Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск на основании структурных аналогий опиатоподобных пептидов из нерегуляторных белков

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Поиск на основании структурных аналогий опиатоподобных пептидов из нерегуляторных белков"

Р Г Б ОЙ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ имени И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК. 577.112.6 : 612.017.1

ШЕСТАК Клавдия Ивановна

ПОИСК НА ОСНОВАНИИ СТРУКТУРНЫХ АНАЛОГИЙ ОПИАТОПОДОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ НЕРЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ

Специальность: 03,00,04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1995

Работа выполнена в лаборатории сравнительной биохимш нервной системы Института эволюционной физиологии и биохи мии им. И. М. Сеченова Российской Академии наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Е. П. Харченко

Официальные оппоненты:

профессор, доктор биологических наук С. Н. Лызлова профессор, доктор биологических наук В. П. Комов

Ведущее учреждение: Московский государственный универ ситет им. М. В. Ломоносова

Jaщитa диссертации состоится „ 1995 год;

___часов на заседании специализированного совета К 002.89.0:

при Институте эволюционной физиологии и биохимш им. И. М. Сеченова РАН по адресу: 194233, Санкт-Петербург пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан ,,

.1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Л. В. Зуева

• ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

---------Актуальность, темы. Ошоидные пептиды (ОП) представляют собой

наиболее шгагочисленную группу нейропептидов:~открытггуже-десятки- ■-----------

эндогенных (знкефэлшл, ондорфины, динорфины, дерморфины, дель- ..торчим) и экзогенных (казоморфины, экзорфины) ОП, синтезированы • тысячи их аналогов. Количество публикаций по ОП не уменьшается, что обусловлено участием ОП в регуляции важнейших функций организма. Основным источником ОП в организме являются их предшественники, содержание в своей последовательности целый набор разнообразных ОП. Вместе с тем в литературе накапливается все больше данных о наличии регуляторных пептидов (РП), в том числе и ОП, в белках с самими различными функциями. Уже достаточно подкреплены экспериментальными результатами теоретические положения о возможности образования РП из белков, не являющихся их традиционными .предшественниками ( Чипенс, 1983, • Carraway, Reinecke, 1984, Янковский, 1985, Харченко, 1988).

Биологически активные фрагменты различных белков обнаружены ' преимущественно при энзиматическом переваривании белковых молекул in vitro. Благодаря же увеличению числа белков с установленной первичной структурой и создании их банков данных перспективным направлением поиска РП становится в последние годы сравнительный анализ последовательностей белков с. целью выявления в них гомологичных РП фрагментов, потенциально способных выполнять функцию биорегуляторов. Интересным аспектом в изучении структурно -функциональных соотношений РП является конструирование и анализ свойств химерных пептидов, включающих в себя разные РП и тем самым обладающих новой комбинацией свойств.

Поскольку экксфалины и дерморфины имеют простую структуру, на основе которой были получены многочисленные; синтетические огшоидные агочисты, мы предположили, что сходные с ними по структуре пептидные фрагменты в нерегуляторных белках могли бы обладать ошюидной активностьч. Возможно, такие опиатоподобные фрагменты модулируют разнообразные функции в организме при интенсивном протеолизе белков, сопровождающем многие патологические и некоторые физиологические состояния.

Поиск новых опиатоподобных пептидов в последовательностях белков представляет не только теоретическое, но и практическое значение в связи с тем, что природные пептиды более "совместимы" с организмом и полностью метаболизируют в отличие от искусственно созданных последовательностей, и поэтому перспективны для 'терапевтических целей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования

являлся поиск в последовательностях белков пептидных фрагментов, сходных либо' отличающихся по структуре с ОП энкефалинами и дерморфином, и создание на основе этих фрагментов новых

высокоактивных опиатоподобных пептидов, а также конструирование химерного пептида, в последовательности которого сочетались бы структуры разных пептидов-анальгетиков.

Для достижения атой цели были поставлена следующие конкретные задачи;

1. Провести целенаправленный поиск опиатоподобных последовательностей в нерегулягорннх белках с известной первичной структурой, отобрать часть выявленных пептидных фрагментов для их синтеза, а также создать новый химерный пептид, который включал бы в себя разные классы пептидов-анальгетиков.

2. Исследовать анальгетическую и опиоидную активность синтезированных пептидных фрагментов белков и химерного пептида по биохимическим и фармакологическим тестам и получить на их основе высокоактивные аналоги.

Научная новизна работы. Впервые проведен сравнительный ана-

_ лиз аминокислотных последовательностей нерегуляторных белков '(свыше 500 белков) для выявления в их составе пептидных фрагментов с опиатрподобной структурой. Показано, что в исследованных последовательностях белков встречаются как пептида, сходные по расположению тирозина в 1-й и фенилаланина в 3-й позициях с известным природным 0П дерморфином, так и пептида энкефалинового типа с тирозином в 1-й и фенклаланином в 4-й позициях.

Впервые выявлена налоксон-обратимая анальгетическая активность синтезированных пептидных фрагментов из каша-легкой цепи иммуноглобулина кролика, тяжелой цепи миозина и актина кролика, . гормона роста человека.

Впервые обнаружена налоксон-обратимая анальгетическая активность для пептидов неэнкефалинового типа из основного миелинового белка и проанкефалина В.

Получены высокоактивные аналоги исследованных наш каппорфи-на и гисторфина путем введения В-аминскислот во 2-ю позицию и амидированием С-концевой аминокислоты пептидов, по анальгетичес-кой активности не уступающие мощному природному пептиду дерморфину.

Впервые предложен п исследован новый химерный пептид, состояний из двух нейропептвдов-знальгеткков: лей-энкефалпна и пентанейротензина. По фармакологическим тестам и радиорецепторно-му анализу выявлено доминирование нейротензинсБой компоненты в химерном пептиде.

Установлено, сродство и селективность изученных пептидов к ц-6- и *-опиоидным рецепторам головного мозга крыс.

Показано ингибирующее влияние отдельных пептидов (каппорфи-на, миелорфина, аналогов каппорф1ша и гисторфина) на активность . аденилатциклазы стриатума мозга крыс.

Научно-практическая значимость работы. Проведенный целена-

5

о

правленный поиск опиатоподобных пептидных фрагментов в последова-тельностях__ нерегуляторных белков показывает перспективность данного подхода "для ойнаружения новых_-опиатоподобных пептидов.

Создание высокоактивных аналогов изученных пептидов "каппор-----------------

фина и гисторфина позволяет рассматривать последовательность Туг-Х-РЬеЧПуЧЛу как основу для создания более мощных -0П.

Конструирование и анализ свойств химерного пептида может способствовать получению новых опиатоподобных пептидов с заданной комбинацией свойств, а также более полному пониманию структурно-функциональных соотношений таких многокомпонентных пептидов каки- V ми являются ОП ендорфины и динорфины.

Модифицированный наш механический тест определения аналь-гетической активности может быть рекомендован лабораториям,;; занимающимся исследованиями анальгетических веществ.

На защиту диссертант выносит следующие основные положения:

1. В различных нерегуляторных 'белках обнаружены пентапептиды, имеющие сходство по расположению тирозина в 1-й и фенилаланина в 3-й позициях с ОП дерморфином.

2. Впервые установлена налоксон-обратимая анальгетическая активность для синтезированных пептидных фрагментов белков (каппа-легкой цепи иммуноглобулина кролика, тяжелой цепи миозина и . актина кролика, гормона роста человека), имеющих структурнае •

сходство с дерморфином, а такке пептидов не энкефалилового типа из основного миелинового белка и интерэнкефалина В.

3. Охарактеризована ошкждная активность некоторых пептидов по конкурентному вытеснению ими меченых селективных опиоидных агонистов на мембранах головного мозга крыс и по влиянию их на активность аденилатциклазы стриатума мозга крыс.

А. Получены высокоактивные аналоги пептидов каппорфина и гистор-

фина, обладающие налоксон-обратимой активностью в 10 - -10 раз большей, чем лей-энкефалин. Определено сродство и селективность аналогов каппорфина и гисторфина к откидным рецепторам головного мозга крыс и влияние их. на активность аденилатциклазы стриатума • мозга крыс. ' ' '

5. Сконструирован химерный пептид иефбин, состоящий из.лей-внке-фалина и пентанейротензинз, для получения опиатоподобного пептида с новой комбинацией свойств и изучения структурно-функциональных соотношений многокомпонентных регуляторных пептидов.

Работа выполнена на дополнительные финансирования Президиума АН СССР, распоряжение N 951 от 30.10.8? г. и N 123 от 12.04.88 г.

Получено удостоверение на рацпредложение "Устройство для измерения уровня болевого порога у животных при воздействии опиоидных веществ", N 662 (7) от 10.01.1987 г. (совместно с Т.В.Соколовой и А.П.Новокрещеновым). . -.

Публикации.По теме диссертации опубликовано 8 научных-работ.

Ад2обация_работн. Материалы диссертации были доложены на VII

Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов, октябрь 1937 г. Таллинн; на Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки", сентябрь 1939 г. Суздаль; на заседании лаборатории сравнительной биохимии нервной системы ИЭФБ им.И.М.Сеченова РАН (декабрь 1990 г); на заседании межлабораторного совещания ИЭФБ им.И.М.Сеченова РАН (январь 1994 г).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждеря, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ¿^страницах машинописного.. . текста, содержит (а таблицы и Л ¿'рисунков. Список включает 2.35" источников, из них НЯ отечественных. .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Поиск и синтез пептидных фрагментов из различных белков.

Сравнительный анализ последовательностей белков проводили на ЭВМ класса СМ-4. Ввод аминокислотных последовательностей белков и поиск совпадающих фрагментов белков осуществляли с помощью комплекса программ, составленных ст.н.с. ИЭФБ им.И.М.Сеченова РАН Левченко В.Ф. Программы реализованы на языке ФОРТРАН (Харченко и соавт., 1988).

Большинство пептидов было синтезировано сотрудниками кафедры природных соединений Петербургского Университета ст.н.с., В.Н.Ка-лихевичем и н.с. З.А.Ардемасовой. Пептид интерэнкефалин В синтезирован ст.н.с. той же кафедры Е.И.Сорочинской, а пептид гистор-фин и миелорфин - д.х.н. О.А.Кауровым из Института особо чистых биопрепаратов.

Объекты_исследования. В работе использовали белых беспородных мышей, весом 16-20 г (самцов) и крыс линии Вистар, весом 180-200 г (самцов).

Анальгетическую_активность синтезированных пептидов оценива-_ _ ^

ли по механическому тесту (тест "прижатия хвоста") и по термическому тесту (тест "горячая пластина") на белых беспородных мышах. При интерацистернальном введении иеследовзли действие пептидов в дозах от 100 до 0,001 нмоль/на мышь, при"внутрибршшшом, подкожном и внутривенном введении мышам - в дозах 0,1- 0,5 мг/на мышь.

■ По механическому тесту количественно определяли значение бо- ■ левого порога. Каждую дозу вводимого пептида исследовали . на груше не.менее', чем из 10 мышей. Сначала у опытных и контрольных мышей определяли значение болевого порога, затем интрацистерналь-

но мтсрошприцом контролышм шшам ввода» 5 шд физиологического раствора, а опытным мышам - 5 мкл раствора пептида соответствующей концентрации^Спустя'"5,~ 10, 29, 30 мин и потом через каждые _ 30 мин до исчезновения анальгетического эффекта пептида определяли значения болевого порога в граммах. Статистическое сравнение в кона-рольной и опытной группах мклей проводили не по "абсолютным значениям выявленных у них болевых порогов, а по разностям между значениями болевого порога до и noose инъекции физиологического раствора и пептида, соответственно. По тесту "горячая пластина" -• определяли длительность латентного периода от момента помещения * мыши на горячую пластину (SO С) до реакция на температуру (Clinesomidt et al., 1979).

Ректальную температуру тела мышей дзыаряш с помощью

полупроводникового микросопротивления МГ-54.

?§М2Р®Ц§01'9ЕЩй_анализ новых синтезированных пептидов проводили на основе конкурентного ингибирования ши связывания меченых селективных лигандов с опиондныш рецепторами (0Ü)-. В качестве источника ОР использовали препарат лиофилизированных мембран головного мозга крыс, полученный как описано в работе ' (Зайцев и соавт., 1984). Исследование опиоидаой активности синте- . зированшх пептидов проводили при температуре 25 и 0 в.среде 5GmM трис, pH 7,4, в присутствии ингибитора пептида бацитрацина (30 мкМ). Бремя инкубации - 40 - 60 мин. Разделение свободного и ■ связанного меченых лиг&ндов проводили вакуумным фильтрованием через стеклянные фильтры фирмы "Whatman" (Англия). За величину . специфического связывания (В ) принимали разницу между величинами связывания меченого лиганда в отсутствии и присутствии I мкМ немеченого лиганда. Из кривых вытеснения меченых лигандов исследуемыми пептидами вычислялась IC^q - концентрация, при которой

связывание меченого лиганда с ОР подавлялось на 50%. В работе использовали меченые тритием опиоидные лиганда: ц-лиганда. -

О А »

налоксон ("Amersham", Англия), (D-Ala -N-Me-Phe -С1у-о1)-энкефа-лин (DAGO), (Институт молекулярной генетики РАН), 5-лиганд -

л г

(D-Ala - D-Leu )-внкефалиа (DADLE) ( "Amersham", Англия), ге-ли-ганд - етилкетоциклазоцин (ЭКЦ) ("New England Nuclear", Англия).

Влияние синтезированных пептидов на активность аденилатцик-

лазы (АЦ) стриатума мозга крыс изучали как описано в работе (Law et al., 1979) с некоторыми модификациями. В опытах с использованием [14С]-АТФ образовавшуюся в ходе реакции [1<1С]-цАМФ выделяли на колонках с Dowex 50У/х8 смолой по методу (Krishna et äl.,I968).

В опытах с использованием [32Р]-АТФ количество образовавшейся -

а

32 :

[ Р]-цАМФ определяли на колонках с окисью алюминия ("Неапя1",

Венгрия) как описано в работе (Авдонин и соавт., 1980).

в мембранных фракциях определяли с

помощью Кумасси С-250 по методу (Ьоув'Ьай, Кги^ез, 1932).

Статистические различия полученных данных оцешшали до

t-кpитepию Стьюдента (Урбах, 1975).

• РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ.ОБСУЖДЕНИЕ. Поиск опиатоподобных пептидных фрагментов в последовательностях нерегуляторжх белков.

В результате проведенного с помощью ЭВМ анализа первичных структур свыше 500 белков было обнаружено, что приблизительно 10% исследованных белков содержат пентапептиды, сходные по расположению ароматических аминокислот тирозина в 1-й и фенилаланина в 3-й позициях с известными ОП дерморфином Туг-Б-А1а-РЬе-С1у-Туг-Рго-Бег-ЦН^ и р-казоморфином Туг-Рго-Р11е-Рго-С1у. В последовательностях исследованных белков выявлены также пептидные фрагменты, имеющие сходство с енкефалинами по расположению тирозина в 1-й и фенилаланина в 4-й позициях, и фрагменты, начинающиеся с фенилаланина и тирозином в 3-й позиции. В работе были исследованы пентапептиды, имеющие структурное сходство с дерморфином и казоморфином (табл.1, N 1-6 ).

Дополнительно изучены пептиды неэнкефалинового типа. Одним из факторов, свидетельствующим о возможном существовании неэнке-фалиновых ОП, является наличие в 0Р анионного центра (Майский, Юхананов, 1985). Мы предположили, что пептиды, содержащие основные.. аминокислоты аргинин и лизин, могли бы взаимодействовать с'0Р и обратились к самим предшественникам ОП, в которых ОП перемежаются с фрагментами, фланкированными'с обеих сторон дипептидами из аргинина и лизина (!&игпег, 1986). Синтезированный фрагмент провнкефалина В - А^-А^-Ип-РЬе-Ьув (поз. 233-237), назван нами интерэнкефэлином В (табл.1).

Второй изученный в работе пептид неэнкефалинового типа - пептид РЬё-Иу-Туг-ИуЧПу из основного югелшювого белка человека (поз. 125-129), названный нами миелор$ином. Предпосылкой для изучения анальгетической активности миелорфина служили данные гго иммунохимическому анализу распределения р-вндорфина в нервной системе. Перекрестную иммунореактивность к моноспецифическим антисывороткам, дифференцирующим энкефалиновые пентапептиды разных эндорфинов, проявляли миелинизированные структуры мозга и, в частности, основной миелиновый белок (Блюм и соавт, 1981). В первичной структуре основного миелинового белка человека (Во^в,

Таблица I. Синтезированные пептидные фрагменты из последовательностей белков и их аналоги.

N Последовательность пептидов

Источник пептида и его Название

позиция в белке пептида

1. Tyr-Ser-Phe-

2. Tyr-Lys-Phe-

3. 'Туг-Ser-Phe-

4. Туг-Ser-Phe-

■Gly-Gly

Gly-His

Leu-Gin Val-Thr

5. Tyr-Asn-Phe-Ala-Yal

6. Tyr-Ser-Phe-

7. Phe-Gly-Tyr-

■Ser-Leu Gly-Gly

8» Arg-Arg-Phe-Ala-Glu

Каппа-легкая цепь иммуноглобулина кролика (98-102) Миозин кролика (тяжелая цепь) (117-121, 173-177) Гормон роста человека (42-46) Актин скелетной мышцы кролика (198-202)

ПротеаЕсдд мозга человека (262-266)

Овальбумин (93-102) Основной миелиновый белок человека (125-129) Проэнкефалин В (233-237)

Каппорфин

Tyr-Ser-Phe-Gly-Gly

Tyr-D-Ser-Phe-Gly-Gly Tyr-Ser-Phe-Gly-Gly-NHg

Tyr-D-Ser-Phe-Gly-Gly-NHg

Аналоги пептидов

Каппа-цепь

иммуноглобулина кролика (98-102)

Миелорфин

Интерэнке-фалин 5

Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly Гистон Н4 Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Gly (98-102) Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Gly-NHg

Phe-Gly-Tyr-Gly-Gly Основной мие-Phe-D-Ala-Tyr-GIy-Gly линовый белок Phe-Gly-Tyr-Gly-D-Ala (125-129) Phe-D-Ala-Tyr-Gly-Gly-NHg

Phe-Gly-Tyr-Gly-D-Ala-IiHg

о Каппорфин - D-Serc- каппорфин NHL- каппорфин 2 5

D-Ser -NHg - каппорфин

2 Гисторфин DgAla сгистофрин D-Ala -Ш^-гистофрин

2 Миелорфин D-Alaí- миелорфин DgAlac- миелорфин D-Ala -NHg- миелорфин

D-Ala5- ffifj - миелорфин

Туг-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu - Химерный пептид-Иэфбин Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu Нейротензин (9-13) Пентанейротензин Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu Лей-энкефалин

х0пиоидная активность гисторфинз впервые показана в опытах in vitro на подвздошной кишке морской свинки (Харченко, Багров, 1986)

МоБсаге11о,1978) нами была обнаружена лишь единственная "опиато-подобная" последовательность Р1ге-С1у-Туг-С1у-С1у, которая имеет инверсию тирозина и фенилаланина в 1-й и 3-й позициях (табл.1).

Пептида с тирозином в 1-й к фенилаланином в 3-й позициях.

Проведенный скрининг синтезированных пептидных фрагментов белков с тирозиноы в 1-й и фенилалнином в 3-й позициях на анальгетическую активность по фармакологическим тестам показал, что пептиды Туг-ЬуБ-РЬе-йу-Мв из тяжелой цепи миозина кролика, Туг-Бег-РЬе-Ьеи-СХп из гормона роста человека, Туг-Еег-РЬе-УаЬ-Пгг из актина скелетной мышцы кролика и Туг-Бег-Р11е-С1у-С1у из каппа-легкой цепи иммуноглобулина кролика проявляли налоксон-абратштра анальгетическую активность при интрацистернальном их введении мышам в дозе 10 нмоль/на мышь по механическому : зсту. Еаппорфин !Еуг-5ег-Р1ге-С1у-01у, проявлявший наибольшую анальгетическую активность среда тестированных пептидов, был использован для дальнейшей характеристики его опиоидной активности и для создания на его основе новых высокоактивных структурных аналогов.

Анальгетическое действие каппорфина зависело от вводимой дозы (0,5-100 тюль/на шшь) (рис.1). При дозе 10 нмоль/на мышь

й 800

<в 6

. §-600

о

ё

ё 400

■о

I 200

К ' «в

га

8 О

Рис.1. 1нальгетические эффекты каппорфина. Изменение болевого

порога в (г) из механическому тесту через 5 мин после штрзцас-тернального введения гешаа: К -5 мкл физиологического раствора, I - 10 нмоль, 2 - 100 ншеь -Еей-эшефалина; 3 - 0,5 нмоль, 4 - 0,75 нмоль, 5-1 нмоль, б - 10 июль, 1 - 100 нмоль каппорфина, 8 -10 нмоль каппорфина + налоксок (2 ыг/кг), * - р<0,05, ** - р<0,Ш, *** - р<0,001 (по критерию Стыщента).

* : у т.. I» т п »* I * »* ... А т 1 *

к 1 а 345 678

хчгсофалкнз.

ЯЙЛСКСОВ,

ТТгП-1:;"

,-i л»"-" У"---1

хал Л

.МО 5 4 У

.т:...7 ^/брл^ишо б дезе 2 мг/кг за 15 минут до

- досч,оБ!?сно--икги<'ировал-ана.пьгетичеекое-явй--

что

цетельетзует о реализации его эф-0? "¿.о^о.т^те^-иоеть действий кзтшог/Ji'Hü была

к:к и з с. ту"-.? -йттге^ч.лттна.

•vf>10 е-тсль/нз r-i-iaib снижал температуру тела 4J С (р\0,01) через 20 лашут после теките

Fa^vlopoI^CiiiCpiüi.* KcirUu.^'^lilä ПО KCKK/P'

ингибпровэнию ¡.'.счетах селективных лигэндов DAGO ([i-лигэнд) и

|{Ли|,и' m-i>Mi<vHii t и .mi t i nrt MeMOucrnäX roJiobüCiO Ц03Г£

iGi'O -iL^ä:; Л^ГГTTn w^^rj—

—о —5 с

неюгя им эти лиггидов при концентрации 10 и 10 М ни при 25

С, ни при О' С в присутствии ингибиторов пептидаз бациграцкна и

каптоприла.

При исследовании валяния пептидов на активность АД избран _стриатума крыс было показано, что кашюрфин уже при концентрациях '1-10 нк.Ч проявлял ингибирущее действие на активность АД стриату-ма крыс в среднем на 18-245 (рис. 2). По сравнению с лей-

I I 1-PMPVHJ1 I

КрЫС Б у Ci/iC'bil л д. у-

100 г

д 80 [ —' ! % ' ßO г

■10

о

в

3

РЧ

о р.

$ ¿0

« i

JL

V / ' /\

-i

А

Г/ А

/■'а Y// Ъ',

10 5

i_iJ_L

1 5

v/A Y// '

v//

Уа

У,

т

У/А

М

1 5 5 mü.

(-

1: I.--:: ■ ■• • г „/л--: (Ii, ./Г-Л-'.га (II) И Л&Й-5Н-') г.и и >••? (АЦ) страатума крыс.

Пу осилилииаг -öK-iiieHocife АЦ s 3. 5а 100 % прлаяга акгяьность АЦ ; ,?• :::: .:■./):п-3). По оеи абси^сс - концентрация

Г':;;.^': -- из:.",еноиие .'ikthekocth. АД в

присутствии пептида и 10 4 М наликсопа. * - р<0,05, **- р<0,01, *** - р<0,001 (по критерию Стьюдента).

г *

1

внкефалином, параллельно исследованным в каждой серии опытов, каппорфин в меньшей степени ингибировал активность АД стриатума крыс. Ингибирование АЦ, вызываемое каппорфином и лей-энкефалином, полностью блокировалось ингибитором ОР налоксоном при концентрации 10" М (рис. 2). Сходные результаты по ингибированию каппорфином активности АЦ мембран стриатума крыс получены и в опытах с 32

использованием [ Р]-АТФ.

Таким образом, среди синтезированных пептидных фрагментов белков наибольшую анальгетическую активность при центральном введении проявлял пептид Туг-Бег-РЬе-Иу-СХу из каппа-легкой цепи иммуноглобулина кролика. Индуцируемая каппорфином анальгезия блокировалась антагонистом ОР налоксоном. Отсутствие специфического связывания каппорфина с ОР головного мозга крыс предполагает возможность взаимодействия его с иными центра™ связывания в ОП рецепторе, отличными от центров связывания |1- б- и ае-рецепторов, тшбо модулирующего его действие на систему огаюидных пептидов. Каппорфин налоксон-обратимым способом ингибировал активность АЦ стриатума крыс, т.е. его анальгетическое действие опосредовано через ОР .

Пептиды, принципиально отличающихся по первичной структуре от энкефалинов.

Пептиды неэнкефалинового типа интерэнкефалин В и миелорфин при интрацистернальном введении мышам по механическому тесту-проявля-ли четко выраженную анальгезию, которая блокировалась предварительно введенным налоксоном. Анальгетическая активность миелорфи-на и интерэнкефалина В превосходила примерно в 2 раза анальгетическую активность лей-энкефалина при дозе 10 нмоль/на мышь. Интерэнкефалин В обладал более длительным анальгетическим дейдт-вием по сравнению с лей-енкефалином и миелорфином, а также вызывал налоксон-обратимую анальгезию по тесту "горячая пластина". Миелорфин обладал гипотершческим действием, снижая температуру тела мышей в среднем на 2,8 С (р<0,05).

По данным радиорецепторного анализа интерэнкефалин В не вы-3 3

теснял меченые лиганды [ Н]-ВАС0 и [ Н]-БАБЬЕ из мест их специфического связывания на мембранах головного мозга крыс. Миелорфин же обладал опиоидной активностью, ингибируя специфическое связывание меченых лигандов с ОР головного мозга крыс как Ц-, так и

о

6-типа, причем сильнее вытеснял ^.-селективный лиганд [ Н]-ВА00. Из значений 1СсП » вычисленных по кривым вытеснения миелорфином 3 3

[ Н]-БАС0 и [ Н.]-ВАБ1|Е, следует, что сродство к (1-ОР на два порядка больше, чем к б-ОР, т.е. миелорфин проявляет четко выраженную специфичность к ц-ОР (табл.2).

Исследования по елияейю миелорфина на активность АЦ стриатума крыс показала, ччо миелорфин при концентрации I мкМ вызывал сни-

Таб.ица 2. Значения Ю^ исследуемых пептидов.по вытеснению ими меченых лигандов на мембранах головного мозга крыс.

Пептиды Значения 1С 50 M»X

o O

[ Н]—DAGO [ H]-DADLE

|А-лигаяд 5-лиганд

Лей-энкефалин 4,5*I0~7 7,5*I0~9 0,017

Иэфбин I,8*I0~6 5,0*I0~8 0,028

•Ш~-каппорфин 2,3*I0~6 2,6*I0~7 ' 0,11

2 D-Ser -каппорфин 1,8*10"® I,3*I0~8 0,72

0 с D-Ser -Шк-каппорфин 3,8*ПГ9 I,8*I0"8 4,7

с. Гисторфин 5,3*I0_7 4,0*I0~6 7,5

2 D-Ala гисторфин 5,0*I0~8 2,8*10"''' 5,6

2 5 D-Ala -ШК-гисторфин 2,8*I0-10 2,4*I0~9 8,6

с Миелофин. 2,8*I0~8 -6 2,0*10 0 71,4

? D-Ala -миелорфин 2,2*I0"7 4,7*I0~7 ' 2,1

2 5 D-Ala -NHg'-миелорфин 6,3*I0~9 1,3*10"' 20,6

DADLE - 3,4*I0"9

DAGO 2,4*I0-10

-конкурентное ингибирование пептидами связывания меченых лигандов с препаратом лиофилизированных мембран головного мозга крыс проводили при 25 в 50 мМ трис буфере, рН 7,4. Концентрация радиолигандов составляла 1,3 нМ для [ НJ-DAG0 и 1,7 нМ для [Н]-DADLE.

жение активности АЦ в среднем на 41% (р<0,01), а при концентрации 5 мкМ - в среднем на 33% (р<0,05) (рис.2).

Таким образом, результаты поиска новых, принципиально отлич- -ных от энкефалинов опиатоподобных пептидов, привели к выявлению

таких пептидов какинтер;.-;-.;-:-: Б кр. '.■••-•• :а. л.-а Б и

ыкелор«£лча из основного млелллоього б^лк'ч ч^те-чсч.

Вксокоактпг.ныо аналоги отгзгоиодобгт пептидов | П1са;о^т1а и миелорфпна.

Для получения более стабильных и Ьчсскооктлинлх опиатопэдоб-ных пептидов были синтезированы аналоги пептидов каппор^/на, гио-торфина и млелор£;ша путы.! структурных шдкфлкп'Ц'Л 2-Я и 5-й позиций пептидов и амидирования С-концевох'о глицина (табл.1).

Введение В-серкна б каппорфлн и О-глчшшз ь • глстор|;:а во вторую позицию в 1000 раз усиливает их аналы'-ллческув активность. Оба В-аналога пептидов проявляют 1*.грз?л,и:г/а г.иальгетичес-кую активность при дозе 0,01 нмоль/нз глиь. Д-.плпроаэнке не С-концевого глицина обоих аналогов с во второй

позиции увеличивало еще на порядок их гйггльность, т.е. они в 10000 раз активнее исходных пептидов. Анздг.гетичеекпй еффект отлх аналогов блокировался ингибитором 0Р налоксонсм, введенным внутрибрнплшю шоам в дозе 2 иг/кг за 15 ьжя до инъекции пептидов. Аналоги кашюрфина и гксторфкна в отличие от исходных пептидов проявляли анальгетический эффект и по тесту "горячая пластина" при дозе Ю- 0,1 нмоль/на м;:шь. При интраплстернальном введе-

шш В-Бег^-каппорфин и В-А1а^-гисторфин не уступали по активности

дерморфину при дозе 0,01 нмоль/на мышь, а В-Бег^-МН^-каппорфин и

В-А1а^-Нк|-гисторфин проявляли анальгезию и при дозе 0,001 нмоль/

на мыэь, что на порядок выше активности дерморфина.

В-А] а^~Кй^-гксторфин,. Б- Бег^-КН^-каппор-фин, как и дер?,юр£ин, при

дозе 0,01 емоль/нэ шшь достоверно сши&кИ тс;,и:-.-р-1туру тела мышей

на 3,5°, 2,1°и 4,4°С (р<0,001), соотботсПри системном

нъ'.-де.':нн (внутрл^рг й;;нно ) выраженный противоболевой эффект был

с гмеч-:к для В- 8ег"-1«С?-ка;глор1лкз л Б А1 з^ЧГ^-гл--:горбина в дозе **> ^

0,25 мл/на г*7-:г;ь и его .\:-.л".-\:у\? прллодллгл па ю мллуту. Аналоги •г- л.: !::• а г:о ф-ар\:аколо: лч^склм тееи.м не обладали столь высокой алальгг-:."ч--сло^ активность.-;, как глстор|ила и каглго^.-ла.

?8дх:-р*ц*г:торук2 аналлз показал, что аналоги в

■5

стллчле от к.':ППорф;тл'1 вытесняли меченые селективные ллгзнды [**Н]-

БАС0 л [^Н]-БАЗЬЕ из мест их специфического слязкьаклл с 0Р головного мозга крыс (рлс.З). Аналоги квшюр£лаа и гиеторфина обладали-' сродство;.: как к ¡1-,так и 6-0Р (табл.2). Отмечается

£

Рис.З. Кривые вытеснения меченых DAGO (1,3 нМ) (А) и DADLE (1,7

нМ) (В) анзлагаии каппорфина на препарате мембран головного^мозга крыс. I - Ш^-кашторфин, 2 - D-Ser -каппорфин, 3- D-Ser каппорфин. Инкубация проводилась при 25° С в течение 60 минут.-

возрастание их сродства к ОР |1- и ö-типа в ряду аналогов: шё-наппорфин < Б-Бег2-каппорфин < Б-Бег2-Ын5-каппорфин и гистор-

О ОС » . Q с

фш < D-Ala -гисторфин < 0-А1а*-ШС;-гисторфш? D-Ser -MHg-кашор-фкн взаимодействует с ОР по агонист - антагонистическому типу (натргввый индекс IC50+NaG1/I050"NaC1=3,3). Значения IC50.D-Ala2-

1®|-5Е<:елорфика примерно на порядок выше IC¡-n миелорфина (табл.'2).

2 5 2 5

Аналоги D-Ser -Ш^-къппорфин и D-Ala -Ш^-гисторфин при концентрациях 1-100 мкМ оказывали ингибирущий эффект на активность

Щ мембран стриатума крыс. Максимально достоверное ингибирование

2 5

D-Ser -каппорфином активности АЦ мембран стриатума крыс

2 5

отставило в среднем 22 % (р < 0,05), a D-Ala -NHg -гисторфином -

2S X (р < 0,05) при концентрации пептидов 10 мкМ. В наших опытах дершрфин (5 мкМ) снижал активность АЦ в среднем на 26% (р<0,05) Везшируя полученные результаты по аналогам пептидов каппор- •

фина и гисторфина, можно отметить, что на основе последовательности Туг-Х-РЬеЧ}1у-С1у были получены высокоактивные опиатогодоб-ные пептиды путем введения во вторую позицию Б-аминокислот и амидирования С-концевой аминокислоты, не уступающие по активности мощному природному пептиду дерморфину.

Особенности свойств химерного пептида - иэфбина.

Новым подходом в поиске опиатоподобных пептидов является создание химерного пептида, состоящего из двух разных классов нейропептидов, обладающих анальгетической активностью: лей-экке-фалина Ту1Ч31у-С1у-РЬе-1>еи и пентанейротензина Аг§-Рго-Туг-11е-Ьеи (фрагмент 9-13 нейротензина). Синтезированный химерный пептид Ту1Ч31у-(51у-РЬе-Ъец-Аг£-Рго-Туг-11е-Ьеи получил -азвание иэфбин.

При интрацистернальном введении мышам все три пептида: иэфбин, пентанейротензин и лей-энкефалин оказывали анальгетическое действие спустя 5 минут после их введения по механическому тесту. При вводимой дозе пептидов 5 нмоль/на мышь изменение болевого порога иэфбином и пентанейротензином было почти одинаковым и значительно превышало изменение болевого порога лей-энкефалином. Иэфбин и пентанейротензин проявляли анальгетический аффект также и при введении их мышам по тесту "горячая пластина": наиболее длительный латентный период проявлял пентанейротензин при'дозе 5 нмоль/на мышь. Иэфбин и пентанейротензин обладали практически одинаковым гипотермическим действием. Предварительно введенный налоксон в дозе 2мг/кг достоверно ингибировал анальгетическое действие иэфбинз и пентанейротензина по механическому тесту и пентанейротензина по тесту "горячая пластина", а также вызывал уменьшение действия иэфбина.

Иэфбин обладал опиоидной активностью, вытесняя меченые лиганды Ц- и 5-типа на мембранном препарате головного мозга крыс, т.е. анальгетический эффект этого химерного пептида реализуется, по-видимому, частично через ОР. Сродство иэфбина, лей-энкефалина и пентанейротензина к ае-ОР головного мозга крыс не выявлено. Из данных 1С50 вытеснения пептидами меченых лигавдов видно, что

наличие' пентанейротензина в химерном пептиде нр Елияет на специфичность связывания его с ОР, но снижает примерно на порядок сродство иэфбина как к Ц-, так и б-типу ОР по сравнению с лей-энкефалином (табл.2). Иэфбин почти--не изменял характера вытеснения меченого налоксона в присутствии ионов натрия из мест специфического связывания ОР головного мозга крыс (натриевый индекс иэфбина = 1,1), что соответствует антагонистическому типу его взаимодействия с рецептором.

Из полученных данных следу-, т, что новый химерный пептид иэфбин, "сочетающий в себе последовательности лей-энкефалина и

ifóirrahv-r.poTOKSiíü?., обладает шальгетичоским и Гйлотермическим' .„^летами, которые, судя по фармакологическим тестам, обусловлены

í¡i;".¡,-ot'Jiíü'ySiУёоЯ ¡соу^олеятой. ' н^лттчтге чтентянейрот'зняига- в-химерном-----------------

шптаде почти из влияет на специфичность связивыма с ОР головного мсога крыс, но спивает на порядок его сродсзто к ¡i- и б-ОР по сраы'ению с лей-отхфэлшюм. "то еще раз подтверждает - значение адресной последовательности аминокислот, которая располагается за эакифалиновой областью. ОП эндорфкнов и динорфинов.

В заключение хотелось бы отметить, что проведенный сравните- ' лышй анализ последовательностей ряда белков позволил нам най^и среди них пептидные фрагменты, тлеющие структурное сходство с ОП Показано, что некоторые из синтезированных пептидных фрагментов белков обладали налоксон-обратзмоЯ аяальгетической и оштоидной активностями. Среди исследованных пептидов опиатоподоб-нуя активность проявляли принципиально отшчшч по структуре от бнкефалшюв пептиды. На основе последовательности Tyr-X-Phe-Gly-Gly были получены высокоактивные аналоги пептидов каппорфчна и гисторфина путем замены на D-аминокислоты во ЩОрой позиции и "амидировакиеы С-концевоД аминокислоты. Конструирование и анализ свойств химерного пептида иэфбина позволил нам показать доминирование С-концевого' фрагмента пентанейротензина в иэфбине, т.-?. . • сочетание в одной молекуле различных пептидов-анальгетиков может привести к созданию опиатоподобных пептидов с новой комбинацией . свойств.

Естественно возникает вопрос, насколько реально выявленные нами опиоидные пептида могут выщепляться из нерегуляторных бежов in vivo. Известно, что ошатоподобные пептиды присутствуют во многих белках и выделены они, в основном, при ограниченном проте-олнзе белков in vitro ф-казоморфины из казеина молока, экзорфины из клейковины шс-ницц, опиатоподобные пептидч из плазмы "крови- и т.д.) (Brant1 et al.,1979, Carraway et al.,1984, Fulmdome, Yosho- . kawa, 1992). Полного экспериментального подтверждения участия их в регуляции жизнедеятельности организма пока еще/ нет. Одним из доказательств возможного образования выявленных наг® опиатоподоб-hlu пептидов из различных нерегуляторных белков могут служить данные о выделении из циркуляции происходящего из гистона Н4 14-аминокислотного остеогенного пептида роста, стимулирующего регенерацию костной ткани в поврежденных участках (Bab et al., 1992). На-С-конце пептида находится выявленный ранее опиатоподоб-ш;й пептид гисторфин (Харченко, Багров, 1936), который, возможно, определяет его осхеогенную функцию, поскольку ОП усиливают регенерацию ткани.

Можно предположить, что вместе со специализированными РП пептидные фрагменты различных белков могут составлять "континуум" РП (Ашмарин, Обухова, 1986), участвующий в регуляции жизнедеяте- -льности организма. Возможно, что продукты ограниченного протеоли-

за белков in situ представляют собой "третью" систему биорегуляции - клеточных гормонов "тетинов" (Чипенс и соавт., 1937), которые являютя свидетельством сохранения эеолюционно примитивных форм, процессинга регуляторных пептидов (Carravvay, Reineck, 1934. Янковский, 1985).

Оценивая же в целом перспективы поиска регуляторных пептидов в последовательностях белков различных функций, следует еще" раз подчеркнуть не только теоретическое, но и практическое значение этого поиска в связи с возможностью применения пептидов в качестве лекарственных' средств, естественных для организма и лишенных побочных эффектов, свойственных многим синтетическим лекарствам.

ВЫВОДЫ.

1. Сравнительный анализ первичной структуры свыше 500 белков показал, что примерно 10% исследованных белков содержат пептидные "фрагменты, имеющие сходство по расположению тирозина в 1-й и фенилаланина в 3-й позициях с опиоидным пептидом дерморфином, и позволил выявить ряд новых перспективных ошатоподобных пептидов.

2. Новый пептид - каппорфин Туг-Зег-РЬе-Иу-Иу из каппа-легкой цепи иммуноглобулина кролика проявляет при центральном введении мышам налоксон-обратимую анальгетическую активность, сопровождаемую гипотермией. Радиорецепторный анализ не выявил взаимодействия капюрфина с опиоидными рецепторами головного мозга крыс. Каппорфин оказывает налоксон-обратимое ингибирование активности адени-латциклазы стриатума крыс. •

3. Новые пептиды неэнкефалинового типа: миелорфин РУге^Ху-Туг-Иу-Иу из основного миелинового белка и интерэнкефалин В А^-А^-01п-РЬе-Ьув из проэнкефалина В, - почти в 2 раза активнее лей-энкефалина по индуцируемому ими анальгетическому эффекту при центральном введении, который блокируется налоксоном. Миелорфин вызывает гипотермическое действие. По данным радиорецепторного анализа миелорфин специфичен к |1-опиоидкым рецепторам головного мозга крыс (1С50=23 нМ) и его сродство к ^.-рецепторам на два

порядка больше, чем к б-рецепторам. Миелорфин ингибирует активность аденилатциклазы стриатума крыс. Интерэнкефалин В не вытесняет ни один из использованных меченых лигандов ц-, б- и ае-опиоидных рецепторов. *

4. Синтетические аналоги каппорфина Туг-Зег-РЬе-ЫуЧПу-Ш^,

Туг-Б-Зег-РЬе-С1у-а1у и Туг-Б-Зег-РЬе-С1у-С1у-1Ш2 и гисторфина Туг-Б-А1а-РЬе-С1у-С1у, Туг-Б-А1а-РЬе-С1у-С1у-Ш9 превышают аналь-

Л

гетическую активность лей-энкефалина .в 10 - 10 раз и не уступают по активности дерморфину. Радиорецепторным анализом охарактеризованы особенности взаимодействия каждого из аналогов пептидов с

ojßion^iur.si рецелтораг,я к ö-тша головного мозга крыс. Аналоги пептидов D-Ser^-Ш^-каппорфин и-Б-АХа^Ш^-гисторфин- более - селек- -•гиг-лш к (а-опиоидным рецепторам (1С^=3,8нМ и IC5q=23 н1/, соответствию) и ингибируют активность аденилатциклазы стриатума крыс. 5. Предложенный химерный пептид иэфбин - Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Рго-Туг-Ile-Ile, в котором сочетаются последовательности лей-знке-^лкна и пентане^отензина, обладает анальгетическим и гипо-термгпеским эффектами. Данные фармакологических исследований и •; радпорецелторного анализа свидетельствуют о доминировании активности нейротензиновой компоненты в химерном пептиде.

По теме диссертации опубликованы следующие .работы:

1. Харченко Е.П., Калихевич В.Н., Шестак К.У!., Соколова Т.В. Каппорфин - новый опиатный пептид из зе-цепи иммуноглобулинов // Докл. АН СССР. 1987. Т.297. N 3. С. 740-743.

2. Харченко Е.П., Соколова Т.В., Калихевич В.Н., Шестак К'.И., Ардемасова З.А., Багров А.Я. Химеры из регуляторных пептидов как "инструмент анализа их действия // Докл. АН СССР. 1987. Т. 297. N. 5. С. 1264-1267. •

3. Калихегач В.Н., Ардемасова З.А., Шестак K.M., Соколова Т.В., Харченко Е.П. Синтез новых опиоидшх пептидов из различных белков и анализ'их анальгетической активности / VII Всес. сигяг. по химии белков и пептидов. Таллинн, 1987. С.189.

4. Харченко Е.П., Калихевич В.Н., Соколова Т.В., Шестак К.И., Ардемасова S.A., Сорочинская Е.И. Опиатоподобные пептиды неэнкефа-линового типа // Докл. АН СССР. 1938. Т. 299. N 6.С. I5I0-I5I2.

5. Харченко Е.П., Калихевич В.Н., Соколова Т.В., Шестак К.И., Ардемасова З.А. Принципиально отличные по первичной структуре отч энкефалинов опиатоподобные пептиды // Биохимьл. 1988. Т. 53. N 7. C.II23-II35.

6. Харченко Е.П., Калихевич В.Н., Соколова Т.В., Шестак К.И.,. Ардемасова З.А. Высокоактивные аналоги опиатоподобных пептидов гисторфина и каппорфина // Вопр.мед.химии. 1989. N 2. С. Ю6-Г09.

7. Шестак К.И., Сергеева М.Г., Зайцев C.B., Калихеъич В.Н.,--Ардемасова З.А. Взаимодействие новых опиатоподобных пептидов с опиоидными рецепторами головного мозга крыс / Всес. конф.- "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки". Суздаль, 1989. С.218.

8. Шестак К.И., Сергеева М.Г., Зайцев C.B., Харченко Е.П., Варфоломеев С.Д., Калихевич В.Н., Ардемасова З.А. Анализ новых опиатоподобных пептидов радиорецепторнш методом // Укр. биохим. журн. 1990. Т. 62. N 2. С. 23-29.