Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ионизирующего излучения на замещение циклических нуклеотидов и активность цАМФ-зависимых протеиназ в лимфоидных клетках крыс

ВАК РФ 03.00.08, Зоология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ионизирующего излучения на замещение циклических нуклеотидов и активность цАМФ-зависимых протеиназ в лимфоидных клетках крыс"

НЛЦ1 ОПАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРА'/ИИ 1 НС'ГИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОI ПАТОЛОГ 11, ОНКОЛОГ 11 I РАЛЮБЮЛОПК 1м. P.e. КАВЕЦЬКОГО

На правах рукопису

НАЛЮВ1НА ОКСАНА еВГЕН11ВНА

ВПЛНВ ШПЭУЮЧОГО ВИПГОКНПОВАИИЯ IIA BMICT ЩПШЧШК 1ГУКЛЕОТИД1В I ЛКГИВШСТЬ цДМ-5—ЗЛЛЕЖ1ШХ riPOTE'fliKIIIA3 В Л1М40Щ1ИХ КЛШЯ1АХ ЩУР1В

03.00.08.- рад1об!ОЛОГ1Я

Автореферат дисертацП на здобуття паукового ступеня кандидата 01олог1чних наук

КИ'/В - 1995

Дисертащию с рукопио Робота виконана на кафедр1 öioxlMi'i 61олог1чного фа!?ультету Мпвського утверситету iM. Тараса Шевченка.

Науковий KepiBHiiK - чл.-кор.ПАН УкраЧни, доктор б1олог!чних наук, професор М.С. Кучеренко;

ОфщШй опоненти :

доктор медичних наук, професор В.А. Барэбой

доктор медичних наук, професор и.О.Шляховснко

Провiдна установа - Ки1вський державний мёдичний ун1вераггет 1м. О.О.Богомольця

Захист в!дбудеться "_"_ 1995 р о _ годинi

на аас!данн1 crieuianiaoBano'i вченоИ ради Л 01.83.01. в 1нститут1 екопериментально! патологii, онколог i'i 1 рад!о01ологП 1м. Р.6, Кавецького МЛН Укра'иш (252022, м.Ктв, вул. Васильк1вська, 45).

Э дисертац1ею можна оэнайомитися в науков1й б1бл1отец1 1ЕП0Р HAH Украши.

Автореферат роз1сланий "_" _ 1995 р.

Вчений'секретар

спец1ап1совано1 вчено! ради Г.Й. Лаврснчук

кандидат <51олог1чних наук

\

ЭАГЛЛЬНЛ ХАРА]СТЕРИСТШ(Л РОВОТИ

Актуапыпсть проблеми. Важлиаим фактором, який визначас. за-коном1рност1 рад1ад1йного у ранения оргшизму, е рад1очутливють тканин, opraniB i систем, HKi в1дпов1дають за виживання организму (Ярмоненко, 1981, Кудряшов i.Беренфельд, 1982). Морфолог1чн1 доо-лтдкення показали, що найб1льш радючутливими е кровотвсрн1 та л!мфо1дн1 органи. Вращения к1сткового мозку, тимусу, селезИти та л1мфатичних ByaJiiB становить одни з найважливш1х проявив гостро-i'o променево^о захворювання (Белоуссва, 1979, Жербин, 1909).

Причинами 1мунодефщиту, який розвиваеться п1сля опром!нен-ня, в 1нтерфазна загибель, пошкодження функцп та м1град1йних властивостей л1мфоцит1в (Ярилин, 1908, Anderson, 1976). Постпро-менева патологia nosepxHi л1мфоцит!в, пов'язана з втратою мемб-ранних рецептор1в, може бути одним з важливих фактор1в наступного зниження функционально! активности та деградацП цих кл1тин. Тест на здатн1сть л!мфоцит1в вступати до бласттрансформащ! п1д впли-вом пол!клоналышх MiTorenin це - ].нтегральний показник, який ха-рактер1эуе функщональний стан iMVHHO'i систем» при piannx патоло-ггях. таких як первишй I вторинн! 1мунодеф1ц1тн1 стали, аутоат-ресивнi захворювання та пухлиннийф1ст (Хоробрых, 1982). Зм1на ДНК-синтезуючо! здатност! л1мфоцит!в при onpoMinenni моле бути виэвана дефектное™ самих кл1тин або зм!нами сп1вв1дношенъ р1зних субпопулящй Л1мфОЦИТ1В.

KpiM пригн1чуючо! ди опромшення на л!мфоцити pmicanl.. про-тилежн1_ реакцП кл1тин - активац!я, диференц!ац5я,' п!дсилення секрецП гуморалышх фактор1в (Шарый, 1986, Hoppe, 1989). Ця р!з~ новидн1сть ефект1в обумовлена особливостями молекулярних проце-ciB, як1 1ндукуються опром!ненням в дшфоцптах. На тепер!шн1й час до кшця не досл1джене питания про природу ф1зико-х!м1чних проце-

с1в, як1 приводить до 6ioxiMi4HHx та ыорфолог1чних ЭМ1Н л1мфо1д-

них кл1тии i, в решт1-решт, до ix загибел1, а також до змши ix

функщонально! активност1 або пострадхавдиного вадновлення. В

зв'язку а тим значний iHTepec являе цАМФ-залежне фосфорилювання,*

яке ваймае ирсшдне положения в регуляцП багатьох внутршньокл1-

Чинних процес!в, катал1зуючи реакци фосфорилювання р1зних бхлко-

вих су0страт1в (Новикова, 1995, Farrar, 1985). Б1олог1чна роль

цЛШ>-залежннх протеШиназ полягае в регуляцП внутрШньогслгтин-

них процес1в та специфгчному контрол1 за д1ею найважливших фер-(

ментативних систем (Dei 1 et. а]., 1988). Вивчення .зиникнення та розвитку pisniix порушень на молекулярному piBHi, з'ясування меха-HiaMiB smIh проте!нк1назно1 активное?! при pa^iauifravix впливах на организм - акту алый та важдив! завдання сучасно'1 рад1об1слог1'i.

b доетуший нам л1тератур1 е тгльки иоодинокг роботи про вплив радХацп на активн!сть цАШ-аалежних проте1нк1наз та ix ро-гуляц1ю. Вивчення молекулярних MexanisMiB функцшнування А-к1назй ■л!мфоцит1в в умовах ироменевого ураження може в1д1грати важливу роль у визначенн! причин, як1 приводить до змйш функцюнально! aiiTHBHOGTi або загибел! клхтини.

