Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние иммобилизации анальгина и циклофосфана на их мутагенность у домовой мыши Mus musculus

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние иммобилизации анальгина и циклофосфана на их мутагенность у домовой мыши Mus musculus"

РГ6 од

- 8 ОКТ 1996

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

ТОГО

Екатерина Феликсовна

УДК 576.312.32:575.113

ВЛИЯНИЕ ИММОБИЛИЗАЦИИ АНАЛЬГИНА И

ЦИКЛОФОСФАНА НА ИХ МУТАГЕННОСТЬ У ДОМОВОЙ МЫШИ

Mus muscufus

Специальность: 03.00.15. - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996г.

Работа выполнена на кафедре медицинской биологии и генетики Санкт-Петербургского медицинского университета им. акад. И.П.Павлова.

Научный руководитель:

- кандидат биологических наук, доц. B.C. Михеев Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор В.Н. Анисимов

- кандидат биологических наук Л.В. Бондаренко

Ведущее учреждение - Институт экспериментальной медицины РАМН.

Защита диссертации состоится 1996г. в<££час.

на заседании диссертационного совета Д 063.57.21. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете

по адресу 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского университета.

Автореферат разослан Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Иммобилизация химических веществ с точки зрения теории мутационного процесса является фактором, модифицирующим мутагенность этих веществ. Проблема модификации химического мутагенеза в настоящее время признана одной из самых приоритетных, поэтому тема диссертационной работы является актуальной в теоретическом отношении. Это определяется еще и тем, что работ по модификации химических мутагенов очень мало, и любые результаты, полученные в диссертационной работе, будут иметь несомненный теоретический интерес.

С другой стороны, проблема генетических последствий загрязнения окружающей среды имеет множество аспектов. Одним из них является лекарственный мутагенез. Развитие фармакологии ведет к тому, что практически каждый человек становится объектом воздействия лекарственных препаратов. Для многих из них, и, в частности, для применяемых населением ненаркотических анальгетиков и цитостатиков. используемых для химиотерапии опухолей, зарегистрирован мутагенный эффект (Sakai et al., 1981; Braun et a!., 1980; Yamomoto et a!., 1982; Reddy et al., 1985; Bochkov et al., 1986; Pydyn et a!., 1991; Hartmann et al., 1995). В этой связи актуальным вопросом является снижение их мутагенности при сохранении терапевтических эффектов этих препаратов.

В медицинской практике для увеличения эффективности действия препаратов все шире используют их иммобилизацию в различных полимерах, например, в поливиниловом спирте (ПВС) и

крахмале.

В связи с этим встает вопрос об изменении мутагенности используемых препаратов. В случае увеличения мутагенности должен быть поставлен вопрос о правомочности применения иммобилизованной формы данного препарата в качестве лекарственной. Не исключено, что иммобилизация будет приводить к снижению мутагенного потенциала лекарственных препаратов. Тогда иммобилизацию можно будет рекомендовать как метод снижения мутагенности лекарственных веществ, особенно если не будет снижен его терапевтический эффект.

Таким образом, выполненная диссертационная работа не имеет аналогов в научной литературе и ее теоретическое и практическое значение несомненно.

Цель и задачи исследования. Целью работы было: оценить возможность модификации мутагенных эффектов анальгина и циклофосфана путем их иммобилизации в различных матрицах.

В наши задачи входило:

1. Изучение мутагенного эффекта терапевтической и субтерапевтической доз анальгина в тестах на индукцию АГС и ХА в клетках костного мозга домовой мыши.

2. Анализ влияния иммобилизации анальгина в ПВС и крахмале на его мутагенность.

3. Сравнение эффективности ПВС и крахмала, как матриц для иммобилизации лекарственных препаратов в тестах на АГС и ХА в соматических клетках.

4. Изучене влияния иммобилизации циклофосфана в крахмале на его мутагенность в тесте на индукцию ХА в сперматоцитах ! домовой мыши, для оценки универсальности подхода по снижению мутагенности лекарственных препаратов путем их иммобилизации.

5. Сравнение двух подходов к снижению мутагенности лекарственных средств: путем иммобилизации и с помощью совместного введения с широко применяемым антимутагеном -витамином С.

Научная новизна.полученных результатов.

1. Впервые показана мутагенная активность терапевтической дозы анальгина в тестах /п vivo на млекопитающих.

2. Впервые зарегистрирован антимутагенный эффект иммобилизации лекарственных препаратов в ПВС и крахмале.

3. Проведен сравнительный анализ двух подходов к снижению мутагенности лекарственных препаратов (иммобилизация препарата и его совместное введение с антимутагеном).

Практическая значимость полученных результатов.

Установлено, что широко применяемый населением анальгин обладает мутагенной активностью в тестах /л vivo, что ставит вопрос о правомочности широкого употребления этого препарата.

Показано снижение мутагенной активности лекарственных препаратов (анальгин, циклофосфан) путем их иммобилизации в ПВС и крахмале, что позволяет рекомендовать данный метод для приготовления лекарственных форм.

Сравнение двух подходов уменьшения мутагенности позволяет сделать вывод о том, что иммобилизация является более предпочтительной, так как не зарегистрирован мутагенный эффект предложенных матриц.

Апробация работы Результаты исследования были доложены на семинаре лаборатории Генетики Животных БиНИИ СПбГУ. Полученные в ходе работы данные были представлены на VI Съезде Всесоюзного Общества Генетиков и Селекционеров им. Н.И. Вавилова (Минск, 1992), на I Съезде Российского Общества Генетиков и Селекционеров им. Н.И. Вавилова (Саратов, 1994).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве основного материала исследований были использованы беспородные самцы домовой мыши Mus musculus в возрасте 30 +/- 1 день весом 20-35 г и самки r возрасте 3 месяцев весом 25-30 г. Беспородные мыши были выбраны сознательно и моделировали генотипическую гетерогенность, характерную для контингента людей, подвергающихся действию лекарственных препаратов.

В тесте на индукцию аномальных головок спермиев (АГС) было сформировано 55 групп и проанализировано 250 самцов. В тесте на индукцию хромосомных аберраций в клетках костного мозга была сформирована 31 экспериментальная группа и суммарно проанализировано 175 животных. В тесте на индукцию

хромосомных перестроек в сперматоцитах f порядка было сформировано 33 группы по 4-5 самцов.

Для эффективного проведения теста на индукцию АГС необходимо анализировать минимум по 4 животных на вариант, упитывая не менее 200 сперматозоидов от каждого животного (Бобринев, Ревазова , 1985). В данной работе учитывали по 300 спермиев от каждого самца, входящего в группу, состоящую из 4-6 животных. Во всех вариантах опытов по изучению индукции хромосомных аберраций (ХА) в клетках костного мозга и в сперматоцитах I анализировали по 200 клеток на стадии ана-телофазы или диакинеза - метафазы I от каждого из животных, входящих в экспериментальную группу.

В качестве тестируемых на мутагенность препаратов были выбраны анальгин (дипирон, метапирин) и циклофосфан фабричного производства. В экспериментах тестировали следующие дозы анальгина (мкг/мышь) - 20, 40, 200; циклофосфана (мг/мышь) - 4, 6, 8. Выбор доз определялся тем, что 40 мкг и 4мг соответствуют терапевтическим дозам анальгина и циклофосфана для человека (в расчете на единицу веса). 25% раствор анальгина разводили до нужной концентрации дистиллированнной водой. Циклофосфан растворяли в физиологическом растворе (0,9% Na Cl). Все растворы готовили ех tempere.

Для иммобилизации анальгина и циклофосфана были выбраны две матрицы: поливиниловый спирт (ПВС), уже используемый в медицинской практике (Макаров, 1979) и раствор крахмала. Для оценки возможной роли соотношения иммобилизуемого и иммобилизующего материалов были использованы матрицы различных концентраций. ПВС был 0,01%, 0,1%, 1% и 5%. Крахмал применяли в концентрациях 1% и 2%. Дальнейшее увеличение концентрации крахмала было затруднено, так как он становился гелеобразным и внутрибрюшинная инъекция была невозможна.

Для изучения антимугагенного эффекта витамина С использовали растворы следующих концентраций (мкг/мышь): 14; 140.

Схемы экспериментов. Было проведено 12 независимых серий опытов. В первой серии животных подвергали воздействию неиммобилизованного анальгина. Препарат вводили однократно внутрибрюшинно в дозах 20, 40, 200 мкг в 0,2 мл соответствующего раствора.

Во второй серии использовали те же дозы препарата, но инъекции производили трехкратно ежесуточно. В соответствующих контрольных вариантах опытов самцам вводили одно- или трехкратно 0,2мл физиологического раствора (0,9% раствор №С1).

В третьей серии опытов использовали самцов 30-дневного возраста линии СВА и С57/В16. Однако, исходя из результатов предыдущих опытов, тестировали только терапевтическую дозу анальгина при однократной инъекции и добавляли еще одну контрольную группу - так называемые интакгкые животные, то есть животные, которых не подвергали никаким воздействиям.

В четвертой, пятой и шестой сериях опытов изучали мутагенность иммобилизованного и неиммобилизованного анальгина. Для

иммобилизации в качестве матрицы был выбран ПВС различных концентраций: 0,01% , 0,1% , 1% , 5% . Обработку мышей проводили однократной внутрибрюшинной инъекцией 0,2 мл следующих растворов: 0,9% ЫаС|, ПВС каждой концентрации, анальгина в водном растворе ( терапевтическая доза 40 мкг и 20 мкг - 0,5 терапевтической дозы), а также этими же дозами анальгина, иммобилизованного в ПВС соответствующих концентраций. Кроме этого, анализу подвергали интактных животных.

В седьмой серии опытов мутагенность неиммобилизованного и иммоблизованного анальгина тестировали на самках мышей 3-месячного возраста. Использовали терапевтичекую дозу анальгина (40мкг) и 1% и 5% ПВС. В качестве контроля анализировали интактных животных.

В восьмой и девятой сериях опытов в качестве матрицы для иммобилизации анальгина был выбран крахмал в концентрации 1% и 2%. Животных обрабатывали по предыдущей схеме.

В десятой серии опытов анализировали мутагенность неиммобилизованного и иммобилизованного циклофосфана в

дозах (мг/мышь): 2, 4, 6, 8. В качестве иммобилизующей матрицы был использован 1% крахмал.

В одиннадцатой серии опытов изучали влияние различных доз аскорбиновой килоты на мутагенность циклофосфана. Обработку мышей проводили двукратными, внугрибрюшинными инъекциями циклофосфана (4 и 8 мг/мышь) и аскорбиновой кислоты (14 и 140 мкг/мышь). В контрольных вариантах мышам вводили 0,2 мл раствора аскорбиновой кислоты (14 и 140 мкг/мышь) и 0,2 мл физиологического раствора, без перерыва во времени или проводили двойную инъекцию физиологического раствора.

Мутагенность неиммобилизованного и иммобилизованного анальгина регистрировали с помощью двух общепринятых тестов -АГС и ХА в клетках костного мозга. Для изучения индукции АГС фиксацию материала проводили через 17 и 35 дней после воздействия. Эти точки фиксации соответствуют воздействию на сперматидыи сперматогонии ( Oud, Reutlinger 1981). Мутагенность неиммобилизованного и иммобилизованного циклофосфана, а также антимутагенное действие витамина С изучали с помощью цитогенетического анализа сперматоцитов I.

Для цитогенетического анализа клеток костного мозга и сперматоцитов I фиксацию материала проводили через 24 часа после воздействия (Cole et al.,1981). Эта точка фиксации соответствует диплотене профазы 1 мейоза (Oud, Reutlinger 1981)

Методики цитогенетического анализа. Для приготовления препаратов зрелых сперматозоидов использовали суспензии из семявыносящих протоков по известной методике ( Лекявичус, Журков, Ревазова 1983). Анализ морфологии головок спермиев проводили под микроскопом "Биолам Р17", учитывая только сперматозоиды с неповрежденной хвостовой нитью. В качестве аномалий регистрировали головки с удлиненным или укороченным крючком, головки с двумя крючками, нитевидные, бананоаидные и аморфные головки, а также сперматозоиды с двумя головками.

Фиксацию и обработку материала для цитогенетического анализа препаратов костного мозга проводили по модифицированной методике Форда (Ford, Hamerton 1956). Для анализа ХА готовили "давленные" препараты. С этой целью приготовленный материал помещали на предметное стекло,

освобождали от фиксатора и наносили краситель - 4% ацетоорсеин. Время окраски составляло 20-30 минут, после чего краситель удаляли фильтровальной бумагой и наносили каплю 45% уксусной кислоты. Материал накрывали покровным стеклом и раздавливали постукиванием по покровному стеклу. Препараты анализировали под микроскопом "Биолам Р17" при увеличении 10X40 и 10X90.

В качестве ХА учитывали мосты и фрагменты, а также двойные мосты и двойные фрагменты.

Фиксацию и обработку материала для цитогенетического анализа сперматоцитов I проводили по методике Ивенса {Evans, 1979). Для анализа материала готовили давленные препараты семенных канальцев. Анализировали диакинез метафазы I с хорошим разбросом бивалентов. Учитывали число клеток с унивалентами (отдельно аугосомными и половыми) и хромосомными аберрациями типа транслокаций, фрагментов, а также с нарушениями типа слипания бивалентов. Слипанием мы обозначали ассоциации негомологичных хромосом: теломерами конец в конец, теломера и центромера, и, возможно, случаи трудно определяемых робертсоновских транслокаций.

Статистическая обработка. Полученные данные обрабатывали статистически после предварительной проверки их на гетерогенность (Асланян и др., 1977). Применяли методы, рекомендованные для малых выборок, то есть единицей варьирования служила одна особь. Достоверность различий между вариантами оценивали по критерию Стьюдента (Рокитский, 1964)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ данных проведенных опытов первой и второй серии показал, что анальгин достоверно повышает (р<0,01) частоту АГС во всех вариантах экспериментов по сравнению с контролем. В серии исследований с однократным введением анальгина эффекты препарата в наименьших дозах (20мкг и 40мкг) статистически не различались, а при максимальной дозе (200мкг) частота АГС была достоверно выше, чем при меньших (р<0,05) (табл1).

Таблица 1. Частота АГС у самцов домовой мыши при действии анальгина.

Анальгин, мкг Вариант опыта 0 20 40 200

Однократная инъекция 7,3 ± 0, 89 14,3 ±0,97 13,3 ± 0,48 17,6 ± 0,76

Трехкратная инъекция 9,6 ± 0,52 15,5 ±0, 61 13,2 ±0,19 17,1 ±0,66

Сравнение данных разных серий опытов не выявило достоверных отличий по частоте АГС в одинаковых вариантах (при одинаковых однократных дозах). Тем не менее, обращает на себя внимание более высокая частота АГС в контроле при 3-х кратной инъекции по сравнению с однократной (различия близки к уровню достоверности 0,05) (табл. 1).

Результаты третьей серии опытов показывают, что терапевтическая доза анальгина достоверно повышает частоту АГС у мышей линий СВА и С57В(/6 по сравнению с контролем. Однако межлинейных различий по чувствительности к анальгину не выявлено. Кроме того, эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными на беспородных животных.

Вывод о мутагенной активности анальгина хорошо согласуется с данными, полученными в других работах, где продемонстрирован мутагенный эффект этого препарата (Михеев и др., 1987, Sylianco, 1978, Braun et al., 1980). Однако, подобный эффект на млекопитающих in vivo был обнаружен впервые. Следовательно, терапевтические дозы этого препарата могут представлять генетическую опасность и для человека. На реальность такой ситуации указывают данные по цитогенетическому изучению последствий приема анальгетиков беременными женщинами (Yamamoto et al., 1982).

В медицинской практике предпринимаются попытки увеличить эффективность действия лекарственных препаратов без

изменения их химической структуры. Одним из подходов решения этой задачи является иммобилизация препаратов на различных матрицах (Ревазова и др. 1976, Ревазова 1983).

Результаты серий опытов по изучению мутагенности неиммобилизованного и иммобилизованного анальгина в различных матрицах в тесте на АГС представлены в таблице 2. Прежде чем анализировать результаты данного опыта, следует отметить, что во всех трех опытах получены принципиально сходные данные. Во-первых, инъекция любого раствора приводила к индукции АГС по сравнени с интактными мышами (р< 0.01). Сам факт индукции этих повреждений можно объяснить с позиции физиологической гипотезы мутагенного процесса, выдвинутой М.ЕЛобашевым (Лобашев М.Е., 1976), согласно которой мутагенные последствия инъекции являются результатом вызванного ею стресса.

Во-вторых, частота АГС оказалась сходной как при введении 0.9% ЫаС1, так и различных концентраций ПВС. В-третьих, максимальные частоты АГС зарегистрированы при инъекции неиммобилизованного анальгина, причем уровень АГС в этих вариантах опыта всегда достоверно превышал таковой при инъекции 0.9% №С1 (р<0.01). В-четвертых, иммобилизация анальгина всегда приводила к достоверному снижению частоты АГС по сравнению с эффектом неиммобилизованного анальгина (0.01<р<0.05 для 0.01%ПВС и р<0.01 в остальных вариантах)

Для подтверждения вывода о мутагенности анальгина был проведен прямой тест на мутагенность испытываемых веществ -цитогенетический анализ хромосомных аберраций в клетках костного мозга. Результаты этого опыта представлены в таблице 3. Их анализ показывает, что в тесте на ХА выявляются те же закономерности, что и в тесте на АГС: индукция ХА самой процедурой инъекции (р<0.01), отсутствие мутагенности разных концентраций ПВС, увеличение частоты ХА при действии 40 мкг и 20 мкг неиммобилизованного анальгина (р<0.01) и протекторный эффект ПВС по отношению к мутагенной активности анальгина (р<0,01). Единственным существенным отличием является характер зависимости протекторного эффекта ПВС от его концентрации. Это справедливо при иммобилизации 40 мкг

Таблица 2. Частота АГС при действии неиммобилизованного и иммобилизованного в ПВС анальгина при фиксации материала через 17 дней после воздействия.

Интактные животные Анальгин мкг 0 Физ. р-р ПВС, %

0,01 0,1 1,0 5,0

0 5,0 ±0,18 4,0 ±0,18 5,1 ±0,30 6,4 ±0,19 6,6 ± 0,24

1,9 ± 0,20 2,7 ±0,20 20 11,7 + 0,34 10,9 + 0,31 9,3 ± 0,40 8,4 ±0,28 6,9 ± 0,20 7,1 ±0,23

40 12,1 +0,34 13,3 + 0,48 10,3 + 0,27 8,7 + 0,30 8,3 ±0,27 10,6 ±0,18

го

Таблица 3. Частота ХА в клетках костного мозга самцов и самок домовой мыши при действии неиммобилизованного и иммобилизованного в ПВС анальгина.

Пол Интактные животные Анальгин, мкг 0 Физ. р- р ПВС, %

0,01 0,1 1,0 5,0

Самцы 1,2 + 0,18 1,5 ±0,20 0 2,7 ± 0,24 2,4 ±0,19 3,1 ±0,24 2,9 ± 0,27 2,7 ±0.17 2,9 ± 0,23

20 3,7 ±0,17 4,1 ±0, 38 3.1+0,35 3,4 ±0,28 2,9 ±0,14 3,0 + 0,25

40 7,1 ±0,30 6,8 ± 0,23 5,3 ± 0,28 5,9 ±0,31 3,8 ± 0,3 3,2 ±0,27

Самки 1,1 ± 0,24 0 - — - 3,1 ± 0, 56 3,9 ± 0, 66

40 7.5 ± 0.61 —— - 5,4 ± 0,43 4,5 ± 0,35

со

анальгина. При иммобилизации 20 мкг анальгина тенденция оказывается такой же, как и в тесте на индукцию АГС, т.е. наибольшей эффективностью для снижения мутагенности обладает 1% ЛВС.

Анализ результатов теста на частоту ХА у самок показал достоверное увеличение клеток с ХА при действии неиммобилизованного анальгина по сравнению с контролем (р< 0.01), а также снижение мутагенности анальгина путем его иммобилизации в 1% и 5% ПВС (р<0,05) (таблица 3). Полученные данные согласуются с результатами 6-й серии опытов по тестированию тех же доз препаратов у самцов. Таким образом, не выявлено половых различий по чувствительности к неиммобилизованному и иммобилизованному анальгину между самцами и самками.

Подводя итоги вышеизложенному, можно сделять вывод о том, что иммобилизованный в ПВС анальгин обладает меньшей мутагенной активностью, чем неиммобилизованный. Естественно встает вопрос об универсальности эффекта иммобилизации.

С целью ответа на этот вопрос были проведены серии опытов, в которых оценивалась мутагенность анальгина, но в качестве матрицы иммобилизации был использован крахмал.

Результаты проведенных экспериментов приведены в таблице 4. Полученные данные свидетельствуют о том, что анальгин индуцирует как АГС так и ХА при обеих дозах (20 мкг и 40 мкг) (р<0,05). С другой стороны, растворы крахмала не демонстрировали мутагенности, за исключением 2% раствора в тесте на АГС. Иммобилизация анальгина в крахмале снижала уровень мутагенности препарата во всех случаях (р<0,05), причем в варианте 20 мкг частоты АГС и ХА достигали контрольных величин.

Сравнение эффективности этих двух матриц показывает, что снижение частоты ХА при использовании для иммобилизации 1% и 5% ПВС происходит на 44% и 53% соответственно, тогда как иммобилизация в крахмале приводит к снижению частоты ХА на 33% и 28% соответственно. Частоты АГС при использовании 1% и 5% ПВС снижаются на 38% и 20%, тот же параметр при применении крахмала изменяется на 25% и 27%. Анализ снижения

мутагенности, при использовании иммобилизованного в различных матрицах анальгина, показывает, что наиболее эффективной матрицей является 1% ПВС в отношении АГС и 5% ПВС в отношении ХА.

Причину этих явлений обсуждать трудно из-за отсутствия информации о конкретных механизмах транспорта тестируемых веществ к клеткам-мишеням, хотя возможно существование отличий и на этом уровне. Не меньшие трудности вызывает и интерпретация протекторного действия ПВС и крахмала, поскольку пока неизвестны химические основы образования комплекса "анапьгин-ПВС". "анальгин-крахмал", что требует более детального и комплексного исследования. Однако можно высказать предположение, что иммобилизация анальгина приводит к изменению кинетики распространения препарата во внутренней среде организма, и, вероятно, параметров транспорта веществ через клеточные мембраны. Очевидно, важную роль в таких исследованих играет выбор высокомолекулярных соединений, химическая структура которых определяет возможность модификации мутагенности иммобилизуемого препарата.

В дальнейших экспериментах анализировали мутагенность неиммобилизованного и иммобилизованного в 1% крахмале циклофосфана в различных дозах (10 мг, 20 мг, 30 мг, 40 мг) в тесте на индукцию ХА в сперматоцитах I на стадии диакинеза метафазы I. Показано, что 1% крахмал не индуцировал аномалии мейоза по сравнению с контрольным вариантом (инъекция физиологического раствора - 0,9% №С1). Кроме этого, действие всех перечисленных доз циклофосфана достоверно повышало уровень ХА в сперматоцитах, причем выявляется зависимость частоты ХА от дозы неиммобилизованного циклофосфана (табл. 5).

Иммобилизованный циклофосфан также достоверно повышал частоту аномалий мейоза (р<0,01). Однако иммобилизация

циклофосфана в 1% крахмале понижала его мутагенность на 58 -68%. При этом действие 8 мг иммобилизованного циклофосфана на мышь было эквивалентным 4 мг неиммобилизованного препарата.

Таблица 4. Частота АГС и ХА при действии неиммобилизованного и иммобилизованного в крахмале анальгина.

Тест Интактные Анальгин, Крахмал, %

животные мкг 0(Физ. р-рО 1 2

0 6,5 ±0,14 6,6 ±0,25 7,6 ±0,23

АГС, % 2,7 ±0,18 20 10,3 ± 0,37 6,7 ± 0,23 7,1 ±0,30

40 12,7 ±0,32 9,5 ± 0,20 9,3 ± 0,23

0 3,1 ±0,35 3,4 ± 0,28 3,0 ±0,21

ХА, % 1,6 ± 0,27 20 4,7 ± 0,38 3,1 ±0,32 3,8 ±0,27

40 7,9 ±0,30 5,3 ±0,18 5,8 ± 0,24

о>

Таблица 5. Частота ХА в сперматоцитах 1 домовой мыши при действии неиммобилизованного и иммобилизоанного в 1 % растворе крахмала циклофосфана.

Циклофосфан (ЦФ), мг/мл Вариант опыта 0 Физ. р - р 10 20 30 40

ЦФ 5,2 ± 0,56 20,1 ±0,70 28,4 ± 2,28 37,8 ± 2,35 49,6 ±0,92 47,1 ±2,95

ЦФ+ 1%р-р крахмала 5,9 ±1.13 6,9 ± 1,27 12,4 ± 0. 76 19,4+ 1,79 24,1 ±2.39 27,2 ± 0,86 27,1 ±1,37

Окончательное решение вопроса об использовании ПВО и крахмала в качестве матрицы для иммобилизации лекарственныхпрепаратов требует изучения терапевтических эффектов иммобилизации. Если ЛВС и крахмал не изменяет этого параметра, они могут быть использованы как протекторные факторы в отношении мутагенности. В случае повышения терапевтического действия препаратов, иммобилизованных в ПВС и крахмале, преимущества иммобилизации становятся абсолютно очевидными.

В следующей серии опытов мы анализировали мутагенный эффект циклофосфана в комбинации с витамином С. Анализ полученных результатов показывает, что сам витамин С не вызывает увеличения частоты ХА в сперматоцитах I домовой мыши по сравнению с физиологическим раствором. Циклофосфан, также как и в предыдущих опытах, достоверно повышал уровень ХА (р<0,01). Что касается действия витамина С, введение 14 мкг на мышь достоверно снижало частоту ХА, индуцированных циклофосфаном (р<0,01), тогда как доза 140 мкг не изменяла этот показатель (табл. 6). Это, вероятно, объясняется тем, что сам витамин С способен генерировать кислородные радикалы при высоких концентрациях (Wertberg 1987). Кроме того, витамин С может не только снижать но и усиливать мутагенную активность некоторых химических веществ (Rosin 1980, Alzicu 1987, Dhir et al 1989). Однако, полученные данные о снижении мутагеннсти циклофосфана путем его совместного введения с витамином С хорошо согласуются с результатами, полученными в других работах (Bose, Sinchas 1994; Chaskadbi 1992).

Полученные нами результаты позволяют сравнить два подхода к снижению мутагенной активности лекарственных препаратов. Иммобилизация циклофосфана уменьшает его мутагенность в тесте на индукцию ХА в сперматоцитах I и такой же эффект наблюдается при комбинированном действии циклофосфана и витамина С. При этом отмечается практически одинаковая эффективность иммобилизации и витамина С в дозе 14 мкг. Тем не менее, на наш взгляд, иммобилизация в данной ситуации является более предпочтительной из-за отсутствия биологической и мутагенной активности ПВС и крахмала.

Кроме того, следует учитывать, что витамин С проявляет антимутагенный эффект в отношении далеко не всех мутагенов (Neale, Salt, Onishis et af. 1987), может снижать мутагенный эффект низких доз мутагена и повышать действие высоких доз этого же мутагена (Alzicu et al. 1987, Dhir et al. 1989). Иммобилизация препаратов вызывает более универсальные последствия, вероятно, снижая скорость поступления препарата в клетки (Корженевская, Михеев 1993), хотя и здесь зависимость эффекта от дозы иммобилизуемого препарата может быть неоднозначной (Фонштейн и др. 1984).

Таблица 6. Частота ХА в сперматоцитах I при действии цикпофосфана и витамина С.

Циклофосфан мг/мл Витамин С, мкг/мл 0 20 40

0 5,9 ±0,55 27,9 + 0,82 45,6 + 0,54

70 6,0 + 0, 73 14,6 ±0,55 22,4 ± 1,10

700 7,6 ± 0,62 27,3 ± 1,01 42,7 ± 1,08

Однако данный подход обладает одним несомненным преимуществом по сравнению с другими - пролонгированием действия препарата, что имеет большое значение в химиотерапевтической практике. Тем не менее, иммобилизация не применима, например, при профилактике последствий контакта с мутагенами окружающей среды, для чего успешно используют витамины, включая и витамин С (Этат е! а1. 1983).

Подводя итоги, можно считать, что мутагенная активность препаратов может меняться при введении в лекарственную форму генетически неактивного компонента (иммобилизация лекарственных препаратов в различных матрицах). Более того, грамотно выбранное вспомогательное вещество (матрица) может снижать нежелательную мутагенную активность лекарственного препарата. К таким неспецифическим модификаторам могут быть

отнесены ПВП, ЛВС и крахмал, затрудняющие транспорт мутагенов к тканям и клеткам-мишеням и способствующие тем самым созданию их меньших концентраций около генетических мишеней (Корженевская, Михеев 1993, Ревазова, Броцлавский 1993).

ВЫВОДЫ:

1. Частота АГС и ХА у животных подвергшихся инъекции физиологического раствора или дистиллированной воды достоверно повышена по сравнению с интактными животными.

2. Внутрибрюшинные инъекции анальгина в дозах 0,02; 0,04; 0,2 мг/особь достоверно повышают частоту АГС у мышей независимо от числа инъекций (одно- или трехкратная).

3. Не выявлены различия в чувствительности к анальгину у беспородных животных и у мышей линии СВА и С57В1/6 в тесте на индукцию АГС.

4. Иммобилизация терапевтической дозы (0,04 мг/особь) и половины терапевтической дозы анальгина в ПВС и крахмале достоверно снижает уровень АГС и ХА в клетках костного мозга самцов и самок мышей.

5. Показана прямая зависимость снижения частоты АГС и ХА от концентрации ПВС в определенных пределах.

6. Не обнаружено зависимости снижения частоты АГС и ХА от концентрации используемого для иммобилизации крахмала.

7. Инъекции циклофосфана в дозах 2; 4; 6; 8мг/особь достоверно повышают частоту ХА в сперматоцитах I у мышей.

8. Иммобилизация циклофосфана в 1% крахмале достоверно снижала уровень ХА в сперматоцитах I у мышей.

Показана антимутагенная активность витамина С в дозе 14 мкг в отношении частоты ХА в сперматоцитах I, индуцированных циклофосфаном.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Михеев B.C., Того Е.Ф., Сивенков Э.С. Модификации мутагенности лекарственных препаратов путем их иммобилизации. Эффект иммобилизации анальгина в поливиловом спирте на мутагенность у мышей // Генетика. - 1993. - Т.29, № 5 - С.785-790.

2. Михеев B.C., Того Е.Ф., Полькина С.И. Модификации« мутагенности лекарственных препаратов путем их иммобилизации. Эффект иммобилизации анальгина в крахмале у мышей // Генетика. - 1993. - Т.29, № 11 - С. 1933-1935.

3. Михеев B.C., Болонина В.П., Анисимона Л.Е., Корженевская М.А., Того Е.Ф. Анализ генетической активности лекарственных препаратов при их иммобилизации // VI съезд Всероссийского Общества Генетиков и Селекционеров им. Н.И.Вавилова, Минск, 1992: Сб. научных трудов. - Минск.: 1992. - с.25.

4. Михеев B.C., Болонина В.П., Того Е.Ф. Действие циклофосфана на половые клетки самцов мыши при его иммобилизации в крахмале // I съезд Российского Общества Генетиков и Селекционеров им. Н.И.Вавилова, Саратов, 20-25 декабря 1994: Сб. научных трудов. - Саратов.: 1994. - с.102.