Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование иммунохимических и биохимических свойств N-концевого фрагмента предшественника натрийуретического пептида В-типа человека
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Исследование иммунохимических и биохимических свойств N-концевого фрагмента предшественника натрийуретического пептида В-типа человека"
На правах рукописи
□034Э453Э
СЕФЕРЯН КАРИНА РУБЕНОВНА
ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ^КОНЦЕВОГО ФРАГМЕНТА ПРЕДШЕСТВЕННИКА НАТРИЙУРЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА В-ТИПА ЧЕЛОВЕКА
03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА 2010
2 I [¿АО
003494539
Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.
Научный руководитель:
доктор биологических наук Катруха Алексей Генрихович
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАМН Северин Сергей Евгеньевич
доктор биологических наук, профессор Белушкина Наталья Николаевна
Ведущая организация:
Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Защита состоится 5 апреля 2010 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, д. 1, стр. 12, Биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук
Медведева М.В.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Натрийуретический пептид В-типа (Brain Natriuretic Peptide, BNP) является пептидным гормоном, функциональным антагонистом ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и симпатической нервной системы. BNP участвует в регуляции кровяного давления, объема жидкости в организме и её электролитного состава, вызывая вазодилатацию сосудов, ускоряя выведение натрия и усиливая диурез. BNP синтезируется кардиомиоцитами в виде прогормона proBNP (108 аминокислотных остатков, а.к.о,), который расщепляется специфической конвертазой с образованием физиологически активного BNP (32 а.к.о.) и N-концевого фрагмента прогормона (NT-proBNP, 76 а.к.о.), которые затем выделяются в кровоток.
Уровень экспрессии гена BNP и секреция BNP и NT-proBNP значительно увеличиваются в случае развития сердечной недостаточности (СН) - тяжелого заболевания, при котором сердце не способно обеспечить организм кровью в необходимых количествах. Клинические проявления СН неспецифичны, что затрудняет диагностику. Показано, что при СН концентрация BNP и NT-proBNP в крови увеличивается прямо пропорционально степени дисфункции левого желудочка сердца. В настоящее время измерение концентрации BNP и NT-proBNP иммунохимическими методами широко используется в клинической практике при обследовании больных с подозрением на CH. Использование BNP и NT-proBNP как биохимических маркеров СН позволяет значительно повысить точность диагностики заболевания. Помимо этого, измерение концентрации обоих пептидов в крови обладает высоким прогностическим значением у больных с СН, а также у больных, перенесших острый инфаркт миокарда. Несмотря на широкое применение в клинике, до последнего времени практически ничего не было известно о биохимических особенностях BNP и NT-proBNP, обнаруживаемых в крови человека. Однако, данные о том, в какой форме маркер существует в крови, необходимы для правильного выбора антител, используемых в иммунохимических диагностических системах. Известно, что на взаимодействие антител с белком-мишенью может оказывать влияние целый ряд факторов (протеолитическая деградация, комплексообразование, пострансляционные модификации и др.), что может приводить к недостоверным результатам при измерении концентрации маркера в крови пациента.
Основной целью данной диссертационной работы было изучение биохимических особенностей NT-proBNP, выделенного из крови больных с CH. Исследование NT-proBNP чрезвычайно осложнено низкой концентрацией белка в крови, варьирующей от 20-300 пг/мл у здоровых людей до 1-100 нг/мл у больных с CH. Поэтому в качестве высокочувствительного и высокоспецифичного инструмента в наших исследованиях мы использовали моноклональные антитела (МАт), специфичные к различным эпитопам
молекулы NT-proBNP, полученные в ходе выполнения данной работы. В работе решались следующие задачи:
1. Получение набора моноклональных антител, специфичных к различным участкам молекулы NT-proBNP человека.
2. Получение молекулярно-генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного NT-proBNP человека в клетках Е. coli. Разработка метода получения и очистки рекомбинантного NT-proBNP, экспрессированного в клетках Е. coli.
3. Разработка метода получения очищенного препарата эндогенного NT-proBNP. Характеризация иммунохимических и биохимических свойств препарата эндогенного NT-proBNP.
4. Изучение факторов, оказывающих влияние на взаимодействие моноклональных антител с NT-proBNP, присутствующим в крови больных с СН.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые показано, что NT-proBNP человека является О-гликопротеином. Установлено, что остатки углеводов, входящие в состав молекулы эндогенного NT-proBNP, препятствуют взаимодействию антител с N-концевым участком (5-12 а.к.о.) и центральной частью белка (участок 28-60). Показано, что участки 13-24 и 63-76 молекулы NT-proBNP либо совсем не гликозилируются в организме человека, либо подвергаются гликозилированию лишь у незначительной части молекул NT-proBNP. В ходе работы были идентифицированы два сайта гликозилирования эндогенного NT-proBNP - остатки Ser5 и Thr58. Установлено, что уровень гликозилирования различных участков NT-proBNP сильно отличается среди больных с СН. Показано, что в крови NT-proBNP присутствует в виде набора отличающихся по массе гликоформ. Эксперименты по изучению стабильности эндогенного NT-proBNP показали, что эндогенный NT-proBNP устойчив к протеолитической деградации в сыворотке крови за исключением N-концевого участка молекулы. В крови больных с СН происходит отщепление двух аминокислотных остатков с N-конца молекулы NT-proBNP, что препятствует взаимодействию антител, специфичных к этому участку, с антигеном. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что гликозилирование и протеолитическая деградация негативно влияют на достоверность измерения концентрации NT-proBNP иммунохимическими методами, в которых используются антитела, специфичные к участкам 1-12 и 28-60. Такие системы серьезно недооценивают концентрацию NT-proBNP в пробе. Полученные данные могут найти практическое применение при разработке новых методов для количественного определения NT-proBNP. Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на 34-м конгрессе Союза Европейских Биохимических
Сообществ в 2009 году (Прага, Чехия), съездах Американской Ассоциации Клинической Химии в 2009 (Чикаго, США), в 2008 (Вашингтон, США), в 2007 (Сан-Диего, США) и в 2005 (Орландо, США) годах; на XXXI Конгрессе Клинической Химии в 2008 году (Хельсинки, Финляндия); на четвертой Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения в 2008 году (Москва, Россия); на Международной конференции «Биотехнология и медицина» в 2006 году (Москва, Россия), а также на Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2004 и 2006 годах (Москва, Россия).
Публикации. По теме диссертации было опубликовано 20 печатных работ, включая 4 статьи в профильном журнале.
Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и их обсуждение, список цитированной литературы. Работа изложена на 140 страницах печатного текста, иллюстрирована 43 рисунками и 8 таблицами. Список цитированной литературы содержит 159 наименований.
Содержание работы
Материалы и методы исследования
Синтетические пептиды, соответствующие различным участкам последовательности NT-proBNP человека, были предоставлены профессором A.B. Ажаевым (Куопио, Финляндия). Рекомбинантный oroBNP (rproBNP), экспрессированный в Е. coli, был получен ранее в нашей лаборатории (чистота >98%).
Конъюгирование пептидов с бычьим сывороточным альбумином проводили с использованием сукцинимидил-4-(М-малеимидометил)-циклогексан-1 -карбоксилата (SMCC, Pierce). При конъюгировании использовали эквивалентное по массе количество пептида и альбумина (молярное соотношение 30:1).
Сэндвич-иммунофосфоресцентный анализ (сэндвич-ИФА). В лунки 96-ти луночного планшета сорбировали антитела (1 мкг). Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании. После отмывки в лунки вносили образец и раствор антител (0.2 мкг), конъюгированных с фосфоресцентной меткой (хелатом европия). Планшеты инкубировали при тех же условиях. После отмывки в лунки вносили раствор усиления, инкубировали в течение 3 мин и измеряли фосфоресценцию на приборе Victor 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer).
Электрофорез в трис-тртиновой буферной системе проводили согласно методике, описанной Шагер и фон Ягов (Schagger & von Jagow 1987). Образцы исследуемых белковых
растворов смешивали в соотношении 3:1 с буферным раствором, содержащим 0.25 M Трис-НС1, рН 6.8, 10% додецилсульфата натрия (ДСН), 40% глицерина, 1.4 M Р-меркаптоэтанола, 0.1% бромфенолового синиего, и нагревали при 100°С в течение 5 мин. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроигллюлозной мембране. После блокировки мест неспецифического связывания мембрану инкубировали в течение часа в растворе специфичных антител (10 мкг/мл). Затем мембрану отмывали и инкубировали с вторичными антителами, специфичными к Fc-фрагментам IgG мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена. После отмывки мембрану инкубировали в растворе хромогенного субстрата, содержащего диаминобензидин и перекись водорода. Выделение NT-proBNP из плазмы крови с использованием метода аффинной хроматографии. Активацию сефарозы CL 4В (GE Healthcare) бромцианом проводили по методике, описанной Остерманом (Остерман 1985). Для выделения NT-proBNP из плазмы больных с СН использовали сефарозу с иммобилизованными антителами, специфичными к различным участкам молекулы NT-proBNP. Плазму центрифугировали, фильтровали и наносили на аффинный носитель, содержащий -100-кратный молярный избыток антител по отношению к общему количеству NT-proBNP в образце. Связавшиеся белки элюировали раствором 0.01 M НС1.
Пегликозияирование эндогенного NT-proBNP. Образец NT-proBNP делили на две части и инкубировали либо с набором гликозидаз (3.75 мЕд/мл эндо-а-Ы-ацетилгалактозаминидазы, 0.0335 Ед/мл сиаладазы Au а-(2-3,6,8,9), 0.112 Ед/мл (5(1-4) галактозидазы и 6.6 мЕд/мл (i-N-ацетилглюкозаминидазы, QA-Bio), либо без них при рН 5.4 в течение 1.5 часов при 37°С. Гель-фильтраиия. На колонку Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенную 0.1 M Na-фосфатным буфером, рН 7.4, содержащим 0.3 M NaCl и 0.005 M ЭДТА, наносили 150 мкл образца. Элюцию проводили тем же буфером при скорости протока 0.8 мл/мин. Колонку предварительно калибровали с использованием набора стандартных белков. Обратно-фазовая хроматография. Образец эндогенного NT-proBNP, выделенный из плазмы больных с СН методом аффинной хроматографии, наносили на колонку Vydac 214ТР10415 (4.6*150 мм, Vydac), содержащую силикагель, модифицированный бутильными группами (С4). Колонка была уравновешена водным раствором ацетонитрила (5%) и трифторуксусной кислоты (0.1 %). Элюцию проводили линейным градиентом (от 5 до 60%) ацетонитрила в течение 30 мин при скорости 1 мл/мин.
Трипсинолиз эндогенного NT-proBNP. После проведения обратно-фазовой хроматографии эндогенный NT-proBNP (2 мкг) растворяли в 40 мкл 0.025 M бикарбоната аммония и добавляли 10 мкл раствора трипсина (Promega) до конечной концентрации 4 нг/мкл. После инкубации в течение ночи при температуре 37°С пробу высушивали, используя роторный испаритель (Savant SpeedVac).
Дегликозширование протеолитических фрагментов с использованием 25% раствора гидроксида аммония проводили в течение ночи при температуре 37°С, после чего образец высушивали, используя роторный испаритель.
Для проведения масс-спектрометуических исследований использовали масс-спектрометр Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems).
Результаты и их обсуждение
Получение и очистка рекомбинантного NT-proBNP.
Для экспрессии рекомбинантного NT-proBNP (rNT-proBNP) в клетках Е. coli была выбрана векторная система рЕТ (Novagen). Экспрессию осуществляли в клетках Е. coli штамма BL21(DE3). Очистку rNT-proBNP из лизата клеток Е. coli, трансформированных плазмидой, содержащей ген NT-proBNP, проводили в две стадии. На первой стадии очистки был применен метод иммуноаффинной хроматографии. Для этого использовали сефарозу CL 4В с иммобилизованными антителами 12В83М9, специфичными к участку 31-39 молекулы NT-proBNP. После первой стадии чистота препарата rNT-proBNP была недостаточной, поэтому проводили его доочистку с использованием метода ионообменной хроматографии на колонке, содержащей карбоксиметил-сефарозу, уравновешенную 0.05 М Иа-ацетатным буфером, pH 4.2. Элюцию осуществляли линейным градиентом концентрации NaCl до 0.6 М. Разработанный нами метод выделения rNT-proBNP из лизата клеток Е. coli позволяет получать белок с чистотой >98% (Рис. 1). Препарат с такой высокой чистотой был
Рис. 1. Анализ препарата очищенного rNT-proBNP (10 мкг). Гель после ^ проведения эдектрофоретическогоразделения окрашивали Кумасси G-250.
необходим для использования в качестве калибратора при иммунохимическом измерении концентрации КГ-ргоВ№ в образцах крови больных с СН. Соответствие массы полученного белка теоретической массе ЫТ-ргоВОТ было показано с использованием метода МА1ЛЛ масс-спектрометрии. Из бактериальной биомассы, выращенной в 3 литрах среды, по разработанной методике выделяли более 10 мг гШ"-ргоВ№.
