Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гипоталамо-гипофизарных гормонов на функциональные показатели и процесс мейоза при культивировании ооцитов коров внутри фолликулов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние гипоталамо-гипофизарных гормонов на функциональные показатели и процесс мейоза при культивировании ооцитов коров внутри фолликулов"

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК имени В. И. ЛЕНИНА

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАЗВЕДЕНИЯ И ГЕНЕТИКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи

ЗУБЕНКО Андрей Александрович

УДК 636.2:591.465.1

ВЛИЯНИЕ ГИПОТАЛАМО-ГИПОФИЗАРНЫХ ГОРМОНОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ И ПРОЦЕСС Л\ЕЙОЗА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ООЦИТОВ КОРОВ ВНУТРИ ФОЛЛИКУЛОВ

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД-ПУШКИН 1990

Работа выполнена в лаборатории культивирования эмбрионов Всесоюзного научно-исследовательского института разведения и генетики сельскохозяйственных животных.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А. К. Голубев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Л. И. Жигачев; доктор биологических наук Б. И. Протасов.

Ведущее научное учреждение — Институт экспериментальной биологии АН ЭССР.

Защита диссертации состоится «ИъНОЯЪРЯ 1990 г. в//" час. на заседании Специализированного совета Д.020.07.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном научно-исследовательском институте разведения и генетики сельскохозяйственных животных по адресу: 189620, Ленинград—Пушкин, Московское шоссе, 55а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан <.3%?>с£/1ТдЪ*Я 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор с.-х. наук, профессор

Б. П. Завертяев

; 1.1. Актуальность. В воспроизводстве лабораторных и • с'е^скохокяПствйшшх животных всо ииро начипапт .применять .^Ьир^оиюмогичйскио могодн. Трансплантация эгбрпонов, вклю-*чавдач в ■ оо(1л виделешт из яичников оамки пухлого генотипа большого ч!'0';д яйцеклеток с целые их культивирования, опло-дотворегля и лолучел'шт ркбрионов для пересадки другим, генетически ыенео ценным яивотннм, является одним яя них. Потен-цйэлышу возможности воспроизводства самок млекопитающих ог-роиш. Однако лишь небольшая часть пх яйцеклеток в процессе жизни реализуется в виде потомства. Под ресшном этой проб-легн работают гяюгие- учонио г.'пра. Рй'яьтзшяруват!. осцитн моп-но друг,-л способами: изолированно и внутри фолликулов. Било установлено,- что репнпцгация мейоза у интрафолликулярних яйцеклеток, в отличие от культивирования их изолированно, происходит только в средах, содержащих гонадотропные гормешз. Однако роль--других <5во логически" активных вошеотв гппоталако-гппсф5зяргого.1гро11схогде'1шя еще мало изучена. Иокуоствешшо .среда, отгекйяе'оя в распоряжении эксперимента торов, но смоделирована -с условиям! т v\vo' /а это приводит л нарушения -мейоза, дегенерации и гибели ооцитов или к пх неполному созревании. ' 1

Но исключено, что сочетание в культуральной среде ряда биологически активных веществ, благоприятно влияющих на со-' зрование ооцитов, может лать высокое обеспечозшо генетически ■ полноценного материала^

1.2. Цель и задачи исследований. Целы?) нашей работа являлось совершенствование методов культивирования ооцитов внэ ' организма. В связи с этим решались оледущиэ. задачи:

1) изучить изменение дыхания л отероидогонеза оварпаяь-згах фолликулов коров различных диаметров в средах.о разнила концентрациями '1'СГ; " •'

2)изучить изменение дыхания п стероидогеяеэа фолликулов, культивируемых в средах, содержащих ЯГ, ФСГ п пх сочетание;

3) выявить степень изменения диханзя-Л- стеропдогенова,-а такке козТ'йтцпонтов корреляций этих пояазатолоЗ у $ояла-

Iгулоб, дультявпруомисс в средах с прояактпноы, гопздотроппн-

рилизмнг TOJIMOHOM (fti-РГ) а аргишш-вазотоциноы (АБТ);

4) выяснять степень изменения уровня дыхания, ствроидо-генава и коэффициентов корреляций этих показателей у фолпику яов, культивируемых в средах, содержащих пролактин, Гн-РГ и АВТ № фоне гонадотрогашх гормонов (ФСГ + ДГ) j

5) определить способность внтрафолпикуиярных ооцитов реинициировать мейоэ в зависимости от уровня дыхашш, стеро-адогенеза;

6) изучить созревание ооцитов, культивируемых внутри фовдикулов в связи с добавками в среду пролактина, Гн-РГ и АВТ.

7) выяснить способность ооцитов к оплодотворению в присутствии биологичеоки активных веществ, благоприятно влияющих на «х ооаревание.

