Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние лигандов на конформационное состояние Na, K-АТФазы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние лигандов на конформационное состояние Na, K-АТФазы"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА. ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

П и н д е л ь Евгения- Владимирова а

ВЛИЯНИЕ ЛИГАНДОВ НА КОНФОРМАЦИОННОЕ СОСТОЯНИЕ Иа.К-АТФазы

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель: кандидат биологических наук

ст.н.сотр. О.Д.Лопина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор В.А.Ткачук

кандидат биологических наук вед.н.сотр. В.А.Костырко

Ведущее учреждение - Институт эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова.

Защитв состоится Февраля 1992г. в -/СК часов на заседании Специализированного Совета Д.053.05.32 при Московском

государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: г.Москва 119899, Ленинские горы, Биологический ф-*ультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 19911-.

Ученый секретарь

Специализированного совета,

к.б.н. Ю.Н.Лейкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность ^¡роблемы. Na.K-АТФаза (КФ 3.6.1.37) является мембранной ферментной системой, осуществляющей активный транспорт ионов Na+ и к+ за счет энергии гидролиза АТФ. В процессе ферментативного цикла молекула иа,К-АТФазы последовательно существует в конформациях Ej и Eg, различия между которыми показаны в ряде исследований (Jorgeneen, 1975; Karlieh, 1978, 1980; Караков, Steinberg, 1982, 1986). Гидролиз АТФ ЭТИМ ферментом осуществляется через стадию образования промежуточного фосфорилированного интермедиата (ЕР), который возникает за счет переноса 7-фосфзта АТФ на Asp 369 е активном центре фермента.

Характерной особенностью яа.К-АТФазы является негиперболическая зависимость активности от концентрации субстрата (Neufeid, bevy, 1969; йоЫпвоп, Piaehner, 1979; Болдырев, 1981). Общепринятой схемой, описывалцвй частные реакции Ка,К-АТФазы и транспортные процессы, осуществляемые этой системой, является схема Поста-Альберса (Albers et al, 1968; Poet et al, 1969):

Na+ K+ ATOtEj-> Ej~P -> Eg-P -> Eg4P.

Однако она не объясняет сложной роли АТФ в процессе функционирования Na.H-АТФазы. На гиперболическая кинетика гидролиза АТФ удовлетворительно описывается схемой Кантли (Cantley, 1983). Эта модель предполагает наличие одного центра связывания АТФ, который имеет разное сродство к субстрату в зависимости от конформационного состояния фермента. При взаимодействии с участком высокого сродства (Е1-конформация) происходит гидролиз субстрата, в то время как связывание АТФ с центром низкого сродства (Ео-конформация) ускоря-

L/M9

ет завершение гидролитического цикла, а именно Е^—>Е| перехода.

В настоящее время в литературе появились данные, противоречащие этим представлениям. Кроме того, схема Кантли не предполагает функционирование фермента в видвуолигомера, тогда как многие факты свидетельствуют о том, что На.К-АТФаза является олигомерной системой. Таким образом, вопрос о механизме работы Ыа,К-АТФазы окончательно не решен. ,

Известью, что скорость Е2—перехода сравнима со скоростью суммарной реакции, тогда как другие, стадии цикла протекают значительно быстрее. Таким образов, Е2—переход является лимитирующей стадией ферментативного процесса и сопрянен с изменением сродства не только к переносимым катионам, но и к АТФ. По этой причине исследование факторов, елиявдих на этот переход, представляет особый интерес, так как может пролить свет на регуляцию реак-кции, осуществляемой ыа,К-АТФазой.

Шль_работы. Целью наших исследований явилось изучение конформационного перехода Е2—>Е|, осуществляемого на,К-АТФазой под действием различных лигандов.

Задачи^исследованяя заключались в следующем:

1). С использованием флуоресцентной метки 5-иодацетамид-флуорэсцеина, ковалентно связываидейся с Иа,К-АТФазой, исследовать влияние температуры и рН на Е?—^ переход.

2). Изучить влияние различных концентраций Па+, к+ и нуклеотидов на Е2—переход.

3). Исследовать концентрационную зависимость связывания АТФ и других лигандов с 11а,К-АТФазой в разных условиях .(рН, 1;°).

На2чнвя_швизна_работы. Обнаружено, что в отсутствие добавленных лигандов равновесие между Е, и Ет конформациями фермента при температурах Ю-40°С сдвинуто в сторону Е^ и зависит от температуры: при ее снижении возрастает доля конформации Е^.

С использованием двух независимых методов (регистрация изменения флуоресценции меченого фермента или включение радиоак-

ъо

тивной метки при связывании [7- Р]АТФ) впервые изучено связывание АТФ и его аналогов с Ш,К-АТФазой в широком диапазоне концентраций (0,5 мкМ - 15 мМ). Установлено, что в присутствии К+ кривая связывания нуклеотида имеет такой же вид, как и зависимость активности фермента от концентрации АТФ. Полученные данные прямо показывают, что кроме центров высокого , сродства к нуклеотиду иа.К-АТФаза имеет центр низкого сродства, причем наличие двух типов АТФ-связывающих центров обнаружено как в среде . с к+ (концентрация 100 - 150 мкМ)„ так и в среде с (концентрация 150 мМ). Эти данные свидетельствуют о том, что фермент не может функционировать в соответствии со схемой, прэдлоненной Кантли, так как . согласно этой схеме ^ и % конформации фермента имеют только один тип АТФ-связывающих центров.

Показано, что в связывании субстрата с центрами высокого и низкого сродства принимают участие различные области молекулы АТФ.

Результаты исследования углубляют представления о механизме действия ка,К-АТФазы, а также ставят новые задачи дальнейшего изучения на,К-АТФазной системы. Полученные данные используются в цикле лекций спецкурса "Биохимия мембран" для студентов кафедры биохимии Биологического факультета МГУ. Сочетание различных методических подходов, использованных в данной работе, может найти

применение при исследовании других мембранных ферментов.

Апробация__работы • Результаты работы были доложены на X

Объединенном симпозиума биохимических обществ СССР и ГДР "Механизм регуляции клеточной активности" (Ташкент, 1989) и на Международном симпозиуме "Moleoular organiaation of biologioal otruoturee" (Москва, 1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Ст2Хктура_и_объ9м_диссв2тащ1и. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, раздела "Результаты и обсувдение", Заключения, Выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит стр. машинописного текста, S~ таблиц и ^¡д рисунков. Список литературы включает источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Матв2иаш_и_методы_исслаздвания.

Объектом исследования явился мембранный препарат На,к-АТФвзы из солевых иэлэз домашней утки. Препарат фермента получали по описанной ранее методике (Болдырев и соввт., 1981). Методом электрофореза в полиакрилаиидном геле в присутствии додецилсульфата натрия показано, что в получаемом препарате содержание белков с молекулярной массой 100 кДа и 4Б кДа, которые соответствуют а и р-субъедакицам фермента, составляет не менее 95%. Удельную активность На.к-АТФазы определяли при 37°С по нарастанию неорганического фосфата в среде инкубации, а также с использованием метода непрерывной спэктрофотометрической

регистрации в присутствии сопряженной системы ферментов пируЕаткиназа - лактэтдегидрогеназэ. Активность Na.K-АТФззы в ферментативных препаратах составляла 1000-2000 мкмоль Фн/мг белка в час, Mg-АТФазная активность отсутствовала.

Известно, что конформации фермента Е9 и Ej различаптся как по интенсивности собственной флуоресценции (Kariish, Yatee, 1978), так и по флуоресценции связанных с ферментом меток (Kariish, 1980; Караков, Steinberg, 1982, 1986). В настоящей работе конформацион-ннй переход регистрировали по изменению флуоресценции Б-иодацет-амидфлуоресцеина (Б-ИАФ), который ковалэнтно взаимодействует с SH-группами каталитической субъединицы и, согласно литературным данным, обладает Еыраженной способностью реагировать на конформацион-ный переход Eg—>Ej (Караков, Steinberg, 1986; Свинухова и соввт., 1987). Связывание метки осуществляется в участке, отличном от субстратного центра фермента. Поэтому ее включение в белок не приводит к снижению активности фермента и не мешает взаимодействию Na,K -АТФазы с АТФ. Включение метки в белок проводили по методу Капако-са и СтейнСерг (Караков, Steinberg,1982). Измерение связывания [7-32Р]-АТФ с препаратом Na,К-АТФазы проводили методом проточного диализа, разработанного Коловиком и Вомаком (Colowiok, Womaok,1969).

Рвзультаты_и_оОс^хденив.

Ранее было показано, что добавление ионов Na+ или к+ к меченой Б-ИАФ Na.K-АТФазе из почек собаки изменяет уровень флуоресценции метки, отражая конформационные переходы Ej<->E9 (Караков, Steinberg, 1982, 1986). Исследуя влияние Na+ и К+ на Na.K-АТФэзу из солеЕых желез уток, мы подтвердили эту закономерность: к+ индуци-

рует сншгеки© уровня флуоресценции белка, меченого 5-ИАФ (шреход в кояформацию Е2), а ка+, напротив, увеличивает ее (переход б кап-формацию Ет) (рис.1). Зависимость флуоресценции от концентрации как ма+, так и к4' лкевт гиперболический характер с К„ дгш а" 20 мкМ н для йа+ 10 мМ. Известно, что ка.к-АТФаза имеет три тело участков связывания для Ка+ и два типа участков связывания для К+ (Тоаойурз, 1979; Щеглова, 1Э81}. При этом обнаружено взаимодействие как кекду цзнтрами для ионов одного вида (тремя натриевыми центрами или двумя калиевами центрами: гоиотрошшз взаимодействия), ток и мееду ионными центрами для разнил: катионов (гетеротропные взаимодействия). Полученную нами гштарболотзскуэ зависимость юто объяснить либо тем, что иямс-шзшю когавормации, которое влияет на флуоресценцию метки, обусловлено взаимодействием ионов только с одош калиевым (с одним натриевым) центром» либо

160

120

флуоресценция,оти.ед.

о

ííaCl е

| KCl о i

1 1 о о —

4 и Г ь о

Г С ^ G О

е <Ü

0 е 8 О 1-1-1-1-- к> е i i i i i ______ I..-— t ■_„.,.)

О 40 80 150 мкМ 10 30 50 70 90 НО мМ

Fue Л. Изменения флуоресценции 5-ИАФ, связанного с на,К-АТФ-азой, вызванные добавлением KCl и Nací (t=20°c).

Гби, что в условиях пропо/лшш экепоржвкта но гыявляэтся взшш-до/;сг1"::я иоздг цонтрвгая свяатсшя для лотов одного тала. Теп кьк соглпопо лктератураш дсшсм для обеспечения гоштрошшх взакко-геобходако пряеутстеш дссишклих коотюстп второго типа катиснов (в среде с машта kojeksc^se"!! Ií+ зсв:тс;лг,:ссть фзр»*ектниа-Biioíi сгклшпосга от концентрации iía+ жзет вид пв сягиояда, а гипербола (Skou,i957)), то, по-зидкмому, в ивнкх ояспорамветалышх услогоях взашэдайотвня шгзду вшитая центрами одного типа нэ вы-

!'з литературы лзшотпо, что AT®, как и Na+, повышает интенсивность улуорасцокцин мочокого фориеатв (Кзрйюв, Steinberg, '1986). В нглстх экспериментах добавление /,ТФ в пробу с мэченой ко,К -ЛТФсве^. находящейся гз щлсутствпк каевдащвх коиаоктрвцкй калия (150 - 200 iscM), твкяе увеличивало интенсивность флуоресценции. Завишзлость флуоресценции от концентрации АТФ имеет вид сложной кривой с ггр око ку точным плато (рис.З.А). При этом повышение флуорооцэнции наблюдается уже в области пязкшс концентраций АТФ, что отражает, по-видимому, связывание нуклеотида с центрами высокого сродства. Увеличение концентрации АТФ способствует дальнейшему повышению уровня флуоресценции, свидетельствуя о дополнительном связывании нуклеотида, но уие с участками низкого сродства к АТФ. Наличие сложной кривой связывания отракавт гетерогенность субстратных центров фермента, находящегося в конформации Eg.

Чтобы проверить, насколько адекватна информация о связывании АТФ, полученная с помощью флуоресцентного метода, ш исследовали

Г1 п

также связывание [7- Р]АТФ с Na.K-АТФазой, используя метод проточного диализа. Зависимость связывания [7~32Р]АТФ от концентрации

флуоресценция,отн.ед.

[АТФ], М

СРМ х 1000

Ш

И

10'

,-3

ю-

• •

• е

[АТФ],М

10"

>-5

Ш

,-4

10"

10'

,-2

16 12

активность(мкмоль Ф„/мг в мин) н

(АТФ],М

ш

г5

ГО-

ТО'

,-3

10'

г2

Рис.2. Кривые, отражающие зависимость от концентрации АТФ: уровня флуоресценции 5-ИАФ .(20°С), связанного с ферментом (А); включения [7-32Р]АТФ в белок (6°С,Б) и ферментативной активности

Иа.К-АТФазы (37°С,В). •

нуклеотида (рис.2,Б) такие имеет вид сложной кривой с промежуточным плато и почти идентична зависимости, полученной в экспериментах с флуоресцентной меткой. Это позволяет сделать вывод, что в используемых нами условиях флуоресцентный метод достаточно адекватно фиксирует связывание нуклеотида и может применяться для регистрации связывания АТФ. До сих пор связывание АТФ с ферментом исследовалось только в области низких концентраций субстрата (до 10 мкМ) (ottoienghi, JenBen, 1983), тогда как ферментативная активность обычно измерялась в области концентраций АТФ до 2 мМ. При этом фиксировалось наличие только одного типа АТФ-связывамцих центров на конформации, обладающей низким сродством №2). Используя два независимых метода, мы показали, что в диапазоне концентраций АТФ 0,2 мкМ -10 ММ калиевая форма фермента имеет не менее двух тише АТФ-связывающих центров.

Кривые, описывающие взаимодействие АТФ с Na.K-АТФэзой и полученные двумя независимыми методами, похожи на кривую, описывающую зависимость активности от концентрации субстрата (рис.2,В). Таким образом, немихаэлисовская кинетика гидролиза АТФ Na.K-АТФазой обусловлена наличием нескольких центров связывания субстрата с различным сродством к нему.

При исследовании зависимости активности Na.K-АТФазы от концентрации АТФ при pH 6,0 и 8,0 также были, получены сложные кривые (рис.3,А), что свидетельствует о взаимодействии АТФ в ходе гидролиза с центрами как высокого, так и низкого сродства к этому лкга-нду. В то же время, флуоресцентный метод при щелочных значениях pH (pH 8,0 при 20°С) фиксирует повышение уровня флуоресценции меченого фермента только в области низких концентраций АТФ. При pH 6,0

3-/Й/0

активность (мкмоль ф„/мг в мин;

юо о АТФ.мкМ

флуоре сценция,отн.ед.

^рН 7,5

Р

/ 9 рн б,о

Г

/ р

рН 8,

I I I I I III I I I I I IIII_I_1_|.| П Ш_!_I I I I I 5 и

10

100

юоо юооо АТФ.мяМ

Рис.3. Кривые, описывающие зависимость от концентрации АТФ -активности Иа.К-АТФазы (А) и уровня флуоресценции 5-ИАФ, связан-

5,Б).

иг»т«п п ма ^-АФЛНооп» /+—9гРп "С)

1

уволпепив флуоресценции неблвдвэтся нреииущвствошо в области ш-vovsx. концентраций ATS; фяуорасцонтшй ответ при рН 6,0 в области низких Есшцоятраций нуклеотлда вараяэн нз столь явно, как при pli 7,5 - (рчо.З.В). Возможно, изменение рН влияет пп функционально ваглл.'о грушш субстраггшх центров таким образом, что хвзрвво-дит nz. в состоите, в котором опи га влвявт на флуоресценцию матги. Это накладывает ограничения на использование флуоресцентного штодо с целью регистрация кои связывания АТФ, так и изменения кокформации фермента.

Известно, что стодафячвский ингибитор ш,К-АТФазы уабаин пол-постх.'о блокирует ферментативную активность. УаОшш связывается с фоа^орщшроввкной формой фэрконта, в соответствии с этим две группа лиговдов, активкруйцив образование фосфофэркента, щдукируют связывание ингибитора: йд2+, На+, АТФ или и неорганический

фосфат. Оба группы лигандов использовались нам? для получения комплекса фзркэат-уобаан, которые мы называли соответственно Е-уабз-ин-1 н В-уабоин-2.

Добавление ионов Na+ к обоим типам комплексов фермента с уа-баином. способствовало увеличению уровня флуоресценции, то есть формент-шгибиторшй комплекс был способен взаимодействовать с На+ и вследствие этого претерпевать ко'нформацйошшй переход —>Ej. При этом сродства к Na+ не менялось (КД=Ю мМ), хотя интенсивность флуоресценции фермента после связывания уабаина сниналась (рис. 4,А). Причиной этого, по-видимому, является уменьшение кокформа-иошюй лабильности фермента после связывания с увбшшом.

В то ха время, образование комплекса фермент-уабзин блокирует

Р-с.4. Влияние натрия (А) и АТФ (Б) на уровень флуоресценции 5-ИАФ, связанного с комплексом фермвнт-уабаин.

флуоресцентные изменения, индуцированные низкими концентрациями АТФ (рис.4,Б), нв влияя на изменения, вызевнныэ шсокетсц концентрациями нуклеотида. Возможно, связывание АТФ с участками высокий сродства не наблюдается в этом случае в силу того, что зти участки уже фосфорилированы, тогда как связывание АТФ с участками низкого сродства сохраняется. Нельзя однако исключить, что АТФ связывается с обоими типами центров комплекса фермент-уабаин, который стабилизирован таким образом, что кокформационнне изменения, индуцированные связыванием АТФ с участками ексокого сродства, не меняют микроокружения флуоресцентной метки. Это предположение подтверждается результатами Аскари и соавт., которые обнаружили два типа АТФ -связывающих центров на комплексе фермент - уабаин (ABkari et al., 1988).

Таким образом связывание уабаина с Na.K-АТФазой, препятствуя гидролизу АТФ, не мешает взаимодействию с ферментом Na+ и АТФ £в высоких концентрациях). При этом сохраняется также способность фермента к конформационнкм изменениям, вызванным связыванием этих лигандов.

Из литературы известно, что натриевая форма фермента связывает АТФ с высоким сродством (Кд=0,1-0,2 мкМ) (Ottolenglii, Jensen, 1983). Однако ранее исследовалось связывание фермента с АТФ лишь в области низких концентраций (до 10 мкМ). Мы изучили флуоресцентный ответ на связывание субстрата с Na,К-АТФазой в широком диапазоне концентраций (5 мкМ - 10 мМ) в присутствии Nat На фоне насыщающих концентраций этого иона (150 мМ) была получена снгмаидальная зависимость изменения флуоресценции от концентрации АТФ (рис.5). При низких концентрациях АТФ изменения флуоресценции в этих опытах не

наблюдалось (вероятно, вследствие того, что фернэнт угэ бил переведен нртГ«1вг,5 о конформацию Е^), тогда как в области высоких концентраций субстрата обнаруживалось значительной гошашш флуоресценции, отражающее связывание АТФ с центрами низкого сродства. Наличие сигмоидалыгой зависимости флуоресценции от коадонтроика ЛТФ в присутствии натрия свидетельствует, по-видимому, о ток, что центры низкого сродства к АТФ взаимодействуют друг с другом. Таким образом, как в присутствии натрия, так и в присутствии калия, фермент имеет два типа АНГФ-связывшощих центров'(с высоким и низким сродством к нуклеотиду). Способность АТФ повышать флуоресценцию на фоне насыщающих концентраций натрия показывает, что На+ и АТФ переводят да.К-АТФазу в конформации, отличающиеся одна от другой. , флуоресценция,отн.ед.

300

200

100

О

О О

о

о

о

Г1аС1

О

Ф ООО

АТФ

ОоО

о

о

©

и

0 40 80 ЧЧ150

10

14

18 мМ

Рис.5. Флуоресцентные изменения, связанного с на,К-АТФазой 5-ИАФ, 1ШДуцированные добавлением КаС1 и АТФ.

Кеилодогшсз ютплтя тегднзратурц пз ironloprffiiniCHinni яэрзгод 3-,—>IiT вшсйзело, что яр" воох телтотрптдют. дрбавлзжгз в пробу !.iot:ob kf ггршадкт к снкззнию фдуорзсценцип шчепого Форгшита» a BiiecomiB на ¡Тюно нссш-акщх концентраций к+ (150 ккМ) еонов нвтряя (ала ДТО) увеличивает интенсивность ©яуорэсцзшда.

"сходняй уровень флуоресценция б-КЙ®, связанного с фэрг'знтсм, з огсутстпзз лкгопдохз 'Еа+, К*, АТФ) обеспечивается популяцией к о-ликуя "г.эчзгхУА хгз,1£-АТ®эзи, яаходошцшзя частично в воафсдшцпа Ej, а чпсточпо з :со1г|рр"!ац15н Е-j. Опродолвв раинщу кояду уровней фяуорооцсвщи исходного препарата форжштв и флуоресценции, характерней для кспформзции Е> (д^ ), из соотношения л K^f разшздя во флуоресценции конформацзй Ej и Eg, рис.1) гяоззяо определить дал» молекул в копформащш Ет в исходном препарате фер;гзнта. ЬЬг установили, что с повшением температуры соотношение Ej/E9 увеличивается от 0,1 до 0,45 (в случае, когда копфорлация Ej обеспечивается связыванием натрия с ферментом, рис.6,А) и от 0,2 до 0,85 (в случае, когда конформация Ej обеспечивается связывояяем AT® с фэр:еитом). Наши результаты показшзают, что тавшенге тегяюратурн сдвигает равновесие »езду конфор^ецтшш. в сторону Ej. Несмотря за то, что с пошившей тешерзтуры наблюдается прирост дола фэр--1 - - "-г »-"пот т "с 'о»* " ~*т, -Tj. гс"т ««йпервтураг про- - • ' ч • р с ' тксго, пто с по-о' ' j очтн Л-:: кратче атому ::&тлсну. О о " r j I 11 " Ч vm - 19SS).

С давшгзпнвм тег.гпоратурн интенсивность флуоресценции обеих конфоргаоцпй ыа.К-АТФазы снижается, однако характер температурной

зависимости . . форм Е^ и Е1 в популяции фермента несколько различается (рис.6,В). Для формы Е2 характерно монотонное уменьшение флуоресценции с ростом температуры. Конформация Е} более чувствительна к этому фактору: для нее характерно выраженное падение флуоресценции в области температур выше 20°С. Это показано как для конформации Ет, полученной в результате связывания с ферментом ионов натрия, так и для конформации, индуцируемой добавлением в среду АТФ. Известно, что при температуре вше 20°С в мембранном препарате Яа,к~АТФззы наблюдается резкое уменьшение микровяз-

флуоресценция,отн.ед.

100 г

80

60

40

20

0

14 20 30 40 г°,С

240

220

Е2 200

180

160

-Ет 140

120

10 20 30 40г°,С

Рис.6. Изменение флуоресценции 5-ИАФ, связанного с Иа.к-АТФ-азой. А - соотношение конформацкй Ет и Е? в исходном препарате фермента при разных температурах, Б - влияние температуры на флуоресценцию конформаций Е^ и Е2.

кости липидного бислоя (Болдырев, 1988). Возможно, связывание калия с иа.К-АТФазой ограничивает ее нонформационнуго "гибкость" в большей степени, чем связывание натрия или АТФ, в результате чего конформация оказывается менее чувствительной к изменению свойств липидного бислоя. Это предположение подкрепляется данными о разной температурной устойчивости фермента в присутствии Иа+ или к+. Так в среде с калием фермент более устойчив к изменению температуры, чем е среде с натрием (гчаапег, 1933).

Исследуя, как изменения в структуре молекулы АТФ влияют на его связывание с ферментом, можно получить информацию о том, какие части молекулы нуклеотида участвуют в связывания. С этой целью мы изучали способность разных нуклеотидов (ЦТФ, ИТФ, ГТФ, УТФ, АДФ, АМФ и р.т-СН^-АТФ) индуцировать конформационные изменения №,К-АТФазы. Анализ флуоресцентных изменений меченого фермента под действием ЦТФ, ИТФ, ГТФ, УТФ показал, что все нуклеотида способствуют конформационному переходу ^—но в разной степени (рис.7). Даже при насыщающих концентрациях эти нуклеотида не способны обеспечить уровень флуоресценции, наблюдаемый при связывании АТФ. - Только зависимость флуоресценции

меченой №,К-АТФазы от -ЦТФ описывается кривой, похожей по форме на кривую, характеризующую связывание АТФ, хотя ЦТФ имеет меньшее сродство к центрам связывания и его связывание в области низких концентраций обеспечивает менее выраженный флуоресцентный ответ. Связывание других нуклеотидов (ГТФ, ИТФ, УТФ) характеризуется гиперболической зависимостью от концентрации лиганда с величиной Кд в области миллимолярных концентраций. Кривые, аналогичные флуоресцентным, были получены для ЦТФ и ГТФ при изучении связывания

радиоактивных нуклеотидов. Из сравнения структуры молекул этих нуклеотидов следует, что АТФ и ЦТФ, невзирал на различия в природа азотистого основания, имеют одно общее свойство: оба нуклзогадо содержат нопротонировшшый азот в первом поло»;о1п:л пурпкохзого (в третьем положении пиргалидишвого) кольца и Ш^-гругшу б зшию-ГИЧНШС П0Л02ЙНИЯХ азотистого основания (Волаугет et 1984). По-видимому, именно наличие такой структуры обеспечивает двухфазную зависимость эффекта от концентрации нуклеотида.

Анализируя флуоресцентные изменения нв,К-АТФазы, ¡дочоной Б-КАФ, в ответ на добавление' в пробу АДФ, АМФ и р.т-СР^-АТФ с на.К-АТФазой (рис. 8), мы обнаружили, что зависимость уровня флуоресценции от концентрации АДФ (так же, как и АТФ) описывается сложной кривой с промежуточным плато. В то же время АМФ способствует повы-

Рис.7. Зависимость уровня флуоресценции 5-ИАФ, связанного с №,К-АТФазой, от концентрации разных нуклеотидов. Данные для ИТФ и УГФ (не приведены) близки тем, что получены с ГТФ.

щ0к1ю стлуорссногцггп только D ОбЛЕОТЕ шгсонах ггощонтрацяй иугакюткда, зависимость жзшнопяя фяуоросцсшвт от копцэптрац®! лп'.'пнда прл-ставлена гпшрболей.

Нэгпдро.-ггаушжй аналог А?Ф, p^-CIL-ATO, езязивоясь о ка,К-ЖзсоГ;, ш-дунирует увеличение флуоросцоншя только в области нгз-i!!E •еткцоктраиий субстрата. Зависимость флуоросценцап от коадектрадга аналога токйо продставлона гипзрболой.

