Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние изменений температуры на активность одиночных ионных каналов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние изменений температуры на активность одиночных ионных каналов"

МОСКОВСКИ! ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ ЕЕВОЛЩИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЦЕЕЕ Вадим Эгонович

УДК 577.352.465

ВЛИЯНИЕ ИЗМЕНЕНИИ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ ОДИНОЧНЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ

03.00.02. Биофизика

Автореферат диссертации на соисканание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1Э91

Работа выполнена в лаборатории биофизики клетки Института биофизики клетки АН COOP г. Пущино.

Научные руководители: д.ф.-м.в, с.н.с. В. Н. Казачвнко, к.б.н, с.н.с. В. И. Гелетюк.

Официальные оппоненты: д.ф.-м.в, профессор fi. А. Твэрдислов, к.б.н, с.н.с. А. К. Филиппов.

Ведущая организация: Институт цитологии АН "СССР, г. Ленинград.

Защита состоится " ^ " 0/СТЯ$ргй.991 г. в час.^^мин. на заседании специализированного совета N 3 ОФГТ (К 053.05.77) в МГУ им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, ГШ, Москва, Ленинские горы, МГУ, Физический факультет, аудитория

Н>ФА .

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке {иаического факультета МГУ.

Автореферат разослав ССнТ^

1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета К 3 ОФГТ кандидат физико-математических наук '

Т. М, Козлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теки

Представленная работа посвящена изучению влияния изменений температуры на проводимость и кинетические характеристики одиночных ионных каналов. Интерес к этой тема обусловлен тем, что температура является одним из наиболее слоено действущих факторов на функционирование ионных каналов: структура белкоЕой глобулы канала и липидного матрикса, распределение токопереносящах ионов по энергиям и характер их сольватного окружения в значительной степени чувствительны к изменениям температуры. Это в свои очередь сказывается на активности ионных каналов при изменении температура. Исследования с применением пэтч-метода в этих случаях позволяют раздельно изучать изменения с температурой проводимости одиночных . ионных каналов и их кинетических характеристик, что дает возмохность делать, оценки величин энергетических барьеров в поре и наблюдать за температурной чувствительностью "воротного механизма" канала.

Цель работы и постановка задач

Целью исследований представленных в данной работе являлось изучение влияния изменений температуры на функционирование одиночных, потенциалозависимых быстрых и медленных К+-каналов различной проводимости в нейронах моллюска.

В круг задач входили:

1) оценка величин энергетических барьеров в поре на основании температурных зависимостей токов через одиночные ионные каналы;

2) изучение влияния изменений температуры на кинетические характеристики быстрых и медленных К+-каналов и их подтипов меньшей проводимости;

3) использование температуры как одного из немногочисленных-факторов, регулирующих амплитуду протекащего через канал тока, наряду с потенциалом и концентрацией ионов К+ (с наружной• стороны фрагмента). Это представляло собой особый интерес при изучении связи амплитудных и кинетических характеристик одиночных ионных каналов.

Научная новизна результатов

В результате исследований получены: а) данные, по оценке величин энергетических барьеров в поре для

1

каналов различной проводимости в диапазонах изменений мембранного потенциала от -40 до +60 мВ и температуры от 0 до 40°С;

б) выявлена особая зона температуры 10 + 20°С, в которой наблюдается немонотонное, аномальное поведение как проводимости канала, так и его кинетических характеристик;

в) обнаружена связь потенциалозависимости и температурочувствительности кинетических характеристик одиночных ионных каналов;

г) показано, что любые изменения температуры, мембранного потенциала и концентрации ионов К+ с внутренней стороны мембраны (1К+1411) ведущие к увеличению амплитуды протекающего через канал тока, приводят к однонаправленным изменениям соответствующих кинетических параметров канала.

Полученные данные позволяют сделать некоторые заключения, касающиеся механизма функционирования одиночных К+-каналов.

Практическое значение работы

Сделаны оценки величин энергии активации проводимости для быстрых и медленных К+-каналов.

