. 2454-62.

105. Miyairi I, Tatireddigari VR, Mahdi OS, Rose LA, Belland RJ, Lu L, Williams RW, Byrne GI. The p47 GTPases Iigp2 and IrgblO regulate innate immunity and inflammation to murine Chlamydia psittaci infection // J Immunol. 2007. - 179(3). - C. 1814-24.

106. Miyake K. Innate immune sensing of pathogens and danger signals by cell surface Toll-like receptors // Semin Immunol. 2007. - 19(1). - C. 3-10.

107. Mosser DM. The many faces of macrophage activation // J Leukoc Biol. -2003.- 73(2). -C. 209-12.

108. Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation // Nat Rev Immunol. 2008. - 8(12). - C. 958-69.

109. Moynagh PN. TLR signalling and activation of IRFs: revisiting old friends from the NF-kappaB pathway // Trends Immunol. 2005. - 26(9). - C. 46976.

110. Muehlberger T, Morcsi JM, Schwarze H, Hristopoulos G, Laenger F, Wong L. The effect of topical tretinoin on tissue strength and skin components in a murine incisional wound model // J Am Acad Dermatol. 2005. - 52(4). - C. 583-8.

111. Murphree LJ, Sullivan GW, Marshall MA, Linden J. Lipopolysaccharide rapidly modifies adenosine receptor transcripts in murine and human macrophages: role of NF-kappaB in A(2A) adenosine receptor induction // Biochem J. 2005. - 391. - C. 575-80.

112. Munford RS, Hall CL. Uptake and deacylation of bacterial lipopolysaccharides by macrophages from normal and endotoxin-hyporesponsive mice // Infect Immun. 1985. - 48(2). - C. 464-73.

113. Muzio M, Ni J, Feng P, Dixit VM. IRAK (Pelle) family member IRAK-2 and MyD88 as proximal mediators of IL-1 signaling // Science. 1997. -278(5343). - C. 1612-5.

114. Oganesyan G, Saha SK, Guo B, He JQ, Shahangian A, Zarnegar B, Perry A, Cheng G. Critical role of TRAF3 in the Toll-like receptor-dependent and -independent antiviral response // Nature. 2006. - 439(7073). - C. 208-11.

115. O'Neill LA, Bowie AG. The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signalling // Nat Rev Immunol. 2007. - 7(5). - C. 35364.

116. Onichtchouk D, Chen YG, Dosch R, Gawantka V, Delius H, Massague J, Niehrs C. Silencing of TGF-beta signalling by the pseudoreceptor BAMBI // Nature. 1999. - 401(6752). - C. 480-5.

117. Otte JM, Rosenberg IM, Podolsky DK. Intestinal myofibroblasts in innate immune responses of the intestine // Gastroenterology. 2003. -124(7). - C. 1866-78.

118. Oyama J, Blais C Jr, Liu X, Pu M, Kobzik L, Kelly RA, Bourcier T. Reduced myocardial ischemia-reperfusion injury in toll-like receptor 4-deficient mice // Circulation. 2004. - 109(6). - C. 784-9.

119. Pacher P, Beckman JS, Liaudet L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease // Physiol Rev. 2007. - 87(1). - C. 315-424.

120. Paik YH, Schwabe RF, Bataller R, Russo MP, Jobin C, Brenner DA. Tolllike receptor 4 mediates inflammatory signaling by bacterial lipopolysaccharide in human hepatic stellate cells // Hepatology. 2003. - 37(5). - C. 1043-55.

121. Park JE, Barbul A. Understanding the role of immune regulation in wound healing // Am J Surg. 2004. - 187(5A). - C. 11-16.

122. Perry AK, Chen G, Zheng D, Tang H, Cheng G. The host type I interferon response to viral and bacterial infections // Cell Res. 2005. - 15(6). - C. 40722.

123. Presta M, Andrés G, Leali D, Dell'Era P, Ronca RInflammatory cells and chemokines sustain FGF2-induced angiogenesis // Eur Cytokine Netw. 2009. - 20(2). - C. 39-50.

124. Presta M, Dell'Era P, Mitola S, Moroni E, Ronca R, Rusnati MFibroblast growth factor/fibroblast growth factor receptor system in angiogenesis // Cytokine Growth Factor Rev. 2005. - 16(2). - C. 159-78.

125. Posselt G, Schwarz H, Duschl A, Horejs-Hoeck J. Suppressor of cytokine signaling 2 is a feedback inhibitor of TLR-induced activation in human monocyte-derived dcndritic cells // J Immunol. 2011. - 187(6). - C. 2875-84.