1.3, Цаучная ^овизш. Впервые в сравнительном аспекте изучены особенности газообмена и стероидогонеза интрафодди-кулярнвде ооцитов, культивируемых ь присутствии различных доз ФСГ, сочетания ФСГ+ДГ, пролахмша, Т»-РГ, АВТ, а также пролактина, Гв-РГ и АКТ на фонь а'оыадотроюшо». Показано, что интенсивность дыхание, стероиддгеиеэв, протекание май о за заводят о? развара овариалышх фолшвдлов и состава куяьту-радьнок среди. Выявлены изменения коэффициентов корреляций функциональных показателей, ^газообмен * стероидогенез)' фолликулов, находящихся в различных средах- Кроме того, определена способность интрафолликуяярных ооцитов: реиницнировать мейоз; в зависимости от уровня, дыхания, с-герондогеьезв и добавок биологически активных веществ. Bis основании чего установлены условия: культуральной среда, способствующие благоприятному созреванию и оплодотворению яйцеклеток вне орга-

тгаоио- •

ДМвНя**-

1.4. Практическая значимость. Исследования показали, .что. оочетавие ФСГ/ЛГ и Гн-РГ благоприятно влияет на физи'о-логб-биохимические функции фолликулов различных размеров. Подтверждена, принципиальная возможность экспросс-тестирова-ння интрафрллинулярних ооцитов1 с помощью попярографич ее кого метода на способность реинициирошть • мёйоз.

Результаты'изучения процосса■фолликулогеноза и мейоза-• могут быть использовани в научных лабораториях,. заНшащих-

ся разработкой и совершенствованием методов культивирования для оплодотворения ооцитов и получения эмбрионов вно организма. А данные по физиологическим и гормональным аспектам оогенеза - для решения теоретических проблем и чтения лекций но генетике и биотехнологии в ВУЗах.

1.5. Апробация работы. Результаты, продставяошше в работе, бняп доложены на заседаниях ученых советов и аспирантских конференциях ВНИИРЕЕ в 1987-1990 гг.

1.6. Объем работы. Диссертация состоит, из введения, обзора литературы, г/а то риалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и предложений. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 8. рисунков и 20 таблиц. Список использованной литературы состоит из 171 источника, в тем числе 121 иностранных авторов.

1.7. Матерная я глетодн исследования. Объектом исследования спуяили фолликулы и ооциты, выделенные из яичников в стадии фолликулярного роста от гинекологически здоровых ко-.ров черно-пестрой порода, убитых на Ленинградском мясокомбината. Материал доотавляли в термосе со средой TC-I99 при. температуре 5-Ю°С не более чем через 1,5 часа посла убоя.

В стерильных условиях фолликулы отмывали средой TC-I99, содоржащой 150 од/т апврмосана я переносили в среду либо для кратковременного (содержащую TC-I99 и определенные сочетания гипоталамо-гипофизарных гормонов), либо для длительного культивирования (содержащую TC-I99 - 80$ + 20$ сыворотки крови крупного рогатого скота, определенное сочетание гн-поталамо-гяпофизарных гормонов й другие компоненты). Газовая фаза для культивирования изолированных ооцитов состояла из 0g - С0£ v 5%,И 2 ~ 90$, а для культивирования фолликулов - 02 - 50&, СО2 - 2 - 45,?. Фолликулы культивировали индивидуальным способом-в роллерной уотановко или в ра.во-внх пластиковых шприцах в зависимости от поставленных задач. Ооцитн культивировали и оплодотворяли по ранее разработанной схеме в лаборатории культивирования эмбрионов ВНИИРГН. При; этом оперму получали от быков-производителей из Цушкинокого племпредприятия. Для оплодотворения öpnrai 0,05 мл суспонзпи с концентрацией капацитлрояашых спорка тозод'цоз катодом '•Wcui* чр " 10^-10°.

После кратковременного (2 часа) культивирования фолликулов различных диаметров при температуре 37,5°С проводили определение наирлжонш кислорода (л р02) и углекислого газа (дрС02) в культура льной среде, полярогрзфичоским методом на гликрогазоапашезаторо кислотно-основного равновесия и гаоов крови (ЕСА-3, Даши). Контролем били пробы среди с фоппику-даш, выдержанными в тех та условиях, только без гормона ль-шх добавок. Кроме того, через каждые пять проб с штрафов-;:шсуллршш оощ'таг.ш ставили пшрицц со средой, но без фолликулов о целью измерения разности значений /. рС^ и л рС©2 меиду различными шриантамв. В течение одной минуты в специальной камора прибора измеряли нормальное давление Од и С(>2, сопоставляя результаты с контролем и пересчитывая на мм рт.ст. на фолликул за 2 чаоа.

Преобразование хрошсс™ социтоб б процесса культивирования -изучали цитологически методом Тарковского (1966). Препараты окрашивали по Романовскому (Азур-Эозином).