Полученные данные привлекают особое внимание исследователей к критическому для всех параметров канала диапазону температуры 10+20°0 вблизи которого проводится большинство экспериментов по регистрации одиночных ионных каналов.

Связь амплитуды тока и кинетических параметров активности ионного канала, а также ряд представлении* данных касающихся характера потенциалозависимости и температурозависимости кинетики по-видимому отражают фундаментальные принципы функционирования канала и позволяют сделать предположение о механизме действия протекающего через канал тока на его воротный механизм.

Апробация работы и публикации

Результаты работы доложены на:

1) Всесоюзном симпозиуме "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических, и рецепторных процессов (Минск, 1988).

2) Всесоюзном симпозиуме "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Кара-Даг, 1989).

3) Всесоюзном симпозиуме ГИоннне каналы" (Кара-Даг, 1990). 2

4) Биологической: школе молодых ученых МГУ (Пущино, 1990).

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, семи глав, выводов и содержит 123 страницы машинописного текста, включая зо рисунков и список цитируемой литературы (119 наимениваний).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Общая характеристика каналов (литературннй обзор)

В главе рассматриваются современное представление о функциональной схеме ионного канала и способ оценки величины энергии активации проводимости го тегшературным измерениям токов через одиночные ионные каналы.

Рассмотрено также влияние температуры на динамическое состояние мембран и непосредственно на проводимость и кинетические параметры ионных каналов.

Глава 2. Экспериментальная часть. Описана методика регистрации одиночных ионных каналов; приведены способы обработки записей гоков и алгоритмы определения кинетических параметров и амплитуды тока.

В качестве объекта исследований использовались полностью изолированные, неидентиЗицкрованные нейроны диаметром 20 + 200 гаем из большого и малого париетальных и висцерального ганглиев мозга большого прудоЕика Цртаеа atagna.Ua.

Нагрев и охлаздение в камере осуществлялись при пропускании через теплообменник (металлическую трубку) либо нагретого воздуха, либо низкотемпературных паров азота.

Для заполнения микрошшеток использовали два типа растворов:

(А) - нормальный физиологический расвор содерзал (в мМ): НаС1 50; КС1 1,5; МвС1г 1,5; СаС12 4 при рН 7,5, которое устанавливали с помощью буфера Нереэ-КОН (2,5 мЫ), применяемого нами во всех растворах.

(Б) - раствор с пониженной концентрацией Са+ и повышенной концентрацией К+ содержал (в Ш): НаС1 50; КС1 10; МдС12 1,5; СаОХ2 0,1 при прением значении рН.

Внутреннюю сторону фрагмента (т.е. камеру) перфузировали обычно 100 кМ-раствором ХС1 при номинальном содержании Са2+(<*10~б Ы), при рН 7,5. В отдельных опытах использовались

3

раствор с мэршщие КС1 (в кМ): 12,5; 25; 50; 200 при рН 7,5.

Глава 3. Влияние изменений температуры и потенциала на

токи через К+-каналы.

В нейронах пресноводного моллюска Lynoiasa stagnai 1а регистрируются по меньшей мере два типа К+-каналов: быстрые и медленные. В контрольных условиях ((К+],_= 100 мМ, [K+]_.i4.= 1,5 мМ, О мВ, 20°0) их проводимость лежит в пределах от единиц пСм (каналы малой проводимости) до 20 s- 40 пСм (каналы большой проводимости).

Медленный•и быстрый К+-каналы основной проводимости имеют пачечный характер активности, но их соответствующие кинетические характеристики противоположным • образом зависят от потенциала V. Окончательная идентификация проводилась по деййнию блокатора Сз+ (1 кМ с внутренней стороны мембраны), который полностью блокировал амплитуду быстрого К+-канала (Кв=0,25 мМ) и не оказывал заметного влияния на медленный К+-канал.