126. Polverini PJ, Cotran PS, Gimbrone MA Jr, Unanue ER. Nature. Activated macrophages induce vascular proliferation. // Nature. 1977. - 269(5631). - C. 804-6.

127. Pull SL, Doherty JM, Mills JC, Gordon JI, Stappenbeck TS. Activated macrophages are an adaptive element of the colonic epithelial progenitor nichenecessary for regenerative responses to injury // Proc Natl Acad Sci USA. -2005.-102(1).-C.9 9-104.

128. Puxeddu I, Piliponsky AM, Bachelet I, Levi-Schaffer F. Mast cells in allergy and beyond // Int J Biochem Cell Biol. 2003. - 35(12). - C. 1601-7.

129. Qin J, Qian Y, Yao J, Grace C, Li X. SIGIRR inhibits interleukin-1 receptor-and toll-like receptor 4-mediated signaling through different mechanisms // J Biol Chem. 2005. - 280(26). - C. 25233-41.

130. Raetz CR, Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins // Annu Rev Biochem. 2002. - 71. - C. 635-700.

131. Raetz CR, Reynolds CM, Trent MS, Bishop RE. Lipid A modification systems in gram-negative bacteria // Annu Rev Biochem. 2007. - 76. - C. 295-329.

132. Rakoff-Nahoum S, Paglino J, Eslami-Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis // Cell. 2004. - 118(2). - C. 229-41.

133. Rappolee DA, Mark D, Banda MJ, Werb Z. Wound macrophages express TGF-alpha and other growth factors in vivo: analysis by mRNA phenotyping // Science. 1988. - 241(4866). - C. 708-12.

134. Ribeiro RA, Souza-Filho MV, Souza MH, Oliveira SH, Costa CH, Cunha FQ, Ferreira HS. Role of resident mast cells and macrophages in the neutrophil migration induced by LTB4, fMLP and C5a des arg // Int Arch Allergy Immunol. -1997. 112(1). - C. 27-35.

135. Rietschel ET, Kirikac T, Schade FU, Mamat U, Schmidt G, Loppnow H, Ulmer AJ, Zähringer U, Seydel U, Di Padova F, et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function // FASEB J. 1994. - 8(2).-C. 217-25.

136. Rietschel ET, Kirikae T, Schade FU, Ulmer AJ, Holst O, Brade H, Schmidt G, Mamat U, Grimmecke HD, Kusumoto S, et al. The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity // Immunobiology. 1993. -187(3-5).-C. 169-90.

137. Rodero MP, Khosrotehrani K. Skin wound healing modulation by macrophages // Tnt J Clin Exp Pathol. 2010. - 3(7). - C. 643-53.

138. Ross R, Ödland G. Human wound repair. II. Inflammatory cells, epithelialmesenchymal interrelations, and fibrogenesis // J Cell Biol. 1968. - 39(1). -C. 152-68.

139. Ruiz N, Kahne D, Silhavy TJ. Transport of lipopolysaccharide across the cell envelope: the long road of discovery // Nat Rev Microbiol. 2009. -7(9). -C. 677-83.

140. Salcedo R, Poncc ML, Young HA, Wasserman K, Ward JM, Kleinman HK, Oppenheim JJ, Murphy WJ. Human endothelial cells express CCR2 andrespond to MCP-1: direct role of MCP-1 in angiogenesis and tumor progression. // Blood. 2000. - 96(1). - C. 34-40.

141. Sato T, Yamamoto M, Shimosato T, Klinman DM. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9 // Wound Repair Regen. 2010,- 18(6). -C. 586-93.

142. Sato S, Sanjo II, Takeda K, Ninomiya-Tsuji J, Yamamoto M, Kawai T, Matsumoto K, Takcuchi O, Akira S. Essential function for the kinase TAK1 in innate and adaptive immune responses // Nat Immunol. 2005. - 6(11). - C. 1087-95.

143. Schwabe RF, Seki E, Brenner DA. Toll-like receptor signaling in the liver // Gastroenterology. 2006. - 130(6). - C. 1886-900.

144. Seki E, De Minicis S, Österreicher CH, Kluwe J, Osawa Y, Brenner DA, Schwabe RF. TLR4 enhances TGF-beta signaling and hepatic fibrosis // Nat Med. 2007. - 13(11). - C. 1324-32.

145. Sen CK. Wound healing essentials: let there be oxygen // Wound Repair Regen.-2009,-17(1).-C. 1-18.

146. Serena Leone, Alba Silipo, Evgeny L.Nazarenko, Rosa Lanzetta, Michelangelo Parrilli, Antonio Molinaro Molecular Structure of Endotoxins from Grain-negative Marine Bacteria: An Update // Mar Drugs. 2007. - 5(3). -C. 85-112.

