Влияние гликозилирования на процессинг предшественника натрийуретического пептида B-типа человека

Семенов, Александр Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние гликозилирования на процессинг предшественника натрийуретического пептида B-типа человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние гликозилирования на процессинг предшественника натрийуретического пептида B-типа человека"

На правах рукописи

СЕМЕНОВ АЛЕКСАНДР ГЕННАДЬЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ НА ПРОЦЕССИНГ ПРЕДШЕСТВЕННИКА НАТРИЙУРЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА В-ТИПА

ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - биохимия

00348023В

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2009

003480236

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Катруха Алексей Генрихович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Глухов Александр Иванович

кандидат биологических наук Воротников Александр Вячеславович

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 26 октября 2009 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, д. 1, стр. 12, биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 2 сентября 2009 года Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Медведева М.В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Натрийуретический пептид В-типа (BNP) является циркулирующим в крови пептидным гормоном. Физиологическое действие BNP проявляется в регуляции объема жидкости организма и кровяного давления. BNP стимулирует натрийурез и диурез, обладает сосудорасширяющим действием, оказывает ингибирующее действие на ренин-ангиотензин-альдостероновую систему.

BNP синтезируется преимущественно кардиомиоцитами. Подобно многим другим биологически активным пептидам, BNP синтезируется в виде молекул-предшественников, процессинг которых приводит к образованию активного гормона. У человека молекула-предшественник, proBNP, состоит из 108 аминокислотных остатков (а.к.о.). Фрагмент, соответствующий по последовательности BNP, состоит из 32 а.к.о. и расположен в С-концевой части молекулы proBNP. В результате процессинга происходит образование двух полипептидов - физиологически активного гормона BNP и N-концевого фрагмента, NT-proBNP, состоящего из 76 а.к.о., для которого физиологическая активность не показана.

При заболеваниях сердечно-сосудистой системы, связанных с повышением давления на стенки камер сердца, концентрация BNP и NT-proBNP в крови значительно повышается, при этом наблюдается положительная корреляция между концентрацией полипептидов и степенью тяжести заболевания. В настоящее время измерение концентрации BNP и NT-proBNP в крови с применением иммунохимических методов широко используется в клинической практике для диагностики сердечной недостаточности (СН), оценки функции левого желудочка, прогнозирования риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, мониторинга терапии CH.

СН - патофизиологическое состояние, вызванное ухудшением сократительной способности сердца, сопровождается увеличением уровня экспрессии и секреции BNP. На ранних стадиях развития СН повышение концентрации BNP в крови обеспечивает регуляцию функционирования сердечно-сосудистой системы и почек. Однако у больных с тяжелыми формами СН даже на фоне очень высоких значений концентрации BNP, определяемых в крови с использованием иммунохимических методов, наблюдается удержание воды и натрия, повышенное системное сосудистое сопротивление и высокие значения преднагрузки сердца. Сравнительно недавно в нашей лаборатории, а позднее и рядом других исследовательских групп, было показано, что высокий уровень иммунореактивного BNP в крови больных с тяжелыми формами СН отражает прежде всего содержание proBNP, а не BNP, как считалось ранее. При этом концентрация /

proBNP в крови больных с СН может в несколько раз превышать концентрацию физиологически активного гормона, BNP.

На основании этих данных в литературе высказывается предположение, что у больных с тяжелыми формами СН может развиваться состояние недостаточности физиологически активного гормона на фоне высокого содержания в крови предшественника - proBNP. Поскольку BNP образуется в результате процессинга proBNP, причиной недостаточности физиологически активного гормона в крови могут быть нарушения процессинга молекул-предшественников. Однако даже предположить, на каком этапе происходит нарушение, достаточно сложно, так как молекулярные механизмы процессинга proBNP в настоящее время практически не изучены.

В данной работе в качестве возможного механизма регуляции процессинга proBNP рассматривается гликозилирование аминокислотных остатков, расположенных рядом с сайтом процессинга. Предположение о возможном влиянии гликозилирования на процессинг proBNP было высказано в нашей лаборатории на основании данных, полученных в недавних исследованиях. Было показано, что NT-proBNP и proBNP, циркулирующие в крови больных с СН, являются О-гликопротеинами. Для рекомбинантного proBNP, экспрессированного в линии клеток млекопитающих СНО (клетки яичника китайского хомяка), Schellenberger и соавторы идетифицировали 7 сайтов гликозилирования: Т36, S37, S44, Т48, S53, Т58 и T7i (Schellenberger et al. 2006). В нашей лаборатории было показано, что центральный участок (28-56 а.к.о.) эндогенного NT-proBNP гликозилирован, тогда как N- и С-концевые фрагменты молекулы не содержат углеводных остатков (Seferian et al. 2008). Наличие гликозилирования у непроцессированного предшественника (proBNP) на участке, расположенном рядом с сайтом расщепления -R76-IS77- (потенциальный сайт гликозилирования - Т7,), и отсутствие гликозилирования по данному сайту у процессированного фрагмента (NT-proBNP) позволило предположить, что:

- гликозилирование молекулы proBNP на участке вблизи сайта расщепления оказывает негативное влияние на процессинг;

- гликозилирование может быть частью регуляторного механизма процессинга proBNP.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное исследование профилей гликозилирования proBNP и NT-proBNP, циркулирующих в крови больных с СН.

2. Разработать метод экспрессии рекомбинантного proBNP в линиях клеток млекопитающих. Выбрать модельную систему для исследования влияния гликозилирования на процессинг proBNP.

3. Разработать метод получения и очистки препарата рекомбинантного proBNP, экспрессированного в линии клеток млекопитающих. Охарактеризовать иммунохимические и биохимические свойства очищенного препарата рекомбинантного proBNP.

4. Исследовать влияние гликозилирования на процессинг рекомбинантного и эндогенного proBNP in vitro под действием конвертазы прогормонов фурин.

5. Исследовать сайт-специфичность процессинга proBNP под действием фурина.

6. Создать молекулярно-генетические конструкции для экспрессии мутантных форм proBNP, содержащих замены остатков серина и треонина, расположенных в непосредственной близости от сайта процессинга, на остатки аланина. Провести исследования эффективности процессинга полученных мутантных форм proBNP.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе с использованием широкого набора иммунохимических, биохимических и молекулярно-биологических методов впервые показано, что эффективность процессинга proBNP человека зависит от статуса гликозилирования участка молекулы, расположенного в непосредственной близости от сайта расщепления. В экспериментах с очищенными препаратами рекомбинантного и эндогенного proBNP было показано, что гликозилирование данного участка препятствует расщеплению proBNP конвертазой фурин. Исследование эффективности процессинга различных мутантных форм proBNP, экспресированных в линии клеток человека, позволило установить, что наличие О-гликанов, ковалентно связанных с остатком треонина в положении 71, препятствует прохождению процессинга proBNP.

Результаты, полученные в данной работе, значительно расширяют современные

представления о молекулярных механизмах процессинга молекулы-предшественника BNP. Показанное в данной работе негативное влияние гликозилирования на процессинг proBNP позволяет объяснить накопление молекул-предшественников в крови больных с тяжелыми формами СН за счет снижения уровня процессинга на фоне повышенного уровня гликозилирования.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ, на 34 конгрессе Союза Европейских Биохимических Сообществ в 2009 году (Прага, Чехия), съездах Американской Ассоциации Клинической Химии в 2009 (Чикаго, США), 2008 (Вашингтон, США), в 2007 году (Сан-Диего, США), на XXXI Конгрессе Клинической Химии в 2008 году (Хельсинки, Финляндия), на четвертой Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения в 2008 году (Москва, Россия), на Международной конференции "Биотехнология и медицина" в 2007 году (Москва, Россия) и на Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2006 году (Москва, Россия). Результаты, представленные в виде стендового и устного докладов на съезде Американской Ассоциации Клинической Химии в 2008 году, были отмечены наградой Американской Национальной Ассоциации Клинической Биохимии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, включая 4 статьи в профильном журнале.

Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и их обсуждение, список цитированной литературы. Работа изложена на 130 страницах печатного текста, иллюстрирована 43 рисунками и 3 таблицами. Список цитированной литературы содержит 191 наименование.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность к.м.н. Е.В. Кошкиной и к.м.н. М.И. Красносельскому за любезно предоставленные образцы плазмы больных с CH.

Содержание работы Материалы и методы исследования

Рекомбинантные proBNP и NT-proBNP человека, экспрессированные в Е. coli (чистота >98%) были любезно предоставлены компанией HyTest (Финляндия).

Моноклональные антитела (МАт). специфичные к различным участкам молекулы proBNP человека, были также предоставлены компанией HyTest (Финляндия). Сэндвич-иммунофосфоресцентный анализ (сэндвич-ИФА). В лунки 96-ти луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбировали специфичные к исследуемому антигену антитела. Затем после отмывки несвязавшихся антител в лунки вносили образец, содержащий исследуемый белок и раствор антител, конъюгированных с фосфоресцентной меткой - стабильным хелатом европия. Планшеты инкубировали в течение 30 мин и отмывали. В лунки вносили раствор усиления LANFIA®, инкубировали в течение 3 мин и измеряли фосфоресценцию на приборе Victor 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer, Финляндия).

Иммобилизацию антител на CNBr-активированной сефарозе проводили согласно методике, описанной Остерманом (Остерман J1.A. 1985).

Электрофорез в трис-трициновой буферной системе проводили согласно методике, описанной Shagger и von Jagow (Schagger & von Jagow 1987).

Вестерн-блоттинг. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану после электрофоретического разделения проводили по методу Towbin и соавторов (Towbinetal. 1979).

Ферментативное дегликозилирование эндогенного proBNP. Образец, содержащий 65 нг эндогенного proBNP, делили на две части и инкубировали с ферментами гликозидазами, специфичными к гликозилированию О-типа, либо без них в течение 1,5 часов при 37 °С. Конечная концентрация ферментов в реакционной смеси составляла: 4,2 мЕд/мл эндо-а-И-ацетилгалактозаминидазы, 52 мЕд/мл сиаладазы Au а-(2-3,б,8,9), 7,3 мЕд/мл ß(l-4) галактозидазы и 122 мЕд/мл ß-N-ацетилглюкозаминидазы (PROzyme, США). После инкубации пробы замораживали и хранили при температуре - 70 °С. Химическое дегликозилирование рекомбинантного proBNP. экспресированного в клетках линии НЕК 293, проводили с помощью трифторметансульфоновой кислоты (ТФМС) по методу Edge и соавторов с небольшими изменениями (Edge et al. 1981). Расщепление proBNP рекомбинантным фурином in vitro. а) Расщепление рекомбинантного proBNP

К 30 мкл образца, содержащего 30 нг рекомбинантого proBNP (экспрессированного в клетках НЕК 293 или Е. coli), добавляли рекомбинантный фурин (Sigma, США) в количестве 1,2 единицы активности. Реакцию проводили в течение 2,5 часов при температуре 37 °С.

б) Расщепление эндогенного proBNP

К образцу, содержащему 3,5 нг эндогенного proBNP в объеме 30 мкл, добавляли рекомбинантный фурин в количестве 1 единицы активности. Реакцию проводили в тех же условиях, что и с рекомбинантным proBNP.

Гель-фильтрация. На колонку Superdex 75 10/300 GL, уравновешенную 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,3 М NaCl и 0,005 М ЭДТА, наносили 150 мкл образца. Элюцию проводили тем же буфером при скорости протока 0,8 мл/мин. Собирали фракции объемом 0,5 мл.

Создание молекулярно-генетической конструкции для экспрессии proBNP. Последовательность кДНК предшественника proBNP была амплифицирована методом ПЦР с использованием 5'- agtcccatggatggatccccagacagcaccttc-З' в качестве прямого праймера и 5'-agtcctcgagttaatgccgcctcagcactttgc-3' в качестве обратного праймера, и переклонирована в вектор pCMV/myc/cyto (Invitrogen, США). В качестве матрицы для амплификации была использована библиотека кДНК из сердечной ткани человека (Clontech, США).

Молекулярно-генетические конструкции для экспрессии мугантных форм proBNP с заменами Т58А, Т71А, S77A, S84A, Т58А/Т71А и T71A/S77A были получены методом сайт-направленного мутагенеза с использованием в качестве матрицы кДНК полноразмерного предшественника дикого типа в составе конструкции pCMV/proBNP. Правильность всех полученных конструкций была подтверждена секвенированием. Культивирование клеточных линий. Клеточные линии НЕК 293, СНО-К1 и NIH ЗТЗ культивировали в ростовой среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, при температуре 37 °С и с содержанием 5% С02 в атмосфере в соответствии со стандартными протоколами АТСС (http://www.atcc.org). Временная трансфекция. Трансфекцию проводили с использованием поликатионного трансфицирующего реагента унифектин-56 (Пеплайн, Россия) при достижении клетками 90-95% конфлюентного монослоя. Смену ростовой среды проводили каждые 24 часа. Сбор кондиционированной среды для анализа проводили через 72 часа после трансфекции.