Покато названных К+-каналов в нейронах моллюска регистрируются одиночные К+-каналы меньшей проводимости (до 5 пОм), которые могут быть идентифицнрованы как подтипы быстрых и медленных К+-каналов. Основанием для этого служит сходство поведения соответствующих каналов мрлой и большой (основной) проводимости.

При заданном уровне мембранного потенциала повышение температуры вызывает увеличение тока (I) и, соответственно проводимости (g) канала.

На рис. 1 в вррениусовых координатах представлено семейство зависимостей 1(Т) для медленного К+- канала (30 пСм) при различных значениях потенциала (V).

В случае, когда пштетка заполнена нормальным физиологическим раствором (рис 1,а), зависимости слабо нелинейны. В области температуры 10 + 20°С наблюдается перегиб и снижение температурной чувствительности токов. За пределами этой зоны зависимости аппроксимируются прямыми линиями. Зона аномального поведения токов (10 + 20°0) наиболее отчетливо выявляется в случаях, когда пипетка заполнена раствором с пониженным содержанием Саг+ (0,1 Ш) и повышенной концентрацией К+ (10 мМ). В втих условиях, при повышении температуры в пределах от 10 до 20°С ток сначала аномально падает, а при <*15°С начинает резко возрастать (рис. 1,6). За пределами se области 10 + 20°С, как и в первом случае (рио. 1,а) зависимости 1(Т) в аррениусовых координатах мояно аппроксимировать прямаки линиями. 4

Рис. I. Зависимость тока от температуры в координатах Аррениуса для медленного К+- канала (g 30 пСм). а - в пипетке фгаиологический раствор А; потенциал! (мВ): -20(1); 0(2); +20(3); +40(4); +60(5). б - в пипетке физиологический раствор Б; потенциалы' (мВ): -20(1); 0(2); +20(3); +40(4).

Каяущиеся значения энергии активации ДЕа для токов (проводимости) определяли по наклонам линейных участков аррениусовых графиков в областях температуры: Т<10°0 и Т>20°С.

На рис. 2,а приведены полученные, таким образом значения AEQ (усредненные данные на четырех фрагментах) для медленного К+-кенала основной проводимости (30 + 40 пСм) в зависимости от величины V, для двух диапазонов температуры: Т>20°С и Т<10°С. В целом значения АЕд при Т>20°С низга значений при Т<10°0. Обе зависимости ДЕа(У) имеют локальный максимум вблизи -10 мВ и локальный минимум при +20 мВ. Наибольшее значение АЕа при Т>20°0 (-10 мВ) равно <*6 ккал/моль, а наименьшее <*3,5 кнал/моль (+20 мВ). При Т<10°С максимальное значение АЕа равно "12 ккал/мол£ (-10 мВ), а минимальное ~4.ккал/шль (+20 мВ).

Значения АЕд, во первых, различны для разных диапазонов температур, а во вторых, является нотенциалозависикыми. Наибольшие значения АЕ„ достигаются при величинах V в

Рис. 2. Зависимости ■ экспериментальных значений ДЕа от мембранного потенциала для деух диапазонов температуры: Т<10°С (1 ) и Т>20°С (2).

а - медленный К+-канал проводимостью <* 35 пСм. АЕа полученны усреднением данных на шести фрагментах. В пипетке физиологический раствор В. О - быстрый К+-канал проводимостью 23 пСм. ЛЕа получены усреднвниэн данных на четырех фрагментах. В пипетке физиологический раствор А. Вертикальные линии указывают стандартное отклонение.

окрестности -20 + +20 мВ, причем при Т>20°С значения ДЕа в 1,52 раза ниже соответствующих значений при Т<10°0. При потенциалах выше 20 мВ для обоих температурных диапазонов ДЕа равна около 4 ккал/моль. Эта величина близка к энергии активации проводимости 100 мМ-раствора КС1 (3,9 ккал/моль). На этом основании мокно допустить, что в исследуемых К+-каналах при У>20 мВ движение ионов К+ происходит как свободная диффузия в водном растворе.