Определение синтеза стероидных гормонов, отражающее уровень стероидогенеза (синтез встрадиола, прогестерона и тестостерона) антралышш фолликулами различных диаметров аа первые дез часа культивирования, осуществляли •радиоиммунологическим методом совместно с сотрудниками лаборатории генетики ко лоз внутренней сакреции (А.Г/Резников, 1900). Материал документировали микрофотографаяш. Статистическую обработку Еолучешшх даннш: дошли на широкачгку^яторе '"Электроника Б3-34" но Н.А.Плохинскону- (1969) и Е.К.Меркурьевой (1970).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ {ЯВСТВЕННЫХ ЙССЛЩОШИЙ И ИХ ОКЯГЩПИВ

2.1. Изучение уровня дыхания и отероидогенеза изолированных овариальных фолликулов в средах, содержащих различные дозы ФСГ

Имеется ряд данных о том, что гонадотроганш вызывают-существенное изменение в отероидогенезе, повышая ароштазную активность и регулируя биосинтез фолликулярных стероидов, ■ при этом препятствуя ингибированию синтеза РНК и белков ( Ба'| 1> Т , ti.llI г I- £ Ст. ,' 1Э89). Кроме того известно,

что даханио, соиряконноо с фосфорилиронаниеи в митохондриях и образованием ЛТФ, создает условия, при которых скорость окисления питательных веществ (глюкоза, пирулат, диктат) регулируется потребностями клетки в полозиоЗ »ш.'риш. Поэтиду п ншгих кесчедовашщх с помощью пояяро графического ч радиоиммунологического методов определят! ступень ответной реакции фолликулов коров различных диаметров па рад концентраций фСГ в культуральной сроде для выпвлепил дозы препарата, мавскмалыю ста;-у;и;рум;:;ои дегхотольную и ».•тс^-оцд'и'уинуо функцию иэучаемнх объектов.

Нами установлено, что наиболее высокое стимулирование. выделения С02 к потребление Og било при шхщонщ-ацип ФСГ >) среде 5 м;<г/мл у мелких фолликулов (1-3 мм) на 52,(Р< 0,001) и 70,5$ (Р< 0,001) соответственно, У крупных фолликулов эти показатели дыхания повышались несколько'меньше, т.о. на 33,$ (Р<0,001) и 42,5% (Р< 0,001). Стероидогенеэ также претерпевал изменения в зависимости от диаметра .объекта и дозы гонадотропина. Синтез прогестерона при низких концентрациях гормона (500 нг/мл) наиболее повышался у мелких фолликулов (1-3 мм) на 61,8$ (Р<0,01), внброо яо эстраднола в этом классе максимально увеличивался при кон-, центрации ФСГ в среде 5 мкг/мя на 61,8$ (Р< 0,001). Эта доза оказалась также стимулирующей секреторную акишность кле-. ток теки и гранулезн других групп овариальных фолликулов. Поэтому в последующих экспериментах данная концентрация 'ФСГ попользовалась при длительном культивировании фолликулов.

2.2. Изучение уровня стероидогенеза изолированных овариальных фолликулов коров вно организма в средах, содержащих ЛГ, ФСГ и их сочетание

Известно, что многие физиологические и комплексные биохимические функции клеток, такие как гликолиз, транспорт сахара, оогенез и другие регулируются комбинированным воздействием различных гормонов ( Su.su. ki 1С Длгтск. fe. , 1989). Кроме того, известно, что для гормонов характерен так называемый эффект аугментации, когда одни гормоны модулируют действие других. Например, эстрогены изменяют реакцию матки и влагалища на прогестерон. Учитывая это, нами была постав-

m о

g*

g

I p.

о

о

<D

g

ffl к

о &

и

в &

р

Яга! f со и О

Л

о

LO M

IN

M

t»SL A +¿o +¿?n Ä til

"ttin ti

ÖOJ 1Ío "УпЬ liö С50Э Oío

oto N^JI ON -=J»0 CvJOJ -^O lß-ф OÍO C\¡C\J

oo осГ ооГ ЮФ IOO со o o o" Oí n oV o°Í

•Sjlrt into MOJ G)<T> l^-O ОГ-- oto COCO oto Oin CO'f nl> MCO COCO NJl'-O CO-^1 ^

cooincqmcsícoco

+¿o"H1p

ИН no

OOÍ СЯО CT) СО СП со vj< in

со

M

UO M

'• i o til ою min

о со ci см o ai com

CO

м

со

со м

ад

M

cr>

M

00 м

со M

I l , +.! +1..

.-I Tlf, ^ 1-1 + +1 +1 +J л . ,

OO HO C4JUJ C\iin öu> oo oo oo u>o CVCO

OO MO <OOJ Ч"С0 OOi moi COIN ^O OiCO IN^

Ci* O ^fOl INO OO 1ЛО ^¿cg 0>0 OCO üToO

OiM -TO CTlOl ОС! _ ----- -

M coà> мю in CO CDTji ад о M Cfioj M озм ы ом M CNJM этм ■ч*

СО w 01 M M CM СО и со M СП l-i M С) «0 M со M СП M M OJ со M

% cj¿j ci о !Nr\! О CO Уть üo ■yOJ +1 oo coo +¿o COO +¿o oo tio c¿o tnoi evo ь Uo too

сом О м О-СО M incví O.'O tÛCO OJCO со со «ЦГ- МО MW M -ФОТ CD Cil CNJM M дает OÎIO СО Oí M crTo too ЮС\» M СО Oll/) юо> OJ юо ^м

ci 1- 1 С СО Oí <0 ол Kj M со OJ си n N (V M со СО C\i

tí, м » H t41 fi4 « Но 4Д :, 1 îi i'H +itl„ .lij M

- J L - L. - . i--V Ш üi L'Jl'4 С Vi '-V - »J

CO«? m M г ; o ro «-i1 CTirj C0'\! со со ab Nf ¡peo IN M Cribi '.О ГУ, COCO С: ci à cru--) M o-^ го íiíPj ir:!n Ю

• ci

r-( E о Ь

?! Й

Ы в и- 1Й

ufe

m «

M

1С

и П

' п> у.

! w í-

, tf с

: <i> г-

'S «

Й ^ R iä b> й и M Й

О F-I \ о r-t ч" о

S1 ^ N й N" f

UÍ 1—i о ою f-jio ö k t>ir> fn-

й Й FÎ <

и +

П(Л (Ц'.О Ö

с:> « Р(С

С) W

t; о

О-ijl

те а Pîn-

SÉtë

О—' •

о

лона эадача выяснить взаишое влияний ФСГ и ЛГ на уровень отероидогенеза (табл.1).

Было установлено,. что при наличии в культуральной среда ФСГ+ЛГ выброо прогестерона -ловималея во всех классах^Фолликулов. Максимальное значение стимуляция его выброса достигало ореди объектов диаметра 5 мм - на 136/5 (Р< 0,001) и 6 мм - на 134$ (Р< 0,001). Анализ выброса тестостерона такие показал взаимоусиливащее воздействие ФСГ и ЛГ. Tan¡ у фолликулов 1-3 мм его биосинтез повышался на ЮЗ,"? (Р < 0,01), а у.-крупных (> G мм) - на 180,7% (Р< 0,001). В других классах изменения носили недостоверный характер. Еыброо еотрэдиола максимально сталировался в этом варианте среда тагло у мелких (1-3 га) и крупных (>б ш) фолликулов на 02$ (Р<0,001) п'49,соответственно. Приведенные данные свидетельствуют о том, что ФСГ и ЛГ, находяоь одновременно в культуральной среде, вероятно, усиливают ароматизацию в текэлышх л гранулезных клетках фолликулярного-комплекса.

2.3. Изучение уровня отероидогенеза изолированных овариальных фолликулов коров , ,

в оредах, содержащих'пролактин, гонадотропин- -рилдзинг гормон (Гн-РГ) и аргшвш-вазотоцин5 ■ (ABT) на фоне гонадотропинов '

Sa последнее время накопилось много сведений о непосредственном воздействии пролактина, Гн-РГ и АВТ на гонады ' млекопитающих. Так, имеются данные об их способности влиять на овуллцию, стероидогенез, поддержание беременности, а также изменять действие лютеинизирумцего гормона и'Другие овариальные функции (би-гл^а S., 1985). Однако сведения об эффектах этих вещеотв противоречивы и получены на' ограниченном чиоле видов (крысы, кролики, обезьяны, человек). ;

На основании этого была поставлена задача выяснить влияние пролактина, Гн-РГ , АВТ на фоне ФСГ/ЛГ на стероидогенев фолликулов коров различных диаметров. Из табл.2 следует, что-в оредв о пролактином на фоне гонадотропных гормонов у мелких.фолликулов, наблюдалось* достоверное уменьшение выброса .', прогестерона на 31,1$ (Р< 0,001). Биосинтез тестостерона в

а

Таблица 2. Влияние прояактина

ОлредедяеглыЗ .гормон

Группа опыта

ерон

Тестостерон

оя

Конзроль Пропактин I* - ЕГ АВТ

Контроль Пролактпн Гн - РГ АВТ . Контроль Пролаяиш Ен - РГ АВТ ■

, Ifc-РГ а АБТ на стеровдогевез фолотвулов к.р.с. (не фоне QCT + ЛГ)

fltphfatp фолликулов (№)

1-3 4 5 6

4100,20* 196,22 15 4708,85* . 386,70 18 4820,I0± 189,40 15 7850,00* 985.40 13

2827,58t-. 236,4¡F® 10 3405,50Í 675,60 19 5016.66* 476,50 18 9644,70* 256,00 14

5740,32t„ I89|70íaac 17 6470,80$ 565,00х 17 6728,42* 559,00х 15 10670,2t. 796,OO** 10

' 8042,98«™ 796,SO30® 15 9914,80t_, 1499,OO2** 18. 9579,96* 1150,25 15 11989,0* 900,40 13

1530,50* 675,90 15 1150,00* 875,32 К 1965,50* 110,20 15 3880,65* 435,48 13

1591,19* 876,80 10 2010,00* 483,00 19 ■ 2347,56$ 210,25 18 5470, B0t_ КЭ^В*3® 14

1391,00* 453,42 17 1065,30* 225,70 17 1740,50* 398,79 15 2976,60Í 98,65х 10

1150,404 167,54 .К 977,27* 105,25 18 1433,18* 186,29 15 2264,54¿_. 13

530,40* 28,75 15 530,37* 89,32 18 489,72* 86,43 15 667,45* ез!4? 13

495,80t 88,95 • 10 436,00* 45,34 19 482,401 83,25 18 537,43Í 29,56х 14

687,89$ 68.10х 17 695,46* 90,05 17 633,00* 140,75 15 10

407.69Í ' 59,90 15 399,90* 78,56 18 337,26* 109,87 15 528,72Í' . 49,7В* 13

опытной среде достоверно увеличивался у средних (5 ш) и крупных (>6 мм) фолликулов на 19,4^ (Р<0,05) и 41% (Р< 0,001) ооответствепно. Выделение встрадиояа заметно подавлялось лишь у крупных фолликулов на 21% (Р< 0,05).

В опытной среде о Ito-РГ выброс прогестерона по сравне-шпо с контролен (среда только с ФСГ+ЛГ) достоверно повылая-ся во всех классах фолликулов: у 1-3 им - на 40% (Р<0,001), 4-х мм - на 37,4$ (Р4 0,05). 5 ш - на 39,5^ (Р< 0,05) я 6 tai - на 35,955 (Р< 0,01). Выдеяенве теотоотерона в данном варяанто среды среди калких а средних фолликулов изменялось незначительно и недостоверно, а у крупных (>6 ш) .. происходило достоверное его уменьшение на 23,3% (Р< 0,05). Однако выброс естрадиола повивался у иелкях фолликулов на 29,6* (Р< 0,06) и у крупных (» 6 ш) - на 23,2£ (Р<0,05).

В среде о аргишш-вазотоцинсы на фоне гонадотропинов биосинтез прогестерона по сравненш о контролем у. мелких (1-3 ш) в средних (4 им) фолликулов увеличивался соответственно па 96,7¡í (Р<0,001) и II0,5JÍ (Р<0,01). Выброо тео-тоотерона и эстраднояа достоверно уменьшался только в кхаосе крупных фолликулов на 41,4^ (Р< 0,001).

2.4. Изменение газообмена и корреляций функциональних показателей дыхания и отероидогенеза овариальннх фолликулов «rt vi tro в среде, содержащей 1>1-РГ на фоне ФСГ/ЛГ

Известно, что в фолликулярной жидкости наряду со стероидами обнаружено больше чиоло биологически активных веществ, к которым относятся также Гн-РГ, ФСГ и ЛГ. Вполне вероятно, что несколько эффектов фолликулярной жидкости (рэн-нициация мейоза, цитоплазматическоо созревание и др.), то есть среда, окружающей яйцеклетку, обусловлено комплексом взаимодействующих веществ ( G агл S , 1985, Нл г г ¡ion I., 1990). ' !

В овязи с этим нами выяснялось изменение газообмена ; фолликулов коров в присутствии Di-РГ и ФСГ+ЛГ, а также проводился анализ корреляции показателей дыхания и стероидо-генеза. Оказалось (табл.3), что в средо с Гн-РГ проявлялся стимулирующий дыхание эффект. Ввдплоние OOg достоверно уве-

о

Таблица 3. Газообмен изолированна* фолликулов в среде, содержащей гонадотрошш-рнлизинг гормон на фоне ФСГ + ЛГ

Показатели дыхания

Воздействие

1-3

Диаметр фолликулов (да)

Выделение ■ С02 Контроль 6,321,20 14 П,04± 1,40 7 (-КО осл 7. 17,50± 0,90 8

Гн-РГ . • • 7,90± 0,90 ' ' II 18Д2к_~ 0,48= ю 13,90= • Т,Б5 II 19,8СЙ 0,4(? . 12

Потребление 0£ Контроль ■ 35,77^ 4,00 14 37,88± 4,00 ' 7' 47,45^ •'. 1,45 7 44,20± ■ 3,20 •8

Гн-РГ 46,82* 1,52х ' П.. 48,84± .4,96 10 41,40± 5,85 II 54

Таблица 4. Коэффициенты корреляций функциональных показателей интенсивности дыхания и секрацот стероидных гормонов для "фолликулов коров в среде с дели барином

на фоне ФСГ + ЛГ

Тгг.„а„„„„_ ; Потребление '. Выделение Выделение Выделение Выделение -

показатели ^ д рп^ С0;?( рС02) прогестерона тестостерона • эстрадиола

_ _ _ _ - - -

Потребление-К . 0,461 0,477 0,545 0,143

°2 * 0 0,568 0,839 0,567 0,664

Выделение К 0,461 ' 0,962"" 0,841" 0,868"

С02 ( РС0^0 0>5Бб 0,983х" 0,470 ' 0,637

К 0,477 " О, Ж*** ,0,954"" 0,933х".

рона " 0 0,839 0,503 0,918'" 0,935""

Выделение К 0,545 0,841я 0,954*" 0,885*х

тестосте- 0 ' 0,567 . . . . 0,470 ' 0,91В /' 0,978х

Выделение К 0,143 0,868х . 0,933*** 0,885""' •

эстрадиола 0 0,664 0,637 . 0,935 0,978я.

ШШЕЧАНИЕ: К - культуральная среда Лез содергания лгшиберина;

О - 1улызградьная среда с содержанием лшшЗерина.

янчнваяось у 4-х wi, 5im и 6 ш фолликулов на 64^ (Р < 0,001), 46,(Р<0,05) я 13,Ij? (Р<0,05) соответственно. Достоверное сшооэние потребления 0t> происходило у мелких (1-3 mi) фоялжкуяов на 31,1? (Р^0,01) я у крупных ( 6 ш) на 22.33! (Р 0.01}.

Коэффициента корреляций функциональных показателей газообмена в стероядогенезз в среде о Ifc-РГ + ФСГ/ЛГ по огяо-венню к контрольно® среде с ФСГ/ЛГ заметно ивыепякись в сеедупцях вариантах пар признаков (табл.4): потребление Og я веделмшо прогестерона (от 0,477 до 0,839); потребление Og я наделение встралнола (от 0,143 до 0,664); вадеяеяяе OOg я одоление тестостерона (от 0,841 до 0,470). {Читальное изменение корреляционной связв в опытной среде наблвда-лось по празнакам - потребление кяслорода я вцдеяеяне твото-стврсиа.

Таким образам, в результате проведенного иссладованяя установлено влияние Ии-РГ на дыхание и взаимосвязь покава-теле4 газообмена я отерондогенеза. Это говорят о том, что данное соединение, включаясь во внутриклеточный метаболизм, активирует определенные энергетические и стероидогеннне фикции овариаяьннх фол лику ков.

2.5. Протекание мойоза ооцитов в фолликулах

о различней интенсивностью дыхания и отсроадо-генеза в среде о ФСГ/ЛГ

Интенсивность газообмена фолликулов (отражающая уровень гликолиза) и стероидогенез являются одними из важнейшие показателей их фуикционалького состояния, в конечном атоге отражая протекание мейоза интра фолликулярных ооцитов. В данной работе исолодованн показателе дыхания и стероидо-генеза на первых двух часах культивирования в связи с ядер-нша созреванием ооцитов в течеиие последующих 22 часов.

анализ хромосомного состояния яйцеклеток после длительного культивщюванш проходил в соответствии с их принадлежностью к группе фолликулов о низ-югм выделением С02 (*.рС02<8 ш рт.ст./мя.фол-2 ч) и по-' треблением 02 (л р0?<40 ixj рт.ст.Лш-фол-2 ч), либо-с "высоким г-вделвш^м П)? (л1С0?>В т.г.: рт.ст./мл-фоя-2 ч) и

потребление!! Og (дрО^> 40 ш рт.ст./мл.фол.2 ч). Обнаружено, что чноло ooiDiToB, не вступивших в иеЗоэ, бико значительно больию у фоявикулов о низкий ввдолониеы СО^, некелп с высоким (65,1* и 29,6? соответственно). Такая же закономерное» по рвннициащга шЛоза бнжа отмочена в для фолликулов с разным потреблением кислорода. Число нербншгцгяроьаБкнх мейоз ооцвтов (teso больше для фохшкуясв с ЕВЗКНМ потробзегасш* кислорода, чем для фол пику гов с шеокли потребяенвеа 02 (53,3Í против 40.5JC). Крсгэ того, вабидакось ваквого Соль-loe клеток па гелофаэе-катафазе П в группе с высоким потреблением 0^, нажеки о нпзкли: 28,(Р< 0,001) a 8,3Caar-носенне илтрофол яякудяргад ооцятсв со прязлаку рокшядаиру»-щяе/ве решшцпирущие ь;еЯоз в классе с яатвнешшш вкдеаэ-ннеы С02 а потроблешеы 0¿ (2,38 upa Р< 0,01 в 1,47 пря Р 0,01) правшам этот пока затее, в класса с нззвям уроытси ввдеяення С02 в потребвевва 02 (0,35 а 0,66).

Пря изучении отероидогейеэа во взакиосвяэз с протока-, наем шйоза после длительного культквярсвания установлено, что синтез прогестерона среда кокках фошшкудов (1-3 ш») о яйцвклеткаш, достигала стадия даакнЕоз-штз^аза П достоверно бая яа 20? 0,05),а сшггаз зстрадаода - па 7G,S$ вшэ, нежели у фояликуксв с ооцктакя, не ракЕПЕртарстьиаа кейоз. В сяадувдей группа (4 ем) достоверно еывз из 66.732 ■ (Р< 0,05) бил выброс эстрадиопа у встушпгсях в иаПоз narga-фоллпкупярпнх ооцктов, пегелл у сстанонавьихся п раавиткз клеток. И у фолгакуяоз ддаттром 6 ьз набквдзкась та ва закономерность э отношении СЕсегнтэза прсгастерсйа (пр&иж»-ла на 27? пря Р< 0,05) а астрадаояа (на 2G? ггря Р< 0,01). Ср®о.1). -

