Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние иммобилизации в полимерные матрицы и изменения хромофор-белковых взаимодействий на фотоцикл бактериородопсина

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние иммобилизации в полимерные матрицы и изменения хромофор-белковых взаимодействий на фотоцикл бактериородопсина"

РГ6 ои

11 Ш 1993

российская академия наук институт теоретической и эксттижнтальнои биофизики

На правах рукописи

уж 577.345 -577.355

ДРУЖКО Анна Борисовна

влияние иммобилизации в полимерные матрицы и изменения хромофор-белковых взаимодействии на фотоцикл бактериородопсина

(03.00.02 - биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Пущино - 1992

Работа выполнена в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики Российской Академии Наук.

Научные руководители: кандидат физико-математических наук

старший научный сотрудник Н.Н.Всеволодов и

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Ю.А.Лазарев кандидат физико-математических наук А.В.Максимычев

Ведущая организация: Институт химической физики РАН

на заседании Специализированного Совета Д 200.22.01 при Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН по адресу:142292 г.Пущино Моск. области, ИТЭБ РАН, конф.зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН.

кандидат биологических наук

старший научный сотрудник С.К.Чаморовский

Защита состоится

часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь Совета, кандидат биологических наук

П.А.Нелигович

Актуальность теш. Бактериородопсин (БР) - ретиналь-белковый комплекс энергопреобрязувдих мембран галобактерий, претерпевает под действием света цикл фотохимических, превращений, что позволяет считать БР природным фотохромом. Природный фотохромизм БР, регулярная гексагональная упаковка его в мембране, уникальные оптические свойства и стабильность явились причиной интереса к нему как к белку, способному к зашей, обработке и хранению оптической информации. Несмотря на несомненный интерес и увеличение количества работ по изучению чисто физических - фотохромных, электрохромных, пьезоэлектрических, голографических - свойств БР, остается невыясненным целый ряд вопросов, касающихся его фотохимической активности. Одна из 'проблем в таких исследованиях - влияние взаимодействия хромофора с белком и бежа с макроокружением на спектрально-кинетические параметры фотоцикла БР.

Подходами к решению этой проблемы явились иммобилизация белка в полимерные матрицы и замена природного хромофора синтетическими аналогами, позволяющая целенаправленно менять характер хромофор-белковых взаимодействий. С этой точки зрения нами были опробованы несколько аналогов БР и наиболее перспективным для дальнейшего подробного исследования выбран 4--кето-бактериородопсин (4-кето-БР), имеющий измененную структуру хромофора в области циклогексенового кольца и демонстрирующий, по нашим данным, замедленный по сравнению с нативным белком фотоцикл.

В соответствии с изложенным ЦЕЛЬЮ работы было изучение влияния изменения макроокружения белка при встраивании его в полимер и модификации микроструктуры хромофорного центра на спектрально-.ашети-ческие параметры фотоцикла БР. Из этого вытекают следующие ЗАДАЧИ:

1. Исследовать влияние иммобилизации в полимерные матрицы на некоторые спектрально-кинетические свойства фотоцикла БР. Изучить характеристики как фотохрома для БР в полимерных матрицах.

2. Изучить влияние на фотоцикл БР такого модифицирующего агента как гидроксиламин (ГА)а также замены хромофора с целью возможного управления фотоциклом БР в полимерных матрицах.

3. Исследовать детально фотохимический цикл и светоадаптацион-ные свойства суспензии 4-кето-БР.

4. Изучить особенности фотохимических превращений 4-кето-БР, иммобилизованного в полимерную матрицу.

5. Исследовать влияние внешнего электрического поля на спектральные свойства 4-кето-БР в полимерной матрице

Научная новизна работы.Впервые для исследования фотохимических и фотофизических, свойств БР и его аналогов применен метод иммобилизации таких белков в прозрачные полимерные матрицы и исследованы свойства иммобилизованных пигментов. Изучено влияние гидроксиламина на фотохимическую активность БР в полимерных матрицах.Обнаружено, что наиболее замедленным фотоциклом из ряда исследованных аналогов БР, иммобилизованных в полимер, обладает 4-кето- БР. Детальное изучение фотоцикла 4-кето-БР в суспензии и полимерных матрицах позволило обнаружить ряд новых интермедиатов и сделать вывод,что спектральная и кинетическая гетерогенность ключевого интермедиата М, наблюдаемая ранее в фотоцикле этого аналога в полимерной матрице, не является особенностью системы белок - хромофор - полимер, а отражает сложную картину хромофор-белковых взаимодействий внутри хромофорного центра. Изучение особенностей процессов свето- и темноадаптации 4-кето-БР в суспензии и полимерной матрице позволило связать направление этих процессов с соотношением кинетик фотоциклов двух изомеров 4-кето-БР. Впервые обнаружены электрооптические превращения 4-кето БР в полимерной матрице, изучены их особенности.