Масс-спектрометрический анализ был выполнен в ЗАО "ПИННИ" на тандемном MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером.

Результаты и их обсуждение Сравнение профилей иммунореактивности эндогенных proBNP и NT-proBNP.

На первом этапе нашей работы мы провели сравнение профилей иммунореактивности эндогенных proBNP и NT-proBNP, циркулирующих в плазме больных с СН, используя МАт, специфичные к различным участкам proBNP, как уникальный высокочувствительный и высокоспецифичный инструмент. Как было ранее показано в наших исследованиях, детальное изучение взаимодействия таких антител с антигеном позволяет выявить участки гликозилирования эндогенных proBNP и NT-proBNP (Seferian et al. 2008).

В качестве источника эндогенных proBNP и NT-proBNP была использована объединенная плазма больных с выраженной формой СН (12 образцов). Сравнительный анализ иммунореактивности эндогенных proBNP и NT-proBNP проводили с использованием метода иммунофосфоресцентного анализа сэндвич типа (сэндвич-ФИА). Для проведения исследований было создано 11 иммунохимических систем, пригодных для количественного определения proBNP или NT-proBNP в растворе. В качестве антител подложки в таких системах были использованы 11 МАт, эпитопы которых перекрывали практически всю последовательность молекулы proBNP с 5 по 76 а.к.о. В качестве детекторного антитела во всех системах для измерения иммунореактивности proBNP было использовано МАт 24С587.98, специфичное к С-концевому участку молекулы proBNP (BNP-часть молекулы proBNP) (Рис. 1). При этом в качестве контрольной была выбрана система lD4|3 24-24C587-98> так как ранее в нашей лаборатории было показано, что антитела, использующиеся в данной системе, нечувствительны к гликозилированию

proBNP. Рис. 1. Эпитопная карта МАт,

1Р41Ы| 5Ю использовавшихся в работе для

т29Ш2^„. „С1; * ' ш * исследования иммунохимических

I s и' а и ¡« л л 4S* я. свойств proBNP и NT-proBNP.

HPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVAT Приведена аминокислотная

."""Л последовательность proBNP человека.

Выделен участок последовательности Mm,,",,* proBNP, соответствующий

15CV„ 24csw.w NT-proBNP (серый фон),

ы тз 76 £ J ш Подстрочными индексами справа от

EGIrghrkmvlytlraprspkmvqgsgcfgrkmdrissssglgckvlrrh названия антитела обозначен участок

. 2|Е6"-". последовательности, к которому оно

специфично.

Измерение иммунореактивности NT-proBNP в образце объединенной плазмы больных с СН проводили после удаления proBNP методом иммунопреципитации. Для этого использовали аффинный носитель, содержащий МАт, специфичные к С-концевому

участку молекулы proBNP (отсутствующему у молекулы NT-proBNP).

При измерении иммунореактивности эндогенного NT-proBNP в качестве детекторных антител в паре с антителами подложки были выбраны МАт 13G12|3.2o и 24Е1167_76, для которых ранее было показано, что они способны взаимодействовать с эндогенным NT-proBNP с высокой эффективностью. Детекторные антитела 24Е1167.76 были использованы в парах с иммобилизованными антителами, специфичными к N-концевой части молекулы NT-proBNP (участок 5-24), а детекторные антитела 13G12i3.2o в парах с антителами, специфичными к участку 28-76 (Рис. 2).

Детекторные янтит&пя 13G12,V»

Анплела подложки (эптолы в диапазоне 5-24 а.к.о.)

Рис. 2. Схематическое изображение комбинаций МАт, использовавшихся для проведения анализа

иммунохимических свойств

NT-proBNP.

УУуУУУ

Необходимость использования двух различных детекторных антител при измерении иммунореактивности NT-proBNP была вызвана тем, что антитела с близко расположенными или перекрывающимися эпитопами не способны образовывать комплекс сэндвич-типа с антигеном по причине возникающих стерических затруднений. В качестве контрольной была выбрана пара антител 15C463-7i-13G12i3-2o, в которой, как было показано в нашей лаборатории, оба антитела не чувствительны к гликозилированию молекул NT-proBNP (Seferian et al. 2008).

В качестве калибраторов для количественного определения proBNP и NT-proBNP в образце плазмы мы использовали рекомбинантные proBNP и NT-proBNP, экспрессированные в Е. coli. Результаты измерения иммунореактивности эндогенных proBNP и NT-proBNP представлены на Рис. 3.

Рис. 3. Профили иммунореактивности эндогенных proBNP и NT-proBNP (объединенная плазма больных с СН).

За 100% были приняты значения концентраций эндогенных proBNP (§, 1,14+0,02 нМ) и NT-proBNP (§§, 8,1±0,06 нМ), полученные при измерении в образце объединенной плазмы больных с СН методом сэндвич-ФИА с использованием контрольных систем ю413.24-24с587-98 для proBNP и 15C463.-u-13G12i3.20 - для NT-proBNP. Результаты представлены как

среднее±стандартное отклонение (п=3).

Детекторные аиппела 24и1 (67-76)

Дртекторпые »нпгтела 24с5 (87-981

Измерения proBNP

Как следует из Рис. 3, иммунореактивность различных участков молекулы, расположенных между аминокислотными остатками 5-56, примерно одинакова у proBNP и NT-proBNP. МАт, специфичные к участку 5-24, взаимодействуют с высокой эффективностью с обоими белками, тогда как МАт, специфичные к центральному участку последовательности (участок 28-56), практически не взаимодействуют ни с proBNP, ни с NT-proBNP. Эти данные хорошо согласуются с данными, ранее полученными в нашей лаборатории при исследовании иммунохимических свойств эндогенного NT-proBNP (Seferian et al. 2008). Ранее было показано, что недоступность центрального участка эндогенного NT-proBNP для взаимодействия с антителами вызвана гликозилированием данного участка молекулы.

Наибольшие различия в профилях иммунореактивности наблюдаются для участка, расположенного между а.к.о. 63-76 эндогенных proBNP и NT-proBNP. Показано, что доступность участка 63-76 молекулы NT-proBNP для взаимодействия с антителами значительно выше, чем доступность аналогичного участка эндогенного proBNP. Для того, чтобы показать, что недоступность (низкая иммунореактивность) участка 63-76 эндогенного proBNP для взаимодействия с антителами так же, как и недоступность центрального участка молекулы, вызвана именно наличием ковалентно связанных О-гликанов, образец proBNP, аффинно-очищенный из объединенной плазмы больных с СН, обрабатывали набором ферментов гликозидаз, специфичных к гликозилированию О-типа, и измеряли иммунореактивность, используя те же 11 систем сэндвич-ФИА, что и в описанном выше эксперименте (Рис. 4).

■ Необработанный proBNP □ Деглнкюилнровянной p-oBNP

Рис. 4. Профили иммунореактивности аффинно-очищенного эндогенного

ргоВОТ до и после обработки гликозидазами.

Значение концентрации эндогенного ргоВЫР, полученное при измерении в образце необработанного гликозидазами ргоВЫР с использованием системы lD4i3.24-24C5s7.98 (§. 0,8±0,02 нМ), было принято за 100%. Результаты представлены как среднее+стандартное отклонение (п=3).

Депкпормые анппела 24с5 (87-98)

Как видно из Рис. 4, в образце эндогенного ргоВ№, обработанного гликозидазами, иммунохимическая активность центрального участка ргоВОТ (28-56) значительно выше,

чем в интактном образце, и практически достигает значений, полученных при измерениях в системах, содержащих антитела, специфичные к участку 13-24. Дегликозилирование также приводило к выраженному увеличению иммунореактивности участка 63-76 (в 2-2,3 раза по сравнению с интактным образцом). Однако увеличение иммунореактивности данного фрагмента молекулы не было столь значительным, как для центрального участка. Было высказано предположение, что набор ферментов, использовавшийся для проведения дегликозилирования, не позволяет достаточно полно проводить дегликозилирование участка 63-76 эндогенного ргоВИР по причине ограниченной субстратной специфичности ферментов.

Учитывая тот факт, что участок 63-76 в случае эндогенного МТ-ргоВ№ не содержит О-гликанов, а в случае ргоВОТ гликозилирован, и также то, что данный участок расположен непосредственно вблизи сайта процессинга ргоВ№ (-Ь^Дэ??-), мы предположили, что гликозилирование молекул ргоВЫР на участке вблизи сайта расщепления может препятствовать взаимодействию конвертазы прогормонов с субстратом - ргоВИР, в результате чего гликозилированная в области 63-76 форма ргоВ№ не может (в отличие от негликозилированной) подвергаться эффективному процессингу.

Экспрессия рекомбинантного ргоВ^ в клетках млекопитающих. Для

проведения дальнейших исследований влияния гликозилирования на процессинг ргоВ№ в качестве модельной системы использовали экспрессию рекомбинантного ргоВИР (гес-ргоВОТ) в клетках млекопитающих.

В качестве экспрессионной системы была выбрана клеточная линия эмбриональных клеток почки человека НЕК 293, широко используемая для работы с рекомбинантными белками. Для проведения экспрессии гес-ргоВИР нами была получена молекулярно-генетическая конструкция на основе векторной системы рСМУ/тус/сую, содержащая вставку кДНК предшественника ргоВИР человека (рСМУ/ргоВОТ). Полученная конструкция рСМУ/ргоВОТ в дальнейшем использовалась для проведения трансфекции.

Анализ процессинга гес-ргоВОТ в клеточной линии НЕК 293. Для исследования возможности процессинга гес-ргоВ№ при экспрессии в клеточной линии НЕК 293 белки из кондиционированной среды, собранной после проведения трансфекции, разделяли методом гель-фильтрации. В полученных фракциях измеряли иммунореактивность форм гес-ргоВИР с использованием трех различных систем сэндвич-ФИА: 24С587-98-АЬ2,

50El|orio8-16F313-20 и 15C46M1-13G12i:,.2I). Измерение иммунореактивности в системе 24C5g7-9g-Ab2, оба антитела в которой специфичны к BNP части молекулы, позволяет детектировать в образцах как BNP, так и proBNP (anti-BNP/proBNP) (Tamm et al. 2009). Система 50E1io2-io8-16F3i3.2o позволяет детектировать в образцах непроцессированный proBNP (anti-proBNP). Для определения содержания в образцах NT-proBNP была использована система 15C463.7|-13G12I3.2o (anti-NT-proBNP), поскольку, как было показано нами ранее, система, содержащая антитела, специфичные к участку 63-76, способна избирательно взаимодействовать с эндогенным NT-proBNP, практически не взаимодействуя с эндогенным proBNP (см. Рис. 3). Результаты измерений представлены на Рис. 5.

anö-BNP/iroBNP

anü-proBNP

anli-NT-jroBNP

1.5 9-

1,0 а

В-

Рис. 5. Иммунореактивность во фракциях, полученных после разделения методом гель-фильтрации (Superdex75) образца кондиционированной среды клеток НЕК 293, трансфицированных pCMV/proBNP. Иммунореактивность была измерена методом сэндвич-ФИА в трех системах: anti-BNP/proBNP, anti-proBNP - левая ось ординат; anti-NT-proBNP - правая ось ординат. Стрелками указаны положения маркеров молекулярной массы и положение максимума пика иммунореактивности синтетического BNP.

10 12 14 16 18 20 22 24 26 Номер фракции

Как видно из Рис. 5, в образце были выявлены три иммунореактивные формы: непроцессированный proBNP (пик с максимумом в области белков с молекулярными массами 30-40 кДа) и два продукта процессинга - BNP (пик с максимумом, совпадающим с максимумом синтстичсского BNP) и NT-proBNP (пик с максимумом в области белков с молекулярными массами 20-30 кДа). Полученный результат можно рассматривать как свидетельство наличия экспрессии в клетках линии НЕК 293 активной конвертазы прогормонов, способной осуществлять процессинг молекул proBNP.