На рис.2,б приведены зависимости ДЕа(У) для быстрого К+-канала при Т<10°С и Т>20°0. При Т>20°С ветчина ¿Е0 составляет 6 + Э ккал/моль при отрицательных потенциалах и стремится к 5 ккал/моль при положительных. При Т<10°С зависимость АЕа(У) имеет противоположную направленность: АЕа равна "4 ккал/моль при отрицательных потенциалах и вблизи О мВ, а при положительных значениях V, АЕа увеличивается до 6 ккал/моль. Поэтому, значения ЛЕа определяются не только температурным диапазоном, но и величиной мембранного потенциала.

Температурная зависимость токов через каналы меньшей проводимости приблизительно такая же, как и у тонов через каналы 6

основной проводимости. Во всех случаях в диапазоне температуры 10 + 20°С наблюдается аномальное поведение токов. За предела?.® этой зоны приводеннне тег.шерзтурные зависимости могно ■ аппроксимировать при,пси линиями и по ¡а наклонам определить кзауцився значения АЕ0.

Глава 4. Влияние изменений температуры и потенциала на капэтячэскяэ характеристики канала.

Для описания кинетики работы канала использовались следущго параметра (средние значешя): длительности пачки импульсов и длительности мвгзгачвчного интервала длительности одиночного импульса тока 1о; и вероятность нахохдения канала в открытом состоянии Р . Зависимость этих величин от Т и V исследованы для медленного и быстрого К+-каналов, а так ко и для их подтипов кеньпеЯ проводимости. Диапазоны изменения температуры: О +' 40°С; потенциала: -40 +60 мВ. Скорость изменения Т порядка 2°0/ман.

На рис. 3,а приведены зависимости средних значений 1;,,. от томпаратуры (при трех значениях потенциала:(в кВ) -40(1), 0(2), +50(3)) для медленного К+-канала.

Общей тенденцией является увеличение 1; с ростом как Т тая и V. Выделяется точка Т=15°С, в которой находятся локальные максимумы зависимостей ЪП(Т) при всех значениях V. Кроме того, коею с определенностью заключить что в диапазоне температуры от Б до 20°С 1; слабо зависят и от температуры и от потенциала по сравнении с областью те.'аэрэтуры 25 > 40°С, где ярко выразят Тв!,310раТур032Е1!СЖ0СТЬ И ПОТеНЦЯаЛОЗПЕТОТМОСТЬ Е8ЛИЧИШ 1; .

На рис. 3,6 приведены зависимости средних значений длительности мегяачвчных интервалов- 1; от т (при трех значениях потенциала:(в кВ) -40(1), 0(2), +60(3)) . Здесь четко прослеживается умвньЕвние 1; с ростом как Т гак и V, причем в диапазоне температуры 20 * 40°С Ь^ практически но зависит от Г и V. Температурозавясимость и потенцяалозаЕИСимость величины tи появляются лияь пра температуре низе 20°0 (17°С). Как в случае с 1: так и с 1;и их темпэратуроззЕисимость и потенциалозавискмость проявляются только в паре. То есть.-асш 1; и 1;и реагируют на изменение Т, то они реагируют и на йзмвнвния V. Отсутствие ге твмнературоэависимости сопровождается отсутствием и готвнцявлозависшлости.

Обобцая полученные данные могно сказать: 1. В области температуры 5 + 20°С 1; слабо зависит от температуры (01О <*2) и от потенциала, а ^ наоборот, сильно

t,.c

t,.C

10 г

а

о

' ' ' ' i '_у ' '

i_i_I I I I I I 1

О 10 20 30 0 Т.'С

О Ю 20 30 Ш I 'С

Рис. 3. (Медленный К+-канал).

Зависимости средней длительности пачек импульсов tn от температуры (а) и от потенциала (б).

а - (в мВ): -40(1); 0(2); +60(3). б - (°С): 6(1); 15(2); 20(3); 25(4); 40(5). В пипетка физиологический раствор А; в камере KCl 100 dl g о 30 пСм.