Практическая ценность работы. Разработанный наш метод иммобилизации БР и его аналогов в прозрачные полимерные матрицы применим для создания сред для регистрации и обработки оптической информации на основе различных биологических светочувствительных комплексов (реакционны^ центры, хлорофиллы, родопсины и др.).Показано, что помещение БР в полимерные матрицы позволило создать новый фотохромный материал "Биохром" с перспективными свойствами, модифицируя который различными агентами или заменой хромофора можно получать разные варианты фотохромных и фоторегистрирунцих материалов с различающимися характеристиками. Целый ряд аналогов, иммобилизованных в' полимерные матрицы, защищен авторским свидетельством СССР "Фотохромный материал" Полученное существенное замедление (до часов) времени фотоцикла в 4-кето-БР в полимерной матрице позволяет говорить о создании фотохромного материала с большим чем у БР временем хранения оптической информации. Обнаружение и характеристики электроиндуцирован-ного сдвига полосы. поглощения позволяет рассматривать 4-кето-БР в полимерной матрице как возможный перспективный электрохромный материал. Результаты исследований свойств БР и его аналогов в суспензии и полимерных матрицах позволяют определить области, в которых использование такого рода материалов имеет преимущества перед уже существующими.

Аппробация работы.Основные результаты работы докладывались на: Всесоюзной конференции "Оптическое изображение и регистрирующие среды" (г.Ленинград, (982), IY Всесоюзной школе "Оптическая обработка информации" (г.Минск, 1982), I Биофизическом съезде (г. Москва, 1982), Всесоюзном совещании "Светочувствительные биологические комплексы и оптическая регистрация информации" (г.Пущино, 1984), Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функция" (г.Рига, 1988), Symposium on Molecular Electronics-Biosensors and Blocomputers (Santa Clara, California, 1988), 11th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (Seattle, Washington, USA, 1989).

По теме диссертации имеется 16 публикаций, 2 работы в печати.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, шести глав, выводов, изложена на //¿страницах машинописного текста, включает ,2?рисунков, ? таблиц и список цитируемой литературы.

Глава 1. Обзор литературы. Обзор состоит из двух разделов. Первый раздел посвящен обзору литературы по БР как протонному переносчику, его фотоциклу и модификациям его при различных воздействиях. Второй раздел рассматривает свойства БР как среды для регистрации оптической информации.

Глава 2. Обьекты и методы исследований.

БР в виде пурпурных мембран (п.м.) штаммов 353П, R1M1, ЕТ 1000 Halobacterium haloblum до 1988г. предоставлялся Чекулаевой Л.Н. (ИБФ АН СССР), а с 1988г производился и выделялся нами в содружестве с Шахбазяном В.Ю. по стандартной методике (Becher В., Casslra J.1975) 4-кето-БР и другие аналоги БР приготовлялись реконструкцией апомемб-ран соответствующими аналогами ретиналя. Аналоги ретиналя предоставлялись Ходоновым А.А. (МИТХТ им.Ломоносова). Кроме этого совместно с Шахбазяном В.Ю. (ИТЭБ РАН) нами был налажен и в дальнейшем использовался альтернативный метод получения 4-кето-БР, когда 4-кето-ретиналь добавляли непосредственно в культуральную среду при выращивании дефицитного по синтезу ретиналя штамма галобактерий JW-5.

Пленки иммобилизованного в полимерные матрицы БР и его аналогов приготовляли по разработанной нами методике, подробно описаной в диссертации.

Спектры поглощения пленок БР и его аналогов измеряли на спектрофотометрах "Specord UV VIS" (ГДР) и "Specord М-40"(ГДР). Кинетические кривые образования и исчезновения фотопродуктов фотоциклов в пленках БР и его аналогов регистрировали на спектрофотометрической

кинетической установке "Свет", (Всеволодов H.H., 1978).

Исследование фотохромных параметров пленок "Биохром" проводилось по методике измерения светотехнических характеристик фотохромных и необратимых светочувствительных материалов, используемых в проекционных системах отображения информации.

Спектры поглощения суспензии 4-кето-БР и кинетические кривые образования и исчезновения медленных фотопродуктов фотоцикла этого аналога регистрировали на спектрофотометрах "Specord UV VIS" (ГДР) и "Specord. М-40"(ГДР) и на дифференциальном спектрофотометре "Hitachi 557"(Япония). Низкотемпературные измерения проводили совместно с Л.С.Броуном на кафедре биофизики биофака МГУ в приставке к "Hitachi 557", либо в криостате с хладопроводом (Кононенко A.A., 1980). Спектры кругового дихроизма суспензий регистрировали на спектрополя-г риметре J-40 AS фирмы "Jasco" (Япония) в Институте биохимии им.Баха АН СССР при содействии В.В.Шубина. Спектры флуоресценции жидких образцов регистрировали на спектрофлуориметре "Hitachi 850" (Япония).

Пикосекундные изменения поглощения регистрировали совместно с С.Л.Логуновым на автоматизированном пикосекундном дифференциальном спектрофотометре, сконструированном на кафедре биофизики биофака МГУ (активирующий свет А.=530нм, длительность импульса ЗОпс) (Корватовс-кий и др., 1987).

Микросекундные и миллисекундные изменения поглощения водных суспензий пигментов исследовали на автоматизированном однолучевом дифференциальном лазерном спектрофотометре (Чаморовский С.К. и др.1989) Кинетику электроиндуцированных изменений поглощения в пленках иммобилизованного в полимерную матрицу 4-кето-БР, а также характер зависимости этих изменений от поля и дифференциальные спектры поглощения "в поле-без поля" регистрировали совместно с Е.П.Лукашевым с помощью аппаратуры, созданной на кафедре биофизики биофака МГУ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава З.Фотоиндуцированные свойства нативного и ГА-модифициро-ванного БР, иммобилизованного в полимерные матрицы. 3.1.Влияние иммобилизации в полимер на фотоцикл БР. При иммобилизации нативного БР в отобранные полимерные матрицы (поливиниловый спирт(пвс) и желатина) исходный спектр поглощения полученных образцов пленок БР не претерпевает существенных изменений,а последующая фотостационарная активация (Х>500нм) приводит к исчезновению исходной полосы при 570нм и образованию полосы в области 400 нм (рисЛ), соответствующей фотопродукту М. Исчезновение этой полосы

коррелирует по времени с восстановлением . поглощения исходной формы БР, что свидетельствует о сохранении фотоцикла в пленке, но завершении его, в отличие от суспензии, фотопродуктом М. Обнаруженное нами отсутствие интермедиатов N и 0 в таких образцах подтвердилось затем другими авторами [Вгу11,1991], 'что связывается с недостаточностью фракции связанной воды в образце для поддержания полного фотоцикла.

- Кинетика распада М в иммобилизованном БР при комнатной температуре и фиксированной относительной влажности (65%) демонстрирует замедление на порядка по сравнению с суспензией БР. Полувремя жизни интермедиата М в таких образцах составляет от 5 до 50 с (рис.2) в зависимости от полимерного связующего, что почти на порядок превышает таковое в воздушно-сухих пленках БР в таких же условиях [Korens--teln & Hess, 1977]. Такое существенное замедление фотоцикла наряду с сохранением фотохромных свойств позволяет рассматривать БР в полимерной матрице как технологичный фотохромный элемент, названный нами "Биохром", и определить его основные характеристики как фотохрома, такие как энергетическая светочувствительность (Н), разрешающая способность (Н), дифракционная эффективность (т)) и цикличность (С) (Табл.1). Сравнение характеристик пленок "Биохром" на основе немоди-фицированного БР с существующими для других фотохромов (Табл.1) показало, что "Биохром" является перспективным фотохромным материалом, но его относительно низкая чувствительность и относительно небольшое время хранения информации (время фотоцикла) свидетельствует о необходимости поиска модификаций таких образцов БР.

3.2 Характеристики ГА-модифицированного БР в полимерных матрицах

как фоторегистрирующей среда

Освещение (А.>500нм) ГА-модифицированного БР, иммобилизованного в полимер,характеризуется исчезновением исходной полосы при 570 нм и образованием неисчезающей полосы ретинальоксима при 380 нм (рис.ЗА), что сходно с процессом фотоиндуцированного гидроксиламинолиза (ФГ) в суспензии БР с ГА, однако, в отличие от суспензии,где время ФГ достигает нескольких часов, рост до насыщения полосы ретинальоксима в пленке ГА-модифицированного БР завершается за 2-3 мин, что происходит вследствие сильного замедления распада М в полимерных пленках БР. Возможность получения неисчезающей полосы ретинальоксима за 1-2 мин облучения пленки позволило рассматривать ГА-модифицированный БР в полимере как среду для однократной записи оптической информации, аналогичной фотографической, в которой процесс, в отличие от реверсивного в пленке "Биохром"(рис.ЗБ), не является таковым, а материал

Рис.2

Рис.I. Фотоиндуцированные превращения иммобилизованного в желатину БР: А-исходный спектр, Б-через 1с после облучения. Рис.2. Кинетики распада фотопродукта М в полимерных пленках БР (отн. влажность 65%, А.=420нм) I - в пвс, 2 - в желатине.(Н вкл.и выкл.света) Рис.3. Фотоиндуцированные спектральные переходы ГА-модифициро-ванного (А) и немодифицированного (Б) БР в полимерных матрицах. Условия облучения двух видов пленок одинаковы,( Ъ500нм).1 - фотоинду-вдрованный спектр, 2 - исходный спектр.

Таблица I. Свойства пленок "Биохром БР" и "Биохром БР П" как

фоторегистрирующих материалов.

Образец Спектр, обл.чувст- И лин/мм Дж/см2 ■П С

вит.,нм %

"Биохром БР" 350-650 >2000* 10~2 1.5-2 >Ю(

"Биохром БР П" 350-600 >250** 9.8 Ю"2*** - -

Иные фотохромы [0esterh.elt et а1.1991 ]:

неорганические 300-700 5000* 10"2-10_1 1-2 1СГ3

органические 400-800 5000* Ю"4-Ю"2 1-2 ю3

* -.измерялось интерференционным способом; ** - измерялось путем контактного копирования штрихэвой миры г"'250мм~:'-; *** - измерялось на уровне 0.5Б.

назван наш "Биохром БР 1Г - с постоянной памятью. Его характеристики как фоторегистрирующего материала (Табл.1) демонстрируют меньшую, чем у пленок "Биохром БР" чувствительность, связанную .по-видимому,с уменьшением влагоссдержания в образце и вследствие этого уменьшением подвижности в нем молекул ГА, и свидетельствуют о необходимости выбора иных модификаций БР, способных менять спектрально-кинетические параметры его фотоцикла, одной из который является замена хромофора. Глава 4.Некоторые спектрально-кинетические свойства БР с модифицированными хромофорами в полимерных матрицах. При инкубации апомембран с серией аналогов ретиналя, модифицированных как в области иононового кольца,так и в полиеновой цепи, реконструированы аналоги БР, встраивая которые в полимер, получаем образцы пленок пигментов с максимумами исходных форм поглощения (форма А) в спектральном ряду от 480 нм до 600 нм (Табл.2). При фотостационарной активации, соответствующей полосе поглощения пигмента, наблюдается ее исчезновение с образованием фотоиндуцированной формы В, соответствующей наиболее долгоживущей коротковолновой форме в цикле фотопревращений аналогов БР (Табл.2). Зарегистрировано также разной степени замедление темновой релаксации фотоиндуцированной формы В по сравнению с нативным БР в таких же матрицах. Из релаксационных кривых распада формы В видно (Табл.2), что наиболее длительной релаксацией обладает 4-кето-БР в полимерной матрице, время жизни формы В в котором больше чем в 13-дезметил-БР с секундным временем жизни ин-термедиата типа М в суспензии [СахчИпег е1 а1., 19831. Полученные данные свидетельствуют, на наш взгляд, о необходимости более подробного изучения 4-кето-БР в суспензии и полимерной матрице. Глава Б.Фотоиндуцированные свойства суспензии 4-кето^Р. 5.1.Фотоцикл реконструированного из апомембран 4-кето-БР. Исходный спектр поглощения 4-кето-БР демонстрирует основную полосу поглощения пигмента с максимумом около 508нм, неоднородность которой можно объяснить наличием в образце как 13-цис- (макс.504нм), так и полностью-транс- (макс.527нм) хромофора. ФотоиндуцироЕанные изменения спектра поглощения суспензии при -196°С характеризуются появлением дифференциального максимума в обл. 562 нм (рис.4а), связанного с образованием интермедиат'а типа К. При постепенном отогревании облученного'образца регистрируется одновременное появление при -П0°С дифференциальных максимумов при 475нм. и 510нм, соответствующих восстановлению исходных форм пигмента и трех полос ЗЭОнм, 410нм и 430нм, отнесенных к интермедиату типа М (рис.4Ь). Не обнаружена

Таблица 2.Спектрально-кинетические свойства аналогов БР в матрице.

Структурные формулы хромофорбв, названия соответствующих хромопротеидов, кинетики распада наиболее долгоки-втаих коштковолновых Фош Фотоциклов пленок пигментов \лакс нм □ макс нм

I VII О 0.5 о. е. БР 0 \ 1.с ( 570 415

2 0.2 3,4-дидегидро- 1 10 с | 593 410

3 0.2 1 1 3-метокси-СН30/ч/ БР 0 \ 25-с I 540 420

4 ^ 5,6-эпокси-БР 0 "У^^ЗО с | 452 380

5 0.1 ЧЛч 13-изопропил БР 0 \ 50 с 1 560 410

6 . 0-2 1 1 и 13-дезметил Д^КЮ с- 565 405

7 0.2 ГЛ^^^О 3,4-Диметокси СНзО^У СН30 0 | 1 500 390

8 0.5 £ 4-кето-БР 0 | 1 515 415

полоса, соответствующая интермедиату типа L.

Спектральная гетерогенность интермедиата М, наблюдаемая при низкой температуре, подтверэдается в экспериментах при комнатной температуре, однако при рН 6-9 спектр характеризуется наличием только 2 полос, соответствующих интермедиатам М-420 и М-440 (максимумы полос соответствующих интермедиатов в низкотемпературном абсолютном спектре образца), а кинетика релаксации их описывается двумя экспонентами с характеристическими временами распада при рН 7.5 порядка 30 с и десятка мин соответственно и рН-зависимостью в диапазоне рН 5-9 с характером зависимости констант от рН lg{M~ -рН/3. При кислых рН (4.5) наблюдается лишь полоса, соответствующая интермедиату М-440, а отсутствие полос, соответствующих интермедиатам М-390 и М-420, говорит, по-видимому, о высокой скорости их распада при данных значениях рН. При щелочных рН £9.5) в спектре наблюдаются все три полосы М, причем положение минимумов в дифференциальных спектрах при кислых и нейтральных рН сдвинуто к 522нм, а в при щелочных рН - к 504 нм, что позволяет считать интермедиата М-420 и М-440 продуктами транс-4-ке-то БР, а М-390 - продуктом 13-цис-4-кето-БР

При изучении быстрых изменений поглощения, индуцированных лазерной вспышкой, наблюдается его рост при 570нм, отнесенный нами к образованию интермедиата К с временем образования <30пс и последующий спад с т порядка 50мкс. Спад поглощения при 570 нм коррелирует с ростом поглощения в области 380-440нм (г=60мкс), соответствующим образованию М-интермедиатов. Регистрация быстрых изменений поглощения в миллисекундной шкале демонстрирует двухкомпонентную кинетику распада M (рис.5А) с т=10-15мс для быстрого компонента, соответствующего распаду М-390, что подтверждается уменьшением его вклада при понижении рН. Медленный компонент, не релаксирующий за 0.5с, по-видимому, относится к медленным М-420 и М-440. Коррелируя с распадом быстрого М, наблюдается рост поглощения в области 590нм с т порядка 15мс и спад его с ге700мс (рис.5Б), которые можно соотнести с образованием и распадом интермедиата типа 0. В области 490нм наблюдается рост поглощения, имеющий быстрый компонент (рис.5В) с d=5-I0mc и тоже коррелирующий с распадом быстрого М, и медленный компонент с т>1с, что соответствует восстановлению исходной формы 4-кето-БР и предполагает возврат в нее как из быстрого М, так и через медленные M и 0. В фотостационарных измерениях наблюдается медленный рост поглощения (i=48c) при 594нм, соответствующий медленному 0 и коррелирующий по времени с распадом М-420, и очень медленный спад с

аз 45мин. В медленных процессах восстановления исходной формы регистрируется как компонент с т^ЗОс, коррелирующий с распадом М-420, так и медленный минутный компонент, связанный с распадом 0-594 и М-440.

Анализ полученных данных позволил представить следующую схему фотоцикла 4-кето-БР, где величины характеристических времен соответствуют рН 7.5 и не указаны возможные переходы мевду фотоциклами:

-►13-ЦИС-4-КЕТ0-БР-504-»К-570-►!?

| + <30пс |

| 5-10мс| |

| 0.5-!с 15-20мс | бОмкс |

-0-594 <-М-390<-

-»ТРАНС-4-КЕТ0-БР-527-»К-570-►!?-

| | 1- <30пс | | II - 30с | 4. | II | Ь? |

| |45мин 50с | бОмкс | | | -0-594<-М-420<--|

I I | Юмин бОмкс | -М-440--

5.3.Особенности светоадаптации в суспензии 4-кето-БР.

Для 4-кето-БР не регистрируется нормальная светоадаггтация, что выражается в отсутствии батохромного сдвига полосы поглощения при освещении темноадаптированного образца. При добавлении 50 мМ азида натрия в суспензию 4-кето-БР при рН 5-7 наблюдаются фотоинду-цированные изменения поглощения, характерные для образца без азида при щелочных рН (в.5), т.е. регистрируется интермедиат М-390, что свидетельствует о сильном (>100раз) замедлении цис-цикла в образце с азидом при данных значениях рН. После релаксации этих изменений регистрируется батохромный сдвиг основной полосы поглощения от 508нм к 522нм, что, по-видимому, отражает накопление транс-4-кето-БР на свету, соответствующее процессу светоадаптации. Обратный переход в тем-новую форму происходит с характеристическим временем около 20 часов.

При повышении рН до 8 в светоадаптированном образце с азидом наблюдается накопление на свету 13-цис- формы, проявляющееся в гип-сохромном сдвиге полосы поглощения к 504нм, т.е.своеобразная темно-адаптация на свету. Обратный переход в исходную форму не происходит.

Таким образом, в 4-кето-БР с азидом натрия, варьируя рН, можно

то-БР в смеси вода-глицерин (40%-60%). а - после фотостационарной активации (460<Х<580) при -196°С, Ь - после отогревания образца "а" до -П0°С (снят дифференциально относительно образца "а").

И

а

о'-

85 ыс

Рис.5.Кинетические кривые изменений поглощения 4-кето-БР (рН 7.5, 10мМ ^Б трицин), индуцированных лазерной вспышкой (\=530нм, 15 не, 30. мДж). Стрежа указывает момент вспышки. А - при 420 нм,' Б - при 594 нм, В - при 490 нм

избирательно накапливать тот или иной изомер в 4-кето-БР, регулируя направление процессов светоадаптации. Управляющим параметром этого регулирования является соотношение скоростей цис- и транс- циклов пигментов: при нейтральных и кислых рН цис-цикл замедлен азидом сильно, а транс-цикл - незначительно с сохранением характера зависимости распада длинноволновых М от рН. При щелочных рН замедление

транс-цикла значительно, исходя из зависимости распада длинноволновых М от рН, тогда как распад М-390 цис-цикла рН-независим при данных значениях рН. По видимому, подобно наблюдаемому для нативного БР и некоторых его аналогов с замедленным распадом М [Коиуата et а1.,1985, Даншина, 1989], в суспензии 4-кето-БР наблюдаются взаимопереходы мевду циклами на стадии распада М с конкуренцией между переходом в цикл другого'изомера и возвращением в свой исходный цикл. При сильном замедлении азидом цис-цикла повышается вероятность перехода М-390 при его распаде в транс-4-кето-БР,накопление последнего и наблюдение процесса светоадаптации. При сильном замедлении трансцикла повышается вероятность перехода длинноволновых М-интермедиатов при их распаде в 13-цис пигмент, накопление его и наблюдение аномальной темноадаптации на свету.

Избирательность воздействия азида на фютоцикл 13-цис пигмента может быть связана с тем, что он, по-видимому, депротонирует внутри-белковый донор, репротонирующий Шиффово основание М-390.

Итак, для суспензии 4-кето-БР обнаружены новые данные, касающиеся особенностей структуры фотоцикла и светоадаптации пигмента. Интересно пронаблюдать проявление этих особенностей при иммобилизации 4-кето-БР в полимерные матрицы.

Глава 6.Фото- и электроиндуцированные свойства 4-кето-БР в полимерной матрице.

6.1.Влияние иммобилизации в полимер на фотоцикл и светоадаптаци-онные свойства 4-кето-БР.

Исходный спектр 4-кето-БР в полимерной матрице характеризуется основной полосой поглощения с максимумом при 515нм (рис.б.кр.1) что говорит об ином соотношении изомеров хромофора в иммобилизованном пигменте, чем в суспензии. Фотостационарная активация образца (А.>500нм) приводит к выцветанию полосы в области 500нм и появлению

3-х полос в области 400нм с максимумами ЗЭОнм, 415нм и 437нм (рис.6,кр.2), отнесенных к интермедиатам М, сходных с наблюдаемыми в суспензии и названных нами М4Щ5Р1. М4КБр2 и М4Щ3Р3 соответственно. Кинетика распада М хорошо описывается суммой 3-х экспонент, а сравнение характеристических времен и относительных вкладов амплитуд для

4-кето-БР и БР в одних и тех же условиях показало значительное замедление (зд 10раз) релаксации всех трех компонентов интермедиата М в 4-кето-БР и больший вклад в общее изменение оптической плотности наиболее долгоживущего интермедиата М4Щ3Р3. чем таковой для БР.

При изучении темновой релаксации фотопродуктов М и восстановле-

Рис.б.Фотоиндуцированные спектральные превращения 4-кето-БР в желатине при постоянном освещении (460<А,<580) Л - исходный спектр незасвеченного образца, 2-6 - спектры после засветки через 4с, 30с, 4.5мин, 16мин, 20часов соответственно.

Рис.7.Индуцированные постоянным электрическим шлем ( 8-Ю6 В/м ) изменения поглощения 4-кето-БР в желатине. А - зависимость амплитуды электроиндуцированных изменений образца от квадрата напряженности электрического поля

ния исходной формы 4-кето-БР (рис.6,кр.2-5) обнаружено, что время жизни М^кбр} не превышает 30с, а времена распада М4КБр2 и М4КБр3 достигают минут и десятков минут соответственно. Исходная полоса поглощения, восстановленная после релаксации фотоиндуцированных изменений (рис.В.кр.б) не имеет характерного батохромного сдвига, что говорит об отсутствии светоадаптации и сходно с суспензией. При модификации БР в матрице сенсибилизирующими добавкащ, используемыми для повышения чувствительности пленок "Биохром" [Всеволодов и др., 19853 кривые релаксации М демонстрируют замедление распада всех трех компонентов М, длинноволновых в большей степени (до часов). Кривая восстановленной после релаксации М исходной формы имеет гипсохром-ный сдвиг максимума до 504нм, демонстрируя темноадаптацию на свету и подтверждая гипотезу о регуляции светоадаптации соотношением скоростей фотоциклов. Исходное соотношение изомеров, наблюдаемое в неосвещенном образце, восстанавливается за время >70 часов.

При низкой температуре в случае фотостационарной активации реги-

стрируется интермедиат типа К, а интермедиат типа 0 отсутствует в фотоцикле 4-кето-БР, подобно наблюдаемому для нативного БР.

Характеристики 4-кето-БР в полимере как фотохромного материала практически не отличаются от таковых для нативного БР. Энергетическая светочувствительность пленок "Биохром 4КБР" с сенсибилизирующими добавками составляет КГ^Дж/см2, а время хранения оптической информации достигает нескольких часов. Увеличение времени фотоцикла 4-ке-то-БР при введении сенсибилизирующих добавок говорит о перспективности модификации 4-кето-БР в матрице различными химическими и физическими факторами. Одним из таких факторов может служить внешнее электрическое поле.