2.6, Протекание шйоза в ттрафояднЕулярвыг соцятаа, культкшруешх в средах, ссдврвйгзЕХ пртлшкгз, 1Ъ-РГ н 1ST

Накопилось- много фактов, свгдетэяьствзтЕгах о прямей воздействия Bi-íT ( Coot« Й L, IS88), пролактеза P(«tut; . 1904) и ABÍ (kélkeT , 1988) ка гонады ююжопатащяж. Секрацвя гйпоталзш-гвпо^заркых гормонов paiyzmpye« с кз-кЗ и не всегда хорошо псоледовашшЯ мазак&зи Еяутряяпчшековкг

п

5000 •

4000

3000

2000

1000

стеровдогенез фолликулов с нереинициирузсщши майоз яйцеклвткашЕДвши-ДДа) п- стероидогенез фолликулов с реншщЕровавшннгг майоз яйцеклетками

р<0,05 ЛЯ - Р<0,01 ЛК к - Р <0,001

П

П - выделение прогестерона фодсткуд-и (пг/2ч.) Т — выделение тестостерона фолликулами Э - выделение зстрадиола фолликулами

1-3

700 600 ■500

400

300 200 Ш0

Диаметр:. 1-3

фолликулов •

(мм) -

Рис. .7 , Стероидогенез фолликулов коров черно-пестрой по роды ь слязи с состоянием хромосом

ннпгафолликулнрннг ооцитов через 24ч. вультшшрованЕя: зяе органягма.

процессов, связанных меаду собой прямыми и обратными связями. Однако нет почти данных о влиянии этих соединений на ыейоз у крупного рогатого скота.

Проведенные нам! эксперименты позволили выяснить дана-оку протекания ядерного созревания оовдтов в сродах с про-лактипом, Гн-РГ и ЛЕТ за 24 и 40 часов (табл.5). Установлено, что внутрифо и лику ляргшо яйцеклетки в среда о пролакти-ном (3 МЕ/мл), культтщуекые 24 часа, в 65£ случаев достигли стадии метафлза I, а в контрольной среда (без пролактн-ка) - я 07$. Через 40 часов в опытной и контрольной сродах на стадиях енафаза-метафаза П находилось 54$ (Р< 0,001) к Щ (Р<0,01), а на кетлфазо I - 25% и 2С)% ооцитов соотьет-ствонно.

В варианте среди с П{-РГ поело 24-х часов культивирования метафазн I достигли ?0£ (Р < 0,01) клеток ц через 40 часов - 10$. Нз болйо тфодвкнутых стадиях мейозе (акафазо-котафазо И) через 24 часа я ыштно» н контрольной группах тюгедтоог.. ?01. к 131, г чорзз -1С ::асох. - £Р< 0,001) 2 74% (Р< 0,01) ооцитов соответственно.

Сспрэгяяпз в среде с АЕТ (,? ;.егД'л) показало, :;тс иасло 24-х чпоог, в. слитном верланта было 73,1 (Р С 0,05) клс-тск ш г»71-&за Г, а а <:снтрслс - 0,% (Р< 0,001). I! ч.зрз 48 с:: . то- ргг^ . . . ... г,.п

То;? (Р< 0,С5) л 74/? 0,01) соизтсз.

Тгп"'7' нчг*бОГее Г-НСОП5* М.'УС" ССЦЯ--

Т" ТТСПГЧОЧ ТП,ТТ ""ГТ-Тт'р.ТЧ'С??!;"''. сродс. с

Ги-РГ (2 мкг/мл).

гормонов

!!ппол1.оог.чшге в практике метода ;;у;л.т1!ьчрова.,шя эмбрионов коров вна организма мо.тет быть усоьорпенствозга.'о только при глубоком иозналии механизмов гормональной регугащщ фог.ликуло-'и осгенеза. Учитывая результаты зкспорнмс-нтси по изучению уровней дцхания и старондогеноза фолликулов в присутствии различите биологически активных воцеств, на данной

кн сг>

Таблица 5. Влияние добавок в присутствии ФСГ/ЛГ на ядерное созревание интрафо лярйых ооцртов ■

Время .* Процент клеток на стадиях

Группы культивирования, ч " дипло— тенэ диаки-1 незе мета-фазе I анафазе-метафазв П

Контроль 24 64 ^ 3 2 — 87 .56 10 6

Цролактин 24 60 14 8 21 13 ' 65х 39 - -

Гн-РГ 24 92 5 5 5 5 70хе 64 20 18

АВТ 24 ' 90 8 7 2 2 73х 66 17 15

Контроль 48 64 - ' - 6 4 20 13 74 . 47

Пролактин 48 72 6" 4 5 4 '35 25 54ХЕ£ 39

Гн-РГ 48 . 78 - - 3 ' 2 10 . . 8 68

АВТ 48 83 2 6 — — 18 23 752' 54-

этапе в ороду для культивирования ооцитов, сбалансированную по стандарту, принятому в лаборатории культивирования эмбрионов ВНИИРПС, также добавляв Гн-РГ.