Получение МАт, специфичных к NT-proBNP человека.
Для иммунизации мышей линии Ва1Ь/С был использован набор синтетических пептидов, перекрывающих всю последовательность ЭТ-ргоВОТ человека (1-12, 1-24, 5-20,
7
13-27, 28-45, 46-60, 61-76 а.к.о.). Чтобы усилить иммунный ответ, пептиды конъюгировали с бычьим сывороточным альбумином. Мышей иммунизировали полученными конъюгатами в течение 5 месяцев. После окончания иммунизации мыши с высоким титром специфичных антител были отобраны для проведения гибридизации.
Отбор гибридом проводили методом иммуноферментного анализа, используя в качестве антигена rNT-proBNP. Клетки отобранных гибридом дважды реклонировали для получения стабильных клеточных линий, продуцирующих МАт. Наработку необходимого количества МАт осуществляли в асцитной опухоли сингенных мышей. Очистку МАт проводили с использованием Protein А-сефарозы. Было получено 73 стабильных клеточных линии, продуцирующих МАт, специфичные к различным участкам молекулы NT-proBNP человека. Из них 13 линий были получены в результате гибридизации клеток миеломы со спленоцитами мышей, иммунизированных пептидом 1-24, 20 линий - пептидом 13-27, 16 линий - пептидом 28-45, 10 линий - пептидом 46-60 и 14 линий - пептидом 61-76.
Определение эпитопной специфичности МАт.
Для более детального зпитопного картирования полученных антител был получен дополнительный набор синтетических пептидов, имеющих перекрывающиеся области. Для каждого из трех пептидов 28-45, 46-60 и 61-76, использовавшихся для иммунизации, были синтезированы по три пептида меньшей длины (Рис. 2А). Для детализации эпитопов антител, специфичных к участкам 1-24 и 13-27, использовали пептиды 1-12 и 5-20. Исследование эпитопной специфичности антител проводили методом иммуноферментного анализа, используя в качестве антигенов конъюгаты пептидов с альбумином. В тех случаях, когда антитела взаимодействовали с несколькими пептидами, считали, что эпитоп тестируемых антител находится в общей для этих пептидов области. Такой подход позволил детализировать эпитопы значительной части полученных антител. Результаты эпитопного картирования антител представлены на Рис. 2Б. Среди антител, полученных в результате иммунизации пептидами 1-24 и 13-27, были выделены антитела, специфичные к N-концевому фрагменту молекулы NT-proBNP (1-12 а.к.о.), к участкам 5-12, 5-20, 13-20 и 1324 а.к.о. Среди антител, специфичных к пептиду 28-45, нам не удалось более точно определить эпитоп для 5 антител, так как эти антитела не взаимодействовали с более короткими пептидами. Остальные антитела, кроме антител I6E634.39 (специфичных к участку 34-39), были специфичны к участку 31-39. Среди антител, полученных после иммунизации пептидом 46-60, мы выделили антитела, специфичные к участкам 48-56, 46-56 и 52-58. Большинство антител, полученных в результате иммунизации мышей пептидом 61-76, были специфичны к С-концу молекулы (участки 67-76 и 67-73), и только у антител 15С46з-71 эпитоп был расположен на некотором расстоянии от конца молекулы (63-71 а.к.о.).
Результаты эпитопного картирования показали, что нам удалось получить набор моноклональных антител, эпитопы которых покрывали практически всю последовательность молекулы ЫТ-ргоВЫР.
2С12, 8Е7, 10В11
5В6, 11Е11, 10G12
ЗН8, 4А6, 8Н2, 29D12
12Н5, 12Н11, 13Н9, 13G12, 16F3, 18А10, 18HS, 20А10, 20Н6, 21G7
7G11, 8G11, 10G9, 1В1, 1D4, 1Е4, 2С6 6Е8, 6D8, 7В5, 5F11, 21ЕЗ
, 5£2, 9F8, 9В11, 10D8, 10Н4, 11D1, 12В8,13С5, 15G1, 17В7
1 5 12 20 24 28 31
HPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVAT
[15С4
3G9, 6F12, 13С1, 14А6, 21Е6
EGIRGHRKMVLYTLRAPR
Рис. 2. А - схематическое изображение пептидов, использованных для определения эпитопной специфичности антител. Б - детальная эпитопная карта полученных антител.
Изучение взаимодействия МАт с NT-proBNP, содержащимся в крови больных с СН.
На первом этапе работы был проведен сравнительный анализ взаимодействия полученных моноклональных антител с rNT-proBNP и эндогенным белком, содержащимся в плазме крови больных с СН, с использованием метода сэндвич-ИФА (Рис. 3). Сэндфич-ИФА как высокочувствительный и высокоспецифичный метод позволяет детектировать антигены, представленные в образце в очень низких концентрациях (около 0.1*10"15 моль/мл) в присутствии многократного избытка балластных белков.
В качестве источника эндогенного NT-proBNP на данном этапе работы использовали объединенную плазму крови больных с СН. Обе формы белка (рекомбинантный и эндогенный NT-proBNP) были протестированы более чем в 5000 парных комбинаций антител, в которых каждое из 73 МАт было использовано и в качестве антитела подложки, и в качестве детекторного антитела.
Антиген
Y
/////
Антитела подложки
Детекторные антитела
Рис. 3. Принцип метода сэндвич-иммуноанализа.
Антитела, специфичные к исследуемому антигену, иммобилизуются на поверхности планшета (антитела подложки). Затем к ним добавляется антиген, образующий первичный иммунный комплекс с иммобилизованными антителами. После этого добавляются антитела, специфичные к другому зпитопу исаедуемого антигена (детекторные антитела). Детекторные антитела конъюгированы с какой-либо меткой (е нашем случае фосфоресцирующим хелатом европия) и служат для выявления первичного иммунного комплекса. Регистрируемый сигнал прямо пропорционален концентрации антигена.
Было показано, что пары антител с одинаковыми или близко расположенными эпитопами не способны взаимодействовать с исследуемыми белками. Очевидно, это связано с конкуренцией антител за одинаковые или перекрывающиеся эпитопы, либо со стерическими препятствиями, которые возникают при взаимодействии двух антител с близко расположенными эпитопами. Все пары антител с удаленными друг от друга эпитопами (МАт, полученные в результате иммунизации разными пептидами) взаимодействовали с высокой эффективностью с rNT-proBNP. Однако только немногие комбинации антител были способны взаимодействовать с NT-proBNP, содержащимся в плазме. Пары, в которых одно из антител было специфично к участку 13-27, а другое - к участку 61-76, демонстрировали самый высокий сигнал с образцом плазмы. Сигнал с эндогенным белком был значительно ниже в том случае, когда одно из антител было специфично к участку 28-45, и практически отсутствовал в случае, когда хотя бы одно из антител было специфично к N-концевой части молекулы (участок 1-12) или участку 46-60. Среди антител, специфичных к участкам 5-12 и 5-20, одна часть антител была способна эффективно взаимодействовать с эндогенным NT-proBNP, тогда как другая - нет.
На основании полученных данных было сделано предположение, что часть эпитопов на поверхности эндогенного NT-proBNP либо модифицирована, либо экранирована другими макромолекулами, образующими комплекс с NT-proBNP. Среди нескольких десятков пар антител, способных "узнавать" эндогенный NT-proBNP, самое высокое соотношение между сигналами, полученными при измерении иммунореактивности эндогенного NT-proBNP и rNT-proBNP, мы наблюдали при использовании пары 15С46[-73 (антитела подложки) -13G12|3_2o (детекторные антитела). Мы предположили, что эпитопы обоих антител у эндогенного NT-proBNP не модифицированы или модифицированы в наименьшей степени по сравнению с rNT-proBNP. Система, разработанная на основе этих антител, была использована в дальнейших исследованиях для измерения концентрации и эндогенного и рекомбинантного NT-proBNP. Чувствительность созданной системы составила 10 пг/мл.
Для того чтобы выявить различия в доступности эпитопов на поверхности рекомбинантного и эндогенного NT-proBNP (т. е. различия в иммунореактивности),
Рис. 4. Сравнение
иммунореактивности эндогенного !ЧТ-ргоВ^ и г!УТ-ргоВ№Р с использованием метода сэндвич-ИФА. Результаты представлены как соотношение иммунореактивности МТ-ргоВЫР в образце плазмы с концентрацией 35 нг/мл и
иммунореактивности в образце, содержащем гЫТ-ргоВЫР в такой же концентрации. Концентрация ЫТ-ргоВЫР в плазме была определена с использованием системы 15С46з-7г 13С12ц.;о.
проводили сравнительное тестирование обоих белков в двадцати различных сэндвич-ИФА системах. В качестве антител подложки в таких системах были использованы 20 МАт, эпитопы которых перекрывали практически всю последовательность молекулы 1ЧТ-ргоВЫР. В качестве детекторных антител использовали либо МАт 24Е11б7-7б (в парах с антителами подложки, специфичными к 1Ч-концевой части молекулы), либо МАт ]З012|3.2а (в парах с антителами, специфичными к участку 28-76). Как было показано ранее, антитела 130121з.2о и 24Е1 167.76 способны взаимодействовать с эндогенным МТ-ргоВОТ с высокой I эффективностью. Необходимость использовать два различных детекторных антитела вызвана тем, что антитела с близко расположенными эпитопами не способны образовывать тройной иммунный комплекс с антигеном. Как видно на Рис. 4, наибольшей иммунореактивностью у эндогенного МТ-рго£МР обладают С-концевой участок (63-76 а.к.о.) и участок 13-24. Иммунореактивность участков 1-12 и 28-45 значительно ниже. Из двух антител, специфичных к участку 5-12, МАт 290125.|2 способно эффективно взаимодействовать с МТ-ргоВ№, содержащимся в плазме, а МАт ЗН85.12- нет.
Проведенные исследования подтвердили нашу гипотезу том, что часть эпитопов на поверхности молекулы эндогенного МТ-ргоВКР модифицирована. Ы-концевой участок (1-12 а.к.о.) молекулы эндогенного ИТ-ргоВКР и ее центральная часть (28-60 а.к.о.) недоступны для антител. Участок 5-12 также, по-видимому, модифицирован, поскольку часть антител не способна взаимодействовать с ним.
Протеолитическая деградация ]\Т-ргоВ№ и ее влияние на связывание с МАт.
Частичный протеолиз под воздействием эндогенных протеаз - одна из наиболее I распространенных модификаций белковых молекул. Мы предположили, что эндогенный ЫТ-ргоВЫР может подвергаться протеолитической деградации в крови. Для проверки этого предположения исследовали стабильность эндогенного ЫТ-ргоВКР в сыворотке крови больных с СН. Образцы сыворотки (содержащие 0.1% азида натрия для предотвращения
3 £
I. к!
,.,1,1,1,-
Иммобилизованные антитела
_А_
Детекторные антитела
13в12 (13-20)
бактериального роста) инкубировали в течение заданных промежутков времени при комнатной температуре. Для определения подверженности к воздействию протеаз различных частей молекулы МТ-ргоВЫР иммунореактивность в образцах измеряли в нескольких сэндвич-ИФА системах с антителами, специфичными к различным участкам молекулы МТ-ргоВКР. При протеолизе происходит удаление или разрушение эпитопов части антител, что приводит к падению иммунореактивности модифицированного белка при определении в системах, использующих такие антитела.
Самое существенное снижение иммунореактивности наблюдали в системах, в которых были использованы антитела 5В6ы2, специфичные к 1Ы-концу молекулы: иммунохимическая активность после 72 часов инкубации уменьшилась до 8% (5В6ы2-130121з_2о) и 16% (5В6ы2-24Е1167-7б) от первоначального уровня (Рис. 5). В то же время стабильность антигена при определении в системах с антителами 29Ш25.[2 (эпитоп удален от К-конца молекулы на 5 а.к.о.), была существенно выше - 90% иммунореактивного ЫТ-ргоВЫР оставалось в пробе после 72 часов инкубации. Меньше всего за время инкубации изменилась иммунореактивность 1ЧТ-ргоВ№ при измерении в системах с антителами, специфичными к центральной части и С-концу молекулы. Мы заключили, что отщепление одного или нескольких аминокислотных остатков с Ы-конца молекулы является причиной низкой иммунореактивности эндогенного 1ЧТ-ргоВКР, определяемой с использованием антител, специфичных к участку 1-12.
.1111
Антитела подложки 5В6 (1-12) 5В6 (1-12) 15С4 (63-71) 1504(63-71) 7В5 (13-20) 15Р11(13-24)
Детекторные антитела 13С12 (13-20) 24Е11(67-76) 29012 (5-12) 18К5(13-20) 16Е6(34-39) 24Е11 (67-76)
Рис. 5. Изменение иммунореактивности эндогенного !ЧТ-ргоЕ^Р в образце сыворотки больных с СН после 72 часов инкубации при комнатной температуре. Результаты представлены в % от иммунореактивности, детектируемой в образце до инкубации.
Проверка гипотезы о существовании !ЧТ-ргоВ№ в крови в виде комплекса с другими макромолекулами.
В случае, если 1МТ-ргоВЫР присутствует в крови в виде комплекса с другими макромолекулами, можно было ожидать, что молекулярные массы эндогенного и гЫТ-ргоВЫР отличаются. Для проверки этой гипотезы подвижность рекомбинантного и эндогенного МТ-ргоВОТ сравнивали при разделении методом гель-фильтрации в
5? 90%
£ 80%
о, О 70%
5 5
х | 60%
» ^ 50%
« & 40% 5 О
I 30%
| 20% з;
10%
неденатурирующих условиях. Образцы плазмы больных с СН (п=7) наносили на гель-фильтрационную колонку Superdex 75 10/300 GL. Время выхода NT-proBNP из колонки определяли путем измерения его иммунореактивности во фракциях с использованием системы 15C46i-73-13G12i3.2o. На колонку также наносили образцы, содержащие rNT-proBNP и rproBNP, разведенные в плазме здоровых доноров.
Как видно из Рис. 6, в образцах плазмы был выявлен один пик иммунореактивности NT-proBNP с максимумом в области -25 кДа, который не совпадал с положением максимумов иммунореактивности rNT-proBNP (-15.3 кДа) и rproBNP (~ 20.6 кДа). Таким образом, было показано, что NT-proBNP в образцах плазмы больных с СН представлен формой с более высокой молекулярной массой, чем rNT-proBNP и rproBNP, экспрессированные в Е. coli.
Рис. 6. Иммунореактивность NT-proBNP во фракциях после разделения белков плазмы — 1 больных с СН методом гель-фильтрации, измеренная с 1 использованием системы l М 4, 5 73-13G12i3_20. Разделение проводилось * па колонке Superdex 75 10/300 GL. 7 Стрелками показано положение стандартов молекулярных масс (кДа) и максимумов иммунореактивности , , . - _, rNT-proBNP и rproBNP.
5 В 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Номер фракции
Полученные данные можно рассматривать как свидетельство в пользу гипотезы о существовании комплекса эндогенного NT-proBNP с другими макромолекулами. Для подтверждения этой гипотезы NT-proBNP экстрагировали из объединенной плазмы больных с СН методом аффинной хроматографии. Выделенный из плазмы NT-proBNP растворяли в буфере, содержащем ДСН и ß-меркаптоэтанол, и нагревали при 100°С в течение 5 мин. Мы полагали, что если компоненты комплекса связаны нековалентной либо дисульфидной связью, то обработка в таких условиях должна приводить к разрушению комплекса. В таком случае подвижность эндогенного и рекомбинантного NT-proBNP при проведении ДСН-электрофореза должна быть одинаковой.
На дорожки геля наносили по 50 нг эндогенного NT-proBNP, rNT-proBNP и rproBNP. После проведения электрофоретического разделения белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом Вестерн блоттинга, затем идентифицировали с использованием МАт 15F1113-24, способных взаимодействовать с высоким аффинитетом с эндогенным NT-proBNP, и МАт 11D131-39. специфичных к центральной части молекулы NT-proBNP, недоступной для антител в случае эндогенного белка. Как видно из Рис. 7А,
1 2 3
1 2 3
Рис. 7. Иммунохимическое окрашивание эндогенного 1ЧТ-рго1^Р с использованием МАт 15111(Л) и 1 Ш13)_39 (Б) на нитроцеллюлозной мембране. На дорожки нанесено: 1 - гШ'-рюВЫР; 2 - гргоВЫР: 3 -эндогенный ЫТ-ргоВЫР, выделенный из объединенной плазмы больных с СН.
окрашивание образца эндогенного №Г-ргоВЫР антителами 15Р1113-24 выявило диффузную полосу в области между стандартами 14.4 и 26.6 кДа, расположенную значительно выше полосы гШ"-ргоВКР. В случае антител 1Ш1л.зд окрашивание дорожки, содержащей эндогенный N1 ргоВ№, как на уровне гЫТ-ргоВКР, так и в области 14.4-26.6 кДа практически отсутствовало (Рис. 7Б). Полученные результаты свидетельствуют о том, что 1МТ-ргоВКР в крови гетерогенен и представлен формой с молекулярной массой большей, чем масса г1ЧТ-ргоВКР. В денатурирующих и восстанавливающих условиях не происходит разделение компонентов предполагаемого комплекса - молекулярная масса эндогенного ТЧТ-ргоВЫР по-прежнему остается выше ожидаемой и центральный участок молекулы МТ-ргоВМР не становится доступным для антител.
Влияние гликозилирования молекулы ]\Т-ргоВОТ на взаимодействие с антителами.
Диффузное окрашивание полос эндогенного 1ЧТ-ргоВ№ на нитроцеллюлозной мембране (Рис. 7) свидетельствует о неоднородности исследуемого белка, т.е. о наличии множества форм с различной молекулярной массой. Подобная гетерогенность свойственна гликозилированным белкам, так как они часто представлены в виде набора различных по молекулярной массе гликоформ, отличающихся длиной и составом олигосахаридных цепей. Поскольку гликозилирование является распространенной посттрансляционной модификацией секретируемых белков, мы предположили, что эндогенный МТ-ргоВЫР также может содержать углеводные остатки. На основании анализа первичной структуры мы исключили возможность Ы-гликозилирования, так как молекула КТ-ргоВ№ не содержит характерной аминокислотной последовательности Лвп-Х-Бег/ТИт, необходимой для этого вида посттрансляционной модификации. В то же время О-гликозилирование МТ-ргоВ№ потенциально может происходить по 8 остаткам серина и 5 остаткам треонина (Рис. 8). Мы
?
НРЬСЗРСЗАЗОЬЕТЗСЬОЕОКННЬООКЬЗЕЬОУЕдТЗЬЕРЬОЕЙРаРТСУШКЗЯЕ 5 8 10 1415 29 3637 44 48 53
А^В
УАТЕОЖСНКШУЬУТгЯАРК
58 71
Рис. 8. Последовательность 1МТ-рго1^Р с возможными сайтами О-гликозилирования.
обнаружили, что большинство остатков серина и треонина расположено как раз в тех участках молекулы, которые по нашим данным недоступны для антител (участки 5-10 и 2958).
Для проверки предположения о том, что эндогенный >ГГ-ргоВЫР гликозилирован, образец ]ЧТ-ргоВЫР, выделенный из объединенной плазмы крови больных с СН, инкубировали с гликозидазами, способными отщеплять углеводные остатки в молекулах О-гликопротеинов. Мы полагали, что если причиной недоступности ряда эпитопов было гликозилирование, то после удаления углеводных остатков антитела смогут взаимодействовать с эпитопами, расположенными в участках 5-12 и 28-60 молекулы N1"-ргоВОТ. Иммунореактивность эндогенного Ш'-ргоВЫР, обработанного смесью гликозидаз, сравнивали с иммунореактивностью необработанного ферментами белка. В исследовании использовали 15 сэндвич-ИФА систем с антителами, специфичными к различным участкам молекулы.
Как видно из Рис. 9, обработка гликозидазами приводила к значительному увеличению иммунореактивности ЫТ-ргоВЫР по сравнению с интактным образцом (в 5.8-41 раза, в среднем в 19 раз) при анализе в системах, где использовались антитела, специфичные к центральному участку (28-56 а.к.о.). В то же время иммунореактивность антигена, измеренная с использованием антител, специфичных к участкам 13-24 и 63-76, увеличилась незначительно (в 0.99-1.25 раза, в среднем в 1.12 раза). После обработки гликозидазами мы
1 20
£ "
2 (0
I 10
н
? 5 х а1 я
? о
Т *Г ^ ^
т- М
Иммобилизованные антитела
А.
Детекторные антитела 24Е11 (67-76)
13С12 (13-20)
Рис. 9. Изменение определяемой концентрации эндогенного 1ЧТ-ргоВ\Р в образце до (зеленые столбики) и после обработки (синие столбики) гликозидазами. Пятнадцать ЫАт, специфичных к различным участкам молекулы МТ-ргоВМР, были использованы в качестве антител подложки в сэндвич-ИФА системах (название и эпитоп антител указаны по оси ОХ). В качестве пары для антител, специфичных к И'Концевой части молекулы (¡-24 а.к.о.) использовали детекторные антитела 24Е1167л6, а для антитеч, специфичных к участку 28-76 -детекторные антитела 13С12ц-2о■ В качестве калибратора во всех системах использовали гИТ-ргоВИР.
А
Б
Номер фракции Номер фракции
Рис. 10. Иммунореактивность эндогенного МТ-ргоВ1ЧР, обработанного (красные линин) и не обработанного гликозидазами (зеленые линии) во фракциях при определении молекулярной массы белка методом гель-фильтрации. На колонку 5иреЫех 75 10/300 а наносили по 45 нг эндогенного ЫТ-ргоВКР, обработанного или не обработанного гликозидазами, либо такое же количество rNT-proBNP. А - иммунореактивность определена в системе 15С4«1-?1-13С12п 2а; Б - в системе 11В1ц-.1<г13С12Пунктирной линией на обоих графиках обозначен профиль иммунореактивности гКТ-ргоВЫР. Стрелками обозначено положение стандартов молекулярных масс (кДа).
не наблюдали значительного увеличения иммунореактивности МТ-ргоВ№, детектируемой с использованием антител 29П125_,2 и ЗН85_12, несмотря на то, что концентрация ИТ-ргоВЫР в исходном образце, определенная с использованием этих антител, была ниже, чем в контрольной системе. Мы предположили, что используемый нами набор ферментов не позволяет добиться полного удаления всех углеводных остатков, поэтому участок 5-12 остается недоступным для антител и после обработки ферментами.
При анализе образца эндогенного МТ-ргоВ№, обработанного гликозидазами, методом гель-фильтрации мы наблюдали смещение пика иммунореактивности в сторону белков с меньшими молекулярными массами по сравнению с необработанным образцом (Рис. 10). Максимум иммунореактивности эндогенного Ж-ргоВОТ, определенный в системе 15С46з_ 71-13012,3-20, приходился на 19 фракцию (~24.5 кДа). Система 1 Ш1з|-39-13012|з_2и с антителом 1 специфичным к центральному участку молекулы, детектировала в тех
же фракциях существенно меньшие количества ЭТ-ргоВ>ГР с максимумом в 20 фракции (-20 кДа). Дегликозилирование приводило к сдвигу пика иммунореактивности, детектируемого обеими системами, в 21 фракцию (~17 кДа). После обработки гликозидазами количество ЫТ-ргоВКР, детектируемое с использованием системы 1Ш1з1_з9-13012,з_2о во фракции с пиком иммунореактивности, увеличилось в 36 раз. Однако даже после обработки ферментами максимумы пиков иммунореактивности эндогенного ОТ-ргоВОТ и гЖ-ргоВОТ не совпадали. Мы полагаем, что причиной этому является неполное удаление углеводных остатков при использовании энзиматического метода.
-г +г
26.6
16.9 14.4
6.5-
-г +г
26.6 ■
16.914.4 -
6.5 ■
1 2 3 4 1 2 3 4
Рис. 11. Иммунохнмическое окрашивание эндогенного 1\Т-рго1^Р на нитроцеллюлозной мембране до (-Г) и после обработки гликозидазами (+Г) с использованием МАт 15П1и.24 (А) и 1Ш1,|.з9 (Б) на нитроцеллюлозной мембране. На дорожки нанесено: I - гЫТ-ргоВИР; 2 -гргоШР; 3 - эндогенный NT■proBNP, выделенный из объединенной плазмы больных с СН.
Образцы эндогенного ЫТ-ргоВКР до и после обработки гликозидазами анализировали с использованием метода электрофореза. На дорожки геля было нанесено по 50 нг эндогенного ЫТ-ргоВЫР, обработанного или не обработанного гликозидазами, и такое же количество гТ^Т-ргоВКР и гргоВЫР. После проведения электрофоретического разделения белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Визуализацию белковых полос на мембране проводили с использованием МАт 15Р11,3_24 и 1Ш1з1-з9- Как видно из Рис. 11А, обработка ферментами приводила к увеличению электрофоретической подвижности эндогенного МТ-ргоВЫР, детектируемого антителами 15Р1113-24. Однако даже после обработки ферментами полоса МТ-ргоВЫР оставалась диффузной и находилась несколько выше полосы гЫТ-ргоВЫР. Как уже отмечалось выше, наблюдаемая диффузность полос с большой вероятностью свидетельствует о неполном удалении углеводных остатков в результате обработки гликозидазами. При детекции с использованием антител 1 Ш131_39 мы наблюдали полосу дегликозилированного ЫТ-ргоВЫР на том же уровне, что и в случае с антителами 15И1113-24■ При этом антитела 1Ш1зю9 практически не взаимодействовали с эндогенным МТ-ргоВ№ до обработки ферментами (Рис. 11 Б).