Для заалхза кривой, описыващай связывание АТО с нз,К-АТСйзой, ш использовали дао кодели. Согласно одной но дашую кривую могко прэдетавить как результат связывания нуклвотвдо с нос;юлькга/л1 (даумя ила тремя) шзнвисижш! участками, то есть как cyi.My нескольких (соотээтствзвно двух или трох) гипербол. Другая модель описывает экспериментальную кривую как сумму двух состав-

Рис. 8. Зависимость уровня флуоресценции от концентрации адениновых нуклеотидов (AT®, АДФ, АМФ И р.Т-СН^-АТФ) для

па,К-АТФазы, меченой 5-ИАФ.

ляющих: гиперболы и сигмоида. Расчеты показали, что вторая модель описывает связывание нуклеотида лучшим образом. Она предполагает наличие одного независимого АТФ-связыввшцвго центра с высоким сродством, взаимодействие с которым описывается гиперболой, и нескольких взаимодействующих центров низкого сродства, связывание нуклеотида с которыми описывается сигмоидой.

Компьютерны® анализ дал возможность рассчитать из экспериментальных данных константы, характеризующие связывание лиганда с такими центрами (Табл.1). Сравнение этих констант позволяет заключить, какие именно участки молекулы субстрата могут быть ответственны за связывание с центрами высокого и низкого сродства.

Все исследованные нуклеотида можно разделить на две группы. Для первой характерна сложная кривая, описывающая зависимость связывания от концентрации лиганда. Сюда относятся АТФ, ЦГФ и АДФ, у которых при физиологических значениях рН в азотистом основании присутствуют депротонированный азот в I (3) и №2-группа в 6 (4) положении пуринового (пиримиданоЕого) цикла, а также имеются, как минимум, две фосфатные группы в концевой части молекулы. Наличие такой структуры необходимо для связывания с центрами высокого сродства и возможно, что именно она существенна для образования олигомера.

Константы, характеризующие связывание этих нуклеотидов в области низких концентраций субстратов, значительно различаются. Высокое сродство характерно для АТФ и АДФ, молекулы которых содержат пуриновое основание. Тот факт, что ЦТФ имеет меньшее сродство к центрам связывания, свидетельствует о том, что для связывания с центрами высокого сродства важным фактором является присутствие

пуриного цикла в молекуле субстрата. Полунасыщение сигмоидальной

Табл.1.Параметры, характеризуицие взаимодействие нуклеотидоЕ с центрами высокого и низкого сродства Иа.к-АТФазы, рвсчитанные на основе модели с двумя типами центров.

гипербола гипербола+сигмоида сигмоида

суб- КД суб- КД К0,5 пн .к0,5

страты (мМ) страты (мкМ) <мМ) страты (мМ)

р.Т-С&з-АТФ 0,08±0,01 АТФ 15±5 8±2 1,5 АТФ** 11*2

Ш 0,5±0,1 АДФ 40-5 6±3 1.3 Ша+)

ИТФ 1,2±0,8 ЦТФ 400-50 6±3 1,4

ГТФ 1,4±0,4

УТФ 1,8±0,Э

АТФ* 3,0-1,2

(В-уабаин)

* для комплекса Е -уабаин, ** в натриевой среде

части кривой для всех этих субстратов наблюдается в одной и той ке области концентраций. Это показывает, что структура азотистого основания не играет вакной роли в распознавании нуклеотида центрами низкого сродства.

Для другой группы нуклеотидов характерна гиперболическая зависимость связывания от концентрации лиганда. Мы предполагаем, что эти аналоги АТФ взаимодействуют только с центрам: высокого сродства, но обладают более низким сродством к нему. р,7-С1^-АТФ, в мо-

лекуле которого между 7 51 Р фосфатными грушами вместо кислорода расположена С^-гругаю, не взаимодействует с центрами низкого сродства (отсутствует сигмоидальная часть кривой), что, видимо, свидетельствует об участии кислорода в связывании нуклеотида с этими центрами. В то же время, отсутствие этого кислорода мало сказывается на взаимодействии нуклеотида с центрами высокого сродства. Для АШ, который не имеет р-фосфата, обнаруживается только один тип нуклеотид-связывавдих центров. Кд для АМФ составляет 0,5 мМ, то есть в 10 раз больше, чем для АДФ при его взаимодействии с центром высокого сродства. Это свидетельствует, что присутствие р-фосфата необходимо для обеспечения сеязыезния нуклеотида с центрами высокого сродства.