Мъта i задач! досл1даення. Метою дакого досл1джоння було нивчення впдкву рентгенiBCbKoro вкнромшенкя в дозах 0,5 1 1 Гр на функц1онування систем« цАШ>-залежного фосфорилювання 01лк1в л1мфо'1'дних юатин inypiB. Для досягнення поставлено} мети до-зав-дань роботи входило :

1. Вивчпти функц1ональиу иктивн1сть л1мф01дних кл1тин тимусу t селезтки ii^/piB п1сля опрокинення .

К. ОцИшти вплив рентген!вськогб опром1нення на фуикщону-вання адекглатциклавно'! оистеми в л1мфоцитах.

3. йид!л:1ти цШЬ-запежну проте'шиназу з дтфоцтчв конт-

рольних та опром1нених шур!в, вивчити денк1 II ф1зико-х1м!чн1 та катап1тичн1 властивост1.

4. Визначити к1нетичн1 характеристики ферменту в контрол! те шсля опром!нення.

5. Досиидити особливост1 регуляцп активное?! цАШ-залежно? протехнкднаэи, видыено! з л1мфоцит!в контроль них та опроы!нених

- тварин.

Наукова новизна 1 практична значим!сть роботк. Встановден! • пострад!ац1йн! порушення функщонально! активное?1 л!мфо'1дних юптин тимусу та селез!нки щур1в п1сля вплизу рентген!вськими променями в дозах 0,5 1 1 Гр. Вперше проведено в них умовах комп-лексне досл!дхення функц1оиування аден1латциклазно1 систем» та системи цЛМ1>-залежного фосфорилювання в л!мфо1дних кл!тинах. Дослужено вплив рад!ацП на ф1аико-х1м1чн1 властивост! та регулящю активност! цАМФ-залежно! проте1нк!нази, ' ввд!лено1 а л1мфоцит!в селезижи щур1в через 12 годин п1сля опром!нення. Показано,_ то оснош!ий внесок в вияслен! гпсля опромшення порушення в функщо-луванн! цАМ5-залежного фосфорилювання з л1мфоцитач щур!в припадав на порушення взаемодП ферменту з бьчковим субстратом фссфорилга-вання та основним активатором фосфотрансферазно! реакцП - цик-л1чним аденозинмонофосфатом'.

Одержан! в робот! результата сприяють б!льш повному розум!н-ню б1ох!м1чних механ!зм1в розвитку променевого вракення орган!з-му. На основ! встановених молекулярно-кл!тинних механ1зм1в порушення функщонування системи цШФ-залежного фосфорилювання 6!лк!в можна эд!йснювати розробку заход1в по ц1леспрямованому впливу на ц! зм!ни з метою 1х корекцН. Результата досл!джень можуть бути покладен! в основу при розробц! науново-обгрунтованих шлях!в створення ефективних сполук, здатних модиф!кувати д1ю !он!зуючо!

радцацп.

Положения,як! виносяться на захист. 1. Шд вшитом опроки-нення в дозах 0,5 та 1 Гр розвиваеться пригнгчення розеткоутворю-ючо"1 здатност1 1 зростання бласттрансформац! Г, як1 характеризуют^ суттевг бм!ии функц1снально'1 актишюст! лгмфоцитгв тимусу та ,се-лез!нки щурхв 2. Пострад1ац1йна дисфункц!я аден1латциклазно1 сис-теми с.упроводжуеться залежним В1Д дози рад!ац1! пригн1ченням активное^ иДМФ-залекно! проте^шанази, зншенням П спорЦненост! до г1стону ' Н 2В та эбоьшенням спор1дненост1 до цАМФ, яке гид внливом автофосфорилювання холоферменту зм1нюеться знижешшм його зв'нзування 8 цАШ>.

Апробащя роботи. 0оновн1 положения дисертацншо! роботи буди представлен! i повгдомлен! на Рад1об1олог1чному в''¿едх (Кшв, 1993), на кижнародн1й конференцп " Навколишне середовище 1 здо-ров'я" (Чери1вц1. 1993), на пауков 1й конференцП професорсь-ко-викладаиького складу КиЧвського уи1Еерситету 1м.Тараса Шевчен-ка (Ки1В,1993), на 1 а'13Д] Укра'шоького б!оф1зичного товариства •(Ки'1в, 1994), на зас1дали1 кафедри б!ох1м!'] Кшвського ун1верси-

Тй'1'У.

Впровадження. Матер¿али дисертац!йно1 роботи використовують-ся в курсах лекщй ■ "Рад1ац1йна 61ох1м1я" КиТвського университету 1м.Тараса Шевченка.

Публ1кацП. По тем! дисертацП опублисовано 7 робхт.

Об'ем 1 структура диопптацП. Диоертац1йна робота складаеть-сл а вступу, огляцу л!тератури, матер1ал1в ! мето;из досл1дження, результатов роботи та !х обговорення, заключения, висновк1в,

- в -

списку л1тератури, що складаеться з 285 poöiT. Дисертац1я викла-дена на 170 стор., мае у своему склад! 26 рисунк1в та 9 таблиць.

МЛТЕР1ЛЛИ I МЕТОДИ ДОСШДШЬ

В досл1дхеннях використовувгиш б1лих щурхв-самгдв вагою 130-150 г.Тварин опроканювали на установи! РУМ-17 в дозах 0,5 i 1 Гр за умов : потулнйсть дози в noBiTpi 24,5 сГр/хв, ф!льтри 0,5 мм (Си + AI), напруга 200 кВ, сила струму.5 мА, в!дстань до по-Bepxiii иМри тварин - 50 см.

Тимус ! селез!нку перетирали через 4 шарн нейлоново! с i тки у середовище 199. Фрагацю л1мфощтв селез1нки отримували центрифу-гувакням кл!тинно! cycneH3i"i на град!ент1 Ficoll-Paque (густина 1,077) за методом (Boyum, 1968).

Стан системи кровотворення оцпловали за такими морфолог1чни-ми показниками : илыисть лейкоцитгв в 1 л KpoBi i сп1вз!дношен-ня р!зних форм лейкощтв, як1 визначали в пофарбованих мазках кров i.

Фунюдональну активМсть л!мфоцит1в. оцпгювали в реаклдях Е-розеткоутворення за методом (Jondal, 1972), спонтанной шйтин-но! UHT0T0KCH4H0CTi за методом (Гордиенко, 1984) i бласттрансфор-мацП за методом (Knox, 1982). Кл1тини (2х10б iui/мл) !нкубуваяи з м1тогенами : конканавал1н A "Sigma" (Кон А) у концентрацП 10 мкг/мл, ф1тогемаглют!н!н "Sigma" (ФГА) - 12,5 мкг/мл, л1попол1с.а-харид "Sigma" (ЛПС) - 50 мкг/мл.

Визначення вм1сту циШчних нуклеотид!в в лшфо!дних iuiiтинах проводили за методом (Steiner, 1972). Активюсть фосфодиесте-рази цикл1чних нуклеотид!в визначали за методом тонкошарово! хроматограф!! на пластинах Silufol (Лазаревич, 1979). Активн1сть гу-ащлатциклази визначали за методом посл!довно! хроматограф!! на

колонках AI2Q3 i Dawex (Nakasava, 1976). Активн1сть аден1латцик-лази визначали за методом (White, Zenzer, 1974).

Вид1лення npeiiapaTis цАМ>-за«ежних протеши наз з лшфоцнтхв селезенки щур1в проводили но модиф!кованому методу (Greengard, 1979) з вжористанням лШйкого град!ента концентрацП кал!й-фос-фатного буфера при елюц11 ферменту з ДЕАЕ-целюлози.

Визначення активноот1 цАМФ-залежних-проте!нк1наз з л1мфо'1д-иих кл1тиц селез1нки щур!в проводили за методом (Gill, Walton, 1979). Про"" активнгсть ферменачв судили по включению 32Р з (г-згР)-АТФ в riCTOK Н 28. 1нкубацИше середовище ;.ля визначення npoTe'iKKiHaaKo'i активност1 в загадьному об'ем! 0,1 мл Micrano : 25 мМ трио-HCl, pH 7,4; 10 мМ MgCl«; 10 ыМ ДТТ; 10 мг/мд ricTOiia Н2В; 0,3 мг/мл б1лка; 5х10~5 М (г~32Р)-АТФ (8-10 х 104 Бк) в пробу. Час 1нкубацП 5 хв при 37° С. Реакщю зупиняли при 4° С з наступним нанесениям проб на диски з ф1льтрувально1 бумаги "■Идь-трш? FN-23" , HKi промивали за методом (Гривенников, 1979). Радхо-

активн!сть вим!рювали в толуольному с.цинтилятор1 ЖС-103 на pi* * 1

динно-сцинтиляцхйному л1чидьнику "Delta-300". Питому активн1сть фермент!в виражали в пмоль 32Р за 1 хв на 1 мг быку.

Бквчення зв'язування 3Н-цАМФ з цАШ-залежними проте'1нк1наза-ми проводили еа методом (Ульмасов, 1980). 1нкубац1йне середовище в загалъному об'см1 0,1 мл м!стило : 30 мМ кал 1й-фосфатний буфер; 10 мМ МцС12; 2х10~б М цАМФ (7-10 X 102 Бк); альбумш 10 мг/мл; 0,5-1,0 мг/мл ферменту. Час 1нкубацП 5 хв при 30° С. РеакцШ ау-ниняли нанесениям сум1ш1 на ультрафыьтри з д1аметром пор 0,23 мкм з подаяьшим ф1льтруванням. Ф1льтри промивали 3 рази буфером, що м1стив : SO мМ кал!й-фосфатний буфер; 10 мМ М£Й2' 10 мМ ДТТ; pH 6,8.

В экспериментах по автофосфорилюванню використовували мето-

дичн1 рекомендацП (Ульмасов, 1980). Досл1дження здзбностГ холо-ферменту .до автофосфорилювання проводили в iiiKyOayl иному сер^до-Binni загальним об'емом 0,1 мл сл!дуючого складу : 0,1 М Трис-HCl, рН 8,7; 10 мМ MgCl2J 2 мМ ДТ'Г; 80 мМ NaGl; ферменту 0,05 мг/мл; О мкМ АТФ; (г-32Р)-ЛТФ (9х103 Бк) i, де вказшп В1дпов1д1п концентрат, i цАШ. 1нкубац!ю проводили яротягсм 30 хв при 30° С. Реакцш вупиняли при 4° С.

Визначення бглка' в препаратах piaHo'i нрироди проводили за методом (Lowry, 1951).

К!нетичну оброб"у результат1в проводили за модиф!кованою програмою "ENSFITTER".

Статистичну обробку результатов та побудову граф!icin проводили на IBM PC Е'Г з використанням стандартных пакетов прикладник програм.

РЕЗУЛЬТАТ!! ТА IX ОБГОВОРВШЯ

Морфологi4Hi дссл!дження показали, ц;о нзйб1лыгою радЛочутли-BicTio характер!зуються кровотворн! i л!мфо1дн1 орган» (Груздев, 198В, Шубик, 1989 ).

Анализ даних по вивченню к!лькост! та сШввЛдьллення кл!тен бьто! upoBi дозволив встановити, що опром!нення в дослЛдкуваних дозах " приводило до зниження к!лькост1 лейкощтв в периферичн!й KpoBi тварин. Ефект мав дозозалежний характер.

Вивчення сп!вв!дношення клЛтинних елеменг1в Kposi в контрол1 i п!д fliera-!он!зуючо! рад!ацп показало, щр наЛб1льш виражен! 3MiHH характера! для нейтроф1л1в i л1мфоцит!в. К!льглсть нейтро-фШв з розвитком пострад1ац!йно! динам!ки п!двищувалась, а л!м-фоцит1в - знижувалась.

При характеристик функц1онального стану л1мфо'!дних :слп'ин

- е -

тимусу 1 селеэшси щур1в ми використували реакцИ спонтанного ро-

V

зеткоутворення та бластно! трансформацп л!ыфоцит1в.

При постанови! реакцП спонтанного розеткоутворення наш були отриман! даш, як1 св1дчатъ про 1стотн1 порушення розеткоутво-рюючо! здатност1 доаглджуваних кл1тин п1д впливом 1он1зуючо! ра-д1аци (табл.1).

Виявлек! Bi.il ни були однотиповими як для спленоцит1в, так 1 для тимоцит1в. Причому з п!двщенням дози опром!нення к!льк!сть розеток статксткчно знижувалась. Найб1лыа значне зниження (на 300 7>) розеткоутворюючо! здатност! нами було в1дм1чено для спленоци-т1в через 6 годин п1сля опром1нення експериментальних тварин в доз! 1 Гр.

Вхдм1чен'=! порушення розеткоутворюючо! здатнослч л1мфоцкт!з в ус! пер!оди спостережень, мабуть, може бути пов'язане з втратою поверхкевих рецепторгв Т-л1мфоцит1в. Рання постпроменева змша рецецтсрних фушсцгй мембран лгмфощтв е характерно» 1 пост1йною ознакою IX променевого ураження (Сунгуров, 1988).

При вивчешп реакцП бластно! трансформацп л1мфоцит1в селе-з!нки 1дур1в нами було показано зростання спонтанно! ДНК-синтеэую-чо! активност! при опромшеши. Максималышй стимулюючин ефект 1он!зуючого випром).июваннн (260 X) був вкявлений через 6 г п!сля опром!нешш в доз1 1 Гр (рис.1). Ми досл!джували як нестимульова-ну прол1феративну активн1стъ лХмфощтв селез!нки щур1в в умовах одноразового рентген!вського опром!нення в дозах 0,5 1 1 Гр, так 1 ефект опром1нення на фон1 стимуляцП м!тсгеном.

Показано, що через 6 г пхсля опром!нення в досл!джуваних дозах мхтогени сгимулюють включения 3Н-тим1дину в ДНК досл!джуваних~ юйтин по-р!зному. Кон А виявие б!льш виражену стимуюючу д!ю (290 %), до того ж ефект збер!гався з тдвшценням дози опром1нения

«о-

Щ

ц=иЬ

2 3 4

1

13 3 4

- з-«

АО<Н

400

У 2 Э *

II Ш

рЧ!

1

I

12 9 4

Рис.1. Включения эН-метилтим!дину п ДНК л!мфоцит1в селез1шси шур!в через 6 (Л)*! 12 (Е^ годин п!сля опром1нення в доз! С,5 (1) та 1 Гр (II)

По ос! аОсциг; 1 - спонтанна ДНК-сянтезуюча актипШсть: стшульов&ча - 2 - ФГА; 3 - Кон А; 4. - ЛПС По ос! ординат: 7. ачтивацП пролЪ}еративнс'1 г\ктивиосг1 _ л1мфоци-т!в опром1ненням ! >.птогенам;: (контроль прийнятий ел 100 7.).

ТаОлиця 1.

К!льк1сть Е-розеток, утзорвних кл!тинами селез!нки ! тимусу щур!в в пострад!ац!йн!к динам!ц! ,М1гп; п-10

1 ■ '■ I Групп Iтварин 1 1 Терм1н п!сля| опром!нення | 1 Тимсццти | 1 Сплсноцити 1 1

1 |Контроль 1 1 6 год | 12 год | 2Л,7±0 3 1 34,2+2,9 | 1 26,7±2,4 \ 20,3±0,в | 1

1 10.5 Гр 1 1 6 год | 12 год | 1в,8±2,8>'.| 25,7+1,7*1 1 22,0±4,0 | 11,8±0,7* ' | 1

1 11 Гр 1 I 6 год | 12 год | 1 х 1 15,3±2,3 | 30,0±2,8 | I 1 9,0±0,9 | 13,2Ю,4* ! ______ ,,,,.. , , 1

* - р!эниця з контролем в!рог!дна (р<0,05)

(рис.1). Виявлен! в!дм1нност1, можливо, обумовлен! там, що Кон А 1 ФГА вплизають на р!зн1 субпопуляцП л1мфоциг1в. Пре1ккубац1я л1мфои.ит1в з В-кл1тикнш м!тогеном (ЛИС) також викликала дозоза-лежне п!дсилення прол1феративио1 в1дпов1д! (220Х при 0,5 1 390% -при 1 Гр). Через 12 г п1сля опром1нення в тих же дозах стимулююча д1я м1тогек1в виражена менше. Нами не виявлен1 в1дм1нностг в

здатност! л1мфоцит!в до синтезу ДНК при стимуляцП кл1тин р1зними • ^

м1тогенаш. Це пов'язано, мабуть, з тим, що з розвитком радхащй-но1 динам ши вхдбуваються структура! та функц1ональн1 порушення в л1мфоцитах опром1нених щур!в. Кр1м того, може змш^ватись чутли-в!сть кл!тинних рецептор1в безпосередньо до самого м1тогену.

Б!ох!м1чн! реакцп', як1 змпдоють метабол!зм л!мфоцит1в, в посгпроменевн! динакиЦ вивчен! недостатньо. В1домо, що систем! циюачних^ нуклеотид!в властивий ун1версальний характер в1дпов1д1 на вплив р1зних екстремальних фактор1в, в тому ч!сл1 ! опромгнен-ня (Федоров, 1979, Соболев, 1987). Тому, можливим пгдходом до ви-яснення найб1льш рад1очутливих ланок даного регуляторного меха-н!зму е, з одного боку, вивчення динам!ки вм1сту цАМФ 1 цГМФ, ре-гулюючих прол!ферац!ю ! дгферетцацш Л1мф01дних кл!тин (Владимиров, 1988); з другого - особливостей функц1онування фермент!в !х синтезу ! г1дрол1ау в л!мфоцитах тимуса 1 селез1ики щур1в, яких опром1нювали одноразово в дозах 0,5 1 1 Гр.

Нами було показано, що опром1нення тварин приводить до зм!н вм!сту цишачних нуклеотид1в. Шсля впливу в доз1 0,5 Гр в!дбува-еться поступове а часом зниження цАМФ 1 п!двищення цГМФ (в 2 рази) в спленоцитах (табл.2). Подальше гадвищення дози,опром1нення посилювало зниження Ем1сту цАМФ в ус! дослдауван! перюди 1 приводило до зниження р1вня цГМФ.

,, Таблица 2.

Пострад1ац1йн1 зм!ни Ем1сту цищичних нукдеоткд!в ( цАШ та цШ> в пмоль/107 ) кл1ткн в л1мфоцитех селеэ1нки Л тимусу щур!в (М±т; п-8).

1 I Групп 1 тварин 1 Ем1ст циклХчни): нуклеотид1в |

| спленоцити ткмоцити | | ЦАШ> цГМг цАШ/пГШ> ЦАШ цГМЭ цАМЭ/цГМЗ|

| Контроль 25,5+3,5 1,5+0,3 17,0 11,8+1,8 3,0+0,9 3,7 |

1 0,5 Гр

1 6 год 1 12 год 21,8±5,8 3,0+0,8* 7,0* 12,1+3,4* 3,5+1,0* 3,5* 4,5±0,б* 1,5+0,3 3,0 | 3,5±0,5* ' 2,1+0,7 1,7*1

1 1 Гр

1 6 год 1 12 год 12,8±2,3* 0,8±0,2* 16,0 3,0+0,4* 0,8±0,2* 3,7 | 15,6+3,5* 0,6+0,1* 26,0* 12,8±1,7 1,0+0,03* 12,8*|

ТаОлиця 3.

Пострэд1ац1йн1 эм!ни активност1 ферментов синтезу таг1дрол1зу цикд1чних нуклеотщЦв в л!мфоцитах селев!нки щур!в (М± п; п-8)

1 |Групп |тварин 1 ! • 1 1 Активн1сть ферыенИв пмоль/м1н кг белка | Аден: лат Гуаниат "Чэсфодиестераза I циклаза цикиаза цАШ цГКИ |

1 ¡Контроль 1 г 30,0+ 1,9 1,9+0,2 1668,3±259,5 0,517+0,02 1

1 |0,5 Гр. 1

1 16 год 112 год 1 61,2+4,9* 6,4+0,3* 4485,7±962,2* 0,668±0,2- ) 39,1+1,8* 6,2+0,2* 2904,3428,0* 0,658+0,2 |

1 ! 1 Гр 1

1 16 год 29,7±0,6 0,77+0,2* 3504,3±165.4* 0,663+0,1 I

I12 год 30,5±0,5 а,07+0,07* 1121,0+115,0* 0,994+0,01 |

* - р1аниця з контролем в1рог1дна (р < 0,05)

Лнал!з даних по вм1сту цикл1чних нуклеотид1в в тимоцитах показав, що опром1иення приводило . до зниження обох метабол!т1в практично в ус! досл!джуван! доэи 1 строга (табл.2). Можливим по-" ясненням в1дм1нностей в характер! зм!н метаболично! з1дпов!д! спленоцит1в ! тимоцит1в на вплиз рад!ацП може бути р1зний попу-,'ляцтшй склад кл!тин досл1джуваких орган!в.

Для нормального функщонування кл1тин необх!дне оптимальне значения сп!вв1дношення цАМФ/цГМФ'(Кисельгоф, 1992). Зг1дно одер-жаних даних, п!сля опром1нення тварин в доз! 0,5 Гр в1дм1часться зниження в1дношення цАШ>/цГШ> в спленоцитах 1 тимоцитах щур1в. Зменшення даного показинка вкаэуе на мокливе п!дсилення в юпти-нах ЦГМФ-залежного механ1зму регуляц!! метабол1зму, д!ючого як позитивний сигнал, який п1дсилюе юитинну прол1ферац!ю ! нригн!-чуе диферещцацш (Муксинова, 1990). Через 12 г п1сля опром1нен-ня в доз1.1 Гр в1дм1чено р1зке збоьшення даного показпнка. П1д-вищеиня р1вня ендогенного цАМФ може бути причиною гальмування функционально! активност! л!мфо!дних шатии,' що може привести до порушення процес1в !мунорегуля1Ц1 (Владимиров, 1991).

Наступним етапом наших дослхджень було вивчення активност! фермент!в. як1 тдтримують концентрац!! цшоичних нуклеотщцв в кл1тин1 - адшилатциклази, гуаШлатциклази ! фосфодиестерази цАМЗ ! цГМФ.

Опромгиення в доз1 0,5 Гр приводило до п!двщення активност! вс1х досл1джуваних фермент!в в спленоцитах (табл.3). 1з эб!льшенням дози зм1ни в систем! цАМ<1> в1дбуваються, головним чином, за рахунок зб1льшення активност! фосфодиестерази, а в систем! цГШ> - внасл1док зменшення активное^ гуан!латциклази. Можливо, виявлен! в пострад!ац!ший динам1Щ зм1ни ' вм!сту

цАМФ i 1(ГШ> мсжуть бути пояснен! порушеннями в функц1опуванн1 ферментативних систем.

При onpoMinenHi в доз! 1 Гр ступ1нь порушень в систем! цАШ гпдсилювався, але був аналог1чним при опром!нешп в доз1 0,5 Гр (табл.3). Cnociepirajiocb pisice зниження активност! гуан1латцигла-зи при практично незм!нних значениях активност! фосфодиестерази цГМФ.

Порушення, як! ми спостер1гали в систем! щтопчних нуклеоти-д!в, можутЬ пикликати в!дпов1дн1. зм1ни в тих структурнпх ! функ-цюналышх б i л как, активн!сть яких контролюеться даними. факторами. ' Важливе Micue серед таких 6iJiKiB займають протешкгнази, як! зд!йснюють фосфорилювання бьчкових субстрат1в (Северин, 1985).

В1Домо, що цАМФ-залежн1 проте!нк!нази вЩграють важливу роль в регуляцП метабол!зму в piamix тканинах i кл1 тинах, в тому числ! ! лимфоцитах. Кр1м того, оск!льки при промеиевому ураженк! мае Micue глибоке порушення метабол1чних npoueciE в л1мфоцитах, актуальним е вивчення властивостей i MexanisMiB регуляцП цАМФ-залежних проте!нк!наз в л1мфо!дних шптинах селез!нки щур1в. OnpoMiiiennH в досл1джуваних дозах приводило до зниження фермента-тивно! активное^ на 32 X i 55 % в!дпов1дно.

Вивчення внутршньокл iTi'iinoi локал!зацП ферментативной активност! показало, що бЗльша частина активност! восереджена в ци-тозол1 (мембрани : цитозоль - 20% : 80%). Тому нами з розчшшо! фракцП' л!мфоцит1в на колонщ з ДЕЛЕ-целлюлозою була вид!лэиа (л1н1йним град1ентом кал!й-фосфат!юго буфера) i часткоЕО очищена цАМг-залежна npoTeiiminaaa. Профт елюцП ферменту, вщцлепого з контрольних i опромгнених тварин, не мали в!дмтностей. Шк ферментативного препарату елюювався з колонки при т1й сашй !онн!й сил! 0r2-0,3 М кагпй-фосфатного буфера.

Для подальшого вивчення вшшву päfliaui'i на систему цАМФ-за-лежного фосфорилювання нами були вибранЛ оптимальн! умови прот! кання фосфотрансферагно! pearau'l: дослЛдження залежносп актив-ност! вЛд часу !нкубацп i концентрацП ферментативного быку показало, що максимальна активность ферменту спостер1галась через 5 хв Меля початку реакцП при концентрацП Ылка 0,05 мг/мл.

Результата досл1джень деяких каталггичних властивостей фермента показали, що рентгек1вське опром1нення в дозах 0,5 i 1 Гр не викликало зм1н в залежностх активност1 фермента В1д концентрацП ioHlB водню : оптимум pH при доелдаени! в рЛзних буферних системах збер1гався в областЛ 7,2-7,5.

Експериментально доведено, що для активацП досл!джуваких протеидназ необхвдй pi3Hi концентрацП цАМФ (Кондратюк, 1992). Одержан! нами дан! в!дносно залежност1 вид!леного ферменту в1д концентрацП цАМФ свЛдчать про те, що з пЛдвиденням концентрат! цнклЛчного нуклеотиду до 5х10~6 М, активн!сть ферменту максимально зростала як в контрол!, так ! через 12 г п!сля опром!нення в дослЛджуваних дозах (рис.2). При цьому опром!ненкя в доз! 1 Гр приводило до зб1льшення активуючо! дП цикл!чного аденозинмоно-фосфата.

цАйлФ-залежна проте!нк!наза - фермент, який мае два субстрати реакцП : донор фосфатно! групи - АТФ та акцептор фосфату - 6i~ лок. В системах in vitro як б1лковий субстрат частое всьго вико-ристовують гiстони (Azhar, 1989). Для досл!джуваного ферменту кращим субстратом виявився ricTOH Н2В. Залежн!сть активност! ферменту вивчалась в flianaeoni концентрац!й г!стону Bifl 0,1 до 1 мг/мл. Опромшення приводило до суттевих порушень у взаемодП ферменту з даним субстратом (рис.3). Вадбуваеться зменшення спо-puumnocTi фермента до ricTOHa H2B, що приводить в свою чеогу до

зменшення максимально! швидкостч фосфотрансферазно! реакц!!.

Вивчення1залежност! активностг А-юкази з л!мфоцит!в селе-з!нки в1д концектрацП АТФ (в!д 10 до 100 мкМ), при наявност! оп-тимальних концентращй бокового субстрату доказало, що суттевих зм1н у взаемодп э даним субстратом реакцп при опрсм!ненн! не спостер!гаеться.

Таким чином, головною причиною 1нактивацП цАМФ-залежних проте!нк1наз, в ид июни* з розчинно! фракцП лхмфоц'.гпв селез1нки, можуть бути.виявлен! наш порушення у взаемод!! фермента з С!лко-вим субстратом.

Д!я-рентген1вського опром1нення на цАМФ-залежн1 проте!нк!-нази також може бути локал!зована на р!вн1 мехатзм!в регуляц1! !х активность В зв'язку з цим ми провели досл1дження фунюцону-вання ряду механ!зм!в регуляцп цАМФ-залежнич проте!нк1наз в умо-вах прсменевого врадення.

Ми припустили, !цр важливе'значения для регуляцН ачтавност! цАМФ-заледних проте!нк1наз' можуть мати характеристики зв'язування цАШ> з проте!нк!назам>-1, тим б1льше, що опром1нення викликадо п1д-силення активуочого ефекту цишпчного нуклеотиду на фермент.

Одержан! нами результата св!дчать про те, що в результат! дп !ок1зуючо! рад1ац!! в!дбуваеться зб^ьшення спор!дненосг! ферменту.до цАМФ (рис.4). Ефект носить дозозалежкий характер. Нами встановлено, що через 12 г п1сля опром!нення в дозах 0,5 1 1 Гр в1дбуваеться порушення у взаемод!! цАМФ-еалежних проте!нк1наз з цишичним аденозинмонофосфатом, що в свою чергу може привести до суттевих зм1н в фунюионуванн! ферменту.

Специфхчним для друго! форми А-к!нази е. регуляторний меха-н!зм, який проявляеться в автофосфорилюванн! холофермент1в (Гри-.

I

-ч

I

Piic.4. Залежн1стъ гв'ягувзг-шя ?H-ii4MS а цАК-гзлелнсо rpoieîHKlHssoD, одерхзною г цитозолп aiiifouKiiB селег1кки контрольна (—) 1 опргяЛнеккх в даз1 С,5 Гр (- -) ta 1 Гр (..) OTÍB в!д кгкцвитрац» ц«в.

Рис.5. Süexaicii аато$зсфсршквання цАМЗ-загежио! npoTfïKKiHssu, сдержано! г цктозаш л1мфици11в с»л-:г1нки контрол&них (—) 1 опро1/1н?них в дсг1 : 0,5 Гр (- -) 13 1 Гр (..) syplB В1д концевтрзцП ШО.

венников, 1981, Rosen, 1975). У вияадку протлсання процесу автофосфорилювання по внутр1шньсмолекулярному мехa»iому повинна про-являтись 1нг1буюча д!я цАМФ. Для перев!рки цього припущення була вивчена залежк1сть !нтенсивност! автофосфорилювання в1д концент-рац!! цАШ. Одержан! данх (рис.5) св1дчать про 1нг1буючу д!ю цАМ$ на процес автофосфорилювання цАМФ-залежних проте!нк!наз в контро-л! (вв'явування цАМй э регуляторною субодиницею приводить до ди-соцхацп холофермекта ка субодиниц!, та до зменшення шаидкост1 автофосфорилювання, яке може прот1кати т!льки в склад! комплексу R2C2). Характер впливу циюпчного нуклеотида на !нтенсивк1сть процесу автофосфоршшжакня принципово не в!др!знявся для А-к!иаз 1з лгмфоцитхй селез!нки контрольних та опромшених в доз1 0,5 Гр тварин. Для ферменту, вид!леного з л1мфоцит!в через 12 г п!сля опром1нення в доз1 1 Гр, в1дм!чена тенденц1я до знкження чутлизос-т! автофосфорилювання до !нг1буючо1 дП цАМ$ (рис.5).

0ц1нюючи рад!очутлив!сть автофосфорилювання цАМ$-залежних проте'йшназ, ми д1йшли висновку, що опром!нення суттево не впли-вае на сам процес автофосфорилювання.

При вивченн! cyMiCHoro зпливу автофосфорилювання i цАМЬ на регуляцхю активност! цАМФ-залежних проте!нк!наз нами показано, щр шьидк1сть фосфотрансферазно! реакцй', яка катал1зувться автофос форильованим ферментом,'значно знижуеться в контрол1 (в 2 рази) (рис.6). OnpoMiHeinm приводить до поступового вир1виовання вста-новлено! р1зниц!. Перетворення одержаних даних в координатах Скетчарда дозволило оцшити описаний вище процес з точки зору взаемодП авто- 1 неавтофосфорильованих форм ферменту безпосе-редньо з активатором фосфотрансферазно! реакц1!. Автофосфорилювання А-каназ в контрол! привело до эб1льшення спор!дненост! хо-

-53

las

-u s

cj CD

- Й1 -

лоферменту до цАМ$ (рис.6). При опром1ненн1 цей процес носить д1-аметралыго протилежний характер (рис.7,8). 31 зростанням дози спо-рцшеШсть автофосфорильованого холофярменту до активатора р!зко внижуеться.

Проводячи анал1з отриманих експерименталышх даних по вив-ченню впливу рентген!вського опром1нения на функц1онування цАМФ-залежного фосфорилювання в л!мфоцитах 1цур1в, сл1д тдм1тити, що цей процес порушуеться в постраЩацшшй перюд. Основним вкладом в виивлен! гпсля опром!нення зм1ни е порушення взаемсдП ферменту з 61лковим субстратом фосфорилвдвання та основним активатороМ фосфотрансферазно'1 реакцП - цикл1чним аденозинмонофосфа-том.

висновки

1. Тотальне рентген]вське опромхнення тварин в дозах 0,5 1 1 Гр приводить до суттевих порушень 1«лькост1 1 сп1вв1дношеиня кл1-тин б1ло1 кров1, а також до зниження розеткоутвориючо! здатност! л1мфоцит1в. Ефект залежить в1д дози рад1ацП.

2. 1он1зуюча рад1ац1я в досл1джуванному д1апазон! доз викли-кае дисфункцш адетлатциклазно! системи, модулюючи активн1сть фермент!в, як1 контролюють внутр1шньокл1тшшу концентрац1ю цик-л1чних нуклеотид1в.'

3. 1з л!мфоцит1в селезенки щур1в була вид1лена 1 частково очищена цАМФ-залежна протеТнклназа, активюсть яког через 12 г Шсля тотального рентген1вського опром1нешш в дозах 0,5 1 1 Гр знижувалаоь в1дпов1дно на 32 7. 1 55 П1д впливом олромхиенни основн1 ф1зико-х1м1чн! та катал!тичн1 властивостх цАМ5>-залежно'1 протептнааи Л1мфоцит1в не змшюються. Спор1днен1сть ферменту до

субстрату фосфотрансфераоно! реакц!! - ricTOny H 2В знижуеться. 1Нд дгею Í0ni3yro40'í радгацп в1дбуваеться залежне В1Д дози випро-м1нювання збьчьшення спор1дненост1 ферменту до активатора - цикличного аденовинмояофосфату.

4. 0пром1нення в досл!джуваниих дозах суттево не впливае на процес автофосфорилювання. але приводить до зкиження спор1Днепост1 холосрерменту до цАМЬ (при onpoMiHeimi в доз! 0,5 Гр - у 1,5 рази, в доз! 1 Гр - 3 рази).

5. Smíhk функц!онапьно! активност! л1мфо1'дних кл!тин, - як1 в1дбуваються Шд впливом тотального рентген!вського опром!нення в дозах 0,5. i 1 Гр, можуть бути викликан! порушеннями в фуикцЛону-ванн1 аденглатциклазно! системи та системи цАМФ-залежного фосфо-рилювання - найважлив!гаих систем регуляцП метабол1зму в iüiíthhí.

СПИСОК РОБIT, НАДРУКОВАНИХ ПО TEMI ДИСЕРТАЦП

1. HaiibOBiKa O.e., Остапченко JI.I., Кучеренко M.G. Вплив lo-. н1зуючогс опромЛнення на морфофункц1ональний стан клггин !мунокомпетентних opraniB щур!в // Bíchuk КУ. - 1Ü93. -N25. - С.6-10.

2. Нальоз1на 0.6., Остапченко Л.I., Кучеренко М.е. Вплив lö-н1зуючого опром!нення в дозах 0,5 та 1 Гр на деяк! показ-ники кровотворення та 1мун1тету // М1жнародна наук.конфе-рен. "Навколишне середовище i здоров'я". - Черн1вц1, 22-25 листопада 1993р., Тез.допов1д., С.118.

3. Налевина O.E., Остапченко Л.И., Кучеренко Н.Е.. Влияние ионизирующего облучения на морфофункциональное состояние клеток иммунокомпетентных органов крыс // Радиобиол.съ-

- 23 -

езд. - Киев, 20-25 сент.1993г., Тез.дск"., Ч.2.-0.704-705.

4. Ручко М;В., Остапченко Л.И., Налевина О.Е., Кучеренко Н.Е.- Влияние различных доз ионизирующего излучения на функциональную активность и механизмы активации лимфозд-

' пых клеток тимуса и селезенки крыс при воздействии стимулирующего сигнала // Радиац.биол. и радиоэкол. -■ 19S4. -34, N 1. - С.247-250.

I

5. Остапченко Л.!., Нальов1на O.S., Пархомець .Т. I. Вшшв io-н!зуючого опром1неш,1я в дозах 0,5 та 1 Гр на функц!ональ-

' ну активн1сть компонент1в цшелонуклеотидзалежних систем регуляцП метабол1зму inypie // 1-й з'1зд Укр.б1сф1з.товар. - Кт'в, 1994г., Тез.допов!д., С.179-180.

6. Кучеренко М.е., Остапченко Л. I., Нальов1на 0.6., Долшняк 0.1.., Попова в.М. Вивчешш чутливост1 циклонуклеотпдза-лежних npoTe'iHKiHas до д1! патогенних фактор1в // Доп.ЛИ Украйни. - 1994. - N10. - С.133-134.

7. Остапченко л!И., Налевина 0.Е., Пархомец Т.Н. Пострадиационные нарушения в системе циклически); нуклеошдов лимфоцитов селезенки и тимуса крыс // Укр.биох.журн. - 1994. - 67.N1. - С.70-75.

Halyovina О.Е. Influence of X-ray radiation on maintenance

of- cyclic nucleotides and activity of cAMF-dependent protein

kinase In rats's lymphoid cells (manuscript).

The dissertation work for degree candidate of biological sciences (speciality 03.00.08. : radiobiology), institute of experimental pathology, oncology and radiobiology of Ukrainian NAS, Kiev, 1995.

In seven scientific works, having been spoken in support of, we can find information about influence of X-ray irradiation upon the system of сЛМР-dependent phosphorylation in lymphoid cells of rats's spleen. It's determined that .revealing of alterations of lymphocytes function activity may be evoked by violations of adenylatcyclase system's- and the system of cAMP-dependent phosphorylation functions.

l

Налевина O.E. Влияние рентгеновского излучения на содержание -циклических нуклеотидов и активность цАМФ-зависимых протеин-кикаа в лимфоидных 1слетках крыс (рукопись). Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.08. - радиобиология, Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им.Р.Е.Ка-пецкого НАН Украины, Киев, 1995. .

Защищается 7 научных работ, в которых содержатся данные о воздействии общего рентгеновского облучения в дозах 0,5 и 1 Гр на систему цАШ>-зависимого фосфорилирования в лимфоидных клетках селезенки крыс. Установлено, что выявленные изменения функциональной' активности лимфоцитов могут быть вызваны нарушениями в функционировании аденилатцигславной системы и системы цАШЬ завист. ого фосфорилирования.

Ключов! слова : функц1оиальна активншть л!мфоцит1в, цАКФ-залежна npoTeïHKinaaa, механ18ми регуляцП активност1 фер-мент1в.

Заказ Тир, f-"7 экз, 1995 г.Укрспецмонтажпроект