147. Silipo A, Lanzetta R, Amoresano A, Parrilli M, Molinaro A. Ammonium hydroxide hydrolysis: a valuable support in the MALDI-TOF massspectrometry analysis of Lipid A fatty acid distribution // J Lipid Res. 2002. -43(12).-C. 2188-95.

148. Simpson DM, Ross R. The neutrophilic leukocyte in wound repair a study with antineutrophil scrum // J Clin Invest. 1972. - 51(8). - C. 2009-23.

149. Singer AJ, Clark RA. Cutaneous wound healing // N Engl J Med. 1999. -341(10).-C. 738-46.

150. Swantek JL, Tsen MF, Cobb MH, Thomas JA. IL-1 receptor-associated kinase modulates host responsiveness to endotoxin // J Immunol. 2000. -164(8). -C. 4301-6.

151. Thomas VA, Wheeless CJ, Stack MS, Johnson DA. Human mast cell tryptase fibrinogenolysis: kinetics, anticoagulation mechanism, and cell adhesion disruption // Biochemistry. 1998. - 37(8). - C. 2291-8.

152. Tidswell M, LaRosa SP. Toll-like receptor-4 antagonist eritoran tetrasodium for severe sepsis // Expert Rev Anti Infect Ther. 2011. - 9(5). - C. 507-20.

153. Tiwari S, Choi HP, Matsuzawa T, Pypaert M, MacMicking JD. Targeting of the GTPase Irgml to the phagosomal membrane via PtdIns(3,4)P(2) and PtdIns(3,4,5)P(3) promotes immunity to mycobacteria // Nat Immunol. 2009. - 10(8).-C. 907-17.

154. Tobias PS, Soldau K, Ulevitch RJ. Isolation of a lipopolysaccharide-binding acute phase reactant from rabbit serum // J Exp Med. 1986. - 164(3). - C. 777-93.

155. Tran AX, Whittimore JD, Wyrick PB, McGrath SC, Cotter RJ, Trent MS. The lipid A 1-phosphatase of Helicobacter pylori is required for resistance to the antimicrobial peptide polymyxin // J Bacterid. 2006. - 188(12). - C. 4531-41.

156. Trent MS, Pabich W, Raetz CR, Miller SI. A PhoP/PhoQ-induced Lipase (PagL) that catalyzes 3-O-deacylation of lipid A precursors in membranes of Salmonella typhimurium // J Biol Chem. 2001. - 276(12). - C. 9083-92.

157. Tsai CM, Frasch CE. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in Polyacrylamide gels // Anal Biochem. 1982. - 119(1). -C. 115-9.

158. Tsung A, Hoffman RA, Izuishi K, Critchlow ND, Nakao A, Chan MH, Lotze MT, Geller DA, Billiar TR. Hepatic ischemia/reperfusion injury involves functional TLR4 signaling in nonparenchymal cells // J Immunol. 2005. -175(11).-C. 7661-8.

159. Tsung A, Sahai R, Tanaka H, Nakao A, Fink MP, Lotze MT, Yang H, Li J, Tracey KJ, Geller DA, Billiar TR. The nuclear factor HMGB1 mediates hepatic injury after murine liver ischemia-reperfusion // J Exp Med. 2005. -201(7). -C. 1135-43.

160. Uesugi T, Froh M, Arteel GE, Bradford BU, Thurman RG. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice // Hepatology. 2001. - 34(1). - C.101-8.

161. Ulmer A J, Heine H, Feist W, Kusumoto S, Kusama T, Brade H, Schade U, Rietschel ET, Flad HD. Biological activity of synthetic phosphonooxyethyl analogs of lipid A and lipid A partial structures // Infect Immun. 1992. -60(8). -C. 3309-14.

162. Valent P, Sillaber C, Baghestanian M, Bankl HC, Kiener HP, Lechner K, Binder BR. What have mast cells to do with edema formation, the consecutive repair and fibrinolysis? // Int Arch Allergy Immunol. 1998. - 115(1). - C. 2-8.

163. Vandenplas ML, Carlson RW, Jeyaretnam BS, McNeill B, Barton MH, Norton N, Murray TF, Moore JN. Rhizobium sin-1 lipopolysaccharide (LPS) prevents enteric LPS-induced cytokine production.// J Biol Chem. 2002. -277(44).-C. 41811-6.

164. Vestal DJ, Jeyaratnam JA. The guanylate-binding proteins: emerging insights into the biochemical properties and functions of this family of large136interferon-induced guanosine triphosphatase.// J Interferon Cytokine Res. -2011. 31(1).-C. 89-97.