6.2.Электроиндуцированный батохромный сдвиг полосы поглощения

4-кето-БР в полимерных матрицах.

Индуцированные внешним постоянным электрическим полем изменения спектра поглощения 4-кето-БР в полимере (рис.7) спектрально близки фотоиндуцированным изменениям таких образцов при -196°С, соответствующим образованию интермедиата К, однако спектр электроиндуцирован-ных изменений сдвинут в сторону более длинных волн. Электроиндуциро-ванные изменения в пленках 4-кето-БР прямо пропорциональны квадрату напряженности приложенного поля (рис.7А), что сходно с характером зависимости электроиндуцированных изменений в воздушно-сухих пленках специально не ориентированного БР. Особо следует подчеркнуть, что относительные электроиндуцированные изменения 4-кето-БР в матрице (к собственно поглощению пигмента в пленке) существенно выше наблвдае-мых [Максимычев и др.,1988] в воздушно сухих пленках специально не ориентированного БР, что может быть связано с более эффективной поляризуемостью 4-кето-БР вследствие наличия электроотрицательного атома в 4-том положении циклогексенового кольца и изменения величины диполя внутри хромофорного центра. Данный факт позволяет рассматривать 4-кето-БР в полимерной матрице как перспективный электрохромный материал.

ВЫВОДЫ

1.Иммобилизация нативного БР в полимерные матрицы сохраняет в основном цикл фотохимических превращений, завершая его переходом из фотопродукта М в БР 570 и замедляя его на порядка по сравнению с суспензией,и позволяет создать фоточувствительную среду "Биохром БР" для реверсивной записи оптической информации как в фотохромном, так и голографическом режимах (светочувствительность 10~^дж/см^, время хранения информации от 5 до 50 с, не менее 10^ циклов

записъ/стирание).

2.Модификация БР гидроксиламином с последующей иммобилизацией в полимерные матрицы позволяет зафиксировать фотохимический цикл на стадии образования фотопродукта М и ретинальоксима, что является предпосылкой создания фоточувствительной среды ("Биохром БР П") для однократной записи оптической информации, аналогичной фотографической.

3.Исследовано влияние на спектральные и кинетические свойства БР модификации белка путем замены хромофорной группы синтетическими аналогами ретиналя. Из 7 изученных реконструированных аналогов БР наиболее длительной релаксацией фотоцикла обладает аналог БР с 4-ке-то-ретиналем (4-кето-БР).

4.Методами импульсной лазерной и низкотемпературной спектроскопии исследован цикл фотохимических превращений 4-кето-БР в водной суспензии. Впервые для этого аналога БР зарегистрирован бато-интер-медиат типа К с временем образования < ЗОпс и' характерным временем распада 50мкс. Зарегистрированы по крайней мере три спектрально и кинетически различающихся интермедиата типа М (М-390, М-420 и М-440). Интермедиат М-390 предположительно относится к фотоциклу 13-цис-4-кето-БР, а М-420 и М-440 принадлежат фотоциклу полностыо-транс-4-кето-БР. Подтверждено существование обнаруженного ранее фотопродукта типа 0-640, обнаружено, что таких интермедиатов в фотоцикле существует по крайней мере два, отличающихся кинетически. Предложена схема фотоцикла для 4-кето-БР.

5.Для 4-кето-БР в суспензии обнаружено, что фотоиндуцированные изменения, характерные для световой адаптации, не наблюдаются. При добавлении азида такие изменения наблюдаются при кислых и нейтральных рН, и не наблюдаются при щелочных. Сопоставление кинетик фотоциклов 13-цис и полностыо-транс 4-кето-БР позволяет предположить зависимость светоадаптации от соотношения скоростей распада интермедиатов М этих фотоциклов.

6. 4-кето-БР, иммобилизованный в полимерные матрицы, обладает фотохимической активностью, сходной с таковой в суспензии^ В то же время он демонстрирует неполный фотоцикл, а также существенное его замедление за счет увеличения времен жизни трех спектрально-кинетических форм фотопродукта М до секунд, десятков минут и часов соответственно. Такое замедление фотоцикла ставит пленки "Биохром 4КБР" в ряд перспективных в некоторых аспектах записи и хранения оперативной информации.

7.Для 4-кето-БР, иммобилизованного в полимерную матрицу и помещенного во внешнее электрическое поле, обнаружен электроиндуцирован-ный батохромный сдвиг основной полосы поглощения, подобный установленному ранее для нативного БР в воздушно-сухих пленках БР. Зависимость амплитуды электроиндуцированных изменений поглощения от напряженности поля носит квадратичный характер. Относительные электроин-дуцированные изменения 4-кето-БР в полимерной матрице существенно превышают таковые в исследованных ранее воздушно-сухих пленках БР, что позволяет предположить более эффективную поляризуемость 4-кето-БР в поле и сделать вывод о возможности использования 4-кето-БР в полимерной матрице в качестве более перспективного электрохромного материала.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1.Бункин Ф.В., Всеволодов H.H., Дружко А.Б., Мицнер Б.И., Прохоров A.M., Савранский В.В., Ткаченко H.H., Шевченко Т.В. Дифракционная эффективность бактериородопсина и его аналогов//Письма в ЖТФ. 1981 .т. 7. .№24. с. 1471-1474

2.Всеволодов H.H., Дружко А.Б. О возможности использования биологических комплексов в качестве фотосред//Оптич. изображение и регистр. среды. 1 Всес.конф. Ленинград. 1982. Тезисы докл. с.256

3.Бункин Ф.В., Всеволодов H.H., Дружко А.Б., Иваницкий Г.Р. Овчинников Ю.А., Прохоров A.M., Савранский В.В. Изменение показателя преломления бактериородопсина в пленке//1 Всес.биофиз.сьезд, М. 1982 Тез. докл. ч.2. JJ2214.

4.Всеволодов H.H., Дружко А.Б., Дюковэ Т.В., Чекулаева Л.Н. Использование пленок "Биохром" в качестве сред для оптической регистрации информации//ГУ Всес.школа по опт.обр.инф.Минск.1982.Тез.с.240

5.Всеволодов H.H., Дружко А.Б., Чекулаева Л.Н., Мицнер Б.И., Евстигнеева Р.П. Фотохромный материал//Авт.свид.JS1032912 от 1.04.83г.

6.Дружко А.Б., Жармухамедов С.К. Пленки "Биохром" на основе некоторых аналогов бактериородопсина//В сб.Светочувствительные биол. комплексы и оптич. регистр, информ. Пущино. 1985. с.129-136.

7.Дружко А.Б., Жармухамедов С.К., Всеволодов H.H. Фотоиндуциро-ванные превращения 4-кето-бактериородопсина в полимерных матрицах// Биофизика. 1986. т. 31 .J&. с. 227-230.

8.Vsevolodov N.N., DruzMco A.B., Dyukova T.V."Bioclirom"-reversi-ble photomaterlal for optoelectronlcs//J.Mol.Electr.1987.Y.3.J61 .p.15

9.Всеволодов Н.Н., Дружко А.Б., Дюкова Т.В., Окон Е.Б., Шахба-зян В.Ю. Реальные возможности применения бактериородопсина в био- и фототехнологиях//Биол.мембр.:структура и функция. Y Сов.-швейцар, симп.Рига.1988. Тез.докл.с.59.

10.Vsevolodov N.N., Druzhko А.В., Dyukova T.V. Actual possibilities of bacterlorhodopsin application In optoelectronlcs//Symp.on Mol.Electr.-Blosen.and Blocomputers.Santa Clara.USA.1988.Froc.p.24.

11.Vsevolodov N.N., Druzhko А.В., Dyukova T.V. Some methods for irreversible write-once recording 3n "Biochrom" films//Images of the Twenty First Century. Aim.Intern.Conf.of the IEEE Engineering in Medicine and Biology.Seattle.USA.1989.Proc.p.1327.

12.Vsevolodov N.N., Druzhko А.В., Dyukova T.V. Actual possibilities of bacterlorhodopsin application In optoelectronics//In book "Molecular Electronics-Biosensors and Biocomputei'S" ed.by F.Hong Plenum Press.N.Y.1989.p.381-384.

13.Броун Л.С., Дружко А.Б., Лукашев Е.П., Чаморовский С.К. Изучение фотохимического цикла аналога бактериородопсина, содержащего остаток 4-кето-ретиналя//Биол.мембраны.1991.т.8..№5.с.460-467.

14.Vsevolodov N.N., Dyukova T.V., Druzhko А.В., Shachtazjan V.Yu. optical recording material based on bacterlorhodopsin modified with hydroxylamine//Optlcal Memory and Neural Networks. ed.A.L.Mikaelian. Proc.SPIE 1621.1991.p.11-20.

15.Броун Л.С., Дружко А.Б., Чаморовский С.К. Световая' адаптация аналога бактериородопсина с 4-кето-ретиналем//Биофизика.1992.т.С7. №1.с.79-85.

16.Лукашев Е.П., Дружко А.Б., Кононенко А.А. Электроиндуцирован-ний батохромный сдвиг полосы поглощения 4-кето-бактериородопсина в пленках на желатиновой основе//Биофизика.1992.т.37..№1.с.86-90

17.Броун Л.С., Дружко А.Б., Кононенко А.А., Чаморовский С.К., Шахбазян В.Ю. Спектральные свойства аналога бактериородопсина, полученного встраиванием 4-кето-ретиналя в бактериоопсин In vivo// Лиол.мембраны.1992.в печати

18.Brown L.S., Druzhko А.В., Chamorovsky S.K., Kononenko А.А. ИпЫп А.В. Regulation of light adaptation In bacterlorhodopsin analog containing 4-keto-retinal//Photochem.Photobiol.1992. in press.

19.11.92 г. Зак.5227Р Тир.85 экз. Уч.-изд.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в ОНТМ ПНЦ РА11