Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние лимфоидспецифического гена pub на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние лимфоидспецифического гена pub на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши"

На правах рукописи

Новосадова Екатерина Вячеславовна

Влияние лимфоидспецифического гена pub на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши

03.00.25 - «гистология, цитология, клеточная биология» 03.00.26 - «молекулярная генетика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003458921

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики соматических клеток Отдела вирусной и клеточной молекулярной генетики Учреждении Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН.

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Гривенников Игорь Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Васильев Андрей Валентинович

кандидат биологических наук Лагарькова Мария Андреевна

Ведущая организация

ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН

Защита состоится Н уЫ; 2009 года в ^

часов

дата, время

на заседании диссертационного совета_Д 002.238.01, созданного при

Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им.

Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26._

E-mail: idbras@bk.ru http://idbras.comcor.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26._и на сайте http://idbras.coincor.ru

Автореферат разослан

43

20QQ г

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н ele0806@vandex.ru

Е.Б. Абрамова

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

В последние годы предметом интенсивного исследования стали эмбриональные стволовые клетки (ЭС клетки) млекопитающих. ЭС клетки представляют собой уникальную модель для изучения процессов, лежащих в основе онтогенеза. Как и в ходе развития зародыша in vivo, ЭС клетки в культуре способны давать начало всем трём зародышевым слоям: энтодерме, мезодерме и эктодерме, а, соответственно, и всем развивающимся из них типам клеток. Исследования дифференцировки ЭС клеток в том или ином направлении в ответ на воздействие специфических индукторов (факторов роста, цитокинов) или на непосредственную генетическую модификацию позволяют приблизиться к пониманию функции исследуемых факторов и генов в данном процессе. Большой интерес в последние годы вызывает направление, связанное с поиском подходов к направленной дифференцировке ЭС и стволовых клеток различных тканей и органов млекопитающих в определённые типы клеток in vitro. Использование экзогенных факторов, позволяющих направить развитие дифференцировки ЭС клеток в том или ином направлении, а также генетические модификации этих клеток открывают перед экспериментатором возможности получения клеток с необходимыми свойствами, позволяющими, в перспективе, использовать их в трансплантологии и заместительной клеточной терапии нейродегенеративных, сердечно-сосудистых и других заболеваний. В связи с этим по-прежнему остается актуальным поиск новых генов, вовлеченных в дифференцировку ЭС клеток в разных направлениях.

В настоящей работе проводилось изучение влияния на рост и дифференцировку ЭС клеток мыши гена pub, который кодирует белок, относящийся к семейству TRIM (tripartite motif) белков. Белки этого семейства вовлечены в процессы клеточного роста, дифференцировки и регуляции

транскрипции. Мутации и перестройки в разных доменах этих белков приводят к таким заболеваниям как семейная средиземноморская лихорадка (FMF familian Mediterranean fever), синдром Опица, карликовость, а также способны вызывать злокачественные заболевания: лейкемию (промиелоцитная), карциному щитовидной железы. Это позволяет предполагать, что белки - члены TRIM-семейства играют важную роль в фундаментальных биологических процессах. Структура Pub свидетельствует о том, что он может обладать регуляторными свойствами. Однако его функция в организме не определена.

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что ген pub человека (hpub) повышенно экспрессируется при лимфогенезе (Tarantul V. et al., 2001). Кроме того, известно, что белок Pub является ингибитором транскрипционного фактора PU. 1, который участвует в гемопоэзе, в частности, влияет на развитие лимфоидной системы. Эти данные позволяют предположить, что ген pub может воздействовать на процесс дифференцировки ЭС клеток и способствовать их специлизации по лимфоидному пути. Цели и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение влияния лимфомоспецифического гена pub на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro, а также оценка онкогенного потенциала данного гена.

В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:

1. Изучить профиль экспрессии эндогенного гена pub на начальных этапах дифференцировки эмбриональных стволовых (ЭС) клеток мыши (при образовании эмбриоидных тел);

2. Получить стабильно трансфицированные поликлональные линии ЭС клеток мыши с повышенной экспрессией гена pub человека {hpub) и подавленной экспрессией эндогенного гена pub мыши;

3. Изучить влияние как подавления экспрессии эндогенного гена pub, так и усиления экспрессии гена hpub на пролиферацию и дифференцировку ЭС клеток мыши в разных направлениях (эктодермальном, энтодермальном, мезодермальном);

4. Оценить онкогенный потенциал гена hpub человека на культуре псевдонормальных клеток крысы линии Rat-2.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые показано, что ген pub экспрессируется в ЭС клетках мыши, и уровень его экспрессии увеличивается при образовании эмбриоидных тел. Использован двунаправленный подход к изучению влияния гена pub на дифференцировку ЭС клеток мыши: получены клеточные линии с повышенной экспрессией гена человека hpub и подавленной экспрессией эндогенного гена мыши pub.

Продемонстрировано влияние гена pub (hpub) на разные пути дифференцировки ЭС клеток мыши. Показано, что высокоэкспрессирующийся в лимфомах ген человека hpub не обладает выраженным онкогенным потенциалом.

Вовлеченность гена pub в разные пути дифференцировки ЭС клеток мыши свидетельствует о его важности в процессах онтогенеза. Полученные данные являются основой для дальнейшего изучения функции гена pub, как в ходе эмбрионального развития, так и во взрослом организме. В работе получены стабильные клеточные линии, которые могут в дальнейшем использоваться как модели для изучения влияния взаимодействия генов на разные пути дифференцировки ЭС клеток. Трансфицированные клеточные линии могут применяться для тестирования фармакологических препаратов, а также для оценки влияния различных цитокинов и факторов роста. Результаты диссертационной работы могут быть использованы в дальнейшем при разработке подходов к направленной дифференцировке ЭС клеток по лимфоидному пути для их использования в заместительной клеточной терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Ген pub повышенно экспрессируется на ранних этапах дифференцировки ЭС клеток мыши, при образовании эмбриоидных тел.

2. Повышенная экспрессия генов человека hpub и мыши pub, а также подавление экспрессии гена мыши pub не оказывают влияние на пролиферативную активность ЭС клеток мыши.

3. Повышенная экспрессия генов человека hpub и мыши pub стимулирует образование эмбриоидных тел из ЭС клеток мыши, в то время как снижение экспрессии гена мыши pub негативно влияет на образование эмбриоидных тел.

4. Ген человека hpub не обладает выраженным онкогенным потенциалом.

5. Экспрессия генов hpub и pub не влияет на дифференцировку ЭС клеток в энтодермальном направлении.

6. Гиперэкспрессия гена человека hpub в ЭС клетках приводит к значительному увеличению кластеров сокращающихся кардиомиоцитов и к существенному снижению образования нейрональных клеток; подавление экспрессии эндогенного гена pub стимулирует дифференцировку нейрональных клеток и негативно влияет на образование кластеров сокращающихся кардиомиоцитов. Негативное влияние гена человека hpub на нейрональную дифференцировку также показано на линии клеток феохромацитомы крысы РС-12.

7. Под влиянием повышенной экспрессии гена человека hpub происходит стимуляция дифференцировки ЭС клеток в лимфоидном направлении.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на третьем съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2005), на VI международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2005), на конкурсах аспирантов, проводимых в Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной генетики РАН (Москва, 2005-2007), на ежегодной Всероссийской научной конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2006), на заседании Ученого Совета Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН (Москва,

2008), на межлабораторном семинаре Учреждения Российской Академии Наук Института биологии развития РАН им. Н.К. Кольцова (Москва, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 3 статьи, 2 из которых - в изданиях рекомендованных ВАК, и 7 тезисов в материалах российских и международных конференций.

Структура н объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты и их обсуждения», «Выводы», «Список литературы».

Работа проиллюстрирована 30 рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 149 источников.

Материалы и методы исследования

Культивирование клеток млекопитающих.

В работе были использованы следующие линии клеток: ЭС клетки мыши линии R1, первичные эмбриональные фибробласты мыши, псевдонормальная линия эмбриона крысы Rat-2, клетки феохромацитомы крысы PC-12, лейкемические клетки человека Jurkat.

Все клетки культивировали при при 37°С и 5% СОг Смену среды осуществляли каждые 3 дня.

Культивирование ЭС клеток проводили в среде альфа-MEM ("Sigma", США), содержащей 15% фетальной сыворотки коровы (ФСК) ("Gibco", США), 0,1 тМ 2-меркаптоэтанол, 2 тМ L-глутамин, заменимые аминокислоты ("Gibco", США), нуклеозиды, витамины и антибиотик гентамицин (20 мкг/мл).

В качестве питающего (фидерного) слоя для ЭС клеток использовали первичные фибробласты, полученные из эмбрионов мышей, пролиферация которых была блокирована митомицином С (5 мкг/мл). Ростовой средой для первичной культуры фибробластов служила среда ДМЕМ ("Sigma", США), содержащая 10% ФСК, 2 шМ L-глутамин и антибиотик гентамицин (20 мкг/мл).

Культивирование клеток псевдонормальной линии эмбриона крысы Rat-2 проводили в среде ДМЕМ (MP Biomedicals, Inc. Франция) содержащей 10% ФСК (HyClone, США), 2 мМ L-глутамин. Смену среды производили каждые 3 дня. Клетки РС-12 культивировали на среде RPMI 1640 с добавлением: 15% ФСК и 80 мкг/мл гентамицина и 2 тМ L-глутамина.

Клетки Jurkat культивировали на среде RPMI 1640 с добавлением 10% ФСК и 80 мкг/мл гентамицина и 2 тМ L-глутамина. Плазмиды, использованные в работе.

1. pcDNA3 («Promega», США) - контрольная плазмида

2. рРВ - на основе плазмиды pcDNA3, содержит вставку кДНК гена человека hpub

3. plneo («Invitrogen», США) - контрольная плазмида

4. pRNAi - на основе плазмиды plneo. Данная плазмида позволяет обеспечить транскрипцию в клетках миРНК, гомологичной определенному участку гена

pub

5. pBR322 - контрольная плазмида

6. pEJ6.6 - на основе плазмиды pBR322, содержит активированный клеточный онкоген c-Ha-rasl.

7. pEGFP-Cl («Clontech», США), плазмида, содержащая ген зеленого флуоресцирующего белка

8. k-pub-myc - контрольная плазмида

9. pub-myc - на основе плазмиды k-pub-myc, содержит вставку кДНК гена мыши pub

Плазмидную ДНК выделяли из трансформированных клеток E.coliXLl на колонках с помощью набора реактивов фирмы «Qiagen», США.

Трансфекция клеток млекопитающих.

Трансфекцию клеток осуществляли методом электроиорации или с помощью липофектамина. Для каждой клеточной линии были экспериментально подобраны оптимальные условия трансфекции. Из клеток, трансфицированных плазмидами, содержащими ген устойчивости к неомицину, после селекции на содержащей антибиотик среде были получены стабильные поликлональные линии. Для оценки частоты трансфекции использовали плазмиду pEGFP-Cl, содержащую ген белка, флуоресцирующего зеленым светом.

Изучение пролиферации клеток.

Для оценки пролиферативной активности трансфицированных линий клетки рассевали по 15x104 на чашки диаметром 35 мм, покрытые желатином (0,01%) с добавлением leukemia inhibitory factor (LIF) (фактор, ингибирующий лейкемию) (10 нг/мл). Количество клеток оценивали на 3-й сут после посева прямым подсчетом под микроскопом Olympus СКХ41 ("Olympus", Япония) в камере Горяева. Для каждой линии просчитывали не менее 6 чашек. Вестерн-Блоттинг.

Клетки осаждали центрифугированием и осадок лизировали в RIPA-буфере, содержащем соответствующие детергенты и ингибиторы протеаз. Электрофоретическое разделение проводили в 10-12% ПААГ. После разделения, белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond ECL («Amersham») или мембрану PVDF («Amersham Parmacia Biotech»). Для детекции белка hPub человека использовали первичные кроличьи антитела к TRIM 14 («Aviva Systems biology», США) и вторичные антитела против IgG кролика, коньюгированные с пероксидазой хрена («ИМТЕК», Россия). Для детекции белка Pub мыши использовали мышиные моноклональные антитела anti-myc («Invitrogen», США) и вторичные антитела против IgG мыши, коньюгированные с пероксидазой хрена («ИМТЕК», Россия). Визуализацицию комплексов проводили с использованием набора ECL («Amersham»).

Анализ дифференцировки ЭС клеток в кардиомиоциты.

ЭС клетки рассевали на 96-ти луночные U-образные плашки («Costar», Нидерланды) по 103 клеток на лунку, в 100 мкл стандартной среды для ЭС клеток без LIF для образования эмбриоидных тел. Подсчет ЭТ с сокращающимися кластерами проводили с 7 по 12 сут культивирования. Иммуноцитохимический анализ.

На 21-е сут культивирования клетки, полученные из эмбриоидных тел фиксировали 4% парафармальдегидом. После трехкратной отмывки lx PBS, обрабатывали раствором PBS, содержащим 0,1% Triton Х100 и 5% ФСК (PBS-Tr-FBS), в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляли первичные антитела к ß-III тубулину («Promega», США) и инкубировали при + 4° С в течение ночи. После трехкратной отмывки раствором PBS-Tr-FBS вносили биотинилированные вторичные антитела к Ig мыши и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Затем после трехкратной отмывки PBS-Tr-FBS вносили пероксидазу, коньюгированную со стрептавидином («ИМТЕК», Россия). Инкубировали 1 ч при комнатной температуре и после трехкратной отмывки раствором PBS-Tr-FBS вносили 0,2% раствор субстрата З-амино-9-этилкарбозола («Sigma», США) в ДМСО. Визуальный контроль за развитием окраски осуществляли под микроскопом Olympus СКХ41 («Olympus», Япония). Для остановки реакции клетки 3-4 раза промывали дистиллированной водой. Индукция дифференцировки стабильно трансфицированных клеток РС-12 под действием ФРН (фактор роста нервов).

Полученные линии клеток рассевали на 24-луночные плашки, предварительно обработанные полилизином (poly-D-Lysine hydrobromide) по 12,5x103 на лунку. Клетки культивировали в бессывороточной среде RPMI с добавлением 80 мкг/мл гентамицина и 2 тМ L-глутамина с одновременным добавлением ФРН в концентрации 100 нг/мл. Подсчет дифференцированных клеток проводили на 9 и 15 сут культивирования под микроскопом (Olympus СКХ41., Japan).

Результаты и их обсуждения

Экспрессия эндогенного гена pub в недифференцированных ЭС клетках мыши линии R1 и эмбриоидных телах.

Экспрессия эндогенного гена pub обнаружена как в недифференцированных ЭС клетках мыши линии R1, так и в эмбриоидных телах, сформированных в ходе спонтанной дифферснцировки. При этом уровень его экспрессии в эмбриоидных телах увеличивается. Это может свидетельствовать о том, что продукт гена pub задействован уже на самых ранних этапах дифференцировки ЭС клеток. Получение и анализ трансфицированных ЭС клеток.

Конструкции, несущие гены человека hpub, мыши pub и вектор, обеспечивающий подавление экспрессии эндогенного гена pub в результате РНК-интерференции, были использованы для получения стабильно - и транзиентно-трансфицированных поликлональных культур ЭС клеток мыши. Стабильно-трансфицированные поликлональные линии:

1. ЭС-hPub (линия с повышенной экспрессией гена человека hpub),

2. 3C-DNA3 (контрольная линия),

3. ЭС-RNAi (линия с пониженной экспрессией эндогенного гена pub)

4. ЭС-Ineo (контрольная линия).

Транзиентно-трансфицированные поликлональные линии:

1. ЭС-pub-myc (линия с повышенной экспрессией гена мыши pub)

2. ЭС-шус (контрольная линия)

Наличие трансгенов hpub и pub было обнаружено методом ОТ-ПЦР и с помощью Вестерн-блоттинга. Также методом ОТ-ПЦР было показано подавление экспрессии эндогенного гена pub в линии ЭС-RNAi.

В связи с тем, что в работе проводилось изучение влияния повышенной экспресии гена человека hpub и пониженной экспрессии гена мыши pub на дифференцировку ЭС клеток мыши, перед нами встал вопрос в какой степени допустимо сравнивать влияния этих генов? Поэтому мы провели сравнительный

анализ трансфицированных культур по их пролиферативной активности и способности образовывать ЭТ и соответствующих контрольных линий.

При сравнении пролиферативной активности опытных и контрольных клеток всех шести линий достоверных различий между ними обнаружено не было (рис. 1а,б,в).

2000 18СО 1600 1400 | 1203 * 1000 J 800

ОНО 400 200 о

Рис. 1. Влияние на пролиферативную активность ЭС клеток повышенной экспрессии генов hpub и pub, а также пониженной экспрессии гена pub.

а. 1,3. 3C-DNA3 (контроль). 2,4. ЭС-hPub.

б. 1,3. ЭС-myc (контроль). 2,4. ЭС-pub-myc

в. 1,3. ЭС-Ineo (контроль). 2,4. ЭС-RNAi.

По оси ординат - число клеток, по оси абсцисс - время культивирования (сутки).**р <0.01.

Эти результаты позволяют предположить, что продукт гена pub и hpub не играет существенной роли в регуляции клеточного цикла ЭС клеток.

В дальнейшем было проведено сравнение этих линий по времени и количеству образующихся ЭТ. Было показано, что в линии клеток ЭС-hPub, несущих экспрессирующийся ген hpub человека, а также в линии клеток ЭС-

pub-myc с повышенной экспрессией гена pub мыши ЭТ образуются примерно на сутки раньше и их количество в два раза больше чем в контрольных вариантах. Тогда как в клетках с пониженной экспрессией гена pub (ЭС-RNAi), ЭТ появляются на сутки позже, при этом количество образованных ЭТ было в

два раза меньше, чем в контрольном варианте. ** > *

* ВН1

а б в

Рис. 2. ЭТ, сформированные трансфицированными ЭС клетками на 3-ии сут культивирования (Х200).

а - контрольные линии клеток (3T-DNA3 и ЭТ-Ineo), б - ЭТ-hPub, в - ЭТ-RNAi.

Таким образом, мы показали, что повышенная экспрессия генов hpub и pub приводит к увеличению количества ЭТ, а подавление экспрессии гена pub негативно сказывается на формировании ЭТ. На основании этих экспериментов можно также сделать вывод, что экспресиия генов hpub и pub оказывает одинаковое воздействие на рост и начальные этапы дифференцировки ЭС клеток.

Онкогенный потенциал гена hpub человека.

Для определения онкогенного потенциала гена hpub проводили трансфекцию первичных фибробластов крысы (линия Rat-2) плазмидой, несущей трансген (hpub). Действие гена hpub оценивали по способности трансфицированных клеток образовывать многослойные колонии на фоне монослоя, так называемые фокусы морфологической трансформации. В качестве положительного контроля образования фокусов морфологической трансформации использовали плазмиду, содержащую кДНК активированного клеточного онкогена c-Ha-rasl. На 23 сут культивирования, клетки окрашивали метиленовым синим и

проводили подсчет образованных фокусов морфологической трансформации под микроскопом. Было показано, что клетки, несущие трансген, не образовывали фокусы морфологической трансформации, что говорит в пользу отсутствия онкогенного потенциала у данного гена (табл. 1). Тогда как, при трансфекции плазмидой рЕ.16.6, несущей активированный онкоген с-На-газ1 было выявлено образование фокусов морфологической трансформации (рис. 3).

Табл. 1. Влияние трансгенов криЬ и с-На-га$1 на образование фокусов морфологической трансформации в псевдонормальной линии клеткок Яа1-2.

Плазмиды для трансфекции Количество фокусов трансформации на 106 клеток

рЕЛб.б (несет вставку онкогена

с-На-гав!) - (положительный контроль) 47+1 *

р8У2пео - (контроль) 0*

рРВ - (несет вставку гена ЪриЪ) 0*

pcDNAЗ - (контроль) 0*

*Данные таблицы - результат трех независимых экспериментов. *- р<0.05

Рис. 3. Фокус морфологической трансформации на 23 сут после трансфекции (Х200). Стрелкой указана многослойная колония на фоне монослоя трансфицированных клеток.

Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на дифференцировку ЭС клеток мыши.

Использование в качестве модели для исследования ЭС клеток мыши позволило нам изучить влияние генов pub и hpub на разные пути дифференцировки клеток, а именно в эктодермальном, энтодермальном и мезодермальном направлениях.

Дифференцировка в эктодермальном направлении дает начало клеткам нервной системы и эпителию, энтодермальном - клеткам печени, поджелудочной железы, щитовидной железы и легких, и мезодермальном -клеткам крови, скелетной и сердечной мускулатуры. В трансфицированных ЭС клетках четырех линий (ЭС-hPub, 3C-DNA3, ЭС-1пео, ЭС-RNAi) при удалении фидерного слоя клеток наблюдалась «спонтанная» дифференцировка. Наличие экспрессии специфических генов-маркеров, характеризующих разные типы клеток, определяли с помощью метода ОТ-ПЦР. Анализ проводили на 10-е сут для выявления маркеров энтодермальной и мезодермальной дифференцировки, а на 21-е сут культивирования - для маркеров эктодермальной дифференцировки.

Для выявления процесса дифференцировки в энтодермальном направлении был проведен анализ экспрессии соответствующих генов-маркеров: vimentin, somatostatin, GATA-4, GATA-6. Был обнаружен одинаковый уровень экспресии генов-маркеров как в клетках с повышенной экспрессией гена hpub, так и в клетках с пониженной экспрессией гена pub, а также в соответствующих контрольных линиях. Исходя из этих данных, можно предположить, что усиление экспрессии гена hpub не влияет на дифференцировку клеток в энтодермальном направлении.

При исследовании дифференцировки в мезодермальном направлении была проведена оценка экспрессии генов tri sk (скелетный тропонин) и tri card (сердечный тропонин), а также генов, ответственных за дифференцировку ЭС клеток в лимфоидном направлении - c-kit и IL-7. Было показано, что уровень экспрессии этих генов в трансфицированных клетках с гиперэкспрессией гена

hpub, выше, чем в контрольной линии. При подавлением экспрессии эндогенного гена pub обнаружен более низкий уровень экспрессии генов tri sk tri card и генов c-kit и IL-7, по сравнению с контрольной линией (рис. 4).

765 пн "

1 2 3 4 5 6

а

355пи ^^т _ щтт

1 2 3 4 5 6 б

1 2 3 4 5 6 В

Рис. 4. Экспрессия генов, вовлеченных в лимфоидную дифференцировку, в стабильно трансфицированных ЭС клетках (10 сут дифференцировки): а) экспрессия гена c-kit, б) экспрессия гена IL-7, в) экспрессия гена «домашнего хозяйства» tub

1 - ЭС-клетки линии ЭС-hPub, 2 - ЭС-клетки линии 3C-DNA3, 3 - ЭС клетки линии ЭС-р1пео, 4 - ЭС клетки линии ЭС-RNAi, 5 - тимус мыши (положительный контроль), 6 - отрицательный контроль.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что повышенная экспрессия гена hpub способствует дифференцировке ЭС клеток по лимфоидному пути.

Также нами было показано, что повышение уровня экспрессии гена hpub существенно ускоряет процесс дифференцировки ЭС клеток в кардиомиоциты, а подавление эндогенного гена pub напротив замедляет их дифференцировку (табл. 2).

Табл. 2. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на количество образующихся кардиомиоцитов.

Культуры клеток Количество кластеров сокращающихся кардиомиоцитов на 100 ЭТ

3C-DNA3 8+2

ЭС-hPub 16±1

ЭС -Ineo 4+1

ЭС-RNAi 1±1

В таблице представлены данные 3-х независимых экспериментов. *р<0.05

Было проведено иммуноцитохимическое окрашивание кластеров кардиомиоцитов антителами к сердечному тропонину (рис. 5).

Рис. 5. Иммуноцитохимическое окрашивание кластеров кардиомиоцитов линии ЭС-hPub, (Х200).

Для изучения влияния генов hpub и pub на дифференцировку в эктодермальном направлении были проведена оценка экспресии генов-маркеров дифференцировки нейральных клеток, а именно гены nestin, fi-IIl tubulin, gfap. Мы показали, что в клетках с повышенной экспрессией гена hpub наблюдается снижение экспрессии данных маркерных генов, а в клетках с подавлением экспрессией pub, напротив, ее увеличение по сравнению с

контролями. Методом иммуноцитохимии с использованием антител против /?-III тубулина мы также показали негативное влияние повышенной экспрессии гена ИриЪ на дифференцировку ЭС клеток в нейрональном направлении, тогда как подавление экспрессии эндогенного гена, напротив, стимулировало образование нейронов (рис. 6,7).

о

ЭС-1пео

ЭС-RNAi

3C-DNA3

ЭС-hpub

а б

Рис. 6. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на процессы нейрональной дифференцировки ЭС клеток in vitro. *р<0.05. Подсчёт нейронов проводили на 21-е сут культивирования после посева ЭТ.

а б

Рис. 7. Иммуноцитохимическое окрашивание ЭС клеток антителами к Р-Ш тубулину на 21 -е сут после посева ЭТ, стрелками указаны нейроны, (Х200) а — клетки ЭС-11КА1, б — клетки ЭС-ЬРиЬ.

Влияние гена ИриЬ человека на нейрональную дифференцировку было также исследовано на линии клеток феохромацитомы крысы РС-12. Эта линия является удобной и широко используемой моделью для изучения процессов

нейрональной диффсрснцировки и клеточной гибели, поскольку под действием фактора роста нервов (ФРН), добавляемого в культуральную среду, клетки приобретают нейрональноподобный фенотип. В результате трансфекции и последующей селекции, были получены две стабильно-трансфицированные поликлональные линии клеток:

1. линия клеток РС 12-ИриЬ (несущая трансген ИриЬ)

2. линия клеток РС12-ОЫАЗ (контроль)

Было показано, что в условиях трофического голодания (при содержании 1% ЭБС в культуральной среде) при добавлении на 1, 3 и 5-е сут в культуральную среду 100 нг ФРН клетки РС-12, несущие трансген ИриЪ и контрольная линия дифференцировались в нейрональноподобные клетки уже на вторые сутки культивирования, а к 7-8 сут в обеих линиях наблюдались нейрональноподобные клетки с хорошо развитыми отростками. При этом количество дифференцированных клеток в контрольной и опытной линии было одинаковым (рис. 8).

а б

Рис. 8. Влияние повышенной экспрессии гена ИриЬ на нейрональную дифференцировку трансфицированных клеток РС-12 при добавлении ФРН в условиях трофического голодания (1 % ЭБС), (Х200), 8 сут культивирования, а) дифференцированные клетки линии РС12-ЬриЬ, б) дифференцированные клетки линии РС12-БЫАЗ.

Однако, при добавление в культуральную среду ФРН в условиях бессывороточной среды, дало другой результат. Количество дифференцированных клеток в линии РС12-ИриЬ было существенно ниже, чем

в контрольной линии PC12-DNAЗ. Эти различия появились на 5 сутки культивирования и сохранялись на протяжении всего эксперимента (рис. 9).

15 сутки после посева

pc12DN43 pcl2hpub

Я не дифференциров энные клетки ■ дифференциров энные клетки

Рис. 9. Влияние повышенной экспрессии гена hpub на нейрональную дифференцировку трансфицированных клеток PC 12 при добавлении ФРН в условиях бессывороточной среды. Результат трех независимых экспериментов.

Результаты эксперимента на клеточной линии феохромацитомы крысы РС-12 может служить подтверждением полученных нами ранее данных о негативном влиянии гена человека hpub на нейрональную дифференцировку ЭС клеток мыши (см. рис. 6,7). Однако нужно иметь в виду, что этот эффект проявляется только в условиях бессывороточной среды, тогда как при пониженном содержании сыворотки (1%) мы не обнаружили различий в характере дифференцировки клеток, несущих трансген hpub и контрольной линии клеток.

Выводы

1. Экспрессия эндогенного гена pub увеличивается на начальных этапах дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши.

2. Изменения в экспрессии генов hpub человека и pub мыши не оказывают влияния на пролиферативную активность эмбриональных стволовых клеток мыши.

3. Повышенная экспрессия гена hpub человека стимулирует, а пониженная экспрессия гена pub мыши ингибирует образование эмбриоидных тел in vitro.

4. На клеточной линии Rat-2 показано, что ген hpub человека не обладает выраженным онкогенным потенциалом, повышение его экспрессии не приводит к формированию фокусов морфологической трансформации.

5. Не обнаружено влияния генов hpub и pub на уровень экспрессии генов-маркеров энтодермальной дифференцировки (vimentin, somatostatin, GATA-4, GATA-6) в эмбриональных стволовых клеток мыши.

6. Повышенная экспрессия гена hpub человека усиливает потенциал эмбриональных стволовых клеток мыши к дифференцировке в мезодермальном направлении: обнаружено увеличение количества сокращающихся кардиомиоцитов, усиление экспрессии генов скелетного и сердечного тропонина (tr sk, tr card), а также лимфоидспецифичных генов c-kit, 1L-7. Пониженная экспрессия гена pub мыши приводит к уменьшению количества сокращающихся кардиомиоцитов и снижению экспрессии этих генов по сравнению с контролем.

7. Повышенная экспрессия гена hpub человека оказывает ингибирующее действие на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши в эктодермальном направлении, приводя к уменьшению количества образующихся нейронов и к снижению экспрессии генов /?-/// tubulin, nestin, тогда как пониженная экспрессия гена pub мыши, напротив, способствует усилению экспрессии этих генов и стимулирует образование нейронов in vitro. Негативное влияние повышенной экспрессии гена hpub на нейрональную дифференцировку подтверждено также в экспериментах на клеточной линии феохромацитомы крысы PC-12.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи:

1. Новосадова Е.В., Мануйлова Е.С., Арсеньева E.J1., Хайдарова Н.В., Долотов О.В., Иноземцева Л.С., Козаченков К.Ю, Тарантул В.З., Гривенников И.А. Разнонаправленное влияние повышенной и пониженной экспрессии гена pub на

21

образование эмбриоидных тел в культуре эмбриональных стволовых клеток мыши // Клеточные технологии в биологии и медицине. №3. 2005. С. 174-179.

2. Новосадова Е.В., Мануйлова Е.С., Арсеньева Е.Л., Хайдарова Н.В., Долотов

0.В., Иноземцева Л.С., Ситникова О.В., Тарантул В.З., Гривенников И.А Эктопическая экспрессия гена pub (hpub) человека в эмбриональных стволовых клетках мыши оказывает разнонаправленное влияние на характер их дифференцировки in vitro // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. Т.1. №2. 2005. С. 14-21.

3. Новосадова Е.В., Мануйлова Е.С., Арсеньева Е.Л., Хайдарова Н.В., Лебедев А.Н., Тарантул В.З., Гривенников И.А. Повышенная экспрессия гена hpub стимулирует лимфоидную дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши, но не образование фокусов злокачественной трансформации in vitro // Медицинская генетика. №8. 2008. С.43-46.

Тезисы конференций.

1. Новосадова Е.В.. Мануйлова Е.С., Арсеньева Е.Л., Хайдарова Н.В., Долотов О.В., Иноземцева Л.С., Ситникова О.В., Тарантул В.З., Гривенников И.А. Изучение влияния экспрессии гена pub на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro // 3-й Съезд биотехнологов, Москва. 2005. 2527 октября. Сборник тезисов. С. 14-15.

2. Гривенников И.А. Новосадова Е.В.. Ситникова О.В., Арсеньева Е.Л., Долотов О.В., Иноземцева Л.С., Хайдарова Н.В., Мануйлова Е.С., Тарантул В.З. Генетические модификации эмбриональных стволовых клеток: подход к их направленной дифференцировке // VI международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород. 2005. 12-16 декабря. Сборник тезисов. С.91.

3. Арсеньева Е.Л., Мануйлова Е.С., Новосадова Е.В.. Хайдарова Н.В., Иноземцева Л.С., Гривенников И.А., Тарантул В.З. Направленная дифференцировка генетически модифицированных эмбриональных стволовых

клеток // VI международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород. 2005. 12-16 декабря. Сборник тезисов. С.86.

4. Новосадова Е.В.. Мануйлова Е.С., Арсеньева Е.Л., Хайдарова Н.В., Долотов О.В, Иноземцева J1.C., Ситникова О.В, Тарантул В.З., Гривенников И.А. Сравнительное изучение влияния экспрессии экзогенного гена hpub и эндогенного гена pub мыши на процессы дифференцировки эмбриональных стволовых клеток // VI международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород. 2005. 12-16 декабря. Сборник тезисов. С.100.

5. Новосадова Е.В.. Мануйлова Е.С., Арсеньева E.J1., Хайдарова Н.В., Долотов О.В, Иноземцева Л.С., Ситникова О.В, Тарантул В.З., Гривенников И.А. Изучение влияния повышенной экспрессии человеческого гена hpub на начальные стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro // Ежегодная Всероссийская научная конференция с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении. Москва. 2006. 24-25 мая. Сборник тезисов. С.93.

6. Гривенников И.А., Новосадова Е.В.. Ситникова О.В., Арсеньева E.JL, Долотов О.В., Иноземцева JI.C., Хайдарова Н.В., Мануйлова Е.С., Тарантул В.З. Эмбриональные стволовые клетки, их генетические модификации и проблема направленной дифференцировки // Ежегодная Всероссийская научная конференция с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении». Москва. 2006. 24-25 мая. Сборник тезисов. С.54.

7. Гривенников И.А., Долотов О.В., Новосадова Е.В., Мануйлова Е.С. Нейродегенерация в центральной нервной системе: нейропротекция или нейротрансплантация? // Конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». Санкт-Петербург-Колтуши. 2008. 10-12 сентября. Сборник тезисов. С.32-33.

Заказ № 109/12/08 Подписано в печать 15.12.2008 Тираж 100 экз Уел пл. 1,5

\ ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 mvw.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Новосадова, Екатерина Вячеславовна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Характеристика и свойства эмбриональных стволовых (ЭС) клеток

1.1.1. Получение ЭС клеток

1.1.2. Клеточный цикл

1.1.3. Дифференцировка ЭС клеток в культуре

1.1.4. Направленная дифференцировка ЭС клеток в культуре

1.1.5. Генетические модификации ЭС клеток

1.1.6. Моделирование эмбрионального развития с использованием ЭС клеток

1.2. Семейство TRIM белков

1.2.1. Характеристика семейства TRIM белков

1.2.2. Три основные группы белков TRIM семейства

1.2.3. Ген pub — представитель семейства TRIM белков 54 1.2.4 .Строение и свойства белка Pub 55 1.2.5. Возможные функции белка Pub

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Культивирование клеток млекопитающих

2.1.1. Культивирование ЭС клеток

2.1.2. Приготовление фидерного слоя из первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши

2.1.3. Культивирование клеток Rat

2.1.4. Культивирование лини клеток феохромацитомы крысы PC

2.1.5. Культивирование клеток человека Jurkat

2.2. Плазмиды, использованные в работе

2.2.1. Плазмиды pcDNA3, plneo, pPB, pRNAi, использованные для трансфекции ЭС клеток

2.2.2. Плазмиды pEJ6.6, pBR322 использованные для трансфекции клеток Rat

2.2.3. Плазмиды k-pub-myc, pub-myc, использованные для трансфекции ЭС клеток

2.3. Трансфекции клеток млекопитающих

2.3.1. Трансфекция ЭС клеток методом электропорации и последующая селекция

2.3.2. Трансфекция ЭС клеток с помощью липофектамина

2.3.3. Трансфекция и селекция псевдонормальной крысиной линии клеток Rat

2.3.4. Трансфекция клеток PC

2.4. Анализ пролиферации трансфицированных ЭС клеток

2.5. Индукция дифференцировки ЭС клеток с образованием ЭТ

2.6. Выделение тотальной РНК и проведение обратной транскрипции

2.7. Полимеразная цепная реакция

2.8. Выделение белковых гомогенатов из клеток млекопитающих

2.9. Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.10. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану после электрофоретического разделения

2.11. Иммуноблотинг

2.12. Анализ дифференцировки ЭС клеток в кардиомиоциты

2.13. Иммуноцитохимический анализ

2.14. Индукция дифференцировки стабильнотрансфицированных клеток PC-12 под действием ФРН

2.15. Статистическая обработка результатов экспериментов

Глава 3. Результаты и их обсуждения

3.1. Экспрессия эндогенного гена pub в недифференцированных

ЭС клетках мыши линии R1 и ЭТ

3.2. Получение трансфицированных линий ЭС клеток с повышенной экспрессией гена человека hpub, гена мыши pub, а также с пониженной экспрессией гена мыши pub

3.2.1. Изучение пролиферативной активности трансфицированных линий.

3.3. Оценка онкогенного потенциала гена человека hpub

3.4. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на разные пути дифференцировки

ЭС клеток мыши

3.4.1. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на энтодермальную дифференцировку

3.4.2. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на мезодермальную дифференцировку

3.4.3. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на эктодермальную дифференцировку

3.5. Влияние гена человека hpub на нейрональную дифференцировку линии клеток феохромацитомы крысы PC

3.6. Возможный механизм влияния экспрессии генов pub и hpub на процессы дифференцировки ЭС клеток

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние лимфоидспецифического гена pub на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши"

Ранее в отделе вирусной и клеточной молекулярной генетики Института молекулярной генетики РАН с помощью метода вычитающей гибридизации были получены и охарактеризованы клоны кДНК повышенно транскрибирующиеся в ВИЧ-ассоциированных иммунобластных лимфомах [1]. Анализ этих кДНК позволил выявить среди них, наряду с уже охарактеризованными генами {set, calpain и т.д.) несколько кДНК с неизвестными функциями. Одним из таких лимфоидспецифичных генов, был ген нуклеотидная последовательность (кДНК) которого содержалась в базе данных генома человека под названием KIAA0129. Японскими учеными было проведено исследование мышиного гомолога гена человека KIAA0129, которому они дали название pub. Показано, что белковый продукт этого гена КТАА0129 человека {hpub) имеет высокую степень гомологии (82%) с мышиным белком Pub [2].

Pub (hPub) относится к семейству TRIM (tripartite motif) белков [2], для которых характерно наличие так называемого TRIM (или RBBC) мотива, состоящего из трёх цинк-связывающих доменов: RING (R), B-box 1 (В1) и B-box 2 (В2), сопровождаемых coiled-coil (СС) регионом [3]. На данный момент известно 37 представителей данного семейства белков [3]. Некоторые из них вовлечены в такие биологические процессы, как регуляция транскрипции, организация цитоскелета, контроль клеточной пролиферации и дифференцировки [4].

Функции гена hpub не изучены. Однако известно, что его мышиный гомолог pub играет важную роль в процессах клеточной дифференцировки и оказывает существенное влияние на транскрипционную активность фактора PU.1 [2]. PU.1 относится к ETS семейству транскрипционных факторов, играет центральную роль в дифференцировке и пролиферации макрофагов и В-клеток в ходе гемапоэза, контролирует функциональную активность нейтрофилов [5]. Показано, что продукт гена pub ингибирует транскрипционную активность PU. 1 в гемоцитах и вследствие этого играет важную роль в дифференцировке и пролиферации миелоидных и лимфоидных клеток [2]. Влияние генов hpub и pub на более ранние стадии развития организма до настоящего времени исследовано не было.

В данной работе для изучения влияния генов hpub и pub на начальные этапы эмбрионального развития использовали модель эмбриональных стволовых клеток.

Эмбриональные стволовые клетки (ЭС клетки) представляют собой уникальную модель для изучения процессов, лежащих в основе онтогенеза. Как и в ходе развития зародыша in vivo, ЭС клетки в культуре способны давать начало всем трём зародышевым слоям: энтодерме, мезодерме и эктодерме, а, соответственно, и всем развивающимся из них типам клеток. Исследования дифференцировки ЭС клеток в том или ином направлении в ответ на воздействие специфических индукторов (факторов роста, цитокинов) или на непосредственную генетическую модификацию позволяют приблизиться к пониманию функции исследуемых веществ и генов в данном процессе.

Есть данные о том, что гены некоторых членов TRIM семейства белков в случае рекомбинации с некоторыми другими генами приобретают свойства онкогена [4]. Основываясь на том, что повышенная экспрессия гена hpub наблюдалась в ВИЧ-ассоциированных иммунобластных лимфомах, необходимо было проверить, является ли увеличение экспрессии этого гена одной из причин злокачественного перерождения клеток и возникновения опухолей?

Нами проведены эксперименты с целью изучения влияния повышенной и пониженной экспрессии гена hpub (pub) на пролиферацию и дифференцировку ЭС клеток мыши in vitro по трём зародышевым слоям: энтодерме, мезодерме и эктодерме. На культуре ЭС клеток мы показали, что ген hpub человека действует аналогично гену pub мыши, что в дальнейшем позволило сравнивать нам действие повышенной экспрессии гена человека hpub и пониженной экспрессии гена pub мыши. Произведена оценка онкогенного потенциала лимфоидспецифичного гена hpub первичных фибробластов эмбрионов крысы.

Цель исследования

Целью работы было изучение влияния лимфомоспецифического гена pub на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro и оценка онкогенного потенциала данного гена.

Задачи исследования:

1. Изучить профиль экспрессии эндогенного гена pub на начальных этапах дифференцировки эмбриональных стволовых (ЭС) клеток мыши (при образовании эмбриоидных тел);

2. Получить стабильно трансфицированные поликлональные линии ЭС клеток мыши с повышенной экспрессией гена pub человека (hpub) и подавленной экспрессией эндогенного гена pub мыши;

3. Изучить влияния подавления экспрессии гена pub и' повышенной экспрессии гена hpub на пролиферацию и дифференцировку ЭС клеток мыши в разных направлениях (эктодермальном, энтодермальном, мезодермальном);

4. Оценить онкогенный потенциал гена hpub человека на культуре псевдонормальных клеток крысы линии Rat-2.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Новосадова, Екатерина Вячеславовна

выводы

1. Экспрессия эндогенного гена pub увеличивается на начальных этапах дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши.

2. Изменения в экспрессии генов hpub человека и pub мыши не оказывают влияния на пролиферативную активность эмбриональных стволовых клеток мыши.

3. Повышенная экспрессия гена hpub человека стимулирует, а пониженная экспрессия гена pub мыши ингибирует образование эмбриоидных тел in vitro.

4. На клеточной линии Rat-2 показано, что ген hpub человека не обладает выраженным онкогенным потенциалом, повышение его экспрессии не приводит к формированию фокусов морфологической трансформации.

5. Не обнаружено влияния генов hpub и pub на уровень экспрессии генов-маркеров энтодермальной дифференцировки (yimentin, somatostatin, GATA-4, GATA-6) в эмбриональных стволовых клеток мыши.

6. Повышенная экспрессия гена hpub человека усиливает потенциал эмбриональных стволовых клеток мыши к дифференцировке в мезодермальном направлении: обнаружено увеличение количества сокращающихся кардиомиоцитов, усиление экспрессии генов скелетного и сердечного тропонина (tr sk, tr card), а также лимфоидспецифичных генов c-kit, IL-7. Пониженная экспрессия гена pub мыши приводит к уменьшению количества сокращающихся кардиомиоцитов и снижению экспрессии этих генов по сравнению с контролем.

7. Повышенная экспрессия гена hpub человека оказывает ингибирующее действие на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши в эктодермальном направлении, приводя к уменьшению количества образующихся нейронов и к снижению экспрессии генов /?-/// tubulin, nestin, тогда как пониженная экспрессия гена pub мыши, напротив, способствует усилению экспрессии этих генов и стимулирует образование нейронов in vitro. Негативное влияние повышенной экспрессии гена hpub на нейрональную дифференцировку подтверждено также в экспериментах на клеточной линии феохромацитомы крысы РС-12.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новосадова, Екатерина Вячеславовна, Москва

1. Ненашева В.В, Максимов В.В, Николавев А.И, Тарантул В.З. Сравнительный анализ уровней транскрипции генов в двух типах ВИЧ-ассоциированных лимфом. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2001. №4. С. 27-31.