165. Wagner R, Ngamsri KC, Stark S, Vollmer I, Reutershan J. Adenosine receptor A3 is a critical mediator in LPS-induced pulmonary inflammation // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010. - 299(4). - C. L502-12.

166. Wald D, Qin J, Zhao Z, Qian Y, Naramura M, Tian L, Towne J, Sims JE, Stark GR, Li X. SIGIRR, a negative regulator of Toll-like receptor-interleukin 1 receptor signaling // Nat Immunol. 2003. - 4(9). - C. 920-7.

167. Wang T, Holland JW, Carrington A, Zou J, Secombes CJ. Molecular and functional characterization of IL-15 in rainbow trout Oncorhynchus mykiss: a potent inducer of IFN-gamma expression in spleen leukocytes // J Immunol. -2007.- 179(3).-C. 1475-88.

168. Walsh LJ, Trinchieri G, Waldorf HA, Whitaker D, Murphy GF Human dermal mast cells contain and release tumor necrosis factor alpha, which induces endothelial leukocyte adhesion molecule 1 // Proc Natl Acad Sei USA.- 1991,-88(10).-C. 4220-4.

169. Watanabe A, Hashmi A, Gomes DA, Town T, Badou A, Flavell RA, Mehal WZ. Apoptotic hepatocyte DNA inhibits hepatic stellate cell Chemotaxis via toll-like receptor 9 // Hepatology. 2007. - 46(5). - C. 1509-18.

170. Weber KS, Nelson PJ, Grone HJ, Weber C. Expression of CCR2 by endothelial cells : implications for MCP-1 mediated wound injury repair and In vivo inflammatory activation of endothelium // Arterioscler Thromb Vase Biol.- 1999.- 19(9).-C. 2085-93.

171. Weller K, Foitzik K, Paus R, Syska W, Maurer M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice // FASEB J. 2006. - 20(13). - C. 2366-8.

172. Werner S, Grose R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines // Physiol Rev. 2003. - 83(3). - C. 835-70.

173. Wesche H, Gao X, Li X, Kirschning CJ, Stark GR, Cao Z. IRAK-M is a novel member of the Pelle/interleukin-1 receptor-associated kinase (IRAK) family // J Biol Chem. 1999. - 274(27). - C. 19403-10.

174. Wicovsky A, Henkler F, Salzmann S, Scheurich P, Kneitz C, Wajant H. Tumor necrosis factor receptor-associated factor-1 enhances proinflammatory TNF receptor-2 signaling and modifies TNFR1-TNFR2 cooperation // Oncogene. 2009. - 28(15). - C. 1769-81.

175. Wilgus TA. Immune cells in the healing skin wound: influential players at each stage of repair // Pharmacol Res. 2008. - 58(2). - C. 112-6.

176. Wright SD, Ramos RA, Tobias PS, Ulevitch RJ, Mathison JC. CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein // Science. 1990. - 249(4975). - C. 1431-3.

177. Wright SD, Tobias PS, Ulevitch RJ, Ramos RA. Lipopolysaccharide (LPS) binding protein opsonizes LPS-bearing particles for recognition by a novel receptor on macrophages // J Exp Med. 1989. - 170(4). - C. 1231-41.

178. Wu H, Chen G, Wyburn KR, Yin J, Bertolino P, Eris JM, Alexander SI, Sharland AF, Chadban SJ. TLR4 activation mediates kidney ischemia/reperfusion injury // J Clin Invest. 2007. - 117(10). - C. 2847-59.

179. Yamamoto M, Sato S, Hemmi H, Uematsu S, Hoshino K, Kaisho T, Takeuchi O, Takeda K, Akira S. TRAM is specifically involved in the Toll-like receptor 4-mediated MyD88-independent signaling pathway // Nat Immunol. -2003.- 4(11).-C. 1144-50.

180. Yamamoto M, Sato S, Hemmi H, Hoshino K, Kaisho T, Sanjo H, Takeuchi O, Sugiyama M, Okabe M, Takeda K, Akira S. Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling pathway // Science. 2003. -301(5633).-C. 640-3.

181. Zhang X, Mosser DM. Macrophage activation by endogenous danger signals // J Pathol. 2008. - 214(2). - C. 161-78.

Информация о работе

Костарной, Алексей Викторович
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Влияние местной стимуляции врожденного иммунитета липополисахаридом Salmonella typhi на репарацию раневых дефектов кожи - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Влияние местной стимуляции врожденного иммунитета липополисахаридом Salmonella typhi на репарацию раневых дефектов кожи - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы