Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хромофор-белковые взаимодействия и световая адаптация бактериородопсина с замедленным фотоциклом

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Хромофор-белковые взаимодействия и световая адаптация бактериородопсина с замедленным фотоциклом"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНША, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ

И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

БРОУН Леонид Сергеевич

УДК

ХРОМОФОР-БЕЖОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И СВЕТОВАЯ АДАПТАЦИЯ БАКТЕРИОРОДОПСИНА С ЗАМЕДЛЕННЫМ ФОТОЦИКЛОМ

(03.00.02 - биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Раоота выполнена на кафедре биофизики Биологического факулкггт» Мо<.-конского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Научный рукоподитель: доктор биологических наук,

профессор А.А.Кононенко. Научный консультант: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник С.К.Чаморовокий.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

и-дущам организация: Международный НШ проблем .управления.

■I (■''); на заседании Специализированного совета К 0Ь3.0!>.68 при Ш • ■т'нс-ном Го'-уднретжжнш Университете им М.И.Ломотк-она по »Л1**.-у: №мж№} 1ТУ89У, Ленинские горы, Биологический факультет

С диссертацией можно "¿знакомиться в биЬлиотеке Биоло-ичоского факультета М1!У.

член-корреспондент АН СССР. I фофессо р М. А. Ост|)ов< 'Кий; кандидат биологических на.ук., старший научный сотрудник С.П. Кчл.-шкш.

Автореферат разослан

£

ШН )'<

■ода.

Учиняй секретарь Совета,

т.К'1'.^р С'д\1юги'1,\.|;п!' наук

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Бактериородопсин (БР) - один из наиболее изученных в настоящее время ретиналь-содержащих фоточувствительных белков. Несмотря на обилие работ но БР и больше успехи в исследовании его фотохимических превращений, открытым остается целый рад вопросов о механизме функционирования БР. Одной из ключевых является проблема взаимодействия белок-хромофор и еначения конкретных зарядовых взаимодействий для протекания фотоцикла ЕР и для процессов перехода между состояниями пигмента с различной конформацией ретиналя (т. н. процессов спето- и темно-адаптации). Наиболее перспективный подход к изучению атих взаимодействий - замена ретиналя на его синтетические аналоги, особенно на те, которые могут определенным образом изменять характер белок-хромофорных взаимодействий. Одним из таких аналогов является 4-кето-БР, имеющий измененнную структуру в месте предполагаемого взаимодействия ретиналя с белковыми группами.

Другим традиционным плодотворным подходом к изучений связи изменений фотоцикла БР с изменениями в его адаптационных процессах является модификация БР при помощи дегидратации, повышения рН и мембранотропных агентов. Перспективно сравнить фотохимические превращения 4-кето-аналога с превращениями модифицированного БР с целью выявления роли белок-хромофорных взаимодействий в различных аспектах функционирования БГ.

В соответствии е этим, ЦЕЛЬЮ работы было исследование влияния изменений белок-хромофорных взаимодействий на фотоцикл и светоадаптацию бактериородопсина и установление связи изменений в фотоцикле с наблюдаемым характером адаптационных процессов. Были поставлены ЗАДАЧИ:

I. Детально исследовать фотоцикл 4-кето-аналога БР различными спектральными методами, в том числе и кинетическими, для чего создать управляемый ЭШ импульсный дифференциальный спектрофотометр с микросекундннм временным разрешением.

-22. На основании квантово-химического рассмотрения хромофоров ЕР и 4-кето-БР попытаться предсказать последствия изменения взаимодействий белок-хромофор.

8. Исследовать процессы свето- и темно- адаптации в 4-кето-БР и их связь с характером его фотоцикла.

4. Изучить влияние таких модифицирующих воздействий, как дегидратация, высокие значения рН среды и мембранотроп-ные агенты, на фотоцикл и светоадаптацию ЕР и сопоставить результаты с полученными при изучении 4-кето-акалога.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Теоретически и экспериментально рассмотрено влияние модификации хромофора БР в области циклоге-ксенового кольца. Описаны фотоциклы полностью-транс- и 13-цис-изомеров 4-кето-ЕР, при этом обнаружен ряд новых интермедиатов. Обнаружены условия появления светоадаптации 4-кето-аналога ЕР, найден способ накопления того или иного изомера аналога. Для 4-кето-БР показано наличие фотмшдуцированной реакции перехода из фотоцикла транс-изомера в 13-цис-изомер (аналогично сухим пленкам ЕР). Показана связь процессов светоадаптации и кинетики фотоцикла для БР и его 4-кето-аналога, выявлена причина снижения эффективности светоадаптации при дегидратации ПМ и в щелочной среде. Показано образование нового интермедиата при длительной дегидратации ЕР. Описана форма ЕР, возникающая при действии диканна, сходная с образующейся при высоких значениях рН.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Результаты исследования свойств БР и его аналогов в зависимости от различных воздействий, замедляющих или модифицирующих фотоцикл могут быть использованы при создании новых материалов в микроэлектронике. Исследование свойств 4-кето-аналогов БР, полученных различными способами, важно для получения аналогов ЕР, имеющих наименьшие нарушения структуры белка. Созданный автоматизированный лазерный спектрофотометр может быть использован для исследования фотобиологических процессов в мембранах и белковых комплексах.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы доложены на 18 научной конферевдии молодых ученых Биологического факультета МГУ (Москва, 1987), на 2 Всесоюзной конференции "Математические и вычислительные методы в биологии. Биомолекулярные системы." (Пущино, 1987), на 2 Всесоюзной конференции "Физико-химическая биология и биотехнология фототрофных микроорганизмов" (Москва, 1987), на 2 Всесоюзном совещании "Фото- и злект-рохромные биоэлементы технического назначения" (Пущино, 1988) и на семинарах кафедры биофизики Биологического факультета МГУ.

По материалам работы имеется семь публикаций, одна работа находится в печати.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка литературы из 420 наименований и приложения. Работа изложена на 190 страницах машинописного текста, включает 29 рисунков и 2 таблицы.

ГЛАВА I представляет собой обзор литературы, посвященной бактершродоисину, изучению его фотохимического цикла и модификациям бактериородопсина.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1.Приготовление образцов для исследования.