уменьшается с увеличением потенциала и температуры (Qlo<*I0). 2. В области температуры от 20 до 40°С tn значительно растет с увеличением температуры и потенциала, а ts практически не меняется.

На рис. 4 показаны распределения величин ?о при различных значениях температуры для медленного К+-канала. По оси ординат отлокена нормированная частота (f) встречаемости то с данным значением, а по оси абсциоо - длительность tq в мс. Sa единицу принято значение I для tq=2 мс (нижняя граница измерений то).

Особой точкой является Т-15°С, что видно на вставке, где приведена зависимость от температуры среднего вначения tq. Так же как и среднее значение длительности пачек tQ, среднее значение то растет с увеличением температуры, достигая цри 15°0 своего локального максимума.

Величина Pq- вероятность нахождения канала в открытом состоянии определяется, в основном, значениями tn и tH, поскольку мекимпульснне интервалы хи в пределах пачек малы. Поэтому, суммарное действие температуры и потенциала на tn и tH и обуславливает поведение Р .

о

Рис. 4. (Медленный К+-канал). Распределения длительности одиночного импульса т при различных температурах (°0): 5(1); 13(2); 15(3); 17(4); 26(5). (Потенциал V = +80 мВ). На вставке показана зависимость среднего значения то от температуры. В пипетке физиологический раствор Ä; в камере HCl 100 мМ. g 30 пСм.

Рис. 5. (Медленный К+-канал). Зависимости от температуры вероятности нахождения канала в открытом состоянии Ро при различных потенциалах (в мВ): а) -40(1); -20(2); +20(3) б) 0(1); +40(2); +60(3). В пипетке физиологический раствор А; в камере KCl 100 мМ. g 30 пСм.

Э

На рис.5 приведены зависимости Ро от температуры, при различных фиксированных уровнях мэмбранного потенциала V.

В целом зависимости емэвт Н-образнув форму, которая наиболее явно Еыракзна при отрицательных потенциалах и при +20 мВ. В области более поло£итальнах потенциалов форма зависимостей сглаЕиваэтся. Вообще г.э наОладаэтся тенденция к росту Ро с увеличением температуры, однако практически для всех потенциалов в окрестности Т-15°С наблюдается локальный максимум, а при +20°С - локальный каигмум.

Для всех кинетических параметров, моено сказать, что повышение температуры Действует на кинетические характеристики медленного К+-квиала так ко как и повышение мембранного потенциала. КсклвчЗниэ составляет диапазон теьшэратури 10 + 20°С (в большинства случаев 12 17=С), в котором наблюдается немонотонное, аномальное поведэниа кинетических параштров. Иатересно, что в этом ле . диапазоне температуры имеет место и аномальное поведение токов (гл. I).

Глава 5. Влияние изменений температуры и потенциала на кинетические характеристики быстрого К+-канала и каналов • меньшей проводимости.

Если у медленного К+-канала наблюдается увеличение вероятности нахождения канала в открытом состоянии Ро с ростом потенциала и температуры, то у быстрого К+-квнала Ро соответствэнно падает (1;и растет, а и то уменьшается).

На рис. 6 приведены зависимости вероятности нахондения канала в открытом состоянии (Ро) от температуры и потенциала (быстрый К'-капал). Общей тенденцией здэсь является уменьшение Ро с росто» тегшрератури и потенциала. 1=15°0 является особой точкой - Ро достигает в ней своего локального минимума. Прием, если в области Т-0. + 15°С Ро слабо реагирует на изменения потенциала • (рис.б.в), то при температурах выше 15°0 потенциалозависимость становится значительной (рис. 6,6).

Что яе касается кинетики каналов малой проводимости (подтипов быстрого К+-канала), то для них, как и для подтипов малой проводимости медленного К+-канала характерно практически" полное отсутствие темпаратурозависимости и потенциалозависимости Р .