Сравнение иммунохимических свойств гес-ргоВОТ и гес^Т-ргоВОТ. При

выборе модельной экспрессионной системы для проведения исследований влияния гликозшшрования на процессинг ргоВ№, помимо клеточной линии НЕК 293, мы также проводили экспрессию гес-ргоВОТ в двух других линиях клеток млекопитающих: СНО-К1 (клетки яичника китайского хомяка) и №Н ЗТЗ (фибробласты мыши). Анализ

форм rec-proBNP в образцах кондиционированной среды трансфицированных клеток СНО-К1 и NIH ЗТЗ показал, что экспрессируемый в данных клеточных линиях rec-proBNP так же, как и в клеточной линии НЕК 293, подвергается процессингу с образованием BNP и NT-proBNP (данные не представлены).

Мы провели сравнение профилей иммунореактивности rec-proBNP, экспрессированных в выбранных нами клеточных линиях, и rec-NT-proBNP, образующихся в результате процессинга rec-proBNP. Результаты измерений представлены на Рис. 6.

Рис. 6. Профили иммунореактивности —НЕХ29Э rec-proBNP, экспрессированных в клеточных линиях НЕК 293, СНО-К1 и NIH ЗТЗ.

Значения концентраций rec-proBNP, полученные при измерении в образцах кондиционированной среды клеточных линий НЕК 293. СНО-К1 и NIH ЗТЗ в системе lD4|3_24-24C587-9g (§), были приняты за 100% (96,0+2,5 нМ, 8.3+0,99 нМ и 13,2±0,37 нМ соответственно). Результаты представлены как среднее+стандартное отклонение (п=3).

Анткгела £ подложки — (эпитол) S

Анппела детекинн 24с5 (87-98)

Как следует из Рис. 6, rec-proBNP, экспрессированные в клеточных линиях НЕК 293, СНО-К1 и NIH ЗТЗ, имеют сходные профили иммунореактивности на участке 5-56, тогда как иммунореактивность участка 63-76 заметно различается. Доступность для взаимодействия с антителами участка 63-76 молекулы proBNP увеличивается в ряду: НЕК 293 < NIH ЗТЗ < СНО-К1 (иммунохимическая активность составляла -1-1,5%, 10-25% и 30-45% от значения, полученного при измерении в контрольной системе, соответственно). В то же время участок 63-76 в случае rec-NT-proBNP, образовавшегося в результате процессинга rec-proBNP под действием клеточной конвертазы, в случае всех трех линий обладает одинаково высокой иммунореактивностью (-80-95% от значения, полученного при измерении в контрольной паре) (данные не представлены). Тогда как иммунореактивность участка 5-56 rec-NT-proBNP была сходной с иммунореактивностью аналогичного участка rec-proBNP.

Уровень процессинга rec-proBNP в линиях клеток НЕК 293, СНО-К1 и NIH ЗТЗ. Результаты, полученные при сравнении иммунохимических свойств proBNP и

NT-proBNP, позволили нам предположить, что NT-proBNP может образовываться только из таких молекул proBNP, которые не гликозилированы или слабо гликозилированы в области, расположенной близко к сайту расщепления. Можно также предположить, что гликозилирование оказывает негативное влияние на процессинг proBNP. В таком случае наименьший уровень процессинга должен наблюдаться для наиболее гликозилированных по участку 63-76 молекул proBNP. Как было отмечено выше, среди трех исследованных нами клеточных линий (НЕК 293, СНО-К1 и NIH ЗТЗ) наибольший уровень гликозилирования rec-proBNP в указанной области наблюдался для белка, экспрессированного в клеточной линии НЕК 293. Таким образом, можно было ожидать, что для rec-proBNP, экспрессированного в данной клеточной линии, будет наблюдаться наименьший уровень процессинга.

Для проверки этого предположения мы исследовали уровень процессинга rec-proBNP, экспрессированных в трех обозначенных выше клеточных линиях. Уровень процессинга был оценен как соотношение молярной концентрации [NT-proBNP] к суммарной молярной концентрации [proBNP + NT-proBNP], Суммарную концентрацию [proBNP + NT-proBNP] определяли с использованием системы 5B6i.|2-13G12u.2o, не чувствительной к гликозилированию молекул NT-proBNP и proBNP. Измерения концентрации [NT-proBNP] проводили с использованием той же системы в образцах кондиционированной среды после удаления из них proBNP методом иммунопреципитации. Результаты представлены на Рис. 7.

Рис. 7. Уровень процессинга rec-proBNP в клеточных линиях НЕК 293, СНО-К1 и NIH ЗТЗ.

Соотношение молярной концентрации

[NT-proBNP] к суммарной молярной концентрации [proBNP + NT-proBNP] измерено в образцах кондиционированной среды клеток НЕК 293, СНО-К.1 и NIH ЗТЗ, трансфицированных pCMV/proBNP. Отмечены статистически значимые различия (*Р < 0,01) для уровня процессинга rec-proBNP в клеточных линиях СНО-К1 и NIH ЗТЗ по сравнению с клеточной линией НЕК 293. Результаты представлены как нек 293 сно-ki мн зтз среднее+стандартное отклонение (п=3).

с.н. - различия статистически незначимы.

Как видно из Рис. 7, уровень процессинга rec-proBNP. экспрессированного в клеточных линиях НЕК 293, СНО-KI и NIH ЗТЗ, различается. Как и ожидалось, среди 3 исследуемых клеточных линий наименьший уровень процессинга rec-proBNP наблюдается для линии НЕК 293. В этих клетках процессингу подвергается не более

8,1±1,1% синтезируемого rec-proBNP, тогда как в клеточных линиях СНО-К1 и NIH ЗТЗ уровень процессинга составляет 37,9±2,5% и 35,8±4,0% соответственно. Таким образом, полученные результаты подтверждают нашу гипотезу о негативном влиянии гликозилирования участка 63-76 на процессинг молекулы proBNP.

Получение очищенного препарата rec-proBNP. Изучение влияния гликозилирования на процессинг проводили на наиболее гликозилированной форме рекомбинатного белка - rec-proBNP, экспрессированном в клетках НЕК 293. Для проведения дальнейших исследований необходимо было получить очищенный препарат proBNP. На первой стадии выделения rec-proBNP экстрагировали методом аффинной хроматографии из кондиционированной среды клеток НЕК 293, трансфицированных pCVM/proBNP. В качестве аффинного носителя использовали сефарозу CL-4B с иммобилизованными МАт 24С587-98 и 50Е1 jo2-ios. специфичными к BNP-части молекулы proBNP. Анализ образца rec-proBNP, полученного после проведения аффинной экстракции, показал, что полученный препарат rec-proBNP содержит примеси других белков. Следующий этап очистки препарата rec-proBNP проводили на колонке, содержащей карбоксиметил-сефарозу. В результате двухстадийного выделения чистота полученного препарата rec-proBNP составляла >95% (Рис. 8). Идентичность полученного препарата rec-proBNP была подтверждена с помощью N-концевого секвенирования.

Рис. 8. Анализ очищенного препарата rec-proBNP, экспрессированного в клеточной линии НЕК 293.

А - Окрашивание раствором кумасси R-250 после проведения электрофоретического разделения. Б - иммунохимическое окрашивание на нитроцеллюлозной мембране с использованием МАт 13G1213.2o.

I - rec-proBNP (НЕК 293) (3 мкг (А) и 0,18 мкг (Б)), 2 - rec-proBNP (£. Coli) (1,5 мкг (А) и 0,1 мкг (Б)). Электрофоретическое разделение проводили в трис-трициновой буферной системе в ПААГ с Т=16,5% и С=3%. Электроперенос на нитроцеллюлозную мембрану проводили методом Вестерн-блоттинг.

Фурин-зависимый процессинг rec-proBNP, экспрессированного в клетках НЕК 293. В настоящее время окончательно не установлено, какая именно конвертаза прогормонов осуществляет процессинг молекул proBNP in vivo. В качестве возможных кандидатов рассматриваются две конвертазы - фурин и корин. С нашей точки зрения, предположение о том, что именно фурин является ферментом, отвечающим за процессинг proBNP, находит большую поддержку в литературе, и поэтому именно фурин

95 кДа -72 кДа -

ЗбкДа -28 кДа -17 кДа -11 кДа -

был выбран нами для проведения дальнейших исследований влияния гликозилирования

на процессинг. Фурин как конвертаза хорошо изучен и описан в литературе; для него показана экспрессия во многих тканях и клеточных линиях.

Исследование проводили с использованием рекомбинантного фурина и следующих образцов rec-proBNP (НЕК 293): интактного rec-proBNP, rec-proBNP после проведения ферментативного дегликозилирования, rec-proBNP после проведения химического дегликозилирования с использованием ТФМС. Также рекомбинантным фурином обрабатывали негликозилированный rec-proBNP, экспрессированный в клетках прокариот (Е. coli). Результаты оценки степени расщепления rec-proBNP под действием фурина представлены на Рис. 9.

Рис. 9. Расщепление rec-proBNP 120 рекомбинантным фурином.

^ Степень расщепления rec-proBNP оценена как

с,' юл * соотношение:

Г А -ж-

proBNP I furin

]х 100%).

proBNP (НЕК 293)

rec-proBNP (НЕК 293) rec-proBNP НИХ 293) rec-proBNP (F. coli)

ферМСИТПТИШЮГО .llMVIllK'OlllJllipOOHIIII)

Яегликошлнроваиин

proBNP - furin

Измерение концентрации proBNP в образцах проводили с использованием системы 50Е1 юмо!г16РЗ п-20. Отмечены значимые различия (*Р < 0,01) для rec-proBNP (НЕК 293) после ферментативного и химического дегликозилирования, и rec-proBNP (Е. coli) по сравнению с интактным rec-proBNP (НЕК 293). Результаты представлены как среднее+стандартное отклонение (п=3).

Как видно из Рис. 9, интактный rec-proBNP (НЕК 293) устойчив к обработке фурином, тогда как тот же белок после химического дегликозилирования и исходно негликозилированный rec-proBNP (Е. coli) подвергались расщеплению на 89±1,0% и 95+0,6% соответственно. Дегликозилирование образца rec-proBNP (НЕК 293) с помощью ферментов приводило лишь к незначительному увеличению степени расщепления (23,5±4,3% от исходного количества). При этом оценка эффективности дегликозилирования участка 67-76 показала, что дегликозилирование с использованием ферментов гликозидаз было менее эффективно, чем химическое дегликозилирование с использованием ТФМС (данные не представлены).

Таким образом, анализируя полученные результаты, можно заключить:

- интактный гликозилированный rec-proBNP (НЕК 293) устойчив к обработке

фурином;

- негликозилированный rec-proBNP (Е. coli) эффективно расщепляется фурином;

- дегликозилирование гес-ргоВИР (НЕК 293), приводящее к удалению О-гликанов на участке 63-76, делает возможным расщепление гес-ргоВКР (НЕК 293) фурином.

Расщепление эндогенного ргоВ№ фурином. С использованием аффинного носителя, содержащего МАт, специфичные к участку 67-76 молекулы ргоВОТ и неспособные взаимодействовать с ргоВОТ в случае, если узнаваемый ими эпитоп гликозилирован, было проведено фракционирование эндогенного ргоВОТ, содержащегося в образце объединенной плазмы больных с СН. В результате фракционирования были получены две основные фракции эндогенного ргоВИР, различающегося по гликозилированию участка 67-76:

- ргоВЫР, не гликозилированный на участке 67-76 (-30% от общего ргоВЫР);

- ргоВИР, гликозилированный на участке 67-76 (~70% от общего ргоВЫР).

Обе фракции эндогенного ргоВИР были обработаны фурином. Результаты эксперимента представлены на Рис. 10

Рис. 10. Расщепление эндогенного ргоВ№ рекомбипантным фурином.

Степень процессинга гес-ргоВЫР оценена как соотношение:

ргоВКР + (иМп

1 » I

-]х 100%).

эндогенный ртов^, энлоггнпып ¡гопм', не гликогнлнровнппып ня глнкошлнровяипып ия училке 67-76 учястг.* 67-76

эндогенный рговот,

ТОГГЯЛЬНЫЙ

ргоВЫР - 1ипп

Измерение концентрации ргоВИР в образцах проводили с использованием системы 50Е1ш2-Ю8-16Р31з-2о- Отмечены значимые различия (*Р< 0,01) для эндогенного ргоВОТ, не гликозилированного на участке 67-76, и тотального образца эндогенного ргоВ№ по сравнению с эндогенным ргоВЫР, гликозилированным на участке 67-76. Результаты представлены как

среднее±стандартное отклонение (п=3).