'Через 1,5 оуток пооле оплодотворения зрели яйцеклеток в контрольном варианте ореда (без Гн-ГТ) было обнаружено 23$ зигот, из которых раздробилооь 17,8$. Тогда гак в культуре с Гн-РГ (100 нг/мл) токовых было 37,4$ и 27$ ооотвэтст- ■ зв1Йо. А в среде с ксш;внтрациеЯ Гн-РГ БСО'нг/мя обнаружили 43$ оплодотворенных и 36,7$ раздробившихся оетгатов (табя.§), В остальных клетках ядерный материал находился на продвинутых стадиях мейоза от онафазн до метафазы П.

Таблица 6. Результаты ооемонения оон^тов, ооэревлнх " в приоутствии 1Ъ-РГ

~ Число ооемёненных л^Т.ТЗГ"

Группа . яйцеклеток ' рД

% ___

10 17

11 27 19 36

лгаикчшю: данные гояугони совместно с л.з.саротттгч.

Получощше данные показали возмо;шость повышения опяо-дотворяомсста п&цог.летск вне ортааизпп ¡три «уяътквярований' ' их в среде о 1&-И\.

Контроль 60 14 23

, Гн-РГ, (100 нг/мд) ' 41 15 37

, Гн-РГ' (500 нт/мл) 54 " 23 43

ггт^г п ж-п ____________. .. .. .. ■

выводы

1. Показано, что эффект гонадотрогашх гормонов на дыхательную и стероидную функции зависит ог их дозы и размера овариальных фолликулов. Так, малые дозы ФСГ (5 нг/мл а

500 нг/мл) не оказывали заметного влияния на эти функции, тогда как более высокая его доза (5 ыкг/мл) стимулировала потребление кислорода, выделение углекислого газа и синтез ряда стероидов фолликулярных клеток.

2. Показано влияние пролактина, Гн-РГ и АВТ на мейоз при культивировании овариальных фолликулов коров в среде с гонадотроцннми гормонами. При этом обнаружен, слабоиигибирую-щий (пролактин), нейтральный (АВТ) и стимулирующий (Гн-РГ) эффекты на ядерное созревание интрафолликулярных ооодтов.

3. Отполирующий эффект Гн-РГ на мейоз, по-видимому, определяется его опосредованным влиянием через эстрадиолсин-тетическую функцию фолликулярных клеток.

. 4. Установлено положительное влияние 1>1-РГ (500 нг/ыл) не только на ыейоз, но и на оплодотворяющую способность ооци-тов. Выход дробящихся яйцеклеток, созревших в среде с Гп-РГ, был значительно выше, чем в контроле (35% против 17%). '•

5. Установлено увеличение корреляции в среде о Гн-РГ на фоне ФСГ-ЛГ по таким показателям фолллкулогенеза, как выделение тестостерона и ввделение эстрадаола, потребление 02 я ваделение эстрадаола (от 0,14 до 0,66). Возможно, что Гн-РГ, усиливая ароматизацию, способствует ловшению потребления кислорода фолликулярными клетками.

6. Подтверждены ранее полученные в лаборатории культивирования эмбрионов ВШЙРГН данные о зависимости реиницвацпи мойоза и выхода созревших яйцеклеток от интенсивности выделения СО2 и потребления Og фолликулами.

ШтЧЕШЕ ПРВДСЯЕНйЯ

I, Рекомендуем при проведении научно-исоледовательскшс рчОот jjó дозреванию ооцйто» коров о цея>4> йовЕйенай оплодотворяющего Цфекй fcnófcbátifciaib Ifc-РГ Í50Ó от/йй) в сЬчё^й-«ии о ФСГ/ЛГ (5 мкг/ш и б Щ/мл).

2; Напученные результаты могут быть йклюЧецЫ в кзпро лекций lid вопросам эндокринной peiyjmijm мейоэа в процессе оогенвза для студентов ВУВов зооветеринарного ii биологического про^Млёй.

СПИСОК опубликований* раЙот по теме даосертаций

1. Влияние различных доз ФСГ w дФШнйв и стёроя¿Ó-генез йзогафовагашх q£styti¿id№irijfrÍjai$iÍc¡B jÜbmritohí f¿'é-jitópoB y кбфбй; Д.Х;Еубонк0г,- А;В.СЁгротквд(,' Г.Г:Ге^ошом, В;В;ДШтри'вв,' A;if;Голубйв; // ¿¡а£ ка'^.ра'бот ВЙВИ»; -1989».- - - C.2Ü-32:

2, Корреюгдия различных показателей дыхаййя й стэрог-^оген'еза изол^ованних оваряалгйых фоллюуяоо ко^ов. / А.В'.СироткиЙ,- к.А.Щбёто\ Á^ftvTóJÍyó'és'. •// Bró.Áfiayra.fiatót вншШ; - йШ,- - ъМлвё. - с.-за-зё';