V,MB

Рис. 6. (Бистры® К+-канал). Зависимости вероятности нахождения канала в открытом состоянии PQ от температуры (а) и от потенциала (б, в). В пипетке физиологический раствор А; в камере KCl 100 läM. g <* 9 пСм.

Глава 6. Сходство в действии изменений температуры, потенциала и концентрации 1К+] . на активность К+-каналов

Выяснилось, что кинетика каналов данного типа одинаковым образом меняется с увеличением тока за счет изменения любого из следуицих параметров: 7; Т; [К*]^.

Общим следствием увеличения каждого из этих параметров является увеличение амплитуды тока через канал. Поэтому, более подробно была исследована величина 1/1 - (константа скорости закрывания канала) в зависимости от амплитуды тока (т_- средняя длительность одиночного шшульса тока).

На рис. V приведены зависимости 1/т от величины тока при четырех значениях потенциала. Ток изменяли еще и за счет изменения температуры от 0 до 45°С.

тт -

Рис. 7. (Быстрый К+-канал) Зависимости константы скорости закрывания канала 1 А от амплитуды тока

о

при различных потенциалах (указаны сверху). Ток изменяли еще и за счет изменения температуры в диапазоне 0+45°0 т.е. 1=1(V.T) В пипетке физиологический раствор А; в камере КС1 100 мМ. g 12 пСм. Фильтр нижних частот, 1 кГц.

Все значения 1/tq, соответствупцие различным потенциалам, лежат на прямых с разными углами наклона, сходящимися к некоторой точке 1/то=-76 с-1. Зависимости эти можно представить аналитически как:

1/т =K(V)I(T)+A, А=-7б с-1.

о

где K(V) - потенциалозависимая константа, значения которой приведены на вставке.

На рис. 8 представлены зависимости 1 /то от тока при различных значениях температуры, где ток изменяли еще и за счет изменения потенциала. Зависимости 1/а от I линейны, причем определенно, чувствительность величины 1/г к току падает с уменьшением температуры.

Аналитическое представление здесь:

1/то = K(T)I(V), где К(Т) -

температурозависимая константа, значения которой приведены на вставке.Из этого уравнения следует соотношение:

1 /К(Т) = tq*I = q =coii3t, где q -заряд проходящий через канал за время одиночного импульса тока.

К(Т) растет с увеличением Т. Это означает, что при высоких температурах небольшие изменения тока влекут ва собой значительные изменения актишости канала. Тем самым еид зависимостей приводит к предположению о наличии связи мезду амплитудой тока и константой скорости закрывания канала 1/г . 12 °

1/Ь.с

-20 О 20 U0 м8

1<У),*А

is т,"с

lA.-kW-Kv)

ГМ,лД

Рис. 8. Быстрый К+-канал Зависимости константы скорости закрывания, канала 1 /Т ОТ аМПЛИТУДЫ T0K8 о

при различных значениях температуры (указаны сбоку). Ток изменяли, еще и за счет изменения потенциала V от -40 мВ до +80 мВ, т.е.' I=I(T,V). А - g « 30 пСм (взято из работы (Казаченко, Геле-тш, 1984,д)). Б - g« 9 пСм. В пипетке физиологический раствор А В камере KCl 100 кМ. На вставке приведены значения температурозависи-мой константы к(Т).

На рис. д приведены зависимости 1/то от величины тока при различных значениях температуры и потенциала, в случае, когда ток изменяли еце и за счет варьирования концентрации [К ] {п.

2.0 l(Ki),nA

Рис. Э. Быстрый К -канал. Зависимости константы скорости закрывания канала 1/1 от амплитуды

о

тока при различных значениях температуры Т (°С), потенциала V (мВ) (указаны на рисунке) и концентрации [К+2,ге (в t.U): (KCl) 12,5; 25; 50; 100; 200, т.е l=I(T,v, [К*]4г1). В пипетке физиологический раствор А. g " 9 пСм.

13

изменения которой в неявном Еиде присутствуют на оси абсцисс. В отличие от зависимостей представленных на рис. 7 и рис. 8, здесь изменяются все три параметра: Т; У; СК+14г1.

Видно, что 1/то раотет о увеличением тока и о температурой, обладая тенденцией к насыщению при Т=5°С. Причем, все точки достаточно хорошо лежат на двух кривых, соответствующих значениям температура 5 и 25°С. Отсюда следует, что цри фиксированной температуре кввдому значению тока (а значит и связанной с током величине 1/то) могут соответствовать на кривой точки с различными значениями потенциала и концентрации (значения потенциала и концентрации на рис. д связаны соотношением: 1-Г(Т,У,[К+]1л)). Поэтому можно заключить, что 1/т явно связана лишь с величиной тока и с те!люратурой, или другими словами - в отличие от величины тока, которая определяется всеми тремя параметрами: Т; V; [К+]{п, константа скорости закрывания канала является явной функцией амплитуда тока и температуры. То есть 1/то=Р(1,Т). Причем, 1/т растот с ростом и температуры и с увеличением тока (за исключением областей насыщения, как например при низких температурах).

Из всего вышесказанного олэдует, что для потенциалозависшого быстрого К'-канала, параметр, характеризующий его активность - константа скорости закрывания канала 1/т в явном виде не зависит ни от потенциала ни от концентрации СК4"]{п.

1/т связана с амплитудой тока и с температурой: 1/то=Р(1,Т), то есть 1/т явная функция от I и Т. Это могет свидетельствовать лишь об одном: воротный механизм быстрого К+-канала из всех приведенных величин 1,У,Т,СК+]{п выделяет только амплитуду тока I и температуру Т.

Предварительные исследования, проведенные нами на медленных К+-каналах, так ке выявляют однонаправленность действия изменений Т,У,СК+}{п на кинетику канала. Правда, эти изменения вызывают противоположные по сравнению с быстрым К+-каналом аффекты.

Если у быстрого любые изменения Т,У, СК+ 31тг, увеличивающие ток, приводят к уменьшению ^ и к увеличению Х^, то у медленного наоборот: то и 1;п растет, а уменьшается (зона 12-И7°С как особая здесь исключается).

ВЫВОДЫ

Методом фиксации потенциала на изолированных мембранных фрагментах из нейронов ~ моллюска для медленного и быстрого 14

К+-канала, а также и для их подтипов меньшей проводимости установлено:

1) В целом, гон через одиночный ионный канал увеличивается с увеличением температуры в диапазоне температуры 0+40°С (О,„«1,5). Кажущаяся энергия активации ДЕ„ определяется на основании уравнения Аррениуса для всех исследованных типов каналов летит в диапазоне 4*12ккал/моль.

2) Значения ДЕд потенциалозавискмы, причем наиболее выражена она у каналов основной (наибольшей) проводимости.

3) В диапазоне температуры 10+20°0 наблюдается аномальный рост проводимости канала с уменьшением температуры или отсутствие зависимости проводимости от температуры. В этом же диапазоне температуры отмечается немонотонное поведение его кинетических параметров.

3) Быстрый К+-канал при Т>20°С характеризуется зависимостью АЕ&(У) приблизительно такой ев как и медленный" К+-канал основной проводимости в соответствующих условиях. При Т<10°С аналогия нарушается.

При температурах выше 20°С АЕа для каналов всех, типов, за исключением быстрого К+-канала основной проводимости слабо зависит от потенциала и имеет сравнительно низкое значение °«4 ккал/моль, соответствующее свободной диффузии ионов К+ в водном растворе.

5) Повышение температуры действует на кинетические характеристики канала так же как и повышение мембранного потенциала (диапазон 10+20°С здесь исключается).

Для медленного К+-канала и его подтипов меньшей проводимости, длительность пачек импульсов 1; и длительность одиночных импульсов тока то увеличиваются, а длительность мевпачечных интервалов ^ уменьшается с ростом температуры и потенциала.