Пурпурные мембраны Н&ЬЬаНегшт ЫоЬшт штамма 353-П и ИШ! были получены из института биофизики АН СССР в Пущино (Л.Н. Чекулаева, В.А. Шахбазян), а из штамма ЕТ-Ю00 выделены по стандартной методике (Ое^егЬеН, 31оескел]и£, 1974).

4-кето-аналог БР был приготовлен в институте биофизики АН СССР в Пущино А.Б.Дружко, обработка апомембран и реконструкция пигмента ло методике (Дружно и др., 1986). Использовали и альтернативный метод получения 4-кето-БР, когда к дефектному по синтезу ретиналя штамму галобактерий добавляли в среду выращивания 4-кето-ретиналь.

Образцы пленок ИМ с фиксированной влажностью получали при выдерювании в герметичной камере с насыщенными растворами

солей или Сахаров в течение 15-45 часов. Быстрая или более глубокая дегидратация проводились путем откачки паров воды из камеры с образцом форвакуумным насосом.

2.2.Методы экспериментального ^следования образцов.

Спектры поглощения образцов и кинетику медленных фаз фо-тоиндуцированных изменений поглощения регистрировали на двухлу-чевом спектрофотометре Hitachi 557 (Япония). Низкотемпературные измерения производили в фирменной приставке либо в криостате с хладопроводом (Кононенко, 1980). Спектры стационарной флуоресценции образцов регистрировали на спектрофлуориметре Hitachi 850 (Япония). Обработку спектров и разложение кинетических кривых на компоненты проводили при помощи программ на языке ВВС BASIC.

Кинетику быстрых фаз фотоиндуцированных изменений поглощения исследовали на автоматизированном однолучевом дифференциальном лазерном спектрофотометре, сконструированном с нашим участием и описанном в работе (Чаморовский и др., 1989). Источник активирующего света - импульсный лазер на неодиме 0Ш-40 (Л0М0, "X 530 нм, длительность 15 не) или фотовспышка ЛУЧ-70 (длительность 700 мке), фотоприемник - ФЭУ-П5 или ФЭУ-39. Сигнал от фотоприемника поступал на АЦП DL-912 ("DATA Lab", Великобритания, частота дискретизации 20 МГц), сопряженный в автоматическом режиме с микроЭВМ Torch-CZl ("Herald Computers", Великобритания). Программы управления экспериментом, обработки и вывода данных написаны на языке ФОРТРАН при консультации В.В.Горохова и И.В.Упорова. Разложение кинетических кривых на экспоненциальные компоненты осуществляли по методу Маркуарта (Хишельблау, 1973).

Сверхбыстрые (пикосекундные) изменения поглощения и флуоресценции регистрировались совместно с С.Л.Логуновым и С.С. Васильевым на автоматизированных пикосекундном дифференциальном спектрофотометре и пикосекундном флуориметре, сконструированных на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ (Л активирующего света 530 нм, длительность 30 пс) (Корватовский и др.,

-5198?, Васильев, Пащенко, 1987).

Спектры кругового дихроизма регистрировали на епектро-поляриметре J-40AS фирмы «Jasco» (Япония) в институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР совместно с В.В.Шубиным.

Спектры резонансного комбинационного рассеяния (PHP) образцов регистрировали совместно с А.А.Чуриным на автоматизированном РКР-спектрометре, сконструированном на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ (Гаджиев и др., 1980).

Дифференциальная сканирующая калориметрия образцов проводилась на приборе ДАСМ-1М производства СКБ ЕЛ АН СССР (г. Пущино) Б.К.Семиным. Скорость сканирования - I градус в минуту. 2.3.Квантово-химические расчеты.

Квантово-химические расчеты параметров ретиналь-подоб-ных молекул производили при помощи программы, написанной при консультации Г.Т.1>рия и И.К.Савостина на языке ФОРТРАН (текст дан в приложении). При расчетах использовали модифицированный метод Хюккеля, пригодный для качественных оценок и сравнений распределения зарядов в молекулах, имеющих сопряженные Я-связи (Пюльман, Пюльман, 1965, Дьюар, 1972). Модификация заключается в учете отличий гетероатомов, введении процедуры самосогласования и учете непланарности молекулы, т.е. скручивания связей. Возможно учесть и наличие метильных групп путем введения поправок к кулоновскому интегралу атома, связанного с метилом (Пюльман, Пюльман, 1965). Самосогласование представляет собой итерационную процедуру, на каздом шаге которой диагональный элемент матрицы Гамильтониана изменяется в соответствии с изменением порядка связи на предыдущем шаге (Заградник, Полак, 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСЭТ.^НИЕ ГЛАВА 3. ФОТОИНДУЦЙРОВАННЫЕ РЕАКЦИИ АНАЛОГА БАКГЕИЮРОДОПСША С 4-КЕГО-РЕГИНАЛЕМ 3.I.Фотоцикл 4-кето-бактериородопсина. Спектр поглощения аналога бактерисродопсина, содержаще-

2-т

го 4-кето-ретиналь, (4-кето-БР) характеризуется широкой основной полосой поглощения с максимумом около 508 нм, включашцей полосы как 13-цис- (максимум 504 нм), так и полностью транс- (максимум 52? нм) хромофора (Хитрина, Лазарова, 1989).

Освещение водно-глицериновой суспензии 4-кето-ЕР при -196 С желтым светом приводит к батохромному сдвигу основной полосы поглощения (РисЛА), соответствующему образованию батоинте-рмедиатов подобных К. Постепенное размораживание освещенного образца приводит к появлению при -ПО С плеч дифференциального максимума (РисЛБ), которые можно ассоциировать с восстановлением исходных форм 4-кето-БР (плечи при 475 и 510 нм), и трех полос, сопоставимых с интермедиатами типа М (дифференциальные максимумы 390, 410 и 430 нм), хотя наличие нескольких полос можно объяснить вибронной структурой (Карнеева и др., 1989). Не обнаружено полосы интермедиата типа Ь, что может быть связано с тем, что максимум его поглощения близок таковому для 13-цис-4-кето-ЕР, но более вероятно, что при размораживании до пороговой температуры батоинтермедиаты переходят непосредственно в М-интермедиаты и параллельно возвращаются в исходное состояние 4-кето-БР.

Обнаруженное при низкой температуре наличие нескольких форм интермедиата М подтверждается изучением фотоиндуцированных изменений поглощения 4-кето-ЕР в фотостационарных условиях при комнатной температуре. В диапазоне рН 6-9 можно наблюдать 2 дифференциальных максимума (Рис.2А,2Г), соответствующих накоплению интермедиатов М-420 и М-440 (индекс после М- указывает на положение максимума полосы соответствующего интермедиата в абсолютном спектре образца, освещенного при -196 С и размороженного до -70 С). Полоса третьего, коротковолнового компонента появляется в дифференциальном спектре (Рис.2В) только при щелочных рН, что связано с коротким временем его жизни при рН менее 9,5.

Кинетика релаксации полос поглощения интермедиатов М-420 и М-440 описывается двумя экспонентами с характеристическими

временами порядка SO с и десятка мин (при рН 7.5), причем вклад медленного компонента больше в-длинноволновой области. После релаксации полосы М-420 можно наблвдать дифференциальный максимум медленного М-продукта при 435 нм (Рис.2Д), т.е. распаду М-440 соответствует минутная, а распаду М-420 - секундная фаза.

Время распада интермедиатов М-420 и М-440 зависит от рН в диапазоне 5-9 (Рис.3), что не характерно для интермедиата М на-тидаох'о ЕР (Ames, Mathies, 1990), причем характер зависимости констант от рН (Ig(k)-v—рН/3) сходен с известным для ЕР мутантного по Asp -96 (Tittor et al., 1989). Считается, что такая зависимость говорит о нарушении репротонирования ШО от внутрибелкового донора, причем величина, определяющая скорость репротонирования, это активность протонов не в объемной фазе, а в протонном канале (Miller et al., 1990).

При рН 4.5 в фотостационарных условиях наблюдается лишь один дифференциальный максимум интермедиата М-440 (Рис.2Б), что связано с ускорением распада М-420 при понижении рН. Положение дифференциального минимума при 530 нм позволяет отнести интерме-диат М-440 к фотоциклу транс-4-кето-БР (максимум поглощения при 527 нм). Неизменность положения дифференциально,.« минимума в диапазоне рН 5-9, когда кроме М-440 присутствует и М-420 (Рис.2А), позволяет считать, что и М-420 - продукт фотоцикла транс-4-кето-ЕР. Нельзя исключить, что компонент М-440 полностью или частично определяется поглощением интермедиата подобного N, в пользу чего свидетельствует близкое к полосе поглощения 4-кето-БР положение его дифференциального максимума, хотя против этого говорят нехарактерные для N условия накопления (низкие ионная сила и рН) и рН-зависимость скорости распада, совпадающая с зависимостью для М-420, а также одновременное появление полос М-390, М-420 к М-440 при размораживании освещенного при -196 С образца.

При рН более 9.5 дифференциальный минимум смещается к 502 нм (Рис.2В) и на дифференциальном максимуме появляется плечо при 390 нм, аналогично низкотемпературному спектру (Рис.1). Кор-

Рис.1. Изменения спектра поглощения водно-глицериновой суспензии (60 об. % глицерина) 4-кето-БР. А - после освещения образца (580 нм>Х >460 нм) при -196 С, Б - после размораживания образца до -ПО С (снят относительно образца А)).

а А д А

Рис.2. Фотоиндуцированные изменения поглощения водной суспензии 4-кето-ЕР. А - через 10 с после выключения активирующего света при рН 7.5, Б - то же при рН 4.5, В - то же при рН 10,5. Справа - Динамика изменений при рН 7,5. Г - изменения спектра при действии постоянной подсветки (^>520 нм), Д - через I мин после выключения активирующего света.

реляция появления дифференциального максимума при 390 нм и дифференциального минимума, соответствующего исчезновению 13-цис-пигмента позволяет предположить, что интермедиа? М-390 является продуктом фотоцикла 13-цис-4-кето-ЕР. Появление третьего спектрального компонента коррелирует с появлением дополнительного компонента релаксации фотоивдуцированных изменений поглощения.

Индуцированный лазерной вспышкой рост поглощения при 570 нм, не разрешаемый по времени (быстрее 50 не), можно приписать К-интермедиатам фотоцикла 4-кето-БР (Рис.4А). Измерение времени нарастания этого сигнала в пикосекундном диапазоне показало, что оно короче 30 пс. Измерения пикосекундной флуоресценции показали, что время ее затухания в красной области менее 5 пс, как и в случае ^модифицированного ЕР (Коиуата е1 »1., 1985), т.е. батоинтер-медаат является практически нефлуоресцируишт. Спад фотоиадуци-рованного поглощения при 570 нм (Рис.4А) происходит с порядка 50 мке, что коррелирует с ростом поглощения в области 380-440 нм (Г"=60 мке), соответсгвущим образованию интермедиатов М (Рис. 4Б). Это соотносится с вышеприведенными данными о невыраженности полосы интермедиата Ь и позволяет предположить его отсутствие в цикле превращений 4-кето-БР.

Кинетика распада интермедиата М содержит быстрый компонент (£^10-15 мс) и медленный, не релаксирупций за 0,5 с (Рис. 4В), по-видимому, соответствующий распаду М-420 и М-440, что подтверждается ростом вклада этого медленного компонента с увеличением длины волны регистрации. При понижении рН наблюдается уменьшение вклада быстрого компонента, предположительно соответствующего распаду М-390, что подтверждается данными фотостационарных экспериментов, где появление полосы М-390 наблюдается лиаь при замедлении фотоцикла, т.е. в водно-глицериновой суспензии, при низкой температуре (Рис.1) или при рН > 9,5 (Рас.2В).

В области 594 нм наблюдается фотоиндуцированный рост поглощения с порядка 15 мс (зто коррелирует о быстрой фазой рас-3- /яу

5,0

¿,5

о,о

5,0

2,5

û.t

h(t)-

рИ

5,0 7,5 10,0 1,0 6,5 9,l

I'hc.S. Зависимость от pH кинетики распада М-интермедаа-toi: цикля 4-кото-ЕР. А - быстрая фаза (М-420), Е - медленная (фаза (М-440) В - быстрая фаза в присутствии азида (50 мМ), Г - ме-дтенна.я фаза в присутствии азида (ГО мМ), Д - быстрая фаза (М-420 цикла 4-кето-БР из штамма JW-5), Е - медленная фаза (М-440 цикла 4-кето-БР из штамма JW-5).

В ;

л) 5 i'.KC

Рис;.4. Кинетика изменений поглощения суспензии 4-кето-> ' (1U мЫ трицил, рН-?.Ь) индуцированных лазерной вспышкой (15 не, 580 им, 30 мДж, шмект импульсного воздействия указан стое-лкой). À - при tvo ш, Б, В - при 420 ш, Г - при 594 нм.

лада М), сменявшийся спадом (Токоло 700 мс), что можно ассоциировать с образованием и распадом интермедиата 0 (Рис.4Г). В фо-тостационаркых измерениях можно наблюдать "медленный" интермеди-ат типа 0 при 594 нм: рост поглощения (Г=48 с), коррелирующий но времени с распадом М-420, и очень медленный спад {Х~ 45 мин).

Имеющиеся спектральные и кинетические данные позволяют предложить схему фотохимических превращений 4-кето-БР (величины характеристических времен, приведенные на схеме, соответствуют рН 7.5 и комнатной температуре, не показаны возможные переходы междо фотоциклами 13-цис-4-кето-БР и транс-4-кето-ЕР).

13 -ЦИС-4-КЕГ0-ВР-504 ---------**К-5? 0

! <30 пс

5-10мс

—* ь?

0.5-1с 15-20мс -----------0 -л------М-390-

60 мкс

г

I----Г"

I I I

»ТРАНС-4-КЕТ0-БР-527 ----------К-570

♦

■Ь?

45 мин

I

30 с

50 с

<30 пс

I I

V

I?

I I

60 мкс

1------- 0-594-«----М-420

10 мин

60 мкс

М-440(т)-

3.2.Аналог, полученный встраиванием 4-кето-ретинвля ш у^о.

Существуют отличия вышеописанного 4-кето-БР, полученного встраиванием 4-кето-ретшаля в аяомембракы штаммов ШМ1 (БТ-

-121000), от пигмента, полученного при выращивании мутантного без-ретинального штамма на среде с 4-кето-ретиналем. Спектр поглощения этого "мутантного" 4-кето-БР имеет минорную полосу при 410 нм, соответствующую поглощению цитохрома Ь коричневых мембран - предшественников ИМ (Эитрег е4 »1., 1976), а спектр ЕД лишен дублета, свидетельствующего об экситонном взаимодействии в тримере (Неуп »1., 1975), что позволяет говорить об измененной структуре мембран (это подтверждается и характером спектров УФ флуоресценции).

В целом, схема фотоцикла "мутантного" 4-кето-БР содержит те же интермедиаты, что и у аналога, полученного т уйго, однако, помимо отличий в структуре, "мутантный" 4-кето-БР демонстрирует изменение характера зависимости кинетики распада интермеда-атов М от рН (Рис.3). В интервале рН 5-7 зависимость описывается как ]в(к)~-рН/5, а в диапазоне 7-9 как 1в(к)л/-рН/1,25. Такой характер зависимости п£и рН > 7,0 отражает тот факт, что скорость репротонирования лимитируется концентрацией протонов во внешней среде, а не скоростью их диффузии к устью полуканала (Семенов и др., 1986), и может следовать из измененной структуры мембран.

3.3.Квантово-химическое рассмотрение хромофора аналога.

Квантово-химические расчеты при помощи модифицированного метода Хюккеля позволяют сравнить распределение зарядов в хромофорах 4-кето-БР и БР. Результаты, полученные при расчете параметров хромофора БР (Табл.1), коррелируют с расчитанными методом М^ОС при учете ¿-связей {Тауап е1 »1., 1985). Сравнение параметров хромофоров ЕР и 4-кето-БР позволяет считать, что введение в ре-тиналь 4-кето-группы не влияет на распределение зарядов в части полиеновой цепи от N до С-9 (Табл.1), что позволяет предположить неизменность характера изомеризации в цикле. Однако, наблюдается появление диполя, локализованного в области циклогексенового кольца, где происходит зарядовое взаимодействие белка с хромофором (КакашзЫ е1 а1., 1980). Исходя из возможного изменения характера это-

го взаимодействия из-за введения электроотрицательного заместителя, для 4-кето-БР можно ожидать сдвига основной полосы поглощения, нарушения светоадаптации, замедления перехода К-Ь и распада интермедиата М, существования независимых циклов 13-цис- и транс-4-кето-БР. Выше нами показаны соответствующие изменения кинетики распада К и М, однако, причины отеуствия светоадаптации у 4-кето-БР прямо не вытекают из квантово-химичесжого рассмотрения хромофоров и требуют детального исследования.

Таблица I. Параметры хромофора БР и 4-кето-БР, рассчитанные модифицированным методом Хшкеля с учетом наличия мотилышх групп. Заряды даны в единицах заряда электрона, величина порядка связи 0 соответствует одинарной связи, а I - двойной. Для сравнения даны заряды, подученные методом МЫООС (Тауап е1 а!., 1985).

Атом ИО ретиналя ШО 4- -кето-ретиналя ШО ретина/

ряд Порядок Заряд Порядок Заряд атома

атома связи атома связи |МЫООС)

() ------ ----- 1.25 .94

С-4 ----- ----- .79 .26 —

С-г, . 89 . 90 . 93 .87 .93

С-6 1.07 .41 1.02 .43 I. . 10

С-7 .97 .82 .98 .81 .95

С-8 1.04 . 45 1.02 .46 I. . 13

С-9 .90 .80 .90 .80 90

С-10 1.07 . 46 1.06 .46 I. .17

С-П ,У7 .81 .97 .81 ,83

С-12 1.01. .43 1.04 .43 I. 20

С-13 .89 .86 .89 .86 79

С-14 1.11 .28 I. II . 28 I. .27

С-15 .80 . 93 .80 .93 72

N 1.25 ------ 1.25 ----- I. 25

3.4.Световая адаптация 4-кето-6актериородопсина.

Освещение темноадаптированного 4-кето-БР не вызывает появления характерного для БР батохромного сдвига полосы поглощения, связанного с накоплением транс-БР, что говорит об отсутствии нормальной светоадаптации. Добавление 50 мМ азида натрия меняет характер фотоиндуцированных сигналов. Освещение образца при рН менее 7,5 приводит к появлению (после релаксации изменений, соответствующих образованию интермедиатов) батохромного сдвига основной полосы поглощения от 508 нм к 522. Дифференциальный спектр сходен со спектром "свет-темнота" для БР и, по-видимому, отражает накопление транс-4-кето-БР на свету. Обратный переход в 13-цис-4-кето-БР происходит в темноте с характеристическим временем около 20 ч (что значительно медленнее времени темноадапта-ции БР) и ускоряется приблизительно в 15 раз при повышении температуры от 20 до 50 С. Таким образом, добавление азида натрия к суспензии 4-кето-БР с рН в диапазоне 5-8 делает возможными процессы сходные с адаптационными процессами БР.

Если в образце, светоадаптированным вышеописанным образом, сместить рН до значения более 8, то на свету происходит накопление 13-цис-4-кето-ЕР, сопровождающееся гипсохромным сдвигом полосы поглощения к 504 нм, т.е. наблюдается т.н. темноадаптация на свету. Таким образом, в присутствии азида соотношение изомеров 4-кето-БР при светоадаптации зависит от рН (кажущаяся величина рК равновесия изомеров лежит при рН 7,7-8,3). У 4-кето-БР без азида равновесие сдвинуто в сторону 13-цис-изомера, что регистрировалось как отсутствие светоадаптации. Итак, возможен контроль светоадаптации 4-кето-БР, т.е. избирательное накопление I любого изомера при изменении рН в обработанном азвдом образце.

Добавление азида натрия вызывает также изменения в кинетике фотоциклов изомеров. Более чем в 100 раз замедляется распад интермедиата Ы-390 фотоцикла 18-цис-4-кето-ЕР. При этом замедление распада длинноволновых Ы-интермедиатов невелико, с сохране-

нием характера зависимости кинетики распада от рН (Рис.3), т.е. фотоцикл транс-4-кето-БР замедляется намного слабее, чем 13-цис. По-видимому, взаимные перехода фотоциклов изомеров осуществляются через М-интермедиаты. Наблвдаемое появление светоадаптации объясняется тем, что азид при нейтральных рН замедляет распад М-390 фотоцикла 13-цис-4-кето-БР значительно сильнее, чем распад М-420 и М-440 фотоцикла транс-4-кето-ЕР, что и ведет к эффективному переходу М-390 в транс-4-кето-ЕР и накоплению последнего при нейтральных рН. При повышении рН происходит замедление распада М-420 и М-440 (Рис.3), тогда как у М-390 скорость распада не зависит от рН в диапазоне 5-9. В результате обратной реакции перехода длинноволновых интермедиатов М в 13-цис-4-кето-БР на свету происходит его накопление, что выражается вышеописанной "темноадаптацией светом" при смещении рН в щелочную область. Вероятно, в отсутствие азида происходит сходный процесс, т.е. све-тоадалтация не наблвдается по причине эффективного перехода М интермедиатов фотоцикла транс-4-кето-БР в 13-цис-4-кето-ЕР.

Итак, наши данные позволяют предположить, что выраженность светоадаптации зависит от отношения констант распада М-ин-термедиатов цис- и транс- циклов, т.к. возвращение интермедиатов М в исходит пигмент конкурирует с переходом в цикл другого изомера. В поддержку нашей гипотезы можно указать на известную корреляцию торможения образования транс-БР на свету с замедлением распада М-412 (С&бкКо еС аЛ., 1950, Когег^еш, Невв, 1977) и на накопление 13-цис-лигмента на свету при сильном замедлении распада М (Балашов, 1985, Коиуата е( а.1., 1985, Даншина, 1989).

Молекулярный механизм избирательного действия азида на кинетику цикла 13-цис-4-кето-БР возможно основан на различиях в способе репротонирования Ш0 разных М-интермедиатов. Если репро-тонировяние у М-420 и М-440 от внутрибелкового донора нарушено, то быстрая, независимая от рН кинетика репротонирования ¡20 у М-390 позволяет считать, что оно происходит от внутрибелковой гру-

шшровки. Анион азида, имеющий рК 4.6, может проникать в ПМ и влиять на состояние протокированноети групп (Tittor et al, 1989) , например, депротонировать донор, репротонирующий ШО у М-390, и замедлять распад М-390, почти не влияя на распад М-420 и М-440.

4-кето-БР сходен во многом с дегидратированными пленками ПМ. Так, для пленок известно сильное замедление распада интермедиата М (Korenstein, Hess, 1977), исчезновение интермедиата L (Чаморовс-кий И др., 1984) И отсутствие светоадаптации (Korenstein, Hess, 1977). Возможно, данный параллелизм обусловлен изменением протонирован-ности одних и тех же групп из-за изменения микроокружения и в случае дегидратации, и при изменении взаимодействий хромофор-белок в 4-кето-БР. Замедление распада М и блокирование светоадаптации в дегидратированных ПМ в свете выдвинутой для 4-ксто-ВР гипотезы зависимости светоадаптации от кинетики фотоцикла делает актуальным исследование пленок ПМ в этом аспекте.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ НА СВЕГОАДАПТАЦИЮ

ВОЗДЕЙСТВИЙ, ЗАМЕДЛЯЮЩИХ ФОТОЦШ БАКГШОРОДОПСША.

4.1.Светоадантация дегидратированных пурпурных мембран.

Исчезновение светоадаптации при дегидратации объясняли либо блокированием цис-транс изомеризации (Korenstein, Hess, 1977а), либо снижением квантового выхода светоадаптации (Varo, Bry¡, 1988). tí работе (Kouyama et al., 1985) высказывается иная точка зрения -постулируется реакция перехода интермедиата М в 13-цис-ЕР, приводящая к снижению эффективности наконления транс-БР на сзету. Прояснить механизм снижения эффективности светоадаптации при дегидратации БР могли бы эксперименты по фотоактивации ПМ с содержанием транс-БР большим, чем равновесное для данной влажности. В случае правоты первой группы гипотез не должно происходить изменений в изомерном составе, в случае же наличия перехода интермедиата М в 13-цис-БР, после освещения должно увеличиться содержание 13-цис-БР, т.е. наблвдаться "темноадаптация на свету".

В процессе светоадаптации влажные пленки ПМ переходят в

состояние с максимумом при 568 нм, аналогичное суспензии ИМ, со держащей преимущественно транс—БР. Быстро дегидратированные в в темноте ПМ (за 10 мин) содержали 75-80% транс-БР (максимум спектра при 554 нм), что совпадает с содержанием транс—БР в образце, не претерпевшем дегидратации, через 10 мин после окончания светоадаптации. После освещения дегидратированных таким образом ПМ, наблвдается гинсохромный сдвиг полосы поглощения до 560 нм, причем дифференциальный спектр фактически идентичен спектру "темнота-свет", отражающему накопление 13-иис-КР, т.е. регистрируется "темноадаптация на свету".

Дегидратация пленок ПМ, использовавшихся в ньши-п экспериментах, приводит к замедлению распада интермедипта М (до десятков сек). Наблвдаемая "темноадаптация на свету" поддерживает идею зависимости эффективности светоадаптации от кинетики распада интермедиата М. По-видимому, реакция возвращения интермеди-ата М в транс-ЕР-568 конкурирует с переходом в 13-цис--БР и при замедлении распада растет доля М-412, переходящего в ЕР-548, а итоговое количество 13-цис-БР, переходящего в состояние БР-568 н процессе светоадаптации, снижается. Таюм образом, светоивдуци-рованный переход из фотоцикла транс-изомера в 13-цис-изомер, обнаруженный для 4-кето-БР и существующий в немодифищрованном БР при дегидратации, ведет к снижению иффективносп. светоадаптации. В связи с тем, что в дегидратированных ПМ всегда присутствует много 13-цис-БР и может происходить изменение протонировянноети различных групп, возможно появление интермедиатов, не характерных для суспензии ПМ.

4.2.Мода_^жащя фотоцикла бактериородонсина при дегидратации.

При выдерживании пленки ПМ в атмосфере низкой влажности (менее 15%) в течение суток и более, наблюдается появление дополнительного плеча в дифференциальном максимуме фотоипдул^ронан-ного спектра при 385 нм и сдвиг изобесгической точки к 452 нм. При перенесении такой пленки в атмосферу 100% влажности на час

и более, можно наблюдать данное плечо в виде отдельного максимума, относительная амплитуда которого по мере выдерживания во влажной среде медленно уменьшается. Данный максимум преобладает над основным при низкой интенсивности сзета и выровдается в плечо при повышении Интенсивности, что позволяет считать этот продукт (назовем его М-385) наиболее медленно распадающимся в реги-дратированных ПМ. По-видимому, образование компонента М-385 зависит от состояния протонированности некоторой группы, депрото-нирование которой происходит при дегидратации.

Можно предположить, что при длительной дегидратации пленок ПМ, аналогично процессам, имеющим место при высоких рН (Кау-лен, Постаногова, 1990), происходит депротонирование группы, которая может акцептировать протон с Ш0 13-цис-БР, вследствие чего образуется интермедиат М-385. По-видимому, наблвдаемый нами ин-термедаат М-890 фотоцикла 13-цис-4-кето-ЕР это аналог М-385.

Интересно отметить, что подобный спектральный компонент (М-385) был зарегистрирован при постоянном освещении светоадап-тированной суспензии ПМ с рН более 9,0. Однако, его происховде-ние требует прояснения, т.к. присутствие 13-цис-БР в таких суспензиях ранее не регистрировалось, хотя его можно ожидать, исходя из выдвинутой гипотезы связи эффективности светоадаптации с кинетикой фотоцикла, которая замедлена при щелочных рН.

4.3.Светоадаптация и модификация ЕР при щелочных рН.

Для выяснения зависимости степени светоадаптации суспензии ПМ от рН регистрировали амплитуду спектральных изменений, связанных со светоадаптацией. При этом было обнаружено, что амплитуда спектра светоадаптации уменьшается при увеличении рН более 9,0. Однако, оказалось, что это снижение количества 13-цис-БР, переходящего в транс-ЕР при светоадаптации, связано с переходом в щелочную форму ЕР - ЕР-460 из транс-ЕР, образующегося в процессе светоадаптации. Наблвдаемый нами в фотостационарных условиях М-лродукт этой формы имел дифференциальный максимум спек-

тра при 390 т и минутную кинетику распада. Можно предположить, что наблвдаемый в дифференциальном спектре при непрерывном освещении щелочных суспензий ПМ компонент, сходный с обнаруженным в пленках М-385, является фотопродуктом щелочной формы ЕР-460, а не 13-цис-ЕР, как предположено для пленок.

Известно, что не только сильное защелачивание суспензии ПМ, но и воздействие целого ряда агентов приводит к образованию сходной с ЕР-460 формой (Овчинников и др., 1980), хотя не известно, во всех ли случаях происходит денротонирование НО. В этой связи интересно рассмотреть влияние на ПМ дикаина', который влияет на характеристики лшшдного 6ислоя и связанные с мембранами катионы (Low et al., 1979, Hanpft et al., 1985, Fremtti et al., 1986), И, по аналогии с другими анестетиками (Nishimura et al., 1985), должен вызывать образование коротковолновой формы БР, подобной ЕР-460.

4.4.Индуцированная дикаином форма бактериородопеина, сходная с щежчндй формой ЕР-460.

Влияние дикаина на ПМ существенно зависит от состояния его ионизации (при рН 7.0 он находится в протонированном состоянии, а при рН 9.5 - в депротонированном). При действии дикаина в депротонированной (электронейтральной) форме наблюдается переход части БР в форму с максимумом поглощения менее 500 нм, преимущественно из БР с ретиналем в транс-конформации, аналогично щелочной форме.ЬР-460 (Овчинников и др., 1980).

Рассчитанный абсолютный спектр поглощения дикаин-индуци-рованной формы имеет максимум при 470 нм (форма БР-470). Спектральные изменения, индуцируемые дикаином, обратимы при закисле-1гии, что может быть связано с изменением заряда дикаина.

Исследование состояния хромофорной группы БР-470 методом РКР показало как появление новой формы (линия 1560 см"1), так и накопление интермедиата с депротонированным BI0 (линии 1570, 1620 см"1), вероятно вследствие замедления фотоцикла. Подобное положение линии основных С=С колебаний (1560 см"') интерпретируется

как следствие изменения окружения хромофора (Pande et al., 1989).

Фотостационарные и кинетические спектральные данные показывают, что депротонированная форма дикаина вызывает замедление распада интермедиата М в фотоцикле БР-570, не влияя на скорость его образования. Индуцированная дикаином форма БР-470 также обладает фотохимической активностью. Максимум спектра интермедиата М в фотоцикле этой формы сдвинут к 380 нм. Кинетика образования этого интермедиата совпадает с таковой для M-4I2 в фотоцикле БР-570, а кинетика распада замедлена на 4 порядка.

Образование новой формы БР под действием дикаина, по-видимому, не обусловлено существенным изменением структуры белка, о чем свидетельствует сходство параметров денатурационных структурных переходов натииного БР и формы БР-470, полученные методом ДСК (температура денатурации 81 С при рН 9.5).

Измерение концентрации двухвалентных катионов в суспензии ПМ показало, что при действии дикаина происходит высвобовде-ние катионов, что, как и гипсохромный сдвиг спектра, может свидетельствовать об ослаблении взаимодействий белок-хромофор.

Воздействие дикаина в протонированной форме при рН 7.0 не приводит к изменению спектра и фотоцикла БР. Бресте с тем, дикаин, не влияя на величину пика денатурации, увеличивает ее температуру на два градуса, что сходно с неспецифическим воздействием на ПМ протонов или одновалентных катионов металлов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование 4-кето-БР показало, что нарушение взаимодействия белок-хромофор в области циклогексенового кольца вызывает ряд изменений в фотоцикле и адаптационных процессах. Интересно рассмотреть сходство свойств 4-кето-БР и БР, модифицированного при дегидратации или повышении рН.

а)Гипсохромный сдвиг максимума поглощения. Наличие такого сдвига согласуется с изменением белок-хромофорного взаимодействия в области С-4—С-6 (Nakanishi et al., 1980). Сдвиг наблюдает-

ся также при глубокой дегидратации ИМ (форма ЕР-530) и при действии щелочных рН или дикаина (форма БР-460 или БР-470), но в этих случаях смещение максимума может быть обусловлено изменением расстояния до противоиона НО или его экранированием (Hildebrandt, Stockburger, 1984, Pande et al., 1989).

б)Отсутствие интермедиа та L и з^едление распада инте-рмедиата К. Отсутствие интермедиата L наблвдали в дегидратированных пленках ПМ (Чаморовский и др., 1984). Хотя причины этого не ясны, как и природа интермедиата L, но, если рассматривать L, как стадию, сопровождающуюся конформациоиными перестойками белка и переносом протона в БР (Fodor et al., 1988), то логично допустить, что как введение дополнительного заряда в хромофор, так и удаление воды может привести к изменению конформационных перестроек.

в)Множественность форм интермедиатов М и 0. Первая причина этого - фотоактивность 13-цис-4-кето-БР, имеющего интермедиата М и 0. Сходное явление обнаружено для 13-цис-ЕР при щелочных рН (Каулен, Зорина, 1988). Зависимость выхода интермедиата М от рН для фотоциклов 13-цис-БР и 13-цис-4-кего-ЕР сходна - при понижении рН он надает, что трактовалось для 13-цис-БР как протежирование группировки, акцептирующей протон Ш0 (Каулен, Поста-ногова, 1990). При длительной дегидратации пленок ПМ нами обнаружено появление коротковолновой формы интермедиата М, также, возможно, связанной с фотоактивностью 13-цис-ЕР. Вероятно, появление интермедиата М в фотоцикле 13-цис-изомеров обусловлено изменением протонированности одних и тех же групп из-за изменения их микроокружения как при дегидратации и повышении рН, так и при изменении зарядовых взаимодействий хромофор-белок в 4-кето-БР.

Вторая причина - две формы интермедиата М в фотоцикле транс-4-кето-БР, что сходно с известным для транс-БР при повышении рН (Govindjee et al., 1989). Возможно, что это связано с существованием двух форм БР, находящихся в рН-зависимом равновесии (Varo, Lanyi, 1990). Для 4-кето-ЕР рК группы, контролирующей равнове-

сие форм может быть сдвинуто, в результате чего две формы M наблюдаются в широком диапазоне рН.

г)Замедление распада интермедиата M и рН-зависимость кинетики распада. Замедление распада M наблвдается при дещдра-тации ПМ и при повышении рН и, по-видимому, связано с малой концентрацией доступных для захвата протонов. Замедление же, наблюдаемое для 4-кето-аналога сходно с известным для БР с заменой аспартата-96 (Tittor et »1., 1989) и, вероятно, связано с нарушением переноса протона от внутреннего донора к 10, о чем свидетельствует характер зависимости кинетики от рН. Изменение взаимодействия с хромофором может влиять на микроокружение этого донора и изменить его рК и, соответственно, донорные свойства.

д)Отсутствие светоадаптации и "темноадаптация светом". По-видимому, отсутствие светоадаптации является вторичным, вытекающим из сильного замедления распада интермедиатов M фотоцикла тракс-4-кето-БР. Вероятно, эффективный переход этих интермедиатов в I3-цис-4-Кето-БР, наблвдаемый как "темноадаптация светом", снижает эффективность светоадаптации. При замедлении же фотоцикла 13-цис-изомера азидом становится эффективной реакция перехода M интермедиата этого цикла в транс-изомер (такая реакция известна и для интермедиата M фотоцикла 13-цис-БР при щелочных рН (Зорина, Каулен, 1988)). Сходный переход интермедаата M в 13-цис-БР при замедлении его распада обнаружен ранее (Kouyama ei al, 1985) и наблюдался нами для дегидратированных пленок ПМ, что подтверждает общий характер связи эффективности светоадаптации с кинетикой фотоцикла транс-ЕР, так же как и известные эффекты корреляции замедления распада M с нарушением светоадаптации для мономерного БР, для ПМ в глицерине и для ряда аналогов ЕР (Dencher et »1., 1983, Балашов, 1985, Данцига, 1989).

ВЫВОДЫ

I. Методами импульсной лазерной и низкотемпературной абсорбционной спектроскопии исследован цикл фотохимических пре-

вращений аналога бактериородопсина (БР), содержащего остаток 4-кето-ретиналя (4-кето-ЕР) и полученного либо встраиванием 4-кето-ретиналя в апомембраны из На1оЬас4епит ЬаЛоЬшт, либо при выращивании безретинальных мутантов галобактерий на среде с 4-кето-ретиналем. Кинетические исследования в микросекундном и миллисекундном временном диапазоне проведены на сконструированном автоматизированном импульсном спектрофотометре.

2. В фотоцикле 4-кето-БР обнаружен батоинтермедиат с временем образования менее 30 пс и характерным временем распада около 50 мкс. Обнаружено также по меньшей мере три спектрально и кинетически различающихся М-подобных интермедиата (М-390, М-420 и М-440). Подтверждено существование по меньшей мере двух фотопродуктов типа 0-640 различающихся кинетически. Интермедиат М-390 предположительно относится к фотоциклу 13-цис-4-кето-БР, а М-420 и М-440 принадлежат циклу транс-4-кето-БР. Кинетика распада ин-термедиата М-390 не зависит от рН в диапазоне 5-9, а у М-420 и М-440 замедляется при повышении рН по закону ^к^-рН/З.

3. Квантово-химические расчеты распределения заряда в хромофорах БР и 4-кето-БР показывают, что различия в распределении заряда не затрагивают область Шиффова основания, а наблюдаются в области циклогексенового кольца.

4. Обнаружено, что фотоиндуцированные спектральные изменения, характерные для световой адаптации, не регистрируются у 4-кето-БР в водной суспензии. После добавления 50 мМ азида при кислых и нейтральных рН такие изменения появляются. При щелочных рН даже в присутствии азида световая адаптация не происходит. Величина рК рН-зависимого спектрального перехода форм 4-кето-БР при светоадаптации составляет 8. Сопоставление кинетик фотоцда-лии 13-цис~ и полностью-транс-4-кето-БР позволяет предположить зависимость светоадаптации от соотношения скоростей распада ин~ термедиатов М этих фотоциклов. Показано наличие светоиндуцирова-нного перехода из фотоцикла полностыо-транс-4-кето-БР в 13-цис-

4-кето-БР, аналогичного наблвдаемому в дегидратированных пленках ЕР переходу из фотоцикла полностью-транс-ЕР в 13-цис-ЕР, спектрально регистрируемого как "темноадаптация на свету".

5. Исследована форма ЕР-470, образующаяся при модификации пурпурных мембран дикаином и сходная с образующейся при высоких рН. По данным спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния света зарядовое окружение хромофора формы ЕР-470 сильно изменено по сравнению с нативкым белком. Форма ЕР-470 обладает фотохимической активностью, причем постоянная времени распада М примерно на 4 порядка величины больше, чем для натив-ного БР-568. Положение и амплитуда денатуращонного пика ЕР-470 указывают на отсутствие значительных изменений структуры белка. Образование сходной формы при высоких значениях рН снижает долю молекул ТЗ т^ис ЕР, претерпевающих светоадаптацию по причине преимущественного образования этой формы из транс-ЕР.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Броун Л.С. Влияние дегидратации на бактериальный родопсин. //Проблемы современной биологии: Тр. 18 науч. конф. мол. ученых биол. фак. МГУ, Москва, 20-24 апреля, 1987. -МГУ, М., 1987,4.2,С.26-30.-Дел. ВИНИТИ 14.09.87, №6653-В87.

2.Броун Л.С., Гурия Г.Т., Савостин И.К. Полуэмпирический квантово-химический метод расчета конформациокных потенциалов ретиналя и его аналогов.//Проблемы современной биологии: Тр. 18 науч. конф. мол. ученых биол. фак. МГУ, Москва, 20-24 апреля, 1987.-МГУ,Ы.,1987,4.2,С.81-35.-Деп. ВИНИТИ 14.09.87, №6653-В87.

3.ГУрия Г.Т., Каштоев В.В., Броун Л.С., Савостин И.К., Варде Я.М., Мельников А.К., Гордеев А.В., рубин А.Б. Физико-математическое описание фотоиндуцированной электронно-конформаци-онной динамики хромофорной группы 6актериородопсина.//Мат. и вы-числ. метода в биологии. Биомолекулярн. системы. 2 Всес. конф., Пущино,8-Ю сент., 1987. Тезисы докл. -Пущино, 1987, С. 66-67.

4-Чаморовский С.К., Сабо Я., Броун Л.С. Автоматизирован-

ный лазерный дифференциальный спектрофотометр дли исследования процессов переноса зарядов при фотосинтезе.//Биол. науки.1989. №6.С.98-100.

5.Броун Л.С., Кононенко- A.A., Протасова Т.Б., Федорович И.Б., Чаморовский С.К. Влияние ультрафиолетового излучения на бактериородопсин.//Радиобиология.1990.Т.30.№4.С.506-511.

6.Броун Л.С., Семин Б.К., Иванов И.И., Кононенко A.A., Чаморовский С.К., Чурин A.A. Дикаин индуцирует образование спектральной формы бактериородопсина БР-470 в пурпурных мембранах галобактерий.//Биохимия.I991.Т.56.#2.С.241-249.

7.Броун Л.С., Дружко А.Б., Лукашев Е.П., Чаморовский С. К. Изучение фотохимического цикла аналога бактериородопсина, содержащего остаток 4-кето-ретиналя.//Биол. мембраны.1991.Т.8.^5. С.460-467.

8.Броун Л.С., Дружко А.Б., Чаморовский С.К. Световая адаптация аналога бактериородопсина с 4-кето-ретиналем.//Биофизика. 1991, в печати.

Подписано к печати Zf.OfM Формат 60x90/16.

Уел, печ. п, It^ Уч.-изд.п, О Тираж -100 экз. Заказ №

Ордена 'Знак Почета" издательство Московского университета. 103009, Москва, ул. Герцена, 5/7. Типография ордена' 'Знак Почета' издательства МГУ. 119899, Москва, Ленкнские горы.