На основании полученных данных мы заключили, что эндогенный МТ-ргоВОТ гликозилирован. Углеводные остатки приводят к увеличению молекулярной массы ЫТ-ргоВЫР по сравнению с расчетной и препятствуют взаимодействию антител с центральной частью молекулы. Обработка гликозидазами приводит к удалению значительной части углеводных остатков и уменьшению молекулярной массы молекулы. После дегликозилирования центральная часть молекулы становится доступна для взаимодействия с антителами.
Определение сайтов гликозилирования эндогенного NT-proBNP.
Для определения сайтов гликозилирования эндогенного NT-proBNP использовали препарат NT-proBNP, выделенный из объединенной плазмы крови 24 больных с высоким уровнем NT-proBNP (>30 нг/мл). NT-proBNP экстрагировали из плазмы методом аффинной хроматографии. Дополнительную очистку образца NT-proBNP проводили на колонке Vydac 214ТР10415, содержащей силикагель, модифицированный бутильными группами (С4). В результате очистки было получено 2 мкг (0.235 нмоль) эндогенного NT-proBNP.
В процессе исследования NT-proBNP был подвергнут расщеплению трипсином, затем углеводные остатки были удалены обработкой смеси пептидов раствором гидроксида аммония. Под действием гидроксида аммония происходит замещение остатка гликана NH2-группой. Таким образом, исходно модифицированные углеводами остатки серина и треонина после обработки гидроксидом аммония имеют молекулярную массу, отличную от немодифицированных остатков на одну единицу атомной массы, что позволяет идентифицировать их масс-спектрометрически. Полученные пептиды были проанализированы методом MALDI-MS/MS.
В результате проведенного масс-спектрометрического исследования (MALDI-MS) было выявлено два пика, молекулярные массы которых отличались от теоретических масс пептидов 3LGSPGSASDLETSGLQEQR21 (1931.93 Да - теоретическое значение/1931 Да -практическое значение) и 55EVATEGIR62 (874.46 Да/873.6 Да) на одну единицу массы. Анализ пептидов методом тандемной масс-спектрометрии (MALDI-MS/MS) позволил выявить два модифицированных остатка - Sers и Thrsg, которые расположены как раз в тех участках молекулы NT-proBNP, которые недоступны для взаимодействия с антителами. Таким образом, результаты масс-спектрометрического анализа подтверждают полученные нами ранее данные о наличии сайтов гликозилирования в N-концевой и центральных частях молекулы NT-proBNP.
Наличие в исследуемом триптическом гидролизате пептида 3-21 (вместо пептида 1-21, который ожидали получить в результате трипсинолиза) свидетельствует о том, что в крови превалируют молекулы NT-proBNP, у которых отщеплены два N-концевых аминокислотных остатка His-Pro, что также согласуется с нашими данными о низкой стабильности N-концевого участка молекулы и его недоступностью для специфичных антител (5В6ы2 и ЮЕ11,.,2).
Из-за ограничений, связанных с количеством исходного материала (плазмы больных с СН) и, как следствие, ограниченным количеством исследуемого препарата, а также недостаточной чувствительности современных аналитических методов, были идентифицированы не все протеолитические фрагменты (покрытие последовательности NT-proBNP составило 35.5%). Таким образом, вполне возможно, мы смогли идентифицировать
только часть сайтов гликозилирования молекулы эндогенного >1Т-ргоВЫР. Для выявления всех возможных участков гликозилирования необходимо проведение дополнительных исследований.
Влияние О-гликозилирования па иммуиореактивность 1ЧТ-ргоВ№, выделенного из индивидуальных образцов плазмы больных с СН.
Согласно полученным нами данным, остатки гликанов, входящих в состав молекулы эндогенного >ГГ-ргоВЫР, препятствуют взаимодействию антител с >1-концевой (5-12 а.к.о.) и центральной частью (участок 28-60) белка. Из этого следует, что концентрация ЫТ-ргоВЫР в образце, измеренная иммунохимическим методом с использованием таких антител, будет значительно ниже концентрации, определенной с использованием антител, специфичных к негликозилированным участкам эндогенного белка (13-24 и 61-76 а.к.о.).
Известно, что для О-гликозилирования характерна значительная внутривидовая вариабельность, которая может проявляться как в числе и составе моносахаридных остатков, так и в самом наличии олигосахаридов, связанных с данным аминокислотным остатком. Мы предположили, что погрешность измерения концентрации >1Т-ргоВ№ иммунохимическим методом, в котором используются антитела, специфичные к гликозилированному участку, может зависеть от интенсивности гликозилирования эндогенного белка данного конкретного больного. У тех больных, у которых КТ-ргоВЫР подвергается сильному гликозилированию, ошибка измерения концентрации МТ-ргоВ№ будет наибольшей.
Для изучения вариабельности гликозилирования МТ-ргоВЫР, белок экстрагировали из индивидуальных образцов плазмы крови 52 больных с СН методом аффинной хроматографии. Полученные образцы обрабатывали гликозидазами и измеряли концентрацию ЫТ-ргоВЫР в образцах до и после обработки ферментами с использованием трех сэндвич-ИФА систем. Систему 15C463.7i-13G12i3.2o использовали в качестве контрольной, поскольку оба антитела специфичны к негликозилированным участкам молекулы эндогенного Ж-ргоВИР. Две другие системы - HDl31.39-i3Gi213.20 и 160Ю48-5б-1301213.20 - содержали антитела 1Ш1з|.з9 или 1601048.5(„ специфичные к гликозилированному участку.
Количество ЭТ-ргоВОТ, определяемое в образцах с использованием систем 1Ш1з1-з9-1301213.20 и 16D1048.56-13G12i3.2o, значительно увеличилось после обработки гликозидазами. Концентрация ЭТ-ргоВОТ в образце, определенная с использованием системы 1Ш1з|_з9-1301213.20, увеличилась в 11.75 раз (медиана, диапазон от 4.95 до 52.67). При использовании системы 16D1048.56-13G12i3.2o определяемая концентрация МТ-ргоВИР увеличилась в 7.96 раз (медиана, диапазон от 2.49 до 76.04). В то же время обработка гликозидазами привела лишь к незначительному (по сравнению с двумя другими системами) увеличению концентрации
19
NT-proBNP, определяемой с использованием системы 15C463.71-13G12n.2o (медиана 1.26, диапазон от 0.99 до 2.16). На Рис. 12А показана корреляция между результатами измерения концентрации NT-proBNP в образцах до и после обработки гликозидазами с использованием систем 15C463-7i-13G12i3.2o и llDl31.39-13G12i3.2o.
Сравнивая результаты измерений в индивидуальных образцах до и после обработки гликозидазами, мы установили, что изменение определяемой концентрации NT-proBNP после дегликозилирования отличается в разных пробах, что, очевидно, связано с разным уровнем гликозилирования у разных больных. Как видно из Рис. 12Б, в некоторых образцах определяемая концентрация NT-proBNP после обработки ферментами увеличилась в 2 раза, в других - в 10 и более раз. Помимо этого, мы отметили, что изменение определяемой концентрации NT-proBNP после дегликозилирования одного и того же образца различается в случае проведения измерений разными системами. Таким образом, наши наблюдения свидетельствуют о том, что 1) гликозилирование негативно влияет на достоверность измерения концентрации NT-proBNP в системах, в которых используются антитела, специфичные к центральной части молекулы; 2) уровень гликозилирования одного и того же участка молекулы NT-proBNP может сильно отличаться у разных больных; 3) у одного и того же больного степень гликозилирования различных фрагментов центральной части молекулы также может различаться.
В настоящее время в клинической практике для измерения концентрации NT-proBNP используются диагностические системы, разработанные на основе поликлональных антител, специфичных к участкам 1-21 и 39-50. Однако, согласно данным, полученным в нашем исследовании, центральная часть молекулы NT-proBNP, включающая в себя область 39-50, гликозилирована. Мы предположили, что гликозилирование может негативно влиять на результаты измерения концентрации эндогенного NT-proBNP существующими диагностическими системами. Для того чтобы проверить это предположение, мы сравнили концентрацию NT-proBNP, измеренную с использованием диагностической системы Roche Elecsys 2010 proBNP, в тех же 52 образцах эндогенного NT-proBNP до и после обработки гликозидазами. Как видно из Рис. 12В, результаты измерения подтвердили сделанный нами ранее вывод о том, что остатки гликанов, входящих в состав молекулы эндогенного NT-proBNP, препятствуют взаимодействию антител с центральной частью белка. Значения концентрации NT-proBNP в не обработанных гликозидазами образцах, определенные с использованием системы Roche Elecsys 2010 proBNP, были в 4.78 раза ниже (медиана, диапазон от 1.74 до 16.50), чем концентрации, определенные в системе 15C463.7i-13G12i3-2o. После обработки гликозидазами детектируемая системой Roche Elecsys 2010 proBNP концентрация NT-proBNP в образцах увеличилась в 4.11 раза (медиана, диапазон от 2.04 до 12.73), в результате чего концентрации NT-proBNP, определяемые в образцах обеими
А
Б
120-1
10080-
■ - гликозидазы ▲ + гликозидазы
f^_____•■■
Л
Концмгградия ЫТ-рпзВЫР, нг)мл (15C4-13G12)
Концентрация NT-proBNP, нг/мл (15C4-13G12)
120-
100-
Ii X Z
II eo-
p z j. 60<
Ii 40-
Ii
8 6 го-
■ I
А
Концентрация NT-proBNP, н (15C4-13G12)
Концентрация NT-proBNP, нг/мл (15C4-13G12)
Рис. 12. А, В - корреляция результатов измерения концентрации NT-proBNP, экстрагированного из 52 образцов плазмы бальных с СН, не обработанных и обработанных гликозидазами. Б, Г - изменение концентрации NT-proBNP в нескольких репрезентативных пробах до и после обработки гликозидазами.
А, Б - концентрации были измерены с использованием систем 15C4fa.7i-13G12n.2o и llDln.jg-13G12n.io; В, Г - с использованием систем I5C4/u.7!-I3GI2u:o и Roche Elecsys 2010proBNP.
системами практически совпадали (Рис. 12В, Г).
Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют о том, что системы для измерения концентрации NT-proBNP, в которых используются антитела, специфичные к центральной части молекулы, могут серьезно недооценивать концентрацию NT-proBNP в пробе. Степень ошибки непредсказуема и зависит от интенсивности гликозилирования молекулы NT-proBNP в участке, распознаваемом антителами. Клиническое значение этого наблюдения еще предстоит установить. Поскольку по нашим данным система с использованием антител 15С46з.71 -13G12i3_2o наименее чувствительна к гликозилированию NT-proBNP, мы полагаем, что при создании диагностических систем для количественного определения NT-proBNP в крови следует использовать антитела, специфичные к участкам 13-20 и 63-71 молекулы NT-proBNP.
Выводы
1. Создана система экспрессии и разработан метод получения высокоочищенного препарата рекомбинантного ЭТ-ргоВКР.
2. Получены и охарактеризованы моноклональные антитела, специфичные к различным участкам молекулы МТ-ргоВОТ человека.
3. Показано, что в крови больных с сердечной недостаточностью И-концевой участок молекулы МТ-ргоВЫР подвергается протеолизу.
4. Впервые эндогенный ЫТ-ргоВОТ описан как гликопротеин с гликозилированием О-типа.
5. Выявлены отличия в степени гликозилирования а) одного и того же участка молекулы Ж-ргоВЫР у различных больных; б) различных участков молекулы в крови одного больного.
6. Установлено, что гликозилирование препятствует взаимодействию антител, специфичных к участкам 5-12 и 28-60, с ЫТ-ргоВЫР. Рекомендовано в системах для количественного определения МТ-ргоВОТ использовать антитела, специфичные к участкам 13-20 и 63-71 молекулы 1ЧТ-ргоВОТ.
Публикации по теме диссертации
1. Semenov AG, Postnikov AB, Tamm NN, Seferian KR, Karpova SN, Bloshchitsyna MN, Koshkina EV, Krasnoselskiy MI, Serebryanaya DV, Katrukha AG. Processing of proBNP is suppressed by 0-glycosylation in the region close to the cleavage site. Clinical Chemistry, 2009;55(3):489-98.
2. Semenov AG, Karpova NS, Postnikov AB, Seferian KR. Tamm NN, Serebryanaya DV, Katrukha AG. O-Glycosylation-mediated heterogeneity of 67-76 region of endogenous pro-Brain Natriuretic Peptide (proBNP) and its processing. Abstract, FEBS congress, Prague, Czech Republic, 4-9 July 2009. The FEBS journal, 2009, Vol. 276, Supplement 1, p. 342.
3. Semenov A, Postnikov A, Karpova N, Seferian K. Tamm N, Serebryanaya D, Katrukha A. New insights into human proBNP processing: the evidence for furin-mediated proBNP processing in vitro. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. 19-23 July 2008, Chicago, IL. Clinical Chemistry, 2009, Vol 55, No S6, A71-A72.
4. Tamm NN, Seferian KR. Semenov AG, Mukharyamova KS, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, Postnikov AB, Serebryanaya DV, Apple FS, Murakami MM, Katrukha AG. Novel immunoassay for quantification of brain natriuretic peptide and its precursor in human blood. Clinical Chemistry, 2008, Vol 54, No 9, pp 1511 - 1518.
5. Semenov A, Karpova N, Serebryanaya D, Postnikov A, Tamm N, Esakova T, Seferian K. Katrukha A. Processing of brain natriuretic peptide precursor (proBNP) is affected by threonine 71 glycosylation. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. 27-31 July 2008, Washington, DC. Clinical Chemistry, 2009, Vol 54, No S6, A94.
6. Semenov A, Karpova N, Postnikov A, Serebryanaya D, Tamm N, Seferian K. Kara A, Katrukha A. The difference in glycosylation between human proBNP and NT-proBNP suggests a new regulatory level in proBNP processing. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. 27-31 July 2008, Washington, DC. Clinical Chemistry, 2009, Vol 54, No S6, A94.
7. Seferian KR. Tamm NN, Semenov AG, Postnikov AB, Katrukha AG. Novel findings of the nature of circulating BNP, proBNP and NT-proBNP. Abstract, LabMed 2008, XXXI Nordic Congress in Clinical Chemistry, Helsinki, Finland, 14-18 June 2008. Abstracts book, 048.
8. Семенов АГ, Карпова НС, Постников АБ, Сеферян KP. Тамм НН, Серебряная ДВ, Блошицина МН, Катруха АГ. Гликозилирование по остатку треонина в положении 71 препятствует процессингу молекул предшественника натрийуретического пептида В. Тезисы конференции «Четвертая всероссийская с международным участием школа-конференция по физиологии кровообращения». Москва, 2008, стр. 88-89.
9. Seferian KR. Tamm NN, Semenov AG, Tolstaya AA, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, Postnikov AB, Serebryanaya DV, Katrukha AG, Apple FS, Murakami MM. Immunodetection of glycosylated NT-proBNP circulating in human blood. Clinical Chemistry, 2008, Vol 54, No 5, pp 866-873.
10. Tamm NN, Seferian KR. Mukharyamova KS, Filatov VL, Kharitonov AV, Kara AN, Esakova TV, Katrukha AG. New type of immunoassay for quantification of brain natriuretic peptide (BNP) and its' precursor - proform of brain natriuretic peptide (proBNP) in human blood. Abstract, 17th IFCC-FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Amsterdam, Netherlands, 3-7 June 2007. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 2007; 45, Special Supplement, p. S380.
11. Katrukha AG, Tamm NN, Semenov AG, Seferian KR, Postnikov AB, Agafonov MO, Kara AN, Esakova TV. Recombinant proform of brain natriuretic peptide (proBNP), expressed in eukaryotic cells as a stable standard for BNP immunoassay. Abstract, The Annual Meeting of the American Association
12. Katrukha AG, Semenov AG, Tamm NN, Seferian KR. Postnikov AB, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, Mukharyamova KS, Tolstaya AA, Filatov V L. Glycosylation of NT-proBNP molecules and NT-proBNP immunoassays. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. San Diego, California, July 15-19 2007. Clinical Chemistry 2007, Vol 53, No 6, Supplement, A23.
13. Katrukha AG, Seferian KR. Tamm NN, Semenov AG, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, Tolstaya AA, Kharitonov AV, Filatov VL. ProBNP is a major form of BNP immunoreactivity in blood of patients with heart failure. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. San Diego, California, July 15-19 2007. Clinical Chemistry 2007, Vol 53, No 6, Supplement, A6.
14. Seferian K. Tamm N, Semenov A, Mukharyamova K, Tolstaya A, Koshkina E, Kara A, Krasnoselsky M, Apple F, Esakova V, Filatov V, Katrukha A. The brain natriuretic peptide (BNP) precursor is the major immunoreactive form of BNP in patients with heart failure. Clinical Chemistry, 2007; Vol 53, No 5, pp 866-873.
15. Ссфсряп KP. Семенов АГ. Исследование иммунохимических свойств N-концевой части предшественника натрийуретического пептида В (NT-proBNP), циркулирующего в крови больных. Тезисы конференции «Биотехнология и медицина», Москва, 14-17 марта 2006. Сборник тезисов конференции, стр. 170.
16. Семенов АГ, Сеферяи КР. Изучение иммунохимических свойств N-концевой части предшественника натрийуретического пептида В (NT-proBNP). Тезисы конференции «Ломоносов-2006», Москва, 12-15 апреля 2008. Издательство МГУ, стр. 206-207.
17. Tamm N, Mukhariamova К, Seferian К. Antopolskii М, Filatov V, Koshkina Е, Krasnoselskii М, Katrukha A. New sensitive sandwich time resolved immunofluorometric assay for quantification of BNP in human blood. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. Orlando, Florida, July 24-28, 2005. Clinical Chemistry 2005, Vol 51, No 6, Supplement, A26.
18. Tolstaya A, Antopolskii M, Kharitonov A, Koshkina E, Krasnoselskii M, Seferian K. Katrukha A. NT-proBNP stability assessed by several sandwich immunoassays utilizing monoclonal antibodies with different epitope specificity. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. Orlando, Florida, July 24-28, 2005. Clinical Chemistry 2005, Vol 51, No 6, Supplement, A26.
19. Сеферяи KP. Толстая AA. Исследование биохимических свойств N-концевой части предшественника натрийуретического пептида В с использованием моноклональных антител. Тезисы конференции «Ломоносов-2004», Москва, 12-15 апреля 2004.
20. Katrukha AG, Severina М, Seferian К. Kolosova О, Esakova Т, Bereznikova A, Bulargina Т. New monoclonal antibodies for N-terminal pro-BNP assay. Abstract, 15th IFCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Barcelona, Spain, June 1-5, 2003. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 2003, 41; Special Supplement, W-208.
Заказ № 103-а/02/10 Подписано в печать 24.02.2010 Тираж 70 экз. Усл. п.л. 1
:-ч\ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30
)) \т>-н>. с/г. ги; е-таИ: т/о@с/г. ги
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сеферян, Карина Рубеновна
Список используемых сокращений.
Введение.
1 Обзор литературы.
1.1 Натрийуретические пептиды.
1.1.1 Семейство натрийуретических пептидов.
1.1.2 Строение натрийуретических пептидов.
1.2 Синтез и ceKpeijim BNP.
1.2.1 Экспрессия BNP в различных тканях.
1.2.2 Структура гена BNP.
1.2.3 Регуляция экспрессии гена BNP.
1.2.4 Процессинг предшественника BNP.
1.2.5 Формы BNP в крови.
1.2.6 Конвертазы прогормонов, предположительно принимающие участие в процессинге proBNP.
1.2.7 Олигомерньге формы proBNP и NT-proBNP.
1.3 Инактивация натрийуретических пептидов.
1.4 Рецепторы натрийуретических пептидов.
1.5 Физиологическое действие BNP.
1.6 Сердечная недостаточность.
1.6.1 Обгцая характеристика.
1.6.2 Гемодинамические изменения в организме при сердечной недостаточности.
1.6.3 Использование BNP и NT-proBNP в клинической практике.
1.7 Измерение концентрации NT-proBNP в крови.
2 Материалы и методы исследования.
2.1.1 Создание молекулярно-генетической конструкции рЕТ-23а(+)-NT-proBNP для экспрессии рекомбинантного NT-proBNP в клетках Е. coli.
2.1.2 Экспрессия рекомбинантного NT-proBNP. Получение лизата клеток Е. coli.
2.1.3 Конъюгирование пептидов с белком-носителем.
2.1.4 Иммунизация мышей и получение линий гибридомных клеток, продуцирующих антитела, специфичные к NT-proBNP.
2.1.5 Иммуноферментный и иммунофосфоресцентный анализы.
2.1.6 ДСН-электрофорез в полиакршамидном геле.
2.1.7 Электрофорез в трис-трщииовой буферной системе.
2.1.8 Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране.
2.1.9 Иммобилизация антител на BrCN-активированной сефарозе.
2.1.10 Выделение NT-proBNP из плазмы крови методом аффинной хроматографии.
2.1.11 Ферментативное дегликозилирование эндогенного NT-proBNP.
2.1.12 Хроматографическое разделение белков.
2.1.13 Трипсинолиз эндогенного NT-proBNP и дегликозилирование протеолитических фрагментов с использованием гидроксида аммония.
2.1.14 Масс-спектрометрический анализ.
3 Результаты и их обсуждение.
3.1 Получение и очисткарекомбинантного NT-proBNP.
3.1.1 Создание молекулярно-генетической конструкцииpET-23a(+)-NT-proBNP для экспрессии рекомбинантного NT-proBNP в клетках Е. coli.
3.1.2 Очистка рекомбинантного NT-proBNP.
3.2 Получение моноклональных антител, специфичных к NT-proBNP.
3.2.1 Конъюгирование пептидов с белком- носителем и иммунизация мышей.
3.2.2 Получение линий гибридомных клеток, продуцирующих антитела, специфичные к NT- proBNP.
3.2.3 Определение эпитопной специфичности моноклональных антител.
3.3 Исследование биохимических особенностей эндогенного NT-proBNP.
3.3.1 Изучение взаимодействия моноклональных антител с NT-proBNP, содержащимся в крови больных с СН.
3.3.2 Протеолитическая деградация NT-proBNP и ее влияние на связывание с моноклоналънъти антителами.
3.3.3 Проверка гипотезы о существовании NT-proBNP в крови в виде гомо- или гетероолигомерных комплексов.
3.3.4 Гликозилирование молекулы NT-proBNP и его влияние на взаимодействие с антителами.
3.3.5 Определение сайтов гликозилирования NT-proBNP методом MALDI-MS/MS.
3.4 Влияние О-гликозилирования на иммунореактивностъ NT-proBNP, выделенного из индивидуальных образцов плазмы больных с СН.
4 Выводы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование иммунохимических и биохимических свойств N-концевого фрагмента предшественника натрийуретического пептида В-типа человека"
Натри йуретический пептид В-типа (Brain Natriuretic Peptide, BNP) является пептидным гормоном, функциональным антагонистом ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и симпатической нервной системы. BNP участвует в регуляции кровяного давления, объема жидкости в организме и её электролитного состава, вызывая вазодилатацию сосудов, ускоряя выведение натрия и усиливая диурез. BNP осуществляет свое действие на организм, взаимодействуя с рецепторами натрийуретических пептидов А-типа, которые являются мембран-связанными гуанилатциклазами. BNP синтезируется кардиомиоцитами в виде прогормона proBNP (108 аминокислотных остатков, а.к.о.), который затем расщепляется специфической конвертазой на физиологически активный BNP (32 а.к.о.) и N-концевой фрагмент прогормона (NT-proBNP, 76 а.к.о.), которые выделяются в кровоток. Физиологическая функция NT-proBNP, если имеется, пока остается неизвестной.
Уровень экспрессии гена BNP и секреция BNP и NT-proBNP в кровоток значительно увеличиваются при сердечной недостаточности (СН). Сердечная недостаточность представляет собой заболевание, при котором сердце не способно обеспечить организхм кровью в необходимых количествах, которое проявляется в виде характерных симптомов (одышка, утомляемость, ограничение физической активности, отеки, влажные хрипы в легких и др.). Сердечная недостаточность может развиваться в результате различных сердечно-сосудистых заболеваний, таких как коронарная болезнь сердца, гипертония, дефекты клапанов сердца, аритмия, кардиомиопатия, а также в результате повреждений миокарда любой этиологии. Клинические проявления СН неспецифичны, что значительно затрудняет диагностику заболевания. Показано, что при СН концентрация BNP и NT-proBNP в крови увеличивается прямо пропорционально степени дисфункции левого желудочка сердца. В настоящее время измерение концентрации BNP и NT-proBNP с использованием иммунохимических методов широко используется в клинической практике при обследовании больных с подозрением на СН. Использование BNP и NT-proBNP как биохимических маркеров СН позволяет значительно повысить точность диагностики СН. Помимо этого, измерение концентрации обоих пептидов в крови обладает высоким прогностическим значением у пациентов с СН, а также у пациентов, перенесших острый инфаркт миокарда.
Несмотря на широкое применение в клинике, до последнего времени практически ничего не было известно о биохимических особенностях BNP и NT-proBNP, обнаруживаемых в крови человека. Однако, данные о том, в какой форме маркер существует в крови, необходимы как для интерпретации результатов теста, так и для правильного подбора антител, используемых в диагностических системах; выбора калибратора и стандартов. На взаимодействие антител с белком-мишенью может оказывать влияние целый ряд факторов (протеолитическая деградация, комплексообразование, пострансляционные модификации и др.), что может приводить к недостоверным результатам при измерении концентрации маркера в крови пациента. Данная работа посвящена исследованию иммунохимических и биохимических свойств эндогенного NT-proBNP.
1 Обзор литературы.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Сеферян, Карина Рубеновна
4 Выводы
1. Создана система экспрессии и разработан метод получения высокоочищенного препарата рекомбинантного NT-proBNP.
2. Получены и охарактеризованы моноклональные антитела, специфичные к различным участкам молекулы NT-proBNP человека.
3. Показано, что в крови больных с сердечной недостаточностью N-концевой участок молекулы NT-proBNP подвергается протеолизу.
4. Впервые эндогенный NT-proBNP описан как гликопротеин с гликозилированием О-типа.
5. Выявлены отличия в степени гликозилирования а) одного и того же участка молекулы NT-proBNP у различных больных; б) различных участков молекулы в крови одного больного.
6. Установлено, что гликозилирование препятствует взаимодействию антител, специфичных к участкам 5-12 и 28-60, с NT-proBNP. Рекомендовано в системах для количественного определения NT-proBNP использовать антитела, специфичные к участкам 13-20 и 63-71 молекулы NT-proBNP.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сеферян, Карина Рубеновна, Москва
1. Altschul, S. F., Madden, Т. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. &1.pman, D. J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25: 3389-402.
2. Arden, К. C., Viars, C. S., Weiss, S., Argentin, S. & Nemer, M. 1995. Localization ofthe human B-type natriuretic peptide precursor (NPPB) gene to chromosome lp36. Genomics 26: 385-9.
3. Bettencourt, P., Ferreira, A., Dias, P., Castro, A., Martins, L. & Cerqueira-Gomes, M.2000. Evaluation of brain natriuretic peptide in the diagnosis of heart failure.1. Cardiology 93: 19-25.
4. Brandt, I., Lambeir, A. M., Ketelslegers, J. M., Vanderheyden, M., Scharpe, S. & De
5. Meester, I. 2006. Dipeptidyl-peptidase IV converts intact B-type natriuretic peptide into its des-SerPro form. Clin Chem 52: 82-7.
6. Campbell, D. J., Mitchelhill, К. I., Schlicht, S. M. & Booth, R. J. 2000. Plasma aminoterminal pro-brain natriuretic peptide: a novel approach to the diagnosis of cardiac dysfunction. J Card Fail 6: 130-9.
7. Chan, J. C., Knudson, O., Wu, F., Morser, J., Dole, W. P. & Wu, Q. 2005. Hypertensionin mice lacking the proatrial natriuretic peptide convertase corin. Proc Natl Acad Sci USA 102: 785-90.
8. Cheng, V., Kazanagra, R., Garcia, A., Lenert, L., Krishnaswamy, P., Gardetto, N.,
9. Clopton, P. & Maisel, A. 2001. A rapid bedside test for B-type peptide predicts treatment outcomes in patients admitted for decompensated heart failure: a pilot study. J Am Coll Cardiol 37: 386-91.
10. Chinkers, M. & Garbers, D. L. 1989. The protein kinase domain of the ANP receptor is required for signaling. Science 245: 1392-4.
11. Cortes, R., Rivera, M., Salvador, A., Garcia de Burgos, F., Bertomeu, V., Rosello-Lleti,
12. E., Martinez-Dolz, L., Paya, R., Almenar, L. & Portoles, M. 2007. Urinary B-type natriuretic peptide levels in the diagnosis and prognosis of heart failure. J Card Fail 13: 549-55.
13. Crimmins, D. L. & Kao, J. L. 2008. A glycosylated form of the human cardiac hormonepro B-type natriuretic peptide is an intrinsically unstructured monomeric protein. Arch Biochem Biophys 475: 36-41.
14. Davidson, N. C., Naas, A. A., Hanson, J. K., Kennedy, N. S., Coutie, W. J. & Struthers,
15. A. D. 1996. Comparison of atrial natriuretic peptide B-type natriuretic peptide, and N-terminal proatrial natriuretic peptide as indicators of left ventricular systolic dysfunction. Am J Cardiol 77: 828-31.
16. Del Ry, S., Passino, C., Emdin, M. & Giannessi, D. 2006. C-type natriuretic peptide andheart failure. Pharmacol Res 54: 326-33.
17. Dubois, С. M., Laprise, M. H., Blanchette, F., Gentry, L. E. & Leduc, R. 1995.
18. Processing of transforming growth factor beta 1 precursor by human furin convertase. J Biol Chem 270: 10618-24.
19. Emdin, M., Passino, C., Prontera, C., Fontana, M., Poletti, R., Gabutti, A., Mammini, C.,
20. Giannoni, A., Zyw, L., Zucchelli, G. & Clerico, A. 2007. Comparison of brain natriuretic peptide (BNP) and amino-terminal ProBNP for early diagnosis of heart failure. Clin Chem 53: 1289-97.
21. Fenrick, R., Babinski, K., McNicoll, N., Therrien, M., Drouin, J. & De Lean, A. 1994.
22. Cloning and functional expression of the bovine natriuretic peptide receptor-B (natriuretic factor Rlc subtype. Mol Cell Biochem 137: 173-82.
23. Flynn, T. G., de Bold, M. L. & de Bold, A. J. 1983. The amino acid sequence of an atrialpeptide with potent diuretic and natriuretic properties. Biochem Biophys Res Commun 117: 859-65.
24. Fuat, A., Murphy, J. J., Hungin, A. P., Curry, J., Mehrzad, A. A., Hetherington, A.,
25. Johnston, J. I., Smellie, W. S., Duffy, V. & Cawley, P. 2006. The diagnostic accuracy and utility of a B-type natriuretic peptide test in a community population of patients with suspected heart failure. Br J Gen Pract 56: 327-33.
26. Gerbes, A. L., Dagnino, L., Nguyen, T. & Nemer, M. 1994. Transcription of brainnatriuretic peptide and atrial natriuretic peptide genes in human tissues. J Clin Endocrinol Metab 78:1307-11.
27. Giuliani, I., Rieunier, F., Larue, C., Delagneau, J. F., Granier, С., Pau, В., Ferriere, M.,
28. Saussine, M., Cristol, J. P., Dupuy, A. M., Merigeon, E., Merle, D. & Villard, S. 2006. Assay for measurement of intact B-type natriuretic peptide prohormone in blood. Clin Chem 52: 1054-61.
29. Gladysheva, I. P., Robinson, B. R., Houng, A. K., Kovats, T. & King, S. M. 2008. Corinis co-expressed with pro-ANP and localized on the cardiomyocyte surface in both zymogen and catalytically active forms. JMol Cell Cardiol 44: 131-42.
30. Goetze, J. P., Dahlstrom, U., Rehfeld, J. F. & Alehagen, U. 2008. Impact of Epitope
31. Specificity and Precursor Maturation in Pro-B-Type Natriuretic Peptide Measurement. Clin Chem.
32. Goetze. J. P., Jensen, G., Moller, S., Bendtsen, F., Rehfeld, J. F. & Henriksen, J. H.2006. BNP and N-terminal proBNP are both extracted in the normal kidney. Eur J Clin Invest 36: 8-15.
33. Goodfriend, T. L., Elliott, M. E. & Atlas, S. A. 1984. Actions of synthetic atrialnatriuretic factor on bovine adrenal glomerulosa. Life Sci 35: 1675-82.
34. Gustafsson, F., Steensgaard-Hansen, F., Badskjaer, J., Poulsen. A. H., Corell. P. &
35. Hildebrandt, P. 2005. Diagnostic and prognostic performance of N-terminal ProBNP in primary care patients with suspected heart failure. J Card Fail 11: SI 5-20.
36. Hammerer-Lercher, A., Fersterer, J., Holzmann, S., Bonatti, J., Ruttmann, E., Hoefer, D.,
37. Mair, J. & Puschendorf, B. 2006. Direct comparison of relaxation and cGMP production in human coronary by-pass grafts in response to stimulation with natriuretic peptides and a nitric oxide donor. Clin Sci (bond) 111: 225-31.
38. Hammerer-Lercher, A., Neubauer, E., Muller, S., Pachinger, O., Puschendorf, B. & Mair,
39. J. 2001. Head-to-head comparison of N-terminal pro-brain natriuretic peptide, brain natriuretic peptide and N-terminal pro-atrial natriuretic peptide in diagnosing left ventricular dysfunction. Clin ChimActa 310: 193-7.
40. Hanford, D. S., Thuerauf, D. J., Murray, S. F. & Glembotski, С. C. 1994. Brainnatriuretic peptide is induced by alpha 1-adrenergic agonists as a primary response gene in cultured rat cardiac myocytes. J Biol Chem 269: 26227-33.
41. Harris, P. J., Thomas, D. & Morgan, Т. O. 1987. Atrial natriuretic peptide inhibits angiotensin-stimulated proximal tubular sodium and water reabsorption. Nature 326: 697-8.
42. Hashiguchi, Т., Higuchi, K., Ohashi, M., Minamino, N., Kangawa, K., Matsuo, H. &
43. Nawata, H. 1988. Porcine brain natriuretic peptide, another modulator of bovine adrenocortical steroidogenesis. FEBSLett 236: 455-61.
44. He, X. 1., Chow, D. c., Martick, M. M. & Garcia, К. C. 2001. Allosteric activation of aspring-loaded natriuretic peptide receptor dimer by hormone. Science 293: 165762.
45. Hermanson, G. 1996. Bioconjugate techniques. Academic press Inc.
46. Heublein, D. M., Huntley, В. K., Boerrigter, G„ Cataliotti, A., Sandberg, S. M., Redfield,
47. M. M. & Burnett, J. C. Jr 2007. Immunoreactivity and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate activating actions of various molecular forms of human B-type natriuretic peptide. Hypertension 49: 1114-9.
48. Hino, J., Tateyama, H., Minamino, N., Kangawa, K. & Matsuo, H. 1990. Isolation andidentification of human brain natriuretic peptides in cardiac atrium. Biochem Biophys Res Commun 167: 693-700.
49. Hirata, Y., Shichiri, M., Emori, Т., Marumo, F., Kangawa, K. & Matsuo, H. 1988. Brainnatriuretic peptide interacts with atrial natriuretic peptide receptor in cultured rat vascular smooth muscle cells. FEBS Lett 238: 415-8.
50. Hughes, D., Talwar, S., Squire, I. В., Davies, J. E. & Ng, L. L. 1999. Animmunoluminometric assay for N-terminal pro-brain natriuretic peptide: development of a test for left ventricular dysfunction. Clin Sci (Lond) 96: 373-80.
51. Hunt, P. J., Espiner, E. A., Nicholls, M. G., Richards, A. M. & Yandle, T. G. 1996.
52. Differing biological effects of equimolar atrial and brain natriuretic peptide infusions in normal man. J Clin Endocrinol Me tab 81: 3871-6.
53. Hunt, P. J., Espiner, E. A., Nicholls, M. G., Richards, A. M. & Yandle, T. G. 1997a. Therole of the circulation in processing pro-brain natriuretic peptide (proBNP) to amino-terminal BNP and BNP-32. Peptides 18: 1475-81.
54. Hunt, P. J., Richards, A. M., Nicholls, M. G., Yandle, T. G., Doughty, R. N. & Espiner,
55. E. A. 1997b. Immunoreactive amino-terminal pro-brain natriuretic peptide (NT-PROBNP): a new marker of cardiac impairment. Clin Endocrinol (Oxf) 47: 28796.
56. Hunt, P. J. Yandle, T. G., Nicholls, M. G., Richards, A. M. & Espiner, E. A. 1995. Theamino-terminal portion of pro-brain natriuretic peptide (Pro-BNP) circulates in human plasma. Biochem Biophys Res Commun 214: 1175-83.
57. Itoh, H., Nakao, K., Mukoyama, M., Saito, Y., Yamada, Т., Shirakami, G., Arai, H.,
58. Hosoda, K., Suga, S., Yoshida, I. & et, a. 1. 1990. Preparation of monoclonal antibodies against brain natriuretic peptide and their application to radioimmunoassay and passive immunization. Endocrinology 127: 1292-300.
59. Januzzi, J. L., van Kimmenade, R., Lainchbury, J., Bayes-Genis, A., Ordonez-Llanos, J.,
60. Januzzi, J. L. Jr, Camargo, C. A., Anwaruddin, S., Baggish, A. L., Chen, A. A., Krauser,
61. Jensen, К. Т., Carstens, J. & Pedersen, E. B. 1998. Effect of BNP on renalhemodynamics, tubular function and vasoactive hormones in humans. Am J Physiol 21 A: F63-72.
62. Jewett, J. R., Koller, K. J., Goeddel, D. V. & Lowe, D. G. 1993. Hormonal induction oflow affinity receptor guanylyl cyclase. EMBOJX 2: 769-77.
63. Jourdain, P., Jondeau, G., Funck, F., Gueffet, P., Le Helloco, A., Donal, E., Aupetit, J. F.,
64. Aumont, M. C., Galinier, M., Eicher, J. C., Cohen-Solal, A. & Juilliere, Y. 2007. Plasma brain natriuretic peptide-guided therapy to improve outcome in heart failure: the STARS-BNP Multicenter Study. J Am Coll Cardiol 49: 1733-9.
65. Julenius, К., Molgaard, A., Gupta, R. & Brunak, S. 2005. Prediction, conservationanalysis, and structural characterization of mammalian mucin-type O-glycosylation sites. Glycobiology 15: 153-64.
66. Karl, J., Borgya, A., Gallusser, A., Huber, E., Krueger, K., Rollinger, W. & Schenk, J.1999. Development of a novel, N-terminal-proBNP (NT-proBNP) assay with a low detection limit. Scand J Clin Lab Invest Suppl 230: 177-81.
67. Kearney, M. T. & Marber, M. 2004. Trends in incidence and prognosis of heart failure;
68. You always pass failure on the way to success. Eur Heart J25: 283-4.
69. Kilic, A., Bubikat, A., Gassner, В., Baba, H. A. & Kuhn, M. 2007. Local actions of atrialnatriuretic peptide counteract angiotensin II stimulated cardiac remodeling. Endocrinology 148: 4162-9.
70. Kimura, K., Yamaguchi, Y., Horii, M., Kawata, H., Yamamoto, H„ Uemura, S. & Saito,
71. Y. 2007. ANP is cleared much faster than BNP in patients with congestive heart failure. Eur J Clin Pharmacol 63: 699-702.
72. Kishimoto, I., Dubois, S. K. & Garbers, D. L. 1996. The heart communicates with thekidney exclusively through the guanylyl cyclase-A receptor: acute handling of sodium and water in response to volume expansion. Proc Natl Acad Sci US A 93: 6215-9.
73. Knappe, S. Wu, F., Masikat, M. R., Morser, J. & Wu, Q. 2003. Functional analysis ofthe transmembrane domain and activation cleavage of human corin: design and characterization of a soluble corin. J Biol Chem 278: 52363-70.
74. Kohler, G. & Milstein, C. 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity. Nature 256: 495-7.
75. Kudo, T. & Baird, A. 1984-1985. Inhibition of aldosterone production in the adrenalglomerulosa by atrial natriuretic factor. Nature 312: 756-7.
76. Kuhn, M. 2003. Structure, regulation, and function of mammalian membrane guanylylcyclase receptors, with a focus on guanylyl cyclase-A. Circ Res 93: 700-9.
77. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4. Nature 227: 680-5.
78. Lam, С. S., Burnett, J. C. Jr, Costello-Boerrigter, L., Rodeheffer, R. J. & Redfield, M. M.2007. Alternate circulating pro-B-type natriuretic peptide and B-type natriuretic peptide forms in the general population. J Am Coll Cardiol 49: 1193-202.
79. Lang, С. C., Prasad, N., McAlpine, H. M., Macleod, C., Lipworth, B. J., MacDonald, T.
80. M. & Struthers, A. D. 1994. Increased plasma levels of brain natriuretic peptide in patients with isolated diastolic dysfunction. Am HeartJXTJ: 1635-6.
81. LaPointe, M. C. 2005. Molecular regulation of the brain natriuretic peptide gene.1. Peptides 26: 944-56.
82. Latini, R., Masson, S., Anand, I., Salio, M., Hester, A., Judd, D., Barlera, S., Maggioni,
83. A. P., Tognoni, G. & Cohn, J. N. 2004. The comparative prognostic value of plasma neurohormones at baseline in patients with heart failure enrolled in Val-HeFT. Eur Heart J 25: 292-9.
84. Light, D. В., Corbin, J. D. & Stanton, B. A. 1990. Dual ion-channel regulation by cyclic
85. GMP and cyclic GMP-dependent protein kinase. Nature 344: 336-9.
86. Lopez, M. J., Garbers, D. L. & Kuhn, M. 1997. The guanylyl cyclase-deficient mousedefines differential pathways of natriuretic peptide signaling. J Biol Chem 272: 23064-8.
87. Lowe, D. G. 1992. Human natriuretic peptide receptor-A guanylyl cyclase is selfassociated prior to hormone binding. Biochemistry 31: 10421-5.
88. Lowe, D. G., Camerato, T. R. & Goeddel, D. V. 1990. cDNA sequence of the humanatrial natriuretic peptide clearance receptor. Nucleic Acids Res 18: 3412.
89. Lowe, D. G., Chang, M. S., Hellmiss, R., Chen, E., Singh, S., Garbers, D. L. & Goeddel,
90. D. V. 1989. Human atrial natriuretic peptide receptor defines a new paradigm for second messenger signal transduction. EMBOJ 8: 1377-84.
91. Maack, Т., Marion, D. N., Camargo, M. J., Kleinert, H. D., Laragh, J. H., Vaughan, E. D.
92. Jr & Atlas, S. A. 1984. Effects of auriculin (atrial natriuretic factor) on blood pressure, renal function, and the renin-aldosterone system in dogs. Am J Med 77: 1069-75.
93. Maisel, A. S., Krishnaswamy, P., Nowak, R. M., McCord, J., Hollander, J. E., Due, P.,
94. Marin-Grez, M., Fleming, J. T. & Steinhausen, M. 1986. Atrial natriuretic peptide causespre-glomerular vasodilatation and post-glomerular vasoconstriction in rat kidney. Nature 324: 473-6.
95. Marttila, M., Hautala, N., Paradis, P., Toth, M., Vuolteenaho, O., Nemer, M. &
96. Ruskoaho, H. 2001. GATA4 mediates activation of the B-type natriuretic peptide gene expression in response to hemodynamic stress. Endocrinology 142: 4693700.
97. Masson, S., Latini, R„ Anand, I. S., Vago, Т., Angelici, L., Barlera, S., Missov, E. D.,
98. Michielsen, E. C., Bakker, J. A., Kimmenade, R. R., Pinto, Y. M. & Dieijen-Visser, M. P.2008. The diagnostic value of serum and urinary NT-proBNP for heart failure. Ann Clin Biochem 45: 389-94.
99. Minamino, N., Aburaya, M., Ueda, S., Kangawa, K. & Matsuo, H. 1988. The presenceof brain natriuretic peptide of 12,000 daltons in porcine heart. Biochem Biophys Res Commun 155: 740-6.
100. Miyagi, M. & Misono, K. S. 2000. Disulfide bond structure of the atrial natriureticpeptide receptor extracellular domain: conserved disulfide bonds among guanylate cyclase-coupled receptors. Biochim Biophys Acta 1478: 30-8.
101. Miyagi, M., Zhang, X. & Misono, К. S. 2000. Glycosylation sites in the atrial natriuretic peptide receptor: oligosaccharide structures are not required for hormone binding. Eur JBiochem 267: 5758-68.
102. Molloy, S. S., Bresnahan, P. A., Leppla, S. H., Klimpel, K. R. & Thomas, G. 1992.
103. Human furin is a calcium-dependent serine endoprotease that recognizes the sequence Arg-X-X-Arg and efficiently cleaves anthrax toxin protective antigen. J Biol Chem 267: 16396-402.
104. Mosterd, A. & Hoes, A. W. 2007. Clinical epidemiology of heart failure. Heart 93:1137-46.
105. Mueller, Т., Gegenhuber, A., Poelz, W. & Haltmayer, M. 2003. Comparison of the
106. Biomedica NT-proBNP enzyme immunoassay and the Roche NT-proBNP chemiluminescence immunoassay: implications for the prediction of symptomatic and asymptomatic structural heart disease. Clin Chem 49: 976-9.
107. Mueller, Т., Gegenhuber, A., Poelz, W. & Haltmayer, M. 2005. Diagnostic accuracy of
108. В type natriuretic peptide and amino terminal proBNP in the emergency diagnosis of heart failure. Heart 91: 606-12.
109. Mukoyama, M., Nakao, K., Hosoda, K., Suga, S., Saito, Y., Ogawa, Y., Shirakami, G.,
110. Nakagawa, O., Ogawa, Y., Itoh, H., Suga, S., Komatsu, Y., Kishimoto, I., Nishino, K.,
111. Nussenzveig, D. R., Lewicki, J. A. & Maack, T. 1990. Cellular mechanisms of theclearance function of type С receptors of atrial natriuretic factor. J Biol Chem 265: 20952-8.
112. Ogawa, Y., Itoh, H., Tamura, N., Suga, S., Yoshimasa, Т., Uehira, M., Matsuda, S.,
113. Shiono, S., Nishimoto, H. & Nakao, K. 1994. Molecular cloning of the complementary DNA and gene that encode mouse brain natriuretic peptide and generation of transgenic mice that overexpress the brain natriuretic peptide gene. J Clin Invest 93: 1911-21.
114. Ogawa, Y., Nakao, K., Mukoyama, M., Hosoda, K., Shirakami, G., Arai, H., Saito, Y.,
115. Suga, S., Jougasaki, M. & Imura, H. 1991. Natriuretic peptides as cardiac hormones in normotensive and spontaneously hypertensive rats. The ventricle is a major site of synthesis and secretion of brain natriuretic peptide. С ire Res 69: 491-500.
116. Ogawa, Y., Tamura, N.; Chusho, H. & Nakao, K. 2001. Brain natriuretic peptide appearsto act locally as an antifibrotic factor in the heart. Con J Physiol Pharmacol 79: 723-9.
117. Okumura, K. Yasue, H., Fujii, H., Kugiyama, K., Matsuyama, K., Yoshimura, M.,
118. Oliver, P. M., Fox, J. E., Kim, R., Rockman, H. А., Клт, H. S., Reddick, R. L., Pandey,
119. K. N., Milgram, S. L., Smithies, O. & Maeda, N. 1997. Hypertension, cardiac hypertrophy, and sudden death in mice lacking natriuretic peptide receptor A. Proc Natl Acad Sci USA 94: 14730-5.
120. Omland, Т., Persson, A., Ng, L., O'Brien, R., Karlsson, Т., Herlitz, J., Hartford, M. &
121. Caidahl, K. 2002. N-terminal pro-B-type natriuretic peptide and long-term mortality in acute coronary syndromes. Circulation 106: 2913-8.
122. Ozaki, J., Shimizu, H., Hashimoto, Y., Itoh, H., Nakao, K. & Inui, K. 1999. Enzymaticinactivation of major circulating forms of atrial and brain natriuretic peptides. Eur J Pharmacol 370: 307-12.
123. Pankow, K., Wang, Y., Gembardt, F., Krause, E., Sun, X., Krause, G., Schultheiss, H. P.,
124. Siems, W. E. & Walther, T. 2007. Successive action of meprin A and neprilysin catabolizes B-type natriuretic peptide. Circ Res 101: 875-82.
125. Pemberton, С. J., Johnson, M. L., Yandle, T. G. & Espiner, E. A. 2000. Deconvolution analysis of cardiac natriuretic peptides during acute volume overload. Hypertension 36: 355-9.
126. Pemberton, C. J., Yandle, T. G., Charles, C. J., Rademaker, M. Т., Aitken, G. D. &
127. Espiner, E. A. 1997. Ovine brain natriuretic peptide in cardiac tissues and plasma: effects of cardiac hypertrophy and heart failure on tissue concentration and molecular forms. J Endocrinol 155: 541-50.
128. Pidgeon, G. В., Richards, A. M., Nicholls, M. G., Espiner, E. A., Yandle, T. G. &
129. Frampton, C. 1996. Differing metabolism and bioactivity of atrial and brain natriuretic peptides in essential hypertension. Hypertension 27: 906-13.
130. Pikkarainen, S., Tokola, H., Majalahti-Palviainen, Т., Kerkela, R., Hautala, N. Bhalla, S.
131. S., Charron, F., Nemer, M., Vuolteenaho, O. & Ruskoaho, H. 2003. GATA-4 is a nuclear mediator of mechanical stretch-activated hypertrophic program. J Biol Chem 278: 23807-16.
132. Porter, J. G., Arfsten, A., Palisi, Т., Scarborough, R. M., Lewicki, J. A. & Seilhamer, J. J.1989. Cloning of a cDNA encoding porcine brain natriuretic peptide. J Biol Chem 264: 6689-92.
133. Potter, L. R., Abbey-Hosch, S. & Dickey, D. M. 2006. Natriuretic peptides, theirreceptors, and cyclic guanosine monophosphate-dependent signaling functions. EndocrRev 27: 47-72.
134. Potter, L. R. & Hunter, T. 2001. Guanylyl cyclase-linked natriuretic peptide receptors:structure and regulation. J Biol Chem 276: 6057-60.
135. Rademaker, G. J. Pergantis, S. A., Blok-Tip, L. Langridge, J. I., Kleen, A. & Thomas
136. Oates, J. E. 1998. Mass spectrometric determination of the sites of O-glycan attachment with low picomolar sensitivity. Anal Biochem 257: 149-60.
137. Rademaker, M. Т., Charles, C. J., Kosoglou, Т., Protter, A. A., Espiner, E. A., Nicholls,
138. M. G. & Richards, A. M. 1997. Clearance receptors and endopeptidase: equal role in natriuretic peptide metabolism in heart failure. Am J Physiol 273: H2372-9.
139. Rosenkranz, A. C., Woods, R. L., Dusting, G. J. & Ritchie, R. H. 2003. Antihypertrophicactions of the natriuretic peptides in adult rat cardiomyocytes: importance of cyclic GMP. Cardiovasc Res 57: 515-22.
140. Rutten, J. H., Boomsma, F. & van den Meiracker, A. H. 2006. Higher renal extraction of
141. ANP compared with NT-proANP, BNP and NT-proBNP. Eur J Clin Invest 36: 514-5.
142. Sawada, Y., Inoue, M., Kanda, Т., Sakamaki, Т., Tanaka, S., Minamino, N., Nagai, R. &
143. Takeuchi, T. 1997. Co-elevation of brain natriuretic peptide and proprotein-processing endoprotease furin after myocardial infarction in rats. FEBS Lett 400: 177-82.
144. Scarborough, R. M., Schenk, D. В., McEnroe, G. A., Arfsten, A. Kang, L. L., Schwartz,
145. K. & Lewicki, J. A. 1986. Truncated atrial natriuretic peptide analogs. Comparison between receptor binding and stimulation of cyclic GMP accumulation in cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 261: 129604.
146. Schagger, H. & von Jagow, G. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal BiochetJ2 166: 368-79.
147. Schellenberger, U., O'Rear, J., Guzzetta, A., Jue, R. A., Protter, A. A. & Pollitt, N. S.2006. The precursor to B-type natriuretic peptide is an O-linked glycoprotein. Arch Biochem Biophys 451: 160-6.
148. Schiller, P. W., Maziak, L., Nguyen, Т. M., Godin, J., Garcia, R., De Lean, A. & Cantin,
149. M. 1985. Synthesis and biological activity of a linear fragment of the atrial natriuretic factor (ANF). Biochem Biophys Res Commiin 131: 1056-62.
150. Schirger, J. A., Heublein, D. M., Chen, H. H., Lisy, O., Jougasaki, M., Wennberg, P. W.
151. Burnett, J. C. Jr 1999. Presence of Dendroaspis natriuretic peptide-like immunoreactivity in human plasma and its increase during human heart failure. Mayo Clin Proc 74: 126-30.
152. Schoenfeld, J. R., Sehl, P., Quan, C., Burnier, J. P. & Lowe, D. G. 1995. Agonistselectivity for three species of natriuretic peptide receptor-A. Mol Pharmacol 47: 172-80.
153. Schoenfeld, J. R., Tom, J. Y. & Lowe, D. G. 1997. Mutations in B-type natriuretic peptide mediating receptor-A selectivity. FEBS Lett 414: 263-7.
154. Seferian, K. R., Tamm, N. N., Semenov, A. G., Mukharyamova, K. S., Tolstaya, A. A.,
155. Seidler, Т., Pemberton, C., Yandle, Т., Espiner, E., Nicholls, G. & Richards, M. 1999.
156. The amino terminal regions of proBNP and proANP oligomerise through leucine zipper-like coiled-coil motifs. Biochem Biophys Res Commun 255: 495-501.
157. Seilhamer, J. J., Arfsten, A., Miller, J. A., Lundquist, P., Scarborough, R. M., Lewicki, J.
158. A. & Porter, J. G. 1989. Human and canine gene homologs of porcine brain natriuretic peptide. Biochem Biophys Res Commun 165: 650-8.
159. Semenov, A. G., Postnikov, А. В., Tamm, N. N., Seferian, K. R., Karpova, N. S.,
160. Bloshchitsyna, M. N., Koshkina, E. V., Krasnoselsky, M. I., Serebryanaya, D. V. & Katrukha, A. G. 2009. Processing of pro-brain natriuretic peptide is suppressed by O-glycosylation in the region close to the cleavage site. Clin Chem 55: 489-98.
161. Shimekake, Y., Kawabata, Т., Nakamura, M. & Nagata, K. 1992. The role of the Cterminal region of rat brain natriuretic peptide in receptor selectivity. FEBS Lett 309: 185-9.
162. Shimizu, H., Masuta, К., Aono, K., Asada, H., Sasakura, K., Tamaki, M., Sugita, K. &
163. Yamada, K. 2002. Molecular forms of human brain natriuretic peptide in plasma. Clin Chim Acta 316: 129-35.
164. Shimizu, H., Masuta, K., Asada, H., Sugita, K. & Sairenji, T. 2003. Characterization ofmolecular forms of probrain natriuretic peptide in human plasma. Clin Chim Acta 334:233-9.
165. Song, D. L., Kohse, K. P. & Murad, F. 1988. Brain natriuretic factor. Augmentation ofcellular cyclic GMP, activation of particulate guanylate cyclase and receptor binding. FEBS Lett 232: 125-9.
166. Steg, P. G., Joubin, L., McCord, J;, Abraham, W. Т., Hollander, J. E., Omland, Т.,
167. Mentre, F., McCullough, P. A. & Maisel, A. S. 2005. B-type natriuretic peptide and echocardiography determination of ejection fraction in the diagnosis of congestive heart failure in patients with acute dyspnea. Chest 128: 21-9.
168. Stingo, A. J., Clavell, A. L., Heublein, D. M., Wei, С. M., Pittelkow, M. R. & Burnett, J.
169. C. Jr 1992. Presence of C-type natriuretic peptide in cultured human endothelial cells and plasma. Am J Physiol 263: H1318-21.
170. Sudoh, Т., Kangawa, K., Minamino, N. & Matsuo, H. 1988. A new natriuretic peptide inporcine brain. Nature 332: 78-81.
171. Sudoh, Т., Maekawa, K., Kojima, M., Minamino, N., Kangawa, K. & Matsuo, H. 1989.
172. Cloning and sequence analysis of cDNA encoding a precursor for human brain natriuretic peptide. Biochem Biophys Res Commun 159: 1427-34.
173. Sudoh, Т., Minamino, N., Kangawa, K. & Matsuo, H. 1990. C-type natriuretic peptide
174. CNP): a new member of natriuretic peptide family identified in porcine brain. Biochem Biophys Res Commun 168: 863-70.
175. Suga, S., Nakao, K., Hosoda, K., Mukoyama, M., Ogawa, Y., Shirakami, G., Arai, H.,
176. Saito, Y., Kambayashi, Y., Inouye, K. & et, a. 1. 1992. Receptor selectivity of natriuretic peptide family, atrial natriuretic peptide, brain natriuretic peptide, and C-type natriuretic peptide. Endocrinology 130: 229-39.
177. Takahashi, N., Saito, Y., Kuwahara, K., Harada, M., Kishimoto, I., Ogawa, Y.,
178. Talwar, S., Squire, I. В., Davies, J. E., Barnett, D. B. & Ng, L. L. 1999. Plasma Nterminal pro-brain natriuretic peptide and the ECG in the assessment of left-ventricular systolic dysfunction in a high risk population. Eur Heart J 20: 173644.
179. Tamura, N., Ogawa, Y., Chusho, H., Nakamura, K., Nakao, K., Suda, M., Kasahara, M.,
180. Hashimoto, R., Katsuura, G., Mukoyama, M., Itoh, H., Saito, Y., Tanaka, I., Otani, H. & Katsuki, M. 2000. Cardiac fibrosis in mice lacking brain natriureticpeptide. Proc Natl Acad Sci USA 97: 4239-44.
181. Tateyama, H., Hino, J., Minamino, N., Kangawa, K., Minamino, Т., Sakai, K., Ogihara,
182. T. & Matsuo, H. 1992. Concentrations and molecular forms of human brain natriuretic peptide in plasma. Biochem Biophys Res Commun 185: 760-7.
183. Thuerauf, D. J. & Glembotski, С. C. 1997. Differential effects of protein kinase C, Ras,and Raf-1 kinase on the induction of the cardiac B-type natriuretic peptide gene through a critical promoter-proximal M-CAT element. J Biol Chem 272: 7464-72.
184. Thuerauf, D. J., Hanford, D. S. & Glembotski, С. C. 1994. Regulation of rat brainnatriuretic peptide transcription. A potential role for GATA-related transcription factors in myocardial cell gene expression. J Biol Chem 269: 17772-5.
185. Togashi, K., Fujita, S. & Kawakami, M. 1992. Presence of brain natriuretic peptide inurine. Clin Chem 38: 322-3.
186. Togashi, K., Hirata, Y., Ando, K., Takei, Y., Kawakami, M. & Marumo, F. 1989. Brainnatriuretic peptide-like immunoreactivity is present in human plasma. FEBS Lett 250: 235-7.
187. Troughton, R. W., Frampton, С. M., Yandle, T. G., Espiner, E. A., Nicholls, M. G. &
188. Richards, A. M. 2000. Treatment of heart failure guided by plasma aminoterminal brain natriuretic peptide (N-BNP) concentrations. Lancet 355: 1126-30.
189. Structure of the dimerized hormone-binding domain of a guanylyl-cyclase-coupled receptor. Nature 406: 101-4.
190. Vanneste, Y., Pauwels, S., Lambotte, L. & Deschodt-Lanckman, M. 1990. In vivometabolism of brain natriuretic peptide in the rat involves endopeptidase 24.11 and angiotensin converting enzyme. Biochem Biophys Res Соттип \1Ъ: 265-71.
191. Varki, A., Cummings, RD., Esko, JD., Freez, HH., Hart, GW. & Etzler, ME. 2008.
192. Essentials of glycobiology. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
193. Vogt-Schaden, M., Gagelmann, M., Hock, D., Herbst, F. & Forssmann, W. G. 1989.
194. Degradation of porcine brain natriuretic peptide (pBNP-26) by endoprotease-24.11 from kidney cortical membranes. Biochem Biophys Res Commun 161: 1177-83.
195. Watanabe, Т. X., Noda, Y., Chino, N., Nishiuchi, Y., Kimura, Т., Sakakibara, S. & Imai,
196. M. 1988. Structure-activity relationships of alpha-human atrial natriuretic peptide. Eur J Pharmacol 147: 49-57.
197. Watanabe, Y., Nakajima, K., Shimamori, Y. & Fujimoto, Y. 1997. Comparison of thehydrolysis of the three types of natriuretic peptides by human kidney neutral endopeptidase 24.11. Biochem Mol Med 61: 47-51.
198. Wilson, E. M. & Сhinkers, M. 1995. Identification of sequences mediating guanylylcyclase dimerization. Biochemistry 34: 4696-701.
199. Wright, S. P., Doughty, R. N., Pearl, A., Gamble, G. D., Whalley, G. A., Walsh, H. J.,
200. Gordon, G., Bagg, W., Oxenham, H., Yandle, Т., Richards, M. & Sharpe, N. 2003. Plasma amino-terminal pro-brain natriuretic peptide and accuracy of heart-failure diagnosis in primary care: a randomized, controlled trial. J Am Coll Cardiol 42: 1793-800.
201. Wu, C., Wu, F., Pan, J., Morser, J. & Wu, Q. 2003. Furin-mediated processing of Pro-Ctype natriuretic peptide. J Biol Chem 278:25847-52.
202. Yamamoto, K., Burnett, J. C. Jr, Jougasaki, M., Nishimura, R. A., Bailey, K. R., Saito,
203. Y., Nakao, K. & Redfield, M. M. 1996. Superiority of brain natriuretic peptide as a hormonal marker of ventricular systolic and diastolic dysfunction and ventricular hypertrophy. Hypertension 28: 988-94.
204. Yan, W., Sheng, N., Seto, M., Morser, J. & Wu, Q. 1999. Corin, a mosaic transmembrane serine protease encoded by a novel cDNA from human heart. J1. Biol Chem 274: 14926-35.
205. Yan, W., Wu, F., Morser, J. & Wu, Q. 2000. Corin, a transmembrane cardiac serineprotease, acts as a pro-atrial natriuretic peptide-converting enzyme. Proc Natl AcadSci USA 97: 8525-9.
206. Yandle, Т., Fisher, S., Espiner, E., Richards, M. & Nicholls, G. 1999. Validatingaminoterminal BNP assays: a word of caution. Lancet 353: 1068-9.
207. Yasue. H., Yoshimura, M., Sumida, H., Kikuta, K., Kugiyama, K., Jougasaki, M.,
208. Виноградов, А.А. и Ямсков, ИА. 1998. Дегликозилирование гликопротеинов.
209. Биоорганическая химия. 24: 803-815.
210. Остерман JI.A. 1985. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Москва: Наука.
-
Сеферян, Карина Рубеновна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2010
-
ВАК 03.01.04
- Биохимические и иммунохимические свойства натрийуретического пептида В-типа и его предшественника
- Влияние гликозилирования на процессинг предшественника натрийуретического пептида B-типа человека
- Поиск на основании структурных аналогий опиатоподобных пептидов из нерегуляторных белков
- Влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на метаболизм белков и нуклеиновых кислот у насекомых
- Влияние синтетического регуляторного пептида селанк на экспрессию генов в мозге и селезёнке