Как видно из Рис. 10, эндогенный ргоВМР, гликозилированный на участке 67-76, устойчив к обработке фурином, тогда как эндогенный ргоВИР, не гликозилированный на участке 67-76, подвергается расщеплению на 90,8±1,7%. Образец эндогенного ргоВЫР, содержащий обе фракции, гликозилированного и не гликозилированного на участке 67-76 ргоВ№ ("тотальный"), подвергался ращеплению на 28,1±1,0%, что согласуется с данными по оценке содержания в образце фракции не гликозилированного на участке 67-76 рго!ШР. Полученные результаты хорошо согласуются с полученными ранее результатами оценки влияния гликозилирования на участке вблизи сайта процессинга на эффективность расщепления фурином гес-ргоВИР, экспрессированного в клетках

НЕК 293 (см. Рис. 9).

Анализ методом масс-спектрометрии показал, что расщепление фурином фракции не гликозилированного на участке 67-76 эндогенного proBNP приводит к образованию молекулы BNP с массой, соответствующей теоретически рассчитанной массе полноразмерной формы BNP (3461,74 Да - теоретическое значение/3462,1 Да -экспериментально полученное значение). Эти данные позволяют заключить, что расщепление фурином не гликозилированной на участке 67-76 формы эндогенного proBNP происходит специфично по сайту -R76nIS77-, и подтверждают гипотезу, согласно которой именно фурин является конвертазой, ответственной за превращение proBNP в BNP и NT-proBNP.

Процессинг мутантных форм rec-proBNP. Для определения остатков серина и/или треонина, гликозилирование по которым препятствует процессингу proBNP, мы использовали метод сканирующего аланинового мутагенеза. Принцип данного метода состоит в том, что исследуемые а.к.о. в последовательности белка заменяются на остатки аланина. Замена остатков серина и/или треонина на остатки аланина делает невозможным О-гликозилирование по сайтам, в которых произведена замена, поскольку гликозилирование О-типа по остаткам аланина невозможно (Рис. 11).

Рис. 11. Участок аминокислотной сайт расщепления последовательности (55-86 а.к.о.) proBNP

человека вблизи сайта расщепления. StjPKMVQgSwGC- Выделены остатки треонина и серина, ' которые были заменены на остатки аланина

методом сайт-направленного мутагенеза.

-evaT,»egirghrkmvlyT71lrapr:

Для проведения исследований были получены молекулярно-генетические конструкции для экспрессии следующих мутантных форм гес-ргоВ№ с одиночными заменами на аланин: треонина в 58 (Т58А) и 71 (Т71А) положениях, серина в 77 (Б77А) и 84 (884А) положениях. Также были получены молекулярно-генетические конструкции с двойными заменами на аланин: треонина в 58 и треонина в 71 положении (Т58А/Т71А), треонина в 71 положении и серина в 77 положении (Т71А/877А).

Для оценки влияния гликозилирования по конкретным остаткам серина и/или треонина на процессинг клетки НЕК 293 трансфицировали конструкциями для экспрессии как мутантных форм гес-ргоВОТ, так и белка дикого типа, и измеряли степень процессинга. Результаты измерений представлены на Рис. 12.

Рис, 12. Процессинг rec-proBNP дикого типа и М)та11тных форм в клеточной линии НЕК 293.

Соотношение молярной концентрации [NT-proBNP] к суммарной молярной концентрации [proBNP + NT-proBNP] измерено в образцах с использованием системы 5B6i-i2-13G12i.i-2o- Отмечены статистически значимые различия (*Р < 0,01) для мутантных форм rec-proBNP Т58А, Т71А, Т58А/Т71А и T71A/S77A по сравнению с rec-proBNP дикого типа. Результаты представлены как среднее+стандартное отклонение (п=3). с.н. - различия статистически незначимы.

Как видно из Рис. 12, уровень процессинга мутантных форм rec-proBNP заметно различается. Для форм rec-proBNP, содержащих замену треонина в 71 положении на аланин (Т71А, Т58А/Т71А и T71A/S77A), наблюдается значительное увеличение уровня процессинга (56,7+3,5%, 51,2±6,4% и 40,5±1,9% соответственно) по сравнению с формой rec-proBNP дикого типа (7,6±0,4%). Также больший уровень процессинга наблюдается для формы rec-proBNP с одиночной заменой Т58А (17,5±1,5%) по сравнению с формой rec-proBNP дикого типа. Для мутантных форм rec-proBNP, содержащих одиночные замены серина в 77 и в 84 положениях, не наблюдалось увеличение уровня процессинга по сравнению с формой rec-proBNP дикого типа (6,4±2,3%, 11,2±0,5% для форм S77A и S84A по сравнению с 7,6±0,4% для формы дикого типа). Для мутантной формы rec-proBNP, содержащей двойную замену Т58А/Т71А, не наблюдалось увеличение уровня процессинга по сравнению с формой rec-proBNP, содержащей одиночную замену Т71А (51,2+6,4% и 56,7+3,5% соответственно). Эти данные позволяют заключить, что за подавление процессинга proBNP главным образом отвечают гликаны, связанные с остатком треонина в 71 положении. Из приведенных выше данных можно также заключить, что низкий уровень процессинга, наблюдаемый для формы rec-proBNP дикого типа (7,6+0,4%), не связан с низким уровнем экспрессии конвертазы прогормонов в клетках НЕК 293, так как для мутантной формы rec-proBNP Т71А уровень процессинга в этой клеточной линии составлял 56,7±3,5%.

Оценка уровня процессинга rec-proBNP дикого типа и мутантной формы T7IA по образованию формы BNP методом гель-фильтрации с последующим измерением иммунореактивности во фракциях (Рис. 13) дала сходные результаты с оценкой уровня процессинга по образованию формы NT-proBNP: 8,2±2,3% и 69+3,4% по сравнению с 7,6%±0,4% и 56,7+3,5% соответственно (см. Рис. 12).

Номер фракции

Рис. 13. Анализ процессинга rec-proBNP дикого типа и формы Т71Л в клеточной линии НЕК 293 с использованием метода гель-фильтрации.

Разделение белков, содержащихся в кондиционированной среде

трансфицированных клеток НЕК 293, проводили на колонке Superdex 75. Концентрации rec-proBNP и rec-BNP во фракциях были определены с использованием системы 24С 587-эд-АЬ2, одинаково эффективно узнающей обе молекулы. Стрелками отмечены положения стандартов

молекулярных масс и положение пика иммунореактивности синтетического BNP.

Заключение

В целом, полученные нами результаты позволяют заключить, что гликозилирование молекул ргоВЫР на участке, расположенном вблизи сайта процессинга, а именно гликозилирование по остатку треонина в положении 71, оказывает ингибирующее действие на процессинг молекул ргоВКР. На основании полученных данных нами предложена принципиально новая схема процессинга ргоВ№ человека, учитывающая влияние гликозилирования (Рис. 14). Результаты, полученные в настоящем исследовании, расширяют современные представления о молекулярных механизмах процессинга предшественника натрийуретического пептида В-типа человека и могут быть важными для понимания основ развития патофизиологических состояний сердечно-сосудистой системы.

Кровоток

Рис. 14. Обновленная и дополненная схема процессинга proBNP, основанная на результатах, полученных в данном исследовании.

Выводы

1. Показаны различия в степени гликозилирования участка 63-76 эндогенных proBNP и NT-proBNP.

2. Разработан метод экспрессии proBNP в линиях клеток млекопитающих. Получен и охарактеризован очищенный препарат рекомбинантного proBNP.

3. Показано, что при экспрессии в клеточных линиях НЕК 293, СНО-К1 и NIH ЗТЗ происходит процессинг рекомбинантного proBNP. На основании экспериментов с различными клеточными линиями предложена модельная система для исследования механизмов процессинга proBNP.

4. Показано, что гликозилирование по остатку треонина в 71 положении подавляет процессинг рекомбинантного proBNP, как при экспрессии в линиях клеток млекопитающих, так и в экспериментах in vitro с использованием фурина в качестве конвертазы прогормонов.

5. Выявлено наличие в крови больных с СН двух форм proBNP, различающихся по статусу гликозилирования участка, расположенного в непосредственной близости от участка расщепления. Показан сайт-специфичный протеолиз фракции эндогенного proBNP, не гликозилированного на участке вблизи сайта процессинга, под действием конвертазы фурин.

6. Предложена новая схема процессинга proBNP в организме человека.

Публикации по теме диссертации

1. Semenov A.G.. Postnikov A.B., Tamm N.N., Seferian K.R., Karpova N.S., Bloshchitsyna M.N., Koshkina E.V., Krasnoselskiy M.I., Serebryanaya D.V., Katrukha A.G. Processing of proBNP is suppressed by O-glycosylation in the region close to the cleavage site. Clinical Chemistry, 2009, Vol. 55, No. 3, pp. 489-498.

2. Tamm N.N., Seferian K.R., Semenov A.C.. Mukharyamova K.S., Koshkina E.V., Krasnoselsky M.I., Postnikov A.B., Serebryanaya D.V., Apple F.S., Murakami M.M., Katrukha A.G. Novel immunoassay for quantification of brain natriuretic peptide and its precursor in human blood. Clinical Chemistry, 2008, Vol. 54, No. 9, pp. 1511 - 1518.

3. Seferian K.R., Tamm N.N., Semenov A.G.. Tolstaya A.A., Koshkina E.V., Krasnoselsky M.I., Postnikov A.B., Serebryanaya D.V., Apple F.S., Murakami M.M., Katrukha A.G. Immunodetection of glycosylated NT-proBNP circulating in human blood. Clinical Chemistry, 2008, Vol. 54, No. 5, pp. 866-873.

4. Seferian K.R., Tamm N.N., Semenov A.G.. Mukharyamova K.S., Tolstaya A.A., Koshkina E.V., Kara A.N., Krasnoselsky M.I., Apple F.S., Esakova T.V., Filatov V.L., Katrukha A.G. The brain natriuretic peptide (BNP) precursor is the major immunoreactive form ofBNP in patients with heart failure. Clinical Chemistry, 2007; Vol. 53, No. 5, pp. 866 - 873.

5. Semenov A.G.. Karpova N.S., Postnikov A.B., Seferian K.R., Tamm N.N., Serebryanaya D.V., Katrukha A.G. O-Glycosylation-mediated heterogeneity of 67-76 region of endogenous pro-Brain Natriuretic Peptide (proBNP) and its processing. Abstract, FEBS congress, Prague, Czech Republic, 4-9 July 2009. The FEBS journal, 2009, Vol. 276, Supplement 1, pp. 342.

6. Semenov A.G.. Postnikov A.B., Tamm N.N., Seferian K.R., Karpova N.S., Serebryanaya

D.V., Katrukha A.G. New insights into human proBNP processing: the evidence for furin-mediated proBNP processing in vitro. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. Chicago, IL, July 19-23 2009. Clinical Chemistry, 2009, Vol. 55, No. S6, Supplement, A71.

7. Semenov A.G.. Karpova N.S., Postnikov A.B., Serebryanaya D.V., Tamm N.N., Seferian K.R., Kara A.N., Katrukha A.G. The difference in glycosylation between human proBNP and NT-proBNP suggests a new regulatory level in proBNP processing. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. 27-31 July 2008, Washington, DC. Clinical Chemistry, 2008, Vol. 54, No. 6, Supplement, A94.

8. Семенов А.Г.. Карпова H.C., Постников А.Б., Сеферян K.P., Тамм H.H., Серебряная Д.В., Блошицина М.Н., Катруха А.Г. Гликозилирование по остатку треонина в положении 71 препятствует процессингу молекул предшественника натрийуретического пептида В. Тезисы четвертой всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения. Москва, 2008. Сборник тезисов конференции, с. 128-129.

9. Seferian K.R., Tamm N.N., Semenov A.G.. Postnikov A.B., Katrukha A.G. Novel findings of the nature of circulating BNP, proBNP and NT-proBNP. Abstract, LabMed 2008, XXXI Nordic Congress in Clinical Chemistry, Helsinki, Finland, 14-18 June 2008. Abstracts book, 048.

10. Katrukha A.G, Semenov A.G.. Tamm N. N„ Seferian K. R., Postnikov А. В., Koshkina

E.V., Krasnoselsky M.Ia.,. Mukharyamova K. Sh, Tolstaya A. A., Filatov V. L. Glycosylation of NT-proBNP molecules and NT-proBNP immunoassays. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. San Diego, California, July 15-19 2007. Clinical Chemistry, 2007, Vol. 53, No. 6, Supplement, A23.

11. Семенов А.Г., Сеферян K.P., Тамм H.H., Постников А.Б. Гликозжированные формы NT-proBNP и proBNP: взаимодействие с антителами и стабгшьность. Тезисы конференции «Биотехнология и медицина», Москва, 14-17 марта 2007. Сборник тезисов конференции, с. 128-129.

12. Семенов А.Г.. Сеферян K.P. Изучение иммунохимических свойств N-концевой части предшественника натрийуретического пептида В (NT-proBNP). Тезисы конференции "Ломоносов-2006", Москва, 12-15 апреля 2008. Издательство МГУ, с. 206-207.

Заказ № 150-а/09/09 Подписано в печать 23.09.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

¿«^ 000 "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

J} www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семенов, Александр Геннадьевич

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Семейство натрийуретических пептидов.

2.1.1. Открытие натрийуретических пептидов.

2.1.2. Натрийуретический пептид В-типа — представитель семейства натрийуретических пептидов.

2.2. Синтез и секреция BNP.

2.2.1. Структура гена BNP.

2.2.2. Экспрессия BNP в различных тканях.

2.2.3. Регуляция секреции и экспрессии BNP.

2.3. Процессинг молекул-предшественников BNP.

2.3.1. Семейство конвертаз прогормонов.

2.3.2. Экспрессия и процессинг молекул-предшествинников BNP.

2.3.3. Фурин и корин — потенциальные конвертазы, осуществляющие процессинг молекул-предшественников BNP.

2.4. Посттрансляционные модификации proBNP и NT-proBNP.

2.4.1. Представления о существовании олигомерных форм proBNP и NT-proBNP.

2.4.2. ProBNP и NT-proBNP как О-гликопротеины.

2.4.3. О-гликозилирование — наиболее распространенный тип посттрансляционных модификаций белков.

2.5. Рецепторы натрийуретических пептидов.

2.5.1. Семейство рецепторов натрийуретических пептидов.

2.5.2. Активация и десенситизация рецепторов.

2.6. Метаболизм BNP в кровотоке.

2.7. Физиологическое действие BNP.

2.7.1. Действие BNP на почки.

2.7.2. Действие BNP на сердечно-сосудистую систему.

2.7.3. Действие на эндокринную систему.

2.8. BNP — диагностический и прогностический биохимический маркер состояния сердечной недостаточности.

2.8.1. Сердечная недостаточность. Общая характеристика.

2.8.2. Патофизиология СН.

2.8.3. Терапевтическое применение натрийуретических пептидов.

2.8.4. Диагностика СН.

2.8.5. Измерение концентрации BNP и NT-proBNP в крови.

2.9. Процессинг молекул-предшественников BNP — возможный регуляторный механизм содержания активной формы BNP в крови.

2.9.1. Формы BNP в крови.

2.9.2. ProBNP - превалирующая форма в крови больных с СН.

2.9.3. Эндокринный парадокс.

3. Материалы и методы.

3.1. Материалы.

3.1.1. Реактивы и материалы для биохимических и молекулярно-биологических исследований.

3.1.2. Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Иммунохимические и биохимические методы.

3.2.1.1. Прямой гшмуноанализ и гшмуноаналнз сэндвич-mima. Общие принципы

3.2.1.2. Коныогирование антител. а) Конъюгирование антител с пероксидазой хрена. б) Конъюгирование антител со стабильным хелатом европия. в) Конъюгирование антител с производным биотина.

3.2.1.3. Прямой иммупоферментный анализ.

3.2.1.4. Прямой гммунофосфоресцентный анализ.

3.2.1.5. Иммунофосфоресцентный анализ сэндвич-типа.

3.2.1.5. Иммунофосфоресцентный анализ сэндвич-типа с направленной сорбцией антител на планшете.

3.2.1.6. Иммобилизация антител на CNBr — активированной сефарозе.

3.2.1.7. Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН в трис-трициновой буферной системе.

3.2.1.8. Вестерн-блоттинг.

3.2.1.9. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобшшзованных на нитроцеллюлозной мембране. а) Визуализация белковых полос с помощью хромогенного субстрата диаминобензидина. б) Визуализация белковых полос с использованием метода усиленной хемилюминесценции (Enhanced Chemioluminescence, ECL).

3.2.1.10. Экстракция и иммунопреципитация proBNP с использованием аффинного носителя. а) Экстракция proBNP из объединенной плазмы больных СН. б) Экстракция рекомбинантного proBNP из объединенной кондиционированной среды. в) Микроэкстракция proBNP методом аффинной хроматографии. г) Иммунопреципитация proBNP.

3.2.1.11. Хроматографическое разделение белков. а) Ионообменная хроматография. б) Гель-фильтрация. в) Обратно-фазовая хроматография.

3.2.1.12. Ферментативное дегликозилирование proBNP.

3.2.1.13. Химическое дегликозилирование рекомбинантного proBNP, экспрессированного в клетках НЕК 293.

3.2.1.14. Расщепление proBNP рекомбинантным фурином in vitro. а) Расщепление рекомбинантного proBNP. б) Расщепление эндогенного proBNP.

3.2.1.15. Масс-спектрометрический анализ.

3.2.2. Молекулярно-биологические методы.

3.2.2.1. Получение молекулярно-генетической конструкцииpCMV/proBNP для экспрессии рекомбинантного proBNP в клетках млекопитающих.

3.2.2.2. Получение молекулярно-генетических конструкций для экспрессии мутантных форм proBNP.

3.2.3. Клеточно-биологические методы.

3.2.3.1. Культивирование клеточных линий НЕК 293, СНО-К1, NIH ЗТЗ.

3.2.3.2. Транзиторная трансфекция эукариотических клеточных линий.

4. Результаты исследования и их обсуждение.

4.1. Сравнение профилей иммунореактивности эндогенных proBNP и NT-proBNP

4.2. Создание молекулярно-генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного proBNP в линиях клеток млекопитающих.

4.3. Экспресиия rec-proBNP в клеточной линии НЕК 293.

4.3.1. Оценка уровня экспрессии rec-proBNP.

4.3.2. Определение оптимального времени культивирования клеток НЕК 293 после проведения трансфекции.

4.3.3. Анализ форм rec-proBNP в кондиционированной среде клеток линии НЕК 293, трансфицированных конструкцией pCMV/proBNP.

4.4. Степень гликозилирования участка 63-76 rec-proBNP и уровень процессинга

4.4.1. Иммунореактивностъ rec-proBNP и rec-NT-proBNP, экспрессированных в клеточных линиях СНО-К1 и NIH ЗТЗ.

4.4.2. Уровень процессинга rec-proBNP при экспрессии в клеточных линиях НЕК 293, СНО-К1 UNIH3T3.

4.5. Получение очищенного препарата rec-proBNP, экснрессированного в клеточной линии НЕК 293.

4.5.1. Выделение и очистка rec-proBNP (НЕК 293).

4.5.2. Характеризация очищенного препарата rec-proBNP (НЕК 293).

4.6. Влияние гликозилирования участка, расположенного вблизи сайта процессинга, на расщепление proBNP конвертазой прогормонов фурином.

4.6.1. Расщепление rec-proBNP, экспрессированного в клетках НЕК 293, рекомбинантнъш фурином.

4.6.2. Расщепление эндогенного proBNPрекомбинантным фурином.

4.7. Процессинг мутантных форм rec-proBNP (НЕК 293).

4.7.1. Сканирующий аланиновый мутагенез.

4.7.2. Оценка уровня процессинга мутантных форм rec-proBNP.

4.7.3. Исследование процессинга rec-proBNP дикого типа и формы Т71А с использованием метода гель-фильтрации.

4.7.4. Исследование BNP, образующегося при процессинге мутантной формы гес-proBNP Т71А, с использованием метода масс-спектрометрии.

4.8. Анализ филогенетической консервативности феномена ингибирования процессинга proBNP под действием гликозилирования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние гликозилирования на процессинг предшественника натрийуретического пептида B-типа человека"

Натрийуретический пептид В-типа (BNP) является циркулирующим в крови пептидным гормоном. Физиологическое действие BNP проявляется в регуляции объема жидкости в организме и кровяного давления. BNP стимулирует натрийурез и диурез, обладает сосудорасширяющим действием, оказывает ингибирующее действие на ренин-ангиотензин-альдостероновую систему.

Фермент, осуществляющий процессинг proBNP в кардиомиоцитах, неизвестен. В качестве возможных конвертаз, осуществляющих процессинг proBNP, в литературе обсуждаются две сериновые протеазы, фурин и корин. Для этих конвертаз была показана потенциальная возможность осуществлять процессинг proBNP in vitro, однако, какова их роль в процессинге proBNP in vivo, еще предстоит выяснить.

Уровень транскрипции и секреции BNP увеличивается под воздействием различных стимулов, как механических (увеличение нагрузки на камеры сердца, гипертрофия), так и гормональных (агонисты адренергических рецепторов, ангиотензин II, эндотелии-1, интерлейкины). По характеру изменения уровня экспрессии в ответ на различные стимулы ген BNP относится к генам раннего ответа. Принято считать, что регуляция содержания BNP осуществляется в основном на уровне экспрессии гена.

Обе формы, BNP и NT-proBNP, образующиеся в результате процессинга молекул-предшественников, а также непроцессированные молекулы proBNP попадают в кровоток. При заболеваниях сердечно-сосудистой системы, связанных с повышением давления на стенки камер сердца, концентрация BNP и NT-proBNP в крови значительно повышается, при этом наблюдается положительная корреляция между концентрацией полипептидов и степенью тяжести заболевания. В настоящее время измерение концентрации BNP и NT-proBNP в крови с применением иммунохимических методов широко используется в клинической практике для диагностики сердечной недостаточности (СП), оценки функции левого желудочка, прогнозирования риска 7 \ L развития сердечно-сосудистых заболеваний, мониторинга терапии CH. Также рассматривается возможность использования препарата на основе синтетического BNP в качестве терапевтического средства для лечения CH.

СН - патофизиологическое состояние, вызванное ухудшением сократительной способности сердца, сопровождается увеличением уровня экспрессии и секреции BNP. На ранних стадиях развития СН повышение концентрации BNP в крови обеспечивает поддержание нормального функционирования сердечно-сосудистой системы и почек. Однако у больных с тяжелыми формами СН даже на фоне очень высоких значений концентрации BNP, определяемых в крови с использованием иммунохимических методов, наблюдается удержание воды и натрия, повышенное системное сосудистое сопротивление j и высокие значения преднагрузки сердца. Сравнительно недавно в нашей лаборатории, а позднее и рядом других исследовательских групп, было показано, что высокий уровень иммунореактивного BNP в крови больных с тяжелыми формами СН отражает, прежде всего, содержание proBNP, а не BNP, как считалось ранее. При этом концентрация proBNP в крови больных с СН может в несколько раз превышать концентрацию физиологически активного гормона, BNP.

В данной работе в качестве возможного механизма регуляции процессинга proBNP рассматривается гликозилирование аминокислотных остатков, расположенных рядом с сайтом процессинга. Предположение о возможном влиянии гликозилирования на процессинг proBNP было высказано в нашей лаборатории на основании данных, полученных в недавних исследованиях. Было показано, что NT-proBNP и proBNP, циркулирующие в крови больных с СН, являются О-гликопротеинами. Для рекомбинантного proBNP, экспрессированного в линии клеток млекопитающих СНО (клетки яичника китайского хомяка), Schellenberger и соавторы идетифицировали 7 сайтов гликозилирования: Т36, S37, S44, Т48, S53, Tsg и Т71 (Schellenberger et al. 2006). В нашей лаборатории было показано, что центральный участок (28-56 а.к.о.) эндогенного NT-proBNP гликозилирован, тогда как N- и С-концевые фрагменты молекулы не содержат углеводных остатков (Seferian et al. 2008). Наличие гликозилирования на участке, расположенном рядом с сайтом расщепления -Rye^Sw- (потенциальный сайт гликозилирования — Т71), у непроцессированного предшественника и отсутствие гликозилирования по данному сайту у процессированного фрагмента позволило предположить, что:

- гликозилирование может быть частью регуляторного механизма процессинга proBNP.

Таким образом, целью данной работы было исследование возможного механизма регуляции процессинга proBNP, основанного на гликозилировании фрагмента молекулы, расположенного рядом с сайтом процессинга. Исследование влияния гликозилирования на процессинг proBNP было проведено на эндогенном proBNP, циркулирующем в крови больных с СН, и рекомбинантном proBNP, экспрессированном в линиях клеток млекопитающих, с использованием широкого набора иммунохимических, биохимических и молекулярно-биологических методов.

В работе были поставлены следующие задачи:

4. Исследовать влияние гликозилирования на процессинг рекомбинантного,и эндогенного proBNP in vitro под действием конвертазы прогормонов фурин.

5. Исследовать сайт-специфичность процессинга proBNP под действием фурина.

6. Создать молекулярно-генетические конструкции для экспрессии мутантных форм ргоВ№, содержащих замены остатков серина и треонина, расположенных в непосредственной близости от сайта процессинга, на остатки аланина. Провести исследования эффективности процессинга полученных мутантных форм ргоВЫР.

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Семенов, Александр Геннадьевич

Выводы

1. Показаны различия в степени гликозилирования участка 63-76 эндогенных proBNP и NT-proBNP.

4. Показано, что гликозилирование по остатку треонина в положении 71 подавляет процессинг рекомбинантного proBNP, как при экспрессии в линиях клеток млекопитающих, так и в экспериментах in vitro с использованием фурина в качестве конвертазы прогормонов.

6. Предложена новая схема процессинга proBNP в организме человека.

Благодарности

Я глубоко признателен своему научному руководителю доктору биологических наук Алексею Генриховичу Катрухе за предоставленную возможность выполнить данную исследовательскую работу и чуткое руководство.

Выражаю искреннюю признательность Карине Рубеновне Сеферян, Наталье Никитичне Тамм, Александру Борисовичу Постникову, Дарье Владимировне Серебряной за неоценимую помощь в выполнении данной работы.

Хочу также поблагодарить своих родных и близких за поддержку и помощь, оказанную при выполнении работы и написании диссертации.

Заключение

Повышение концентрации циркулирующего в крови гормона BNP является одним из регуляторных механизмов, направленных на компенсацию патофизиологического состояния, возникающего при развитии дисфункции сократительной способности сердца. Компенсирующее действие BNP направленно на регуляцию функций сердечно-сосудистой системы и почек и проявляется в поддержании водно-солевого баланса. Однако по не известным в настоящее время причинам при тяжелых формах СН компенсирующее действие BNP слабо выражено.

Как было показано в ряде исследований, в крови больных с СН основной белковой формой, проявляющей BNP-специфичную иммунореактивность, является proBNP.' Концентрация proBNP в крови в несколько раз превышает концентрацию физиологически активного гормона BNP. Преобладание в крови формы непроцессированного предшественника BNP, обладающего значительно меньшей физиологической активностью по сравнению с формой зрелого гормона, может быть причиной развития состояния недостаточности физиологически активного гормона, которое наблюдается у больных с тяжелыми формами CH. Поскольку в настоящее время молекулярные механизмы процессинга proBNP практически не изучены, сложно сказать, на каком этапе происходит нарушение, приводящее к накоплению в крови формы непроцессированного предшественника.

В данном исследовании с использованием широкого набора иммунохимических, биохимических и молекулярно-биологических методов было показано, что эффективность процессинга предшественника натрийуретического пептида В-типа человека зависит от статуса гликозилирования участка молекулы, расположенного вблизи сайта процессинга. Исследование эффективности процессинга различных мутантных форм rec-proBNP, экспрессированных в клеточной линии НЕК 293, позволило установить, что прохождению процессинга proBNP препятствует наличие О-гликанов, ковалентно связанных с остатком треонина в положении 71. Проведенный сравнительный анализ известных аминокислотных последовательностей proBNP млекопитающих позволяет предположить, что механизм регуляции процессинга под действием гликозилирования является уникальным механизмом, характерным для человека и приматов.

Показанное в данном исследовании негативное влияние гликозилирования на участке вблизи сайта процессинга на процессинг proBNP позволяет объяснить накопление proBNP в крови за счет уменьшения уровня процессинга. Можно предположить, что некоторые патофизиологические состояния, связаные с повышением уровня О-гликозилирования, могут приводить к аномально высокому уровню гликозилирования молекулы proBNP и, таким образом, препятствовать нормальному процессингу proBNP. Как следствие - в крови уменьшается концентрация физиологически активной формы гормона, что, в свою очередь, приводит к прогрессированию CH. Клиническую значимость данного открытия еще предстоит выяснить.

На основании полученных в данном исследовании результатов нами предложена принципиально новая схема процессинга proBNP человека, учитывающая влияние гликозилирования участка, расположенного вблизи сайта процессинга (Рис. 43). Согласно этой схеме, при экспрессии proBNP процессингу подвергается только фракция белка, не содержащая ковалентно связанных О-гликанов по остатку треонина в положении 71. Фракция proBNP, гликозилированного по остатку треонина в положении 71, не расщепляется конвертазой прогормонов и попадет в кровоток в виде непроцессированных молекул. Таким образом, можно предположить, что гликозилирование по остатку треонина в положении 71 выполняет регуляторную роль, определяя эффективность процессинга предшественника BNP. Мы полагаем, что результаты, полученные в настоящем исследовании, расширяют современные представления о молекулярных механизмах процессинга предшественника натрийуретического пептида В-типа человека и могут быть важными для понимания основ развития патофизиологических состояний сердечно-сосудистой системы. О

Рис. 43. Обновленная и дополненная схема процессинга proBNP, основанная на результатах, полученных в данном исследовании.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семенов, Александр Геннадьевич, Москва

1. Остерман, JI. А. 1985. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. 1985, Москва: Наука.

2. Alfalah, М., R. Jacob, U. Preuss, К. P. Zimmer, Н. Nairn, and Н. Y. Nairn. 1999. О-linked glycans mediate apical sorting of human intestinal sucrase-isomaltase through association with lipid rafts. Curr Biol 9 (11):593-596.

3. Apple, F. S., M. Panteghini, J. Ravkilde, J. Mair, A. H. Wu, J. Tate, F. Pagani, R. H. Christenson, and A. S. Jaffe. 2005. Quality specifications for B-type natriuretic peptide assays. Clin Chem 51 (3):486-493.

4. Apweiler, R., H. Hermjakob, and N. Sharon. 1999. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta 1473 (l):4-8.

5. Arden, К. С., C. S. Viars, S. Weiss, S. Argentin, and M. Nemer. 1995. Localization of the human B-type natriuretic peptide precursor (NPPB) gene to chromosome lp36. Genomics 26 (2):385-389.

6. Barr, C. S., P. Rhodes, and A. D. Struthers. 1996. C-type natriuretic peptide. Peptides 17 (7): 1243-1251.

7. Blobel, G. 1980. Intracellular protein topogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 11 (3): 14961500.

8. Brandt, I., A. M. Lambeir, J. M. Ketelslegers, M. Vanderheyden, S. Scharpe, and I. De Meester. 2006. Dipeptidyl-peptidase IV converts intact B-type natriuretic peptide into its des-SerPro form. Clin Chem 52 (l):82-87.

9. Brown, L. A., D. J. Nunez, and M. R. Wilkins. 1993. Differential regulation of natriuretic peptide receptor messenger RNAs during the development of cardiac hypertrophy in the rat. J Clin Invest 92 (6):2702-2712.

10. Brown, L. A., R. A. Rutherford, D. J. Nunez, J. Wharton, D. G. Lowe, and M. R. Wilkins. 1997. Downregulation of natriuretic peptide C-receptor protein in the hypertrophied ventricle of the aortovenocaval fistula rat. Cardiovasc Res 36 (3):363-371.

11. Bruneau, B. G., and A. J. de Bold. 1994. Selective changes in natriuretic peptide and early response gene expression in isolated rat atria following stimulation by stretch or endothelin-1. Cardiovasc Res 28 (10):1519-1525.

12. Bruneau, B. G., L. A. Piazza, and A. J. de Bold. 1997. BNP gene expression is specifically modulated by stretch and ET-1 in a new model of isolated rat atria. Am J Physiol 273 (6 Pt 2):H2678-2686.

13. Campbell, D. J., K. I. Mitchelhill, S. M. Schlicht, and R. J. Booth. 2000. Plasma amino-terminal pro-brain natriuretic peptide: a novel approach to the diagnosis of cardiac dysfunction. J Card Fail 6 (2): 130-139.

14. Cao, L., and D. G. Gardner. 1995. Natriuretic peptides inhibit DNA synthesis in cardiac fibroblasts. Hypertension 25 (2):227-234.

15. Cheung, B. M., J. E. Dickerson, M. J. Ashby, M. J. Brown, and J. Brown. 1994. Effects of physiological increments in human alpha-atrial natriuretic peptide and human brain natriuretic peptide in normal male subjects. Clin Sci (Lond) 86 (6):723-730.

16. Chinkers, M., and D. L. Garbers. 1989. The protein kinase domain of the ANP receptor is required for signaling. Science 245 (4924): 1392-1394.

17. Clerico, A., G. Iervasi, and G. Mariani. 1999. Pathophysiologic relevance of measuring the plasma levels of cardiac natriuretic peptide hormones in humans. Horm Metab Res 31 (9):487-498.

18. Corti, R., J. C. Burnett, Jr., J. L. Rouleau, F. Ruschitzka, and T. F. Luscher. 2001. Vasopeptidase inhibitors: a new therapeutic concept in cardiovascular disease? Circulation 104 (15):1856-1862.

19. Cowie, M. R., and G. F. Mendez. 2002. BNP and congestive heart failure. Prog Cardiovasc Dis 44 (4):293-321.

20. Crimmins, D. L. 2005. Human N-terminal proBNP is a monomer. Clin Chem 51 (6):1035-1038.

21. Crimmins, D. L., and J. L. Kao. 2007. The human cardiac hormone fragment N-terminal pro B-type natriuretic peptide is an intrinsically unstructured protein. Arch Biochem Biophys 461 (2):242-246.

22. Crimmins, D. L., and J. L. Kao. 2008. A glycosylated form of the human cardiac hormone pro B-type natriuretic peptide is an intrinsically unstructured monomeric protein. Arch Biochem Biophys 475 (1):36-41.

23. Developed in collaboration with the Heart Failure Association of the ESC (HFA) and endorsed by the European Society of Intensive Care Medicine (ESICM). Eur Heart J 29 (19):2388-2442.

24. Doust, J. A., P. P. Glasziou, E. Pietrzak, and A. J. Dobson. 2004. A systematic review of the diagnostic accuracy of natriuretic peptides for heart failure. Arch Intern Med 164 (18): 19781984.

25. Edge, A. S. 2003. Deglycosylation of glycoproteins with trifluoromethanesulphonic acid: elucidation of molecular structure and function. Biochem J 316 (Pt 2):339-350.

26. Edge, A. S., C. R. Faltynek, L. Hof, L. E. Reichert, Jr., and P. Weber. 1981. Deglycosylation of glycoproteins by trifluoromethanesulfonic acid. Anal Biochem 118 (1):131-137.

27. Emori, T., Y. Hirata, T. Imai, S. Eguchi, K. Kanno, and F. Marumo. 1993. Cellular mechanism of natriuretic peptides-induced inhibition of endothelin-1 biosynthesis in rat endothelial cells. Endocrinology 133 (6):2474-2480.

28. Flynn, T. G., M. L. de Bold, and A. J. de Bold. 1983. The amino acid sequence of an atrial peptide with potent diuretic and natriuretic properties. Biochem Biophys Res Commun 117 (3):859-865.

29. Furuya, M., N. Ohnuma, M. Takehisa, Y. Hayashi, T. Ishihara, N. Minamino, K. Kangawa, and H. Matsuo. 1991. Pharmacological activities of brain natriuretic peptides of human, porcine and rat origin. Eur J Pharmacol 200 (2-3):233-237.

30. Galligan, J. J. 1998. Focus on: "G protein-dependent activation of smooth muscle eNOS via natriuretic peptide clearance receptor". Am J Physiol 275 (6 Pt 1):C1407-1408.

31. Garg, R., and S. Yusuf. 1995. Overview of randomized trials of angiotensin-converting enzyme inhibitors on mortality and morbidity in patients with heart failure. Collaborative Group on ACE Inhibitor Trials. JAMA 273 (18):1450-1456.

32. Garner, B., A. H. Merry, L. Royle, D. J. Harvey, P. M. Rudd, and J. Thillet. 2001. Structural elucidation of the N- and O-glycans of human apolipoprotein(a): role of o-glycans in conferring protease resistance. J Biol Chem 276 (25):22200-22208.

33. Gerbes, A. L., L. Dagnino, T. Nguyen, and M. Nemer. 1994. Transcription of brain natriuretic peptide and atrial natriuretic peptide genes in human tissues. J Clin Endocrinol Metab 78 (6): 1307-1311.