Для быстрого К+-канала и его подтипов меньшей проводимости ситуация обратная - ^ и то уменьшаются, а 1;„ увеличивается с ростом Т и V. <210 для кинетических параметров может достигать «15.

В диапазоне температур! Ю+20°С наблвдается как немонотонное поведение кинетических параметров так и резкая смена характера их зависимостей.

6) Совокупность данных позволяет сделать предположение о наличии структурных перестроек (фазовых переходов), происходящих в системе канал-липидный мзтрикс.

7) Дня Есэх исследованных типов каналов обнаружена

связь температурозависимости и потенциалозависимостиих активности. Именно, если канал по каким-либо причинам не имеет тешературозависЕмость, то у него отсутствует и потенцйалозависимость кинетики, В случае se наличия температурозеввисгагасти, наибольшая потенциалозависимость его кинетических параметров нвблэдается икэшга в той зона температур!, где имеет место и наибольшая их потенциалозависимость. Для подтипов быстрого и медленного К+-каналов меньшей проводимости отмечается тенденция к одновременной потере как текпературочувствятельности, так и потенцизлозависиыости с уменьшением проводимости канала.

8) Для быстрого К+-канала обнаружено сходство в действии на его активность изменений потенциала, температуры (зона 1020°С исключается) и концентрации [К+]{п. Именно, любые изменения этих параметров, ведущие к увеличению амплитуда тоне, приводят к однонаправленным изменениям соответствующих кинетических параметров.

Более того, установлено, что константа скорости закрывания канала I/io определяется только величиной тока I и температурой Т и в явном виде не зависит ни от потенциала ни от концентрации [К+], . .

{п .

Предварительные исследования для медленного К -канала приводят к аналогичному выводу.

9) Явная зависимость константы скорости закрывания канала 1/то от тока I и температуры Т, а также вся совокупность полученных результатов позволяют сделать предположение о возможном механизме функционирования ворот канала.

Именно: функционирование воротного механизма канала определяется анергией, дассигшрующей в виде тепла при прохождении конов через канал. Влияние этого тепла, на "ворота" может Сыть либо пряшм - на белковую глобулу канала с соответствущнм изменением структуры, либо опосредованным -через изменение физических параметров бислойного матрикса, окружающего канал.

Список опубликованных работ по теме диссертации. Цееб В. Э., Телеман В. Я., Кавспенко В. Н. Елияние изменений температуры на функционирование одиночного К+-канала в нейронах моллюска. Аномальные эффекты// Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологичеоких и рецепторных процессов (Тез. докл.) Минск. 1988. С. 142.

Галеток В. И., Кааахенко В. В., Цееб В. Э. Квантованность кинетических параметров одиночных ионных каналов// Докл. АН СССР. 1Э88. Т.301. N2. 0.465-469.

Цееб В. Э., Гелетюк В. И., 'Казаченко В. Н. Температурная зависимость проводимости медленного К+-канала в нейронах моллюска// Биол. мембраны. 1Э89а. Т. 6. С. 1102-1111.

Цееб В. Э., Гелетюк В. И., Казсыешо В. В. Сходство в действии изменений мембранного потенциала и температуры на активность К+-каналов в нейронах моллюска// Одиночные ионные каналы в биологических мембранах (Тез. докл.) Кара-Даг. 19896, 0. 99.

Кааачешю В. й., Гелетюк В. И., Цееб В. Э.

Влияние изменений температуры на проводимость калиевых каналов олигомеров различного порядка// одиночные ионные каналы в биологических, мембранах (Тез. докл.) Кара-Дат. 1989.

•Цееб В. Э., Гелегпок В. Я., Казаяенхо В. Я. Сходство в действии температуры, мембранного потенциала и концентрации К+ на активность К+-каналов в нейронах моллюска// Ионные каналы в биологических мембранах (Тез. докл.) Кара-Даг. 1990. С. 99.

Г.С7.9Г г. Сяк. 342ГР Тир.ГЛ5 экз. Уч.-изд.д. 1,0 Отпечетано на ротапринте в ОНТИ ШН