2. Hirose S., Nishuzumi Н., Sakano Н. Pub, a novel PU.1 binding protein, regulates the transcriptional activity of PU.1. // Biochem. Biophs. Com. 2003. V. 311. P. 351-360.

3. Torok M., Etkin L. Two В or not two B? Overview of the rapidly expanding B-box family of proteins. // Differentiation. 2000. V. 67. P. 63-71.

4. Lloberas J., Solier C., Celada A. The key rol of PU.l/SP-1 cells, myeloid cells and macrophages. // Immunol. Today. 1999. V. 20. P. 184-189.

5. Doetschman Т., Eistetter H., Katz M., Schmidt W. and Kemler R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. II J. Embryol. Exp. Morphol. 1985. V. 87. P. 27-^5.

6. Evans M. and Kaufman M. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. //Nature. 1981. V. 292 P. 154-156.

7. Wobus A., Holzhausen H., Jakel P. and Schoneich J. Characterization of a pluripotent stem cell line derived from a mouse embryo. II Exp. Cell Res. 1984. V. 152. P. 212-219.

8. Geijsen N., Horoschak M., Kim K., Gribnau J., Eggan K. and Daley Q. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells. //Nature. 2004. V. 427. P. 148-154.

9. Hiibner К., Fuhrmann G., Christenson K., Kehler J., Reinbold R., De La F., Wood J., Strauss F., Boiani M. and Scholer R. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. // Science. 2003. V. 300. P. 1251-1256.

10. Toyooka Y., Tsunekawa N., Akasu R. and Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 11457-11462.

11. Blyszczuk P., Asbrand C., Rozzo A., Kania G., St-Onge L., Rupnik M. and Wobus A. Embryonic stem cells differentiate into insulin-producing cells without selection of nestin-expressing cells. // Int. J. Dev. Biol. 2004. V. 48. P. 1095-1104.

12. Dang S. and Zandstra P. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. // Methods Mol. Biol. 2004 V. 290. P. 353-364.

13. Doss M., Koehler C., Hescheler J., Sachinidis A. Embryonic stem cells: a promising tool for cell replacement therapy. // J. Cell. Mol. Med. 2004. V. 8. P. 465-473.

14. Soria В., Skoudy A., Martin F. From stem cells to betta cells: new strategies in cell therapy of diabetes mellitus. // Diabetologia. 2001. V. 44. P. 407-415.

15. Keller G. Embryonic stem cells differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. // Genes & Dev. 2005. V. 19. P. 1129-1155.

16. Evans M., Kaufman M. Establishment in culture of pluripotential cells from mous embryos. // Nature. 1981. V. 292. P. 154-158.

17. Martin G., Evans M. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 1441-1445.

18. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. // Cell. 1992. V. 70. P. 841-847.

19. Гривенников И.А., Мануйлова E.C. Эмбриональные стволовые клетки в изучении функции генов в процессах дифференцировки и развития. В книге: Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Под ред. Академика Свердлова Е.Д. М.: Наука. 2003. Т. 1. С. 290.

20. Миталипов Ш.М., Миталипова М.М., Иванов В.И. Влияние длительности культивирования на плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro и in vivo. // Онтогенез. 1994. Т. 25. №6. С. 19-27.

21. Gearing D., Goygh N., King J. Molecular cloning and expression of cDNA encoding a murine myeloid leukemia inhibitory factor (LIF). // EMBO J.1987. V. 6. P. 3995-4002.

22. Kishimoto Т., Taga Т., Akira S. Cytokine signaltransduction. // Cell. 1994. V. 76. P. 253-262.

23. Taupin J., Pitard V., Dechanel J. Leukemia inhibitory factor: part of a large ingathering family. // Int. Rev. Immunol. 1998. V. 16. P. 397-426.

24. Williams R., Hilton D., Pease S. Mieloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potentional of embryonic stem cells. // Nature.1988. V. 336. P. 684-687.

25. Smith A., Heath J., Donaldson D., Wong G., Moreau J., Stahl M., Rogers D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. //Nature. 1988. V. 336. P. 688-690.

26. Tomida M., Yamamoto-Yamaguchi Y., Hozumi M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic Ml cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. // J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P.10978-10982.

27. Baumann H., Wong G. Hepatocyte-stimulating factor III shares structural and functional identity with leukemia-inhibitory factor. // J. Immunol. 1989. V. 143. P. 1163-1167.

28. Hilton D. LIF: lots of interesting functions. // Trends Biochem. Sci. 1992. V. 17. P. 72-76.

29. Murphy M., Dutton R., Koblar S., Cheema S., Bartlett P. Cytokines which signal through the LIF receptor and their actions in the nervous system. // Prog. Neurobiol. 1997. V. 52. P. 355-378.

30. Mori M., Yamaguchi K., Abe K. Purification of a lipoprotein lipase-inhibiting protein produced by a melanoma cell line associated with cancer cachexia. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 160. P. 1085-1092.

31. Resnik J., Bixler L., Cheng L., Donovan P. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture. //Nature. 1992. V. 359. P. 550-551.

32. Chodorowska G., Glowacka A., Tomczyk M. Leukemia inhibitory factor (LIF) and its biological activity. // Ann. Univ. Mariae Curie Scolodowska. 2004. V. 59. P. 189-193.

33. Ying Q., Stavridis M., Griffiths D., Li M., Smith A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. //Nat. Biot. 2003. V. 21. P. 183-186.

34. Pesce M., Anastassiadis K. and Scholer H. Oct-4: lessons of totipotency from embryonic stem cells. // Cells Tissues Organs. 1999. V. 165. P. 144—152.

35. Thomson J., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S., Waknitz M., Swiergiel J., Marshall V. and Jones J. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. // Science. 1998. V. 282. P. 1145-1147.

36. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S. and Smith A. Functional expression cloning of nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. // Cell. 2003. V. 113. P. 643-655.о

37. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segawa K., Murakami M., Takahashi K., Maruyama M., Maeda M. and Yamanaka S. The homeoprotein nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. // Cell. 2003. V. 113. P. 631-642.

38. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. // Cell. 1992. V. 70. P. 841-847.

39. Niwa H., Myyazaki J., Smith A. Quantitative expression of OCT-3/4 definies differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. // Nat. Genet. 2000. V. 24. P. 328-330.

40. Nishikawa S., Hirashima M., Matsuyoshi N., and Kodama H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK+VE-cadherin cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. // Development. 1998. V. 125. P. 1747-1757.

41. Yoshida H., Hayashi S., Kunisada Т., Ogawa M., Nishikawa S., Okamura H., Sudo Т., and Shultz L. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. // Nature. 1990. V. 345. P. 442-444.

42. Nakano Т., Kodama H. and Honjo Т. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. // Science. 1994. Y. 265. P. 10981101.

43. Guan K., Rohwedel J., Wobus A. Embryonic stem cell differentiation models: cardiogenesis, myogenesis, neurogenesis, epithelial and vascular smooth muscle cell differentiation in vitro. // Cytotech. 1999. V. 30. P. 211-226.

44. Dieterlen-Lievre F. On the origin of haemopoietic stem cells in the avian embryo: An experimental approach. // J. Embryol. Exp. Morphol. 1975. V. 33. P. 607-619.

45. Godin I., Dieterlen-Lievre F. and Cumano A. Emergence of multipotent hemopoietic cells in the yolk sac and paraaortic splanchnopleura in mouse embryos, beginning at 8.5 days postcoitus. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Y. 92. P. 773-777.

46. Medvinsky A. and Dzierzak E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. // Cell. 1996. V. 86. P. 897-906.

47. Palis J., Roberston S., Kennedy M., Wall C. and Keller G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. // Development. 1999. V. 126. P. 5073-5084.

48. Russel E. Heriditary anemias of the mouse: A review for geneticists. // Adv. Genet. 1979. V. 20. P. 357-459.

49. Keller G., Kennedy M., Papayannopoulou Т., Wiles M. Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture. // Mol. Cell. Biol. 1993. V.13. P. 473-486.

50. Haar J. and Ackerman G. A phase and electron microscopic study of vasculogenesis and erythropoiesis in the yolk sac of the mouse. // Anat. Rec. 1971. V 170. P. 199-224.

51. Murray P. The development of in vitro of the blood of the early chick embryo. //Proc. Roy. Soc. London. 1932. V. 11. P. 497-521.

52. Sabin F. Studies on the origin of blood vessels and of red corpuscles as seen in the living blastoderm of the chick during the second day of incubation. // Contrib. Embryol. 1920. V. 9. P. 213-262.