34. Gladysheva, I. P., B. R. Robinson, A. K. Houng, T. Kovats, and S. M. King. 2008. Corin is co-expressed with pro-ANP and localized on the cardiomyocyte surface in both zymogen and catalytically active forms. JMol Cell Cardiol 44 (1):131-142.

35. Goetze, J. P. 2004. Biochemistry of pro-B-type natriuretic peptide-derived peptides: the endocrine heart revisited. Clin Chem 50 (9): 1503-1510.

36. Goetze, J. P., J. Kastrup, and J. F. Rehfeld. 2003. The paradox of increased natriuretic hormones in congestive heart failure patients: does the endocrine heart also fail in heart failure? Eur Heart J24 (16):1471-1472.

37. Graham, F. L., J. Smiley, W. C. Russell, and R. Nairn. 1977. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol 36 (l):59-74.

38. Gunning, M., B. J. Ballermann, P. Silva, B. M. Brenner, and M. L. Zeidel. 1990. Brain natriuretic peptide: interaction with renal ANP system. Am J Physiol 258 (3 Pt 2):F467-472.

39. Hansen, J. E., O. Lund, J. Engelbrecht, H. Bohr, and J. O. Nielsen. 1995. Prediction of O-glycosylation of mammalian proteins: specificity patterns of UDP-GalNAc:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase. Biochem J308 ( Pt 3):801-813.

40. Hart, G. W. 1992. Glycosylation. Curr Opin Cell Biol 4 (6):1017-1023.

41. He, Q., M. Mendez, and M. C. LaPointe. 2002. Regulation of the human brain natriuretic peptide gene by GATA-4. Am J Physiol Endocrinol Metab 283 (l):E50-57.

42. He, X., D. Chow, M. M. Martick, and K. C. Garcia. 2001. Allosteric activation of a spring-loaded natriuretic peptide receptor dimer by hormone. Science 293 (5535): 1657-1662.

43. Hemmila, I., S. Dakubu, V. M. Mukkala, H. Siitari, and T. Lovgren. 1984. Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays. Anal Biochem 137 (2):335-343.

44. Henry, J. P., and J. W. Pearce. 1956. The possible role of cardiac atrial stretch receptors in the induction of changes in urine flow. J Physiol 131 (3):572-585.

45. Hino, J., H. Tateyama, N. Minamino, K. Kangawa, and H. Matsuo. 1990. Isolation and identification of human brain natriuretic peptides in cardiac atrium. Biochem Biophys Res Commun 167 (2):693-700.

46. Holmes, S. J., E. A. Espiner, A. M. Richards, T. G. Yandle, and C. Frampton. 1993. Renal, endocrine, and hemodynamic effects of human brain natriuretic peptide in normal man. J Clin Endocrinol Metab 16 (l):91-96.

47. Horio, T., M. Kohno, and T. Takeda. 1992. Effects of arginine vasopressin, angiotensin II and endothelin-1 on the release of brain natriuretic peptide in vivo and in vitro. Clin Exp Pharmacol Physiol 19 (8):575-582.

48. Hosoda, K., K. Nakao, M. Mukoyama, Y. Saito, M. Jougasaki, G. Shirakami, S. Suga, Y. Ogawa, H. Yasue, and H. Imura. 1991. Expression of brain natriuretic peptide gene in human heart. Production in the ventricle. Hypertension 17 (6 Pt 2): 1152-1155.

49. Hounsell, E. F., M. J. Davies, and D.j V. Renouf. 1996. O-linked protein glycosylation structure and function. Glycoconj J13 (1): 19-26.

50. Huang, W. S„ M. S. Lee, H. W. Perng, S. P. Yang, S. W. Kuo, and H. D. Chang. 2002. Circulating brain natriuretic peptide values in healthy men before and after exercise. Metabolism 51 (11):1423-1426.

51. Hughes, D., S. Talwar, I. B. Squire, J. E. Davies, and L. L. Ng. 1999. An immunoluminometric assay for N-terminal pro-brain natriuretic peptide: development of a test for left ventricular dysfunction. Clin Sci (Lond) 96 (4):373-380.

52. Hunt, P. J., E. A. Espiner, M. G. Nicholls, A. M. Richards, and T. G. Yandle. 1996. Differing biological effects of equimolar atrial and brain natriuretic peptide infusions in normal man .J Clin Endocrinol Metab 81 (11):3871-3876.

53. Hunt, P. J., E. A. Espiner, M. G. Nicholls, A. M. Richards, and T. G. Yandle. 1997a. The role of the circulation in processing pro-brain natriuretic peptide (proBNP) to amino-terminal BNP and BNP-32. Peptides 18 (10): 1475-1481.

54. Hunt, P. J., A. M. Richards, M. G. Nicholls, T. G. Yandle, R. N. Doughty, and E. A. Espiner. 1997b. Immunoreactive amino-terminal pro-brain natriuretic peptide (NT-PROBNP): a new marker of cardiac impairment. Clin Endocrinol (Oxf) 47 (3):287-296.

55. Hunt, P. J., T. G. Yandle, M. G. Nicholls, A. M. Richards, and E. A. Espiner. 1995. The amino-terminal portion of pro-brain natriuretic peptide (Pro-BNP) circulates in human plasma. Biochem Biophys Res Commun 214 (3):1175-1183.

56. Ishizaka, Y., Y. Yamamoto, M. Tanaka, F. Kato, N. Yokota, J. Kato, K. Kitamura, T. Eto, K. Kangawa, and et al. 1995. Molecular forms of human brain natriuretic peptide (BNP) in plasma of patients on hemodialysis (HD). Clin Nephrol 43 (4):237-242.

57. Itakura, M., M. Iwashina, T. Mizuno, T. Ito, H. Hagiwara, and S. Hirose. 1994. Mutational analysis of disulfide bridges in the type C atrial natriuretic peptide receptor. J Biol Chem 269 (11):8314-8318.

58. Jeng, A. Y., P. Savage, M. E. Beil, C. W. Bruseo, D. Hoyer, C. A. Fink, and A. J. Trapani. 2002. CGS 34226, a thiol-based dual inhibitor of endothelin converting enzyme-1 and neutral endopeptidase 24.11. Clin Sci (Lond) 103 Suppl 48:98S-101S.

59. Jensen, K. T., J. Carstens, and E. B. Pedersen. 1998. Effect of BNP on> renal hemodynamics, tubular function and vasoactive hormones in humans. Am J Physiol 274 (1 Pt 2):F63-72.

60. Jentoft, N. 1990. Why are proteins O-glycosylated? Trends Biochem Sci 15 (8):291-294.

61. Julenius, K., A. Molgaard, R. Gupta, and S. Brunak. 2005. Prediction, conservation analysis, and structural characterization of mammalian mucin-type O-glycosylation sites. Glycobiology 15 (2):153-164.

62. Kangawa, K., and H. Matsuo. 1984. Purification and complete amino acid sequence of alpha-human atrial natriuretic polypeptide (alpha-hANP). Biochem Biophys Res Commun 118 (1): 131-139.

63. Kimura, K., Y. Yamaguchi, M. Horii, H. Kawata, H. Yamamoto, S. Uemura, and Y. Saito. 2007. ANP is cleared much faster than BNP in patients with congestive heart failure. Eur J Clin Pharmacol 63 (7):699-702.

64. Kisch, B. 1956. Electron microscopy of the atrium of the heart. I. Guinea pig. Exp Med Surg 14 (2-3):99-112.

65. Kitashiro, S., T. Sugiura, Y. Takayama, Y. Tsuka, T. Izuoka, S. Tokunaga, and T. Iwasaka. 1999. Long-term administration of atrial natriuretic peptide in patients with acute heart failure. J Cardiovasc Pharmacol 33 (6):948-952.

66. Knappe, S., F. Wu, M. R. Masikat, J. Morser, and Q. Wu. 2003. Functional analysis of the transmembrane domain and activation cleavage of human corin: design and characterization of a soluble corin. J Biol Chem 278 (52):52363-52370.

67. Knowles, J. W., G. Esposito, L. Mao, J. R. Hagaman, J. E. Fox, O. Smithies, H. A. Rockman, and N. Maeda. 2001. Pressure-independent enhancement of cardiac hypertrophy in natriuretic peptide receptor A-deficient mice. J Clin Invest 107 (8):975-984.

68. Kollenda, M. C., A. M. Vollmar, G. A. McEnroe, and A. L. Gerbes. 1990. Dehydration increases the density of C receptors for ANF on rat glomerular membranes. Am J Physiol 258 (4 Pt 2):R1084-1088.

69. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227 (5259):680-685.

70. Lainchbury, J. G., A. M. Richards, M. G. Nicholls, E. A. Espiner, and T. G. Yandle. 1999. Brain natriuretic peptide and neutral endopeptidase inhibition in left ventricular impairment. J Clin Endocrinol Metab 84 (2):723-729.

71. Lang, C. C., A. M. Choy, and A. D. Struthers. 1992. Atrial and brain natriuretic peptides: a dual natriuretic peptide system potentially involved in circulatory homeostasis. Clin Sci (Lond) 83 (5):519-527.

72. Lang, C. C., N. Prasad, H. M. McAlpine, C. Macleod, B. J. Lipworth, T. M. MacDonald, and A. D. Struthers. 1994. Increased plasma levels of brain natriuretic peptide in patients with isolated diastolic dysfunction. Am Heart J127 (6):1635-1636.

73. LaPointe, M. C. 2005. Molecular regulation of the brain natriuretic peptide gene. Peptides 26 (6):944-956.

74. Levin, E. R. 1993. Natriuretic peptide C-receptor: more than a clearance receptor. Am J Physiol 264 (4 Pt l):E483-489.

75. Levin, E. R., D. G. Gardner, and W. K. Samson. 1998. Natriuretic peptides. N Engl J Med 339 (5):321-328.

76. Liang, F., and D. G. Gardner. 1999. Mechanical strain activates BNP gene transcription through a p38/NF-kappaB-dependent mechanism. J Clin Invest 104 (11):1603-1612.

77. Liao, X., W. Wang, S. Chen, and Q. Wu. 2007. Role of glycosylation in corin zymogen activation. J Biol Chem 282 (38):27728-27735.

78. Loke, I., I. B: Squire, J. E. Davies, and L. L. Ng. 2003. Reference ranges for natriuretic peptides for diagnostic use are dependent on age, gender and heart rate. Eur J Heart Fail 5 (5):599-606.

79. Luchner, A., T. L. Stevens, D. D. Borgeson, M. Redfield, C. M. Wei, J. G. Porter, and J. C. Burnett, Jr. 1998. Differential atrial and ventricular expression of myocardial BNP during evolution of heart failure. Am J Physiol 21A (5 Pt 2):H1684-1689.

80. Maack, T. 1992. Receptors of atrial natriuretic factor. Annu Rev Physiol 54:11 -27.

81. Magga, J., M. Marttila, P. Mantymaa, O. Vuolteenaho, and H. Ruskoaho. 1994. Brain natriuretic peptide in plasma, atria, and ventricles of vasopressin- and phenylephrine-infused conscious rats. Endocrinology 134 (6):2505-2515.

82. Maki, M., M. Parmentier, and T. Inagami. 1984. Cloning of genomic DNA for human atrial natriuretic factor. Biochem Biophys Res Commun 125 (2):797-802.

83. Mantymaa, P., O. Vuolteenaho, M. Marttila, and H. Ruskoaho. 1993. Atrial stretch induces rapid increase in brain natriuretic peptide but not in atrial natriuretic peptide gene expression in vitro. Endocrinology 133 (3):1470-1473.

84. McDonagh, T. A., A. D. Cunningham, C. E. Morrison, J. J. McMurray, I. Ford, J. J. Morton, and H. J. Dargie. 2001. Left ventricular dysfunction, natriuretic peptides, and mortality in an urban population. Heart 86 (l):21-26.

85. McDowell, G., C. Shaw, K. D. Buchanan, and D. P. Nicholls. 1995. The natriuretic peptide family. Eur J Clin Invest 25 (5):291-298.

86. Michielsen, E. C., J. A. Bakker, R. R. Kimmenade, Y. M. Pinto, and M. P. Dieijen-Visser. 2008. The diagnostic value of serum and urinary NT-proBNP for heart failure. Ann Clin Biochem 45 (Pt 4):389-394.

87. Minamino, N., K. Kangawa, and H. Matsuo. 1988. Isolation and identification of a high molecular weight brain natriuretic peptide in porcine cardiac atrium. Biochem Biophys Res Commun 157 (l):402-409.