Анализ полученных нами данных в совокупное™ с литературными фактами позволяет считать, что в случае гиперболического характера взаимодействия нуклеотидов с ферментом, последний представлен про-томером, в то время как сигмоида отражает взаимодействие лигандов с олигомером Ыа,К-АТФазы. Эти результаты дают основание для предположений о том, что модифицирующее действие АТФ, АДФ и ЦТФ отра-

а

жает регуляцию взаимодействия протомеров в олигомерном ансамбле ИаД-АТФазы.

ВЫВОДЫ

I. С использованием флуоресцентной "метки 5-иодацетамидфлуо-ресцеина, ковалентно связанной с ыа.К-АТФазой, охарактеризованы

кокформациционные изменения фермента, индуцироЕанныз Ма+ к к+. Ка+

увеличивает флуоресценцию метки, связываясь с центрами одного типа

(Кд=10мМ), а к+, напротив, снижает ее, также взаимодействуя с

центрами одного типа (Кд=2(^лМ).

2. В присутствии насыщающих концентраций как Па+,так и к+ флуоресценция меченой гта,К-АТФазы снижается с ростом температуры.

ГТпт* тчэтггтопоттта оттгр ^П^П 1\Га_Лтпижа {Т?-. \ /^пттаа ттгггэптчэг/гФа гтс.гга хг т/га —

менениям температуры. С повышением температуры от 10 до 40°С доля т-формы в исходном препарате фермента увеличивается в 3 раза.

, ор

3. В присутствии 100 мкМ к зависимость связывания [7- Р1АТФ с йа,К-АТФазой в ряду концентраций 0,2 мкМ - 10 мМ описывается кривой с промежуточным плато, что свидетельствует о гетерогенности АТФ-связывающих центров. Аналогичная кривая характеризует зависимость флуоресценции меченого фермента от концентрации АТФ, что позволяет использовать флуоресцентный метод для изучения связывания нуклеотидов.

■4. Зависимость флуоресценции На,К-АТФазы, меченой 5-ИАФ, от концентрации ДЦФ и ЦТФ также описывается кривой с промежуточным плато. Связывание других нуклеотидов характеризуется гиперболой, причем сродство к центрам связывания убывает в ряду р,7~метилен-АТФ, АМФ, ИТФ, ГТФ и УТФ. Комплекс фермент-уабаин имеет один тип АТФ-связывающих центров с низким сродством.

5. В присутствии насыщающих концентраций Иа"1" зависимость флуоресценции меченой Иа.К-АТФазы от концентрации АТФ имеет вид сигмоиды с К0 5 = II мМ.

6. Связывание АТФ с ферментом может быть описано как связывание нуклеотида с одним типом центров высокого сродства и несколькими взаимодействующими центрами низкого сродства, что математически выражается как сумма гиперболы (Кд= 15 мкМ) и сигмоиды (Кд ^=8 мМ). Связывание с центрами обоих типов характерно только для нуклеотидов, содержащих непротонированный азот в I положении пури-

нового цикла и, как минимум, две фосфатные группы в концевой части молекулы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Лапина О.Д., Федосова Н.У., Пиндель Е.В. Na.K-АТФаза: механизм гидролиза различных нунлвотидов и четвертичная структура фермента-Х. Объед. Симпозиум биохишч. обществ СССР-ГДР Механизм регуляция клеточной активности, Ташкент, 1989, с.БО.

2. Boldyrev A.A., Ьоргка O.D., Findel E.V. Ка.К-АТРаве: The nature of regulation by ATP - Int. Symposium "Molecular organization of biological structures", Moscow, 1989, p. 155.

3. Lopina O.D., Findel E.V., Boldyrev A.A. Na,K-ATPase Labelled with 5-iodoaoetamidofltioreßaein: oonformat ional transition indUBed by different nuoleotideB.-PEBS Lett., 1990, v.266, N 1,2, p.75-77.

4. Пиндель E.B., Лопина О.Д., Болдырев A.A. Влияние температуры на конформационное состояние Na.K-АТФазы. -Вестник МГУ, 1990, сер.16, N 4, с.43-46.

Б. Boldyrev A.A., Fedoeova N.U., Lopina O.D., Pindel E.V. Regulatory Role of ATP in the Na, К-ATPase Operation. J.Gen.PhyBiol. in ргевв.

Подписано к печати Щ-91 Формат 60x90/16. Усл. печ, л. Уч.-изд.л,

Тираж ¡СО экз. Заказ К» /¿/9

Ордена 'Знак Почета* издательство Московского университета. 103009, Москва, ул, Герцена, 5/7. Типография ордена "Знак Почета* издательства МГУ. 119899, Москва, Ленинские горы»