53. Faloon P., Arentson E., Kazarov A., Deng C., Porcher C., Orkin S. and Choi K. Basic fibroblast growth factor positively regulates hematopoietic development. // Development. 2000. V. 127. P. 1931-1941.

54. Lacaud G., Gore L., Kennedy M., Kouskoff V., Kingsley P., Hogan C., Carlsson L., Speck N., Palis J. and Keller G. Runxl is essential for hematopoietic commitment at the hemangioblast stage of development in vitro. // Blood. 2002. V. 100. P. 458-466.

55. Sachinidis A., Fleischman В., Kolossov E., Wartenberg M., Sauer H., Hescheler J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cell. // Card. Research. 2003. V. 58. P. 278-291.

56. Scerjanc I., Petropoulos H., Ridgeway A., Wilton S. Myocyte enhancer factor 2C and Nkx2-5 up-regulate each other's expression and initiate cardiomyogenesis in P19 cells. // J. of Boil. Chem. 1998. V. 273. P. 3490434910.

57. Behfar A., Zingman L., Hodgson D., Rausier J., Kane G., Terzic A., Puceat M. Stem cell differentiation requires a paracrine pathway in the heart. // FASEB J. 2002. V. 16. P. 1558-1566.

58. Wei H., Juhasz O., Li J., Tarasova Y., Boheler K. Embryonic stem cell and cardiomyocite differentiation: phenotypic and molecular analyses. // J. Cell. Nol. Med. 2005. V. 9. P. 804-817.

59. Le Douarin В., Nielsen A., Gamier J., Ichinose H., Jeanmougin F., Losson R. Apossible involvement of TIF la and TIFip in the epigenetic control of transcription by nuclear receptors. // EMBO. J. 1996. V. 15. P. 6701-6715.

60. Nakanisi M, Hamazaki T, Komazaki S, Okochi H, Asashima M. Pancreatik tissue formation from murine embryonic stem cells in vitro. // Differentiation. 2007. V. 75. P. 1-11.

61. Ventura C., Maioli M. Opioid peptide gen expression primers cardiogenesis in embryonal pluripotent stem cells // Circ. Res. 2002. V. 87. P. 189-194.

62. Dang S and Zandstra P. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. // Methods Mol. Biol. 2004. V. 290. P. 353-364.

63. Kramer J., Hegert C., Guan K., Wobus A., Muller P. and Rohwedel J. Embryonic stem cell-derived chondrogenic differentiation in vitro: activation by BMP-2 and BMP-4. // Mech. Dev. 2000. V. 92. P. 193-205.

64. Buttery L., Bourne S., Xynos J., Wood H., Hughes F., Hughes S., Episkopou V. and Polak J. Differentiation of osteoblasts and in vitro bone formation from murine embryonic stem cells. // Tissue. 2001. V. 7. P. 89-99.

65. Bain G., Kitchens D., Yao M., Huettner J. and Gottlieb D. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. // Dev. Biol. 1995. V. 168. P. 342-357.

66. Fraichard A., Chassande O., Bilbaut G., Dehay C., Savatier P. and Samarut J. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. //J. Cell Sci. 1995. V. 108. P. 3181-3188.

67. Guan К., Chang H., Rolletschek A., Wobus A. Embryonic stem cell-derived neurogenesis. Retinoic acide induction and lineage selection of neuronal cells. // Cell Tissue Res. 2001. V. 305. P. 171-176.

68. Ye W., Shimamura K., Rubenstein J., Hynes M. and Rosenthal A. FGF and Shh signals control dopaminergic and serotonergic cell fate in the anterior neural plate. // Cell. 1998. V. 93. P. 755-766.

69. Simon H., Bhatt L., Gherbassi D., Sgado P. and Alberi L. Midbrain dopaminergic neurons: Determination of their developmental fate by transcription factors. // Ann. NY Acad. Sci. 2003. V. 991. P. 36-47.

70. Bagutti C., Wobus A., Fassler R. and Watt F. Differentiation of embryonal stem cells into keratinocytes: Comparison of wild-type and PI integrin-deficient cells. // Dev. Biol. 1996. V. 179. P. 184-196.

71. Coraux C., Hilmi C., Rouleau M., Spadafora A., Hinnrasky J., Ortonne J., Dani C. and Aberdam D. Reconstituted skin from murine embryonic stem cells. // Curr. Biol. 2003. V. 13. P. 849-853.

72. Rathjen P., Nichols J., Toth S., Edwards D., Heath J., Smith A. Developmentally Programmed induction of differentiation inhibiting activity and the control of stem cell populations. // Genes Dev. 1990. V. 4. P. 23082318.

73. Chinzei R., Tanaka Y., Shimizu-Saito К., Hara Y., Kakinuma S., Watanabe M., Teramoto K., Arii S., Takase K., Sato C., Terada N. and Teraoka

74. H. Embryoid-body cells derived from a mouse embryonic stem cell line show differentiation into functional hepatocytes. // Hepatology. 2002. V. 36. P. 22—29.

75. Choi D., Oh H., Chang U., Koo S., Jiang J., Hwang S., Lee J., Yeoh G., Shin H., Lee J. and Oh B. In vivo differentiation of mouse embryonic stem cells into hepatocytes. // Cell Transplant. 2002. V. 11. P. 359-368.

76. Yamada Т., Yoshikawa M., Kanda S., Kato Y., Nakajima Y., Ishizaka S. and Tsunoda Y. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocyte-like cells identified by cellular uptake of indocyanine green. // Stem Cells. 2002. V. 20. P. 146-154.

77. Yamamoto H., Quinn G., Asari A., Yamanokuchi H., Teratani Т., Terada M. and Ochiya T. Differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes: biological functions and therapeutic application. // Hepatology. 2003. V. 37. P. 983-993.

78. Soria В., Roche E., Berna G., Leon-Quinto Т., Reig J. and Martin F. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. // Diabetes. 2000. V. 49. P. 157-162.

79. Leon-Quinto Т., Jones J., Skoudy A., Burcin M. and Soria B. In vitro directed differentiation of mouse embryonic stem cells into insulin-producing cells. // Diabetologia. 2004. V. 47. P. 1442-1451.

80. Desbaillets I., Ziegler U., Groscurth P. and Gassman M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. // Experemental Physiology. 2000. V. 85. P. 645-651.

81. Xu. C., Liguori G., Adamson E., Persico M. Abrogation of the CRIPTO gene in mouse leads to failure of postgastrulation morphogenesis and lack of differentiation ofcardiomyocites. //Development. 1999. V. 126. P. 483-494.

82. Bahramian M. and Zarbl H. Transcriptional and posttranscriptional silencing of rodent alpha 1(1) collagen by a homologous transcriptionally self-silenced transgene. // Mol. Cell Biol. 1999. V. 19. P. 274-283.

83. Wobus A., Boheler K. Embryonic Stem Cells: propects for developmental biology and cell therapy. // Physiol. Rev. 2005. V. 85. P. 635-678.

84. Lake J., Rathjen J., Remiszewski J., Rathien P. Reversible programming of pluripotent cell differentiation. // J. Cell. Sci. 2000. V. 113. P. 555-566.

85. Rathjen J., Lake J., Bettess M., Washington J., Chapman G., Ratjen P. Formation of primitive ectoderm like cell population, EPL cell, from ES cell in response to biologically derived factors. // J. Cell Sci. 1990. V. 112. P. 601-612.

86. Kubo A., Shinozaki K., Shannon J., Kouskoff V., Kennedy M., Woo S., Fehling H., Keller G. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. //Development. 2003. V. 131. P. 1651-1662.

87. Reddy B, Etkin L, Freemont P. A novel zinc finger coiled-coil domain in a family of nuclear proteins. // Trends. Biochem. Sci. 1992. V. 17. P. 344-345.

88. Borden K. RING fingers and B-boxes: zinc-binding protein-protein interaction domains. //Biochem. Cell. Biol. 1998. V. 76. P. 351-358.

89. Сингер M., Берг П. Гены и геномы. М.: Мир. 1998. Т.2. С. 130-131.

90. Takanashi М., Cooper G. ret transforming gen encodes a fusion protein homologous to tyrosine kinases. // J. Mol. Cell. Biol. 1987. V. 7. P. 1378-1385.

91. Tezel G., Nagasaka Т., Iwahashi N., Asai N., Iwashita Т., Sakata K., Takanashi M. Different nuclear/cytoplasmic distributions of RET finger protein in different cell types. // Pathol. Int. 1999. V. 49. P. 881-886.

92. Shimono Y., Murakami H., Hasegawa Y., Takahashi M. RET finger protein is a transcriptional repressor and interacts with enhanser of polycomb that has dual transcriptional functions. // J. Biol. Chem. 2000. V. 257. P. 3941139419.

93. El-Hodiri H., Shou W., Etkin L. Xnf7 functions in dorzal-ventral pattering of the Xenopus embiyo. // Dev. Biol. 1997. V. 190. P. 1-17.

94. Shou W., Li X., Wu С., Cao. Т., Kuang G., Etkin L., Che S. Finely turned regulation of cytoplasmic retention of Xenopus nuclear factor 7 by phosphorylation of individual threonine residues. // J. Mol. Cell. Biol. 1996. V.16. P. 990-997.

95. Jensen J., Shieles C., Freemont P. PML protein isoforms and the RBCC/TRIM motif. // Oncogen. 2001. V. 20. P. 7223-7233.

96. Zhong S., Hu P., Ye Т., Stan R., Ellis N., Pandolfi P. A rol for PML and the nuclear body in genomic stability. // Oncogen. 1999. V. 18. P. 7941-7947.

97. Moosmann P., Georgiev O., Le Douarin В., Bourquin J., Schaffner W. Transcriptional repression by RING finger protein TIFip that interacts with the KRAB repressor domain of KOX1. // Nucleic Acide Res. 1996. V. 24. P. 48594867.

98. McKercher S., Torbett В., Anderson K., Henkel G., Vestal D., Baridault H., Klemzs M., Feeney A., Wu G., Paige C., Maki R. Targeted disruption of the PU.1 gene results in multiple hematopoetic abnormalities. // EMBO J. 1996. V.15.P. 5647-5658.

99. Kodandapani R., Pio F., Ni C., Picciali G., Klemsz M., McKercher S., Maki R., Eli K. A new pattern for helix-turn-helix recognition reveald by the PU.1 ETS-domain-DNA complex. //Nature. 1996. V. 380. P.456-460.

100. Zhang P., Behre G., Pan J., Iwama A., Radomska H., Auron F., Tenen D. Negative cross-talk between hematopoetic regulators: GATA protein repress PU.1. // Med. Science. 1999. V. 96. P. 8705-8710.

101. Hallier M., Lerga A., Barnache S., Tavitian A., Moreau-Gachelin F. The transcription factor Spi-l/PU.l interacts with the Potential Splicing Factor TLS. //J. Biol. Chem. 1998. V.273. P. 4838-4842.

102. Hallier M., Tavitian A., Moreau-Gachelin F. The transcriptional factor Spi-l/PU.l binds RNA and interferes with the RNA -binding protein p54nrb. // American Society for Biochem and Molecular Biol. 1996. V. 271. P. 1117711181.

103. Zhang P., Zhang X., Iwama A., Yu C., Smith K., Mueller В., Narravula S., Torbett В., Orkin S. and Tenen D. PU.1 inhibits GATA-1 function and erythroid differentiation by blocking GATA-1 DNA binding. // Blood. 2000. V. 96. P. 2641-2648.

104. Guerrasio A., Saglio G., Rosso C., Alfarano A., Camaschella C., Lo Coco F., Biondi A., Rambaldi A., Nicolis S., Ottolenghi S. Expression of GATA-1 mRNA in human myeloid leukemic cells. // Leukemia. 1994. V. 8. P. 10341038.

105. Schuetze S., Stenberg P., Kabat D. The Ets-related transcription factor PU.1 immortalizes erytroblasts. // Mol. Cell .Biol. 1993. V. 13. P. 5670-5678.

106. Rekhtman N., Radparvar F., Evans Т., Skoultchi A. Direct interaction of hematopoietic transcription factors PU.1 and GATA-1: functional antagonism in erythroid cells. // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 1398-1411.

107. Shimono Y., Murakami H., Hasegawa Y., Takahashi M. RET finger protein is a transcriptional repressor and interacts with enhancer of polycomb that has dual transcriptional functions. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 3941139419.

108. Suzumori N., Burns K., Yan W., Matzuk M. RFPL4 interacts with oocyte proteins of the ubiquitin-proteasome degradation pathway. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 550-555.

109. Eisenbies C., Singh H., Storb U. Pip, a novel IRF family member, is a lymphoid-specific, PU. 1 -dependent transcriptional activator. // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 1377-1387.

110. Pongubala J., Van Beveren C., Nagulapalli S., Klemsz M., McKercher S., Maki R. and Atchison M. Effect of PU. 1 phosphorylation on interaction with NF-EM5 and transcriptional activation. // Science. 1993. V. 259. P. 1622-1625.

111. Papaioannov V., Johnson R. Production of chimeras and genetically defined offspring targeted ES cells. // In book Gene targeting. A Practical Approach. Ed. By Joyner A. J. Oxford University Press. 1993. P. 107-109.

112. Robertson E. Embryo-derived stem cell lines. // In book Teratocarcinomas and embryonic stem cells. A Practical Approach. Ed. By Robertson E. J. Oxford. Washington DC: IRL Press. 1987. P. 71-112.

113. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. С. 58.

114. Sell S. Stem cell origin of cancer and differentiation therapy. // Crit. Rev. Oncol/ Hematol. 2004. V. 51. P. 1-28.

115. Nenasheva V., Nikolaev A., Martynenko A., Tarantul V. Differential gene expression in HIV/SIV-associated and spontaneous lymphomas. // Int. J. Med. Sci. 2005. V. 2. P.122-128.

116. Tarantul V., Nikolaev A., Martynenko A., Hannig H., Hunsmann G., Bodemer W. Differential gene expression in B-cell non-Hodgkin's lymphoma of SIV-infected monkey. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2000. V. 16. P. 173179.

117. Tarantul V., Nikolaev A., Hannig H., Nenasheva V., Hunsmann G., Bodemer W. Detection of Abundantly Transcribed Genes and Gene Translocation in Human Immunodeficiency Virus Associated non-Hodgkin's Lymphoma. //Neoplasia. 2001. V. 2. P. 132-142.

118. Бобрышева И.В., Барон Е.М., Варшавер Н.Б. Роль активированного клеточного онкогена с-Ha-ras-l в мутагенном эффекте плазмиды pEJ6.6. // Генетика. 1992. Т.28. №8. С. 5-11.

119. Holtzinger A., Evans Т. Gata4 regulates the formation of multiple organs. //Development. 2005. V. 132. P. 4005-^1014.

120. Peterkin Т., Gibson A., Patient R. GATA-6 maintains BMP-4 and Nkx2 expression during cardiomyocyte precursor maturation. // Embo J. 2003. V. 22. P. 4260-4273.

121. Reiter J., Alexander J., Rodaway A., Yelon D., Patient R., Holder N., Stainier D. Gata5 is required for the development of the heart and endoderm in zebrafish. // Genes Dev. 1999. V. 3. P. 2983-2995.

122. Holtzinger A., Evans T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. // Dev. Biol. 2007. V. 312. P. 613-622.

123. Peterkin Т., Gibson A., Patient R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. // Dev Biol. 2007. V. 311. P. 623-635.

124. Zhao R., Watt A., Battle M.5 Li J., Bondow B. and Stephen A. Loss of both GATA4 and GATA6 blocks cardiac myocyte differentiation and results in acardia in mice. // Duncan. Developmental Biology. 2008. V. 317. P. 614-619.

125. Nakanishi M., Hamazaki Т., Komazaki S., Okochi H., Asashima M. Pancreatic tissue formation from murine embryonic stem cells in vitro. // Differentiation. 2007. V. 75. P. 1-11.

126. Leavis P., Gergely L. Thin filament-linked regulation of vertebrate muscle contraction. // CRC Crit. Rev. Biochem. 1984. V. 16. P. 235-305.

127. Dhoot G., Perry S. The localization of the different forms of troponin I in skeletal and cardiac muscle cells. // Exp. Cell. Res. 1978. V. 117. P. 357-370.

128. Perry S. Troponin I: inhibitor or facilitator. // Mol. Cell. Biochem. 1999. V. 190. P. 9-32.

129. Fuchs E., Weber К. Intermediate Filaments: Structure, Dynamics, Function and Disease. // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 345-382.

130. Jiang Y., Henderson D., Blackstad M., Angel C., Miller R. and Verfaillie C. Neuroectodermal differentiation from mouse multipotent adult progenitor cells. // PNAS. 2003. V. 18. P. 1-7.

131. Houston I. et all. Reduction in PU.1 activity results in a block to В cell development, abnormal myeloid proliferation, and neonatal lethality. // Exp. Hematol. 2007. V. 35. P. 1056-1068.

132. Potocnik A., Nielsen P. and Eichmann K. In vitro generation of lymphoid precursors from embryonic stem cells. // The EMBO Journal. 1994. V. 22. P. 5274-5283.

133. Chabot В., Stephenson D., Chapman V., Besmer P., Bernstein A. The proto-oncogene c-kit encoding a transmembrane tyrosine kinase receptor maps to the mouse W locus. // Nature. 1988. V. 335. P. 88-89.

134. Geissler E., Ryan M., Housman D. The dominant-white spotting (W) locus of the mouse encodes the c-kit proto-oncogene. // Cell. 1988. V. 55. P. 185-92.

135. Gibson L., Piktel D. and Landreth K. Insulin-like growth factor-1 potentiates expansion of interleukin-7- dependent pro-B cells. // Blood. 1993. V. 82. P. 3005-3011.