88. Motwani, J. G., H. McAlpine, N. Kennedy, and A. D. Struthers. 1993. Plasma brain natriuretic peptide as an indicator for angiotensin-converting-enzyme inhibition after myocardial infarction. Lancet 341 (8853): 1109-1113.

89. Mueller, T., A. Gegenhuber, W. Poelz, and M. Haltmayer. 2005. Diagnostic accuracy of B type natriuretic peptide and amino terminal proBNP in the emergency diagnosis of heart failure. Heart 91 (5):606-612.

90. Murthy, K. S., B. Teng, J. Jin, and G. M. Makhlouf. 1998. G protein-dependent activation of smooth muscle eNOS via natriuretic peptide clearance receptor. Am J Physiol 275 (6 Pt 1):C1409-1416.

91. Nakao, K., Y. Ogawa, S. Suga, and H. Imura. 1992. Molecular biology and biochemistry of the natriuretic peptide system. II: Natriuretic peptide receptors. J Hyper tens 10 (10): 11111114.

92. Nakayama, K. 1997. Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins. BiochemJ2>21 ( Pt 3):625-635.

93. Norman, J. A., D. Little, M. Bolgar, and G. Di Donato. 1991. Degradation of brain natriuretic peptide by neutral endopeptidase: species specific sites of proteolysis determined by mass spectrometry. Biochem Biophys Res Commun 175 (l):22-30.

94. Nussenzveig, D. R., J. A. Lewicki, and T. Maack. 1990. Cellular mechanisms of the clearance function of type C receptors of atrial natriuretic factor. J Biol Chem 265 (34):20952-20958.

95. Ogawa, H., Y. Qiu, C. M. Ogata, and K. S. Misono. 2004. Crystal structure of hormone-bound atrial natriuretic peptide receptor extracellular domain: rotation mechanism for transmembrane signal transduction. J Biol Chem 279 (27):28625-28631.

96. Oikawa, S., M. Imai, A. Ueno, S. Tanaka, T. Noguchi, H. Nakazato, K. Kangawa, A. Fukuda, and H. Matsuo. 1984. Cloning and sequence analysis of cDNA encoding a precursor for human atrial-natriuretic polypeptide. Nature 309 (5970):724-726.

97. Ozaki, J., H. Shimizu, Y. Hashimoto, H. Itoh, K. Nakao, and K. Inui. 1999. Enzymatic inactivation of major circulating forms of atrial and brain natriuretic peptides. Eur J Pharmacol 370 (3):307-312.

98. Pankow, K., Y. Wang, F. Gembardt, E. Krause, X. Sun, G. Krause, H. P. Schultheiss, W. E. Siems, and T. Walther. 2007. Successive action of meprin A and neprilysin catabolizes B-type natriuretic peptide. Circ Res 101 (9):875-882.

99. Patel, K. D., M. U. Nollert, and R. P. McEver. 1995. P-selectin must extend a sufficient length from the plasma membrane to mediate rolling of neutrophils. J Cell Biol 131 (6 Pt 2):1893-1902.

100. Persic, L., A. Roberts, J. Wilton, A. Cattaneo, A. Bradbury, and H. R. Hoogenboom. 1997. An integrated vector system for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage display libraries. Gene 187 (1):9-18.

101. Potter, L. R., S. Abbey-Hosch, and D. M. Dickey. 2006. Natriuretic peptides, their receptors, and cyclic guanosine monophosphate-dependent signaling functions. Endocr Rev 27 (l):47-72.

102. Potter, L. R., and T. Hunter. 1998. Phosphorylation of the kinase homology domain is essential for activation of the A-type natriuretic peptide receptor. Mol Cell Biol 18 (4):2164-2172.

103. Potter, L. R., and T. Hunter. 2001. Guanylyl cyclase-linked natriuretic peptide receptors: structure and regulation. J Biol Chem 276 (9):6057-6060.

104. Protter, A. A., A. M. Wallace, V. A. Ferraris, and R. E. Weishaar. 1996. Relaxant effect of human brain natriuretic peptide on human artery and vein tissue. Am J Hypertens 9 (5):432-436.

105. Richards, A. M., J. G. Lainchbury, M. G. Nicholls, A. V. Cameron, and T. G. Yandle. 2002. Dendroaspis natriuretic peptide: endogenous or dubious? Lancet 359 (9300):5-6.

106. Rutledge, E. A., B. J. Root, J. J. Lucas, and C. A. Enns. 1994. Elimination of the O-linked glycosylation site at Thr 104 results in the generation of a soluble human-transferrin receptor. Blood*3 (2):580-586.

107. Sackner-Bernstein, J. D., M. Kowalski, M. Fox, and K. Aaronson. 2005a. Short-term risk of death after treatment with nesiritide for decompensated heart failure: a pooled analysis of randomized controlled trials. JAMA 293 (15): 1900-1905.

108. Sackner-Bernstein, J. D., H. A. Skopicki, and K. D. Aaronson. 2005b. Risk of worsening renal function with nesiritide in patients with acutely decompensated heart failure. Circulation 111 (12):1487-1491.

109. Schagger, H., and G. von Jagow. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem 166 (2):368-379.

110. Schellenberger, U., J. O'Rear, A. Guzzetta, R. A. Jue, A. A. Protter, and N. S. Pollitt. 2006. The precursor to B-type natriuretic peptide is an O-linked glycoprotein. Arch Biochem Biophys 45\ (2): 160-166.

111. Schweitz, H., P. Vigne, D. Moinier, C. Frelin, and M. Lazdunski. 1992. A new member of the natriuretic peptide family is present in the venom of the green mamba (Dendroaspis angusticeps). J Biol Chem 267 (20):13928-13932.

112. Seger, M. A., and H. P. Bennett. 1986. Structure and bioactivity of the amino-terminal fragment of pro-opiomelanocortin. J Steroid Biochem 25 (5B):703-710.

113. Seidah, N. G., and M. Chretien. 1999. Proprotein and prohormone convertases: a family of subtilases generating diverse bioactive polypeptides. Brain Res 848 (l-2):45-62.

114. Seidler, T., C. Pemberton, T. Yandle, E. Espiner, G. Nicholls, and M. Richards. 1999. The amino terminal regions of proBNP and proANP oligomerise through leucine zipper-like coiled-coil motifs. Biochem Biophys Res Commun 255 (2):495-501.

115. Seidman, C. E., K. D. Bloch, K. A. Klein, J. A. Smith, and J. G. Seidman. 1984. Nucleotide sequences of the human and mouse atrial natriuretic factor genes. Science 226 (4679): 1206-1209.

116. Seilhamer, J. J., A. Arfsten, J. A. Miller, P. Lundquist, R. M. Scarborough, J. A. Lewicki, and J. G. Porter. 1989. Human and canine gene homologs of porcine brain natriuretic peptide. Biochem Biophys Res Commun 165 (2):650-658.

117. Shaw, G., and R. Kamen. 1986. A conserved AU sequence from the 31 untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation. Cell 46 (5):659-667.

118. Shimizu, H., K. Masuta, K. Aono, H. Asada, K. Sasakura, M. Tamaki, K. Sugita, and K. Yamada. 2002. Molecular forms of human brain natriuretic peptide in plasma. Clin Chim Acta 316 (1-2):129-135.

119. Smith, K. A. 1988. Interleukin-2: inception, impact, and implications. Science 240 (4856): 1169-1176.

120. Steinhelper, M. E. 1993. Structure, expression, and genomic mapping of the mouse natriuretic peptide type-B gene. Circ Res 72 (5):984-992.

121. Stults, J. T., K. L. O'Connell, C. Garcia, S. Wong, A. M. Engel, D. L. Garbers, and D. G. Lowe. 1994. The disulfide linkages and glycosylation sites of the human natriuretic peptide receptor-C homodimer. Biochemistry 33 (37): 11372-11381.

122. Sudoh, T., K. Kangawa, N. Minamino, and H. Matsuo. 1988. A new natriuretic peptide in porcine brain. Nature 332 (6159):78-81.

123. Sudoh, T., K. Maekawa, M. Kojima, N. Minamino, K. Kangawa, and H. Matsuo. 1989. Cloning and sequence analysis of cDNA encoding a precursor for human brain natriuretic peptide. Biochem Biophys Res Commun 159 (3):1427-1434.

124. Sudoh, T., N. Minamino, K. Kangawa, and H. Matsuo. 1990. C-type natriuretic peptide (CNP): a new member of natriuretic peptide family identified in porcine brain. Biochem Biophys Res Commun 168 (2):863-870.

125. Sward, K., F. Valsson, P. Odencrants, O. Samuelsson, and S. E. Ricksten. 2004. Recombinant human atrial natriuretic peptide in ischemic acute renal failure: a randomized placebo-controlled trial. Crit Care Med 32 (6): 1310-1315.

126. Tateyama, H., J. Hino, N. Minamino, K. Kangawa, T. Minamino, K. Sakai, T. Ogihara, and H. Matsuo. 1992. Concentrations and molecular forms of human brain natriuretic peptide in plasma. Biochem Biophys Res Commun 185 (2):760-767.

127. Tateyama, H., J. Hino, N. Minamino, K. Kangawa, T. Ogihara, and H. Matsuo. 1990. Characterization of immunoreactive brain natriuretic peptide in human cardiac atrium. Biochem Biophys Res Commun 166 (3): 1080-1087.

128. Ten Hagen, K. G., T. A. Fritz, and L. A. Tabak. 2003. All in the family: the UDP-GalNAc:polypeptideN-acetylgalactosaminyltransferases. Glycobiology 13 (1):1R-16R.

129. Thanka Christlet, T. H., and K. Veluraja. 2001. Database analysis of O-glycosylation sites in proteins. Biophys J 80 (2):952-960.

130. Thibault, G., R. Garcia, J. Gutkowska, J. Bilodeau, C. Lazure, N. G. Seidah, M. Chretien, J. Genest, and M. Cantin. 1987. The propeptide Asnl-Tyrl26 is the storage form of rat atrial natriuretic factor. Biochem J241 (l):265-272.

131. Togashi, K., S. Fujita, and M. Kawakami. 1992. Presence of brain natriuretic peptide in urine. Clin Chem 38 (2):322-323.

132. Togashi, K., T. Kameya, K. Ando, F. Marumo, and M. Kawakami. 1991. Brain natriuretic peptides in human plasma, spinal cord and cerebrospinal fluid. Clin Chim Acta 201 (3): 193-200.

133. Towbin, H., T. Staehelin, and J. Gordon. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76 (9):4350-4354.

134. Watanabe, Y., K. Nakajima, Y. Shimamori, and Y. Fujimoto. 1997. Comparison of the hydrolysis of the three types of natriuretic peptides by human kidney neutral endopeptidase 24.11. Biochem Mol Med 61 (l):47-51.

135. Wilson, E. M., and M. Chinkers. 1995. Identification of sequences mediating guanylyl cyclase dimerization. Biochemistry 34 (14):4696-4701.

136. Wilson, I. B., Y. Gavel, and G. von Heijne. 1991. Amino acid distributions around O-linked glycosylation sites. Biochem J 215 ( Pt 2):529-534.

137. Wu, C., F. Wu, J. Pan, J. Morser, and Q. Wu. 2003. Furin-mediated processing of Pro-C-type natriuretic peptide. J Biol Chem 278 (28):25847-25852.

138. Wu, F., W. Yan, J. Pan, J. Morser, and Q. Wu. 2002. Processing of pro-atrial natriuretic peptide by corin in cardiac myocytes. J Biol Chem 277 (19): 16900-16905.

139. Yan, W., N. Sheng, M. Seto, J. Morser, and Q. Wu. 1999. Corin, a mosaic transmembrane serine protease encoded by a novel cDNA from human heart. J Biol Chem 274 (21):14926-14935.

140. Yan, W., F. Wu, J. Morser, and Q. Wu. 2000. Corin, a transmembrane cardiac serine protease, acts as a pro-atrial natriuretic peptide-converting enzyme. Proc Natl Acad Sci U S A 97 (15):8525-8529.

141. Yandle, T. G. 1994. Biochemistry of natriuretic peptides. J Intern Med 235 (6):561-576.

142. Yeaman, C., A. H. Le Gall, A. N. Baldwin, L. Monlauzeur, A. Le Bivic, and E. Rodriguez-Boulan. 1997. The O-glycosylated stalk domain is required for apical sorting of neurotrophin receptors in polarized MDCK cells. J Cell Biol 139 (4):929-940.

Информация о работе

Семенов, Александр Геннадьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Влияние гликозилирования на процессинг предшественника натрийуретического пептида B-типа человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы