Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гипоталамических нонапептидов на интерреналовые железы лягушек с удаленной передней долей гипофиза и в опытах in vitro

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние гипоталамических нонапептидов на интерреналовые железы лягушек с удаленной передней долей гипофиза и в опытах in vitro"

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ имени И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ЛУКЬЯНЕНКО

Евгения Олеговна

УДК 591.147.6:577.175.349:57.085.1+22

ВЛИЯНИЕ ГИПОТАЛАМИЧЕСКИХ НОНАПЕПТИДОВ НА ИНТЕРРЕНАЛОВЫЕ ЖЕЛЕЗЫ ЛЯГУШЕК С УДАЛЕННОЙ ПЕРЕДНЕЙ ДОЛЕЙ ГИПОФИЗА

И В ОПЫТАХ IN VITRO (МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

Специальность: 03.00.11 — Эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена в лаборатории нейроэндокрииологии (зав. — чл,-корр. РАН, доктор биологических наук А. Л. Поленов) Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова Российской АН.

Научный руководитель — чл.-корр. Российской АН, доктор биологических наук А. Л. Поленов.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук С. П. Гам-барян; доктор медицинских наук А. А. Пузырев.

Ведущее учреждение — Санкт-Петербургский ветеринарный институт.

Защита диссертации состоится 17 марта 1992 г. в 13 часов на заседании Специализированного совета (К-002.89.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Адрес: 194223, Санкт-Петербург, проспект М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан « 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

В. Зуева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Последнее время в связи со значительным загрязненном окружающей среда большое значение приобретает изучение механизмов защити организма от стрессорного воздействии различных внешних факторов. Одним из важных органов, который участвует в реализации защитно-приспособительных реакций организма, является кора надпочечников млекопитающих и её гомолог у Anamnia - интерреналовая железа ПШ). Изучении гипоталамичоских нейрогормональных механизмов регуляции ИРЖ в условиях стресса у амфибий и посвящено настоящее исследование.

ИРЖ представляет собой периферическую эндокринную железу, активность которой регулируется гипоталамусом. Наиболее хорошо изучен трансаденогинофизарный путь регуляции активности ИРК. Регуляция при этом осуществляется следующим образом: нейросекретор-кне клетки гипоталамуса посредством выделения в портальный кровоток передней доли гипофиза ^ПДГ) кортиколиберина и вазотоцина СВТ) стимулируют секрецию АКТГ кортикотропоцитами ( Tonon et al., 1986). АКТГ, в свою очередь, стимулирует секрецию кортикостерои-, дов ИРЖ ( Euponb et el.Д975). В 1962 г. А.Л.Поленов высказал предположение о возможности прямого, через общий кровоток, влияния нонапептидных нейрогормонов гипоталамуса на функциональную активность периферических эндокринных желёз парзаденогипофизар-ным путём, что, вероятно, имеет особо важное значение при сильном или длительном стрессорнои воздействии. Действительно, в настоящее время доказано, что вазопресоин может оказывать прямое стимулирующее, влияние на кору надпочечников млекопитающих fBalla et al.,1985; Woodcock et al ,,1986). Что же касается ИРЖ низший позвоночных, то имеются лишь единичные данные о возможности такого влияния. Так, в опытах in vivo было показано, что ВТ вызывает активацию ИР1 амфибий спустя 10 суток после удаления у них ПДГ, то есть при исключении трансаденогипофизарного пути регуляции ИРЖ (Елифанов и соавт.,1988). Данных об изменении ИРЖ под. влиянием ВТ спустя более длительные сроки после удаления у амфибий ПДГ нам не известно. Отсутствуют так^же сведения об участии в регуляции ЙРЯ у Anamniá другого гипоталамцческого нонапептида -мезотоцина ÍÍ.1T). .

Изучение механизмов регуляции ИРЖ амфибий нонапептидными . нейрогормонами представляет интерес для эволюционной физиологии,

- ц -

поскольку позволяет глубже понять процесс формирования регуляции адреиокортикальной функции в ходе филогенеза, особенно у низших позвоночных.

Необходимо отметить, что определённую трудность для изучения влияния нонапептидных. нейрогормонов на ИРЖ представляет то, что ИРК у амфибий находится в комплексе с сулрареналовой /железой (СРЖ). В связи с этим, согласно представлениям А.Л.Поленова (1978г.), в исследованиях нельзя не учитывать возможность двойного контроля активности периферических эндокринных желез, в ток число и ИРЖ, со стороны гипоталамических нонапептидных нейрогормонов и катехоламинов СРЖ. Кроме того, нельзя исключить и возможность опосредованного влияния нонапептидных нейрогормонов на ИРЖ через СРЖ. Таким образом, при изучении влияния нонапептидов представляется необходимым'одновременное' изучение реакции на нейрогормони как ИРК, так и СРЖ. При атом, по-видимому, целесообразно использование различных методов исследования, в частности, морфометрического и биохимического. Кроме того,'наряду с изучением реакций желёз на нонапептиды в условиях организма, важно'проведение опытов ■ in vitro, которые позволяют исключить возможное влияние на нелезу других биологически активных веществ, и, прежде всего, гормонов. ' Цель и задачи исследования.

Основной целью настоящей работы является изучение возможности прямого парааденогипофизарного пути влияния нонапептидных нейрогормонов гипоталамуса на функциональную активность ИРЖ амфибий на примере травяной лягушки Rana temporaria. Поскольку ЮТ расположена вместе с СРВ и катехолёмшш последней .могут оказывать влияние на корт'икостероидогенеэ, предполагалось также изучить реакцию СРЖ на нонапептиды.

Для выполнения намеченной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать влияние инъекций МТ и ВТ на состояние ИРК лягушек с удалённой ПДГ в условиях in vivo . '

2. Исследовать влияние.различных концентраций МТ и ВТ на функциональную активность ИРЖ в,условиях in vitro.

3. Исследовать влияние адреналина и его сочетаний с МТ и ВТ на' Функциональную активность ЙР1 в условиях in vitro.

4. Исследовать влияние инъекций-'Ш! и ВТ на состояние CPI'in vive 5., Исследовать влияние различных концентраций МТ и ВТ на функ- '

циональную активность СРЖ в условиях in vitro . Основные положения, выносимые на защиту.

1. ВТ в стрессорншс концентрациях в опытах in vivo и in vitro ■ оказывает прямое активирующее влияние на функциональную активность ИИ травяной лягушки.

2. МТ в отреосоршх концентрациях в опытах ín vivo и in vitro не оказывает влияния на функциональную активность ИИ и CPS.

3. ВТ в стриссорной концентрации в опытах in vivo и.in vitrootca-зывает активирующее влияние на функциональную активность CPS. .

4. МТ в концентрации, значительно превышающей стрсосорную, в." опытах in vitro оказывает икгибирующео влшшио на функциональную активность СРЙ.

Научная новизна результатов.

В данной работе приведены новые факты, демонстрирующие влияние гипоталамического нонапептида - ВТ на активность ИРЖ амфибий. Так, было показано, что ВТ активирует ИР2 амфибий спустя два месяца после удаления ПДГ. Впервые в эксперименте, проведённом в условиях in vitro , цорфометрическим методом показана активация ИРЖ амфибий в ответ на введение в культуральную среду ВТ. Впервые установлено, что МТ не сказывает существенного влияния на функциональное состояние ЙРЖ неолерировапных лягушек и особей с удалённой ПДГ. Аналогичные результаты получены в опытах, проведённых в условиях in vitro . Впервые исследовано влияние нона' пептидных нейрогормонов на СРЖ амфибий в условиях in vivo и " in vitro . Показано, что ВТ в стрессорной концентрации стимулирует функциональную активность CPS; МТ в стрессорной концентрации не оказывает влияния, а в концентрации, значительно правы- •• тающей стрессорную,- ингибирует активность СРЖ амфибий. Теоретическая и практическая значимость работы.

Результаты работы вносят,вклад в понимание процессов регуляции функций периферических эндокринных желёз гипоталамичеокими нона-пептидами филогенетически древним парааденогипофизарным путём. Они показывают различное участие нонапептидных нейрогормонов гипоталамуса - ВТ и МТ - в процессе регуляции функциональной активности HPS амфибий. Результаты предварительных исследований по влиянию одного адреналина и сочетаний его с нокапептидами на HPS и СРЖ, полученные в опытах in vitro , свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения вопроса о значении взаимодействия нонапептидных нейрогормонов и-натехоламинов в регуляции функций

периферических эндокринных келёа. Полученные в работе результаты используются в курсе лекций по нейроэндокрииологии в Санкт-Петербургском государственном университете и в Педагогическом университете имени А.И.Герцена. Кроме того, в ходе исследования била разработана новая методика культивирования "надпочечников" лягушек в условиях in vitro , которая может быть использована в научных экспериментах. Апробация работы.

Материалы диссертация были доложены на Ленинградском городском семинаре по нейроэндокринологпи (1989г.), на заседаниях Ленинградского общества анатомов, гистологов и эмбриологов (1989--1991г.), на ХУ конференции Европейского общества сравнительных эндокринологов (1990г.), на III Всесоюзном симпозиуме "Физиологическое и клиническое значение регуляторпых пептидов" (Горький, 1990г.), на X конференции, посвященной памяти академика Л.А.Орбе-ли (Ленинград, 1990г.), Объём и структура работы..

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объект'а и методик исследования, изложения результатов собственных исслодовапий, обсуждения результатов,'заключения, выводов и списка испольаовашшй литературы. Материалы диссертации изложены на 158 страницах машинописного текста, включая таблицы и-рисунки, в том числе 34 микрофотографии. Список использованной литературы состоит из 209 источников, в той числе 17'¡ иностранных. ■

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования служили половозрелые лягушки - самцы капа temporaria., массой около 30 грамм. .

Эксперимент in vivo .

Опыты проводились' на неоперированных лягушках (контрольная группа) и особях с удалённой ПДГ (подопытная группа), которые в j течение ноября-января содержались в банках с небольшим количеством води при температуре +15°С. Удаление ПДГ проводили по матоди-; ке, описанной Б.Н.Савченко (1977). . "' Воздействие го£ио}тльнцх_веп1бствл

■ В этих опытах использовали кеопорировашшх лягушек и особей . опусти два месяца после удаления у них ПДГ. Обе группы животных были разделены на четыре подгруппы'(по. 6.-9 животных). Каждая подгруппа состояла из лягушек, которым : I ~ не делали инъекций, 2 - вводили физиологический раствор (ФР) длп поШсилотершшх

швотных (I'-Ю мМ HaCl, водный раствор), 3 - вводил» МТ, 4 - вво-цили ВТ. МТ и ВТ растворяли в ФР в концентрации I нМ/мл, ФР и гормональные препараты вводили внутримышечно в количестве 0,5 мл/ [00 гр веса лягушки. Вводимая доза ноИрогормона (5 uM/кг) является близкой к стрессорной, поскольку уровень нейрогормона в периферической крови лягушки при стрессе - 0,1 - I нМ/л (B>»ntley ,' 1971; Nouwen , Kuhn,I985). Инъекции проводили три pasa о интервалами в 30 минут. Через 30 минут после последней инъекции лягушек декапитировали. Для исследования у них брали почки с "надпочечниками" и кровь.

Гистологическив и мо^омм£иче£кие_методш:и.

Одну" почку от каждой лягушки фиксировали в жидкости Буэна и после обычной обработки заливали в парафин. Срезы толщиной 5-6 мим окрашивали по методике азан по Гейдеигайну. Отдельно проводили анализ периферической СПЗ) и внутренней (ВЗ) зон НР1. Параллельно изучали состояние СП. Исследование полученного материала заключалось в обшей морфологической оценке состояния желёз и в морфометрическом анализе. ■

При морфометрическом анализе каждой зоны ИРЖ, á такие СРЖ определяли размеры ста клеток и их ядер. Площадь клеток определяли по отношению стандартной ллоипди сеточки (6'+00 шш'~) к количеству ядер клеток, попавших в неё. Объём ядер вычисляли по формуле эллипсоида вращения. Все измерения производили при увеличении иммерсионного объектива xIOO.

Биохимические методики^

Вторую почку с "надпочечником" от каждой лягушки использовали для определения содержания в "надпочечнике" катехоламинов (адреналина и норадреналина) и диоксифенилаланина (ДОФА) спектрофлуо-риметрическам методом.

Радиокммунологически определяли содержание кортикостерона (КС) в плазме крови лягуыек с использованием коммерческого набора реактивов РИН-В- Н.

Эксперимент in vitro .

Опыты проводили в ноябре. У акклимированиых к комнатной температуре лягушек сразу после декапииации извлекали почки с "надпочечниками" и рассекали их'вдоль железы приблизительно пополам. Полученные части помещали на бактоагаровую подложку в лунки камеры, залитые '0,5 мл культуралькой среды. 1% раствор бактоагара готовили на водном растворе Нерея (8 мМ; 'NaOH до рН=7,4). Сое-

тип культу paльной питательной среди: Среда 19ЭМ - 38%, бычья эмбриональная с.иворотка - 2/S, деионизировашшя вода - W¡&.

Предварительную инкубацию проводили в течение 60 кинут а двух сиенах культ,урэлышй средн. В опытах одна половина "надпочечника" служила контрольным, g другая - подопытным образцом. Последующую инкубацию в течение 90 минут (21°С) проводили для контрольного образца - в культуральной среде, а для подопытного - в культуральной среда с добавлением одного или двух гормонов.

Била исследована реакция ИМ и С PK на следующие гормоны и их сочетания:

1. Адренокортикотропнмй гормон^^ f АКТГ) - 10 нМ/л,

2. Вазотоцин ÍВТ) - 0,1, I, 10 нМ/л, '

3. Мезотоцин CUT) - Q,I, I, 10 кМ/л,

4."Адреналин - 0,1 ыкМ/л (выбранная концентрация адреналина соответствует уровню этого нейрогориона в плазме крови амфибий при стрессе ( Withers et el., 1988),'

5. Адреналин - 0,1 ыкй/л j вазотоцин -'I нМ/л, . ' Адреналин - 0,1 ик!1/л + вазотоцин - 10 нМ/л, •

6. Адреналин - 0,1 шШ/л + ыеэотоцин - I нМ/л, . Адреналин - 0,1 ыкМ/л + иезотоцин - 10 нМ/л.

По окончании опытов объекты (по б - 8 пар половинок "надпочечников" в каждом опыте) фиксировали в жидкости Буэна и после обычной обработки заливали в парафин!,. Морфологический и морфоиетри-ческиН анализы проводили так же, как и в эксперименте in vivo •.

Достоверность различия полученных дашшх в опытах in vivo определяли с помощью метода Манна -Уитнзя, а в опытах in vitro -путём сравнения попарно сопряжённых вариантов (А'шиарин и соавт., 1971} Болыаов, Йиирнов, 1983)., ' ;.

РЕЗУЛЬТАТ»'ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.-В ИРЖ интактных травяных лягунек из всех серий опытов по ■• морфо-^ункционалышм признакам отчётливо выделяются ПЗ и ВЗ, что ранее било описано в работе Hanke и Weber (1965) на том же • объекте. ■

I. Эксперимент in vivo . '

■ ■■ Влияние удаления передней доли гипофиза на .состояние "надпочечника".

Результаты иссле?,оьаний показали, что спустя два месяца после удаления ПДГ состояние ИPI лягушек резко изменилось: достоверно. (р<0,05) уменьшился объём ядер клеток ПЗ и ВЗ (Рис.1), причём в

мкм

□пздвз Ыпдг удалена

О ФР МТ ВТ

О ФР МТ

Рис.1. Результаты исследования неоперированннх лягушек и особей с удалённой ПДГ, которым не делали инъекций (0)а или вводили ФР,МТ и ВТ. А - объём ядер клеток ИРЖ, Б - концентрация КС в плазме крови неоперированннх лягушек, В - концентрация КС в плазме крови лягушек с удалённой ПДГ. I I'- группы различаются достоверно Ср<0,05).

Здесь и далее результаты представлены в виде М+_м.

Па уменьшилась и площадь'клеток (р<0,05), их цитоплазма стала сильно вакуолизировашюй, а ядра деформировались. Кроме того, в плазме крови лягушек понизился уровень КС (р<0,05). Полученные нами результата, а также данные других исследователей (Hanke , Weber , 1965; Елифанов и соаьт., 1988) свидетельствуют о снижении функциональной активности ЙРЖ после удаления 1Щ\ то есть при исключении трансадоногипофиэарного пути регуляции ИРК.

В отличие от ИРЖ, состояние СРЖ но изменилось после удаления у лягушек ПДГ (Рис.2). Это согласуется с результатами других авторов (Burgos , 1959; Bourgeois et al I9?8) и говорит об отсутствии зависимости активности СРЖ от гормонов ПДГ.

Инторреналовая железа. .

Влияние, ъаэотошшь Результаты эксперимента показали, что у лягушек обеих групп (неоперированныа и с удалённой ПДГ) в ответ' на введение ВТ (5 нЦ/кг) произошли'.значительные изменения в состоянии ИРК, свидетельствующие о её активами: снизилась'степень вакуолизации цитоплазмы клеток, достоверно (p<0,Qí¿) увеличились размеры их ядер (что особенно выражено в клетках ПЗ железы), креме того, достоверно (р<0,05) 'возрос уровень КС в плазме крови.

В исследовании А.В.Елифанова и соавторов (1988) было показано, что инъекции ВТ в той ко дозе гипофизэктомированной стерляди я-лягушкам о удалённой ПДГ (спустя 10 дней после операции)-также привадит к активации ИРЖ и повышению концентрации КС в плазме крови. . • ' -

Таким образом, сопоставление наших.и литературных данных свидетельствует о возможности прямого влияния ВТ на функциональную активность ИРЖ амфибий, а также 'о том, что реакция ИРЖ на ВТ не зависит от срока после удаления ПДГ. , ■ ' ;.

Влияние ыезотоцинаА В результате эксперимента, проведённого на неоперироканиых лягушках й особях с удалённой ПДГ, достоверных отличий от контроля в состоянии ИРЖ подопытных животных, • инъецированных МТ, выявлено но было.

В литературе мы не нашли данных по влиянию МТ на ИРЖ амфибий в условиях in vivo ; результаты опытов с введением ЦТ и его' гомо-. лога, окситоцина, полученные на животных других классов, весьма противоречивы.

Су п ра ре н а л о в а я :ка лаза.

Влияний вазотопин;^ Результаты наших исследований показали, ' после введения ВТ (5 нМ/кг) уровень иорад'раналина и ДОФА в ."над-

umr

100

50

A

ЫКГ

2-

I

I I- кооперированные 1—' лягушки ПДГ удалена

I

\

\ \ \ \ \

О О ФР МТ ВТ

О ФР МТ ВТ О ФР МТ ВТ

Рио. 2. Результаты исследования неоперировашшх лягушек н особей с удалённой ПДГ, который не делали инъекций (0) или вводили ФР, МТ и ВТ. А - объём ядер клеток СРЖ, Б - содержание адреналина в "надпочечниках" (в мкг на.железу), 1 Г-1- группы различаются достоверно (р<0,05).

IIQ

100-

А

-ь

но

IOQ

90

olOXIJICL. о

7

/ / /

/ £

JgJ - АКТГ □ -ВТ

а - мт

"10 0,1 .1 10 -нМ/л . 0,1 I 10 0,1 I 10 нМ/л

Рис.'З. Изменение объёма ядер клеток внутренней зоны ИРК СА) н клеток СРЖ ГБ) после воздействия гормонами в-различных концентрациях в эксперимента in.vitro . к - контроль (Ю0%)\ точкой показано, что подопытная подгруппа достоверно (р<0,05) отличается от контрольной.

почечниках" лягушек не изменился, однако произошло достоверное (pt0,05) повышенно содержания адреналина в "надпочечниках" как {»¡оперированных лягушек, так и особой с удаленной ПДГ. Кроне того, у кивотных с удалённой ПДГ достоверно Ср<0,05) увеличился объём ядер хромаффтншх клеток;. вероятно, ВТ повышает активность синтетических процессов в хромаффпшшх клетках CPS.

Сходные результаты били получены в исследовании И.С.Константиновой и соавторов (1988), в .котором Сило выявлено- увеличение объёмов ядер клеток CPä у- неоперпровяшшх лягушек и у особей с удалённой ПДГ (спустя 10 дней после операции) после инъокшШ ВТ в той же дозе.

Влияние мезотодигеь Состояние С РЖ лягушек обеих групп но изменилось после введения животным МТ в дозе 5 нМ/кг. В литературе мм не нашли данных о влишщи МТ на СРК амфибий.

Результаты исследований по .влиянию вазопрессина и окситоцпна на хромаффишшо 'клетки мозгового всиостлп надпочечников млеко-■• питавших немногочисленны и противоречивы.

2. Эксперимент in vitro .

Инторреналовая келеза.

Воздействие AKTL\ . Для проверки возможности функционирования ИРЖ в условиях in vitro мы исследовали реакцию её на АКТГ. Результаты анализа показали, что при введении АКТГ в культуральну ю среда f 10 н1,!/л) произошла активация ИРЖ, что проявилось в достоверном (р<0,05) увеличении.объёмов ядер клеток ПЗ и БЗ (Рис.3). Полученный результат свидетельствует о том, что в условиях in vitro сохраняется способность ИРЕ "надпочечников" к реакции на воздействие адекватного агента.

Воздействие вазотодина^ Морфометричеокий анализ выявил достоверное (р<0,05) увеличение объёмов ядер клеток ВЗ ИРЖ при воздействии ВТ в концентрациях 0,1 и I нМ/л, -причём реакция железы на меньшую концентрацию ВТ была выражена сильнее (Рис.3). Содержание ИРЖ в культуральной средо с добавлением ВТ .в концентрации 10 нМ/л не вызвало изменений в её состоянии. Результаты этих . исследований свидетельствуют о непосредственном активирующем влиянии ВТ в стрессорной концентрации на ИРЖ лягушек.

В литературе мы не обнаружили морфологических исследований влияния нейрогормопов на ИРЖ в,условиях in vitro . Однако, биохимическими методами было показано, что добавление ВТ в течение 15-20 минут в перфузиоикую среду шзпвает повышение секреции кор-

тикостероидпых гормонов фрагментами "надпочечншшв" лигулчнс '(Lurcher et al 1989; Kloee et в! .,1990). Нами результаты •огхичаотвя от данных других авторов геи, что в условиях о пово-ишшои концентрации ВТ наблюдалось снижение реакции ИРХ на ВТ, в то время как в литература описана обратная тенденция (Kloaa

et al, 1990). Можно предположить, что наблюдаемая в нашем акс-яорш.ю-нте реакция колени связана со значительной (90 минут) продолжительностью воздействия ВТ на liPt; недавно било показано,чти при длительном воздействии ВТ на HPS чувствительность eîi к этому нонапептиду спивается (Larcher et al 1989). • . ' '

Наин и литературные данные свидетельствуют о тон, чти степень реакции ИРЖ зависит как от концентрации воздействующего пейро-

• гормона, так и от длительности его воздействия, а, кроме того, доказывают возможность прямого (параадоиогиио&изариим путём) участия ВТ в регуляции активности ИРЖ .амрибип.

Воздействия мезотоциши Существенных различий в состоянии , клеток ИРХ подопытных и контрольных образцов в опытах с jвведением в культуральную среду Ш' в концентрациях 0,1, I и 10 н'!/л не выявлено.

3 исследованиях других авторов наблюдалась реакция HPS на введение I.1T в условиях in vitro, но при очень высокой концентрации MÏ (выше 10 нМ/л (Larcher et al, 1990) И I ltldJ/Jl (Xlcae

• et al,, 1989). По-видимому, HT. но оказывает значительного влияли»! на функциональную активность ПРИ амфибий, по сравнению с ВТ.

Воздействие а;Д£оналина_и_его_сочетаний_с_в£зотоци1тм_:1_мозо-тишщои. В опытах о введением в культуральну.ю среду адреналина ■ (0',1 uicïi/л) и его сочетаний с ВТ или МТ ("I и 10 нМ/л) не было

выявлено достоверных различи!! в состоянии, клеток I1PH контрольных ' и подопытных образцов. Такии образом, результаты исследований показали, что в опытах in vitro один адреналин в выбранной концентрации но оказывает заметного влияния на ИР1. Однако, из ли, торатуры известно (Horra et-al ., 1990), что адрёналнн в значи-• тедыю более высокой концентрации (J мМ/л) оказывает ингибирущеа влиянии на кор'гикостароидогенез фрагментов "надпочечников" амфибий.-

Результаты совместного введения адреналина и ВТ показали, что адреналин как бы снимает активирующее влияние ВТ на И РЖ. Подобный блокирующий эффект катохолащцш; был отмечен в опытах, in vitro на "надпочечниках" Кипа rUibunda. Так, введение в перФузионнуи сре;ду дофашша блокировало влияние ангиотонзнна II на кортикосте-

роидогенез (Morra et al 1990). Полученные данные позволяют предполагать, что катехолашшы и, в частности, адреналин могут снимать влияние гормонов и нейрогормонов (например, ВТ) на функциональную активность HPS. Подобное изменение реакции железы при одновременном введении в среду нескольких нойрогормонов ыокет бить отражением их сложного взаимодойствия, существующего в организме. . ' ■ ' . -

Супрареналовая жолчза. .

Воздействие ЛКТГ. Добавление АКТ? f10 нМ/л) в. культурэльную среду не вызвало достоверных изменений в состоянии CPÄ,- что свидетельствует об отсутствии зависимости её активности от ЛКТГ.

Воздействии; вазотоцшшА Результаты исследований показали,' что в условиях'in vitro достоверное (p<0l05) увеличение объема ядер клеток CPÏ происходит только при концентрации ВТ I кМ/л (Рис.3), при концентрации ВТ 0,1 и 10 нМ/л изменений в состоянии CPÄ но наблюдается. Полученные результаты позволяют предположить, что наряду,с нервноироводниковой (Wilson , Kirnhner, 1977), существует также и нейрогормональнап регуляция активности СPI, вероятно, она проявляется именно в условиях жёсткого стресса, когда концентрация ВТ в плазме крови амфибий достигает величины, близкой I нМ/л (Bentley , 1971). Отсутствие реакции СРК на ВТ в-моцьшей концентрации (0,1 нМ/л), возможно, объясняется тем, что ь норме ВТ присутствует в хромаффинных клетках амфибий примерно в такой кс. концентрации, что было показано в биохимических исследованиях на "надпочечниках" Rena ridibunda (Larcher èt al 1989).

Вероятно, существует возможность опосредованного влияния ВТ на СРХ через ИР1. Так, на примере птиц н млекопитающих было показано, что кортикостероидные гормоны участвуют в процессе метилирования норадреналина при его превращении в адреналин (Стаб- ' ровский, 1968; Шаляпина, 1979)¡ Однако, биохимические исследования., проведённые на лягушках, не подтвердили зависимости биосинтеза катехоламинов от активности ИР1 у амфибий (Bourgeois et al., •1978). Видимо, необходимо дальнейшее изучение механизмов регу- . ляции ВТ активности CPS у амфибий. '

ВоздеЙ£Твие мезотодинал Состояние СРЖ не изменилось при инкубации в среде, с добавлением МТ в концентрациях 0,1 и I нМ/л. Только при концентрации МТ 10 нМ/л произошло достоверное (р<0,05") снижение объёма ядер хромаффинных ¿слеток. Полученные результаты

Рис. h. Гипотетической схема регуляции НРЖ и СРЖ нонапоптидними нейрогормошши.

----активирующее влпншш АКТГ и ВТ на активность HPS,

------предполагаемое активирующее влияние ВТ на СРЖ,

*-----предполагаемое тормозное влияние ИТ на активность. CPI,

>----предполагаемое блокирующее влияние адреналина (А) на

.действие ВТ на КИ.

Дополнительные сокращения: ГГНС - гипоталамо-гипофизарнан нейросекроторная система, ЗДГ - задняя доля гипофиза, КЛ - кор-тиколиборин, ИСК - нейросекроторная клетка, СВ - срединное 'возвышенно, ПрДГ - промежуточная доля' гипофиза. , ■■

свидетельствуют о том, что в высокой концентрации ИТ может оказывать икгпбнрующое влияние на активность СРЖ-.

Каких-либо данных но влиянию МТ на СРЖ амфибий в литературе нет'. Результаты'исследований по влияли» оненгоцинд на хроиаффин-ние клетки мозгового вещества надпочечников млекопитающих немногочисленны и противоречивы. •

Воздействие ад£еналина_и_его_сочет£ний_с_вазото1щн£м_и_им,о-топином. В опытах с введением в кулътурэльную среду адреналина (0,1 мкМ/л) и сочетаний его о ВТ или с МТ (I и 10 нМ/л) «в было выявлено достоверных изменений в состоянии CPS. Результаты исследований свидетельствуют о том, что в данных условиях эксперимента адреналин не оказывает значительного влияния на СРЖ.

В этом опыте, как и в случае-с ИРЖ, совместное введение в культуральную среду адреналина с нонапептидаии приводит к тому,что

эффект последних на СРЖ не проявляется. То есть, адреналин как бы блокирует в'лняшю ВТ и МТ на CPI. Подобное блокирование адреналином действия окситоиина. было получено в опытах на молочной железе (Толкунов, 1987).

Таким образом, приведённые результаты наших экспериментов и немногочисленные данные из литературы свидетельствуют в пользу представления А.Л.Поленова (1979) об универсальности принципа нейрогормональной регуляции - взаимодействия нонапептидннх и моноаииновнх (катехоламинсв, в частности) кейрогормонов на уровне клеток мишеней.

На основании собственных и литературных данных была построена гипотетическая схема (Рис.'О регуляции ИРЖ гипоталамическими нонапептидами транс- и парааденогип0физе[рным путями. В схеме отражена возможная роль адреналина (главного катехоламина, выделяемого при стрессе) в этом1 процессе,, а также показано пред-. Полагаемое влияние нонапептидннх нейрогормонов на СРЖ.

ВЫВОДУ:.

1. В интерреналовой нелезе половозрелых особей травяной лягушки ¡tena temporaria различаются две зоны. Периферическая зона состоит из клеток со слабо вакуолизированной цитоплазмой и овальными крупными ядрами и ядрышками. Внутренняя зона содержит клетки с вакуолизированной' цитоплазмой и небольшими неправильной формы ядрами с маленькими ядрышками. Клетки обеих зон отчётливо pea- • тируют на различные воздействия-.в экспериментах, проводимых в условиях как in vivo , так и in vitro .

2. Спустя два месяца после удаления передней доли гипофиза у лягушек наблюдается значительная инактивация интерреналовой железы, которая проявляется в повышении вакуолизации цитоплазмы клеток, изменении формы их ядер, а также в уменьшении размеров клеток и их ядер. Инактивация интерреналовой железы сопровождается снижением концентрации кортикостерона в плазме крови. Изменений в состоянии хромаффинных клеток супрареналовой железы в тех же условиях эксперимента выявить не удалось.

'3. Введение вазотоцнна в дозе 5 нМ/кг как неопорированным лягушкам, так и особям с удалённой передней долей гипофиза .(спустя два'месяца поело операции) вызывает активацию интерреналовой железы, которая проявляется в-снижении вакуолизации цитоплазмы клеток и увеличении объёма их ядер, причём изменения наиболее ярко выражены в периферической зоне железы и сопровождаются

повышением концентрации кортикостероиа в плазме крови. » В опытах in vitro введение в культур,альную среду вазотоцина .в стрессорных концентрациях 0,1 и I нМ/л такие вызывает повышение функциональной активности янтерроналовой колези, о чей свидетельствует увеличение объёма ядер оё клеток. При этом изменения , более выражены во внутренней зоне железы, чем в периферической.

4. Введение в культуралыгую среду в опытах in vitro мазотоцина в концентрациях стрессорных и значительно превышающей стрессор-нув /'O.I, I и 10 нМ/л), а также ого введение кооперированным лягушкам и особям с удалённой передней долей гипофиза в дозе 5 нМ/кг не оказывает влияния на функциональное состояние интерроналовой железы.

5. Ваэотоцин участвует в прямой регуляции интерреналовой аелази филогенетически древним парааденогшюфизарннм путём. Сравнение действия вазотоцина и мезогошша на интерроналовую железу в условиях наших экспериментов показало, что, в отличие от вазотоцина* мезотоцин не оказывает непосредственного влияния на эту железу.

6. Введение вазотоцина в дозе 5 нМ/кг как неоперировзшшм лягушкам, так и особям с удалённой передней долей гипофиза .вызывает активацию супрареналовой железы, которая проявляется в повышении количества адреналина в "надпочечниках". Кроме/того, у лягушек

с удалённой передней долей гипофиза выявлено увеличение объёма .ядер хромаффинных клеток. .

Б условиях in vitro введение в культурадьную среда вазотоцина в концентрации I нМ/л также активирует хромаффшнше клетки супрареналовой железы, что проявляется в увеличении обьёма их ядер. При концентрации вазотоцина в культу.ралъной среде 0,1 и 10 нМ/л достоверных изменений в функциональной активности этой железы не наблюдается,

Полученные данные свидетельствуют о том, что только высоко стрессорные концентрации вазотоцина (характерные для жёсткого стресса) стимулируют функциональную активность супрареналовой келезц.

7. Введение мезотоцина в дозе 5 нМ/кг как неонериравашшы лягушкам, так и особям с удалённой передней долей гипофиза не вызывает изменений в функциональном состоянии супрареналовой железы.

В условиях in vitro введение в культуральную среду мезото-цина в концентрациях 0,1 и 1 н!,1/л такие не вызывает' изменений в функциональном состоянии супрареналовой железы, В концентрации

10 нМ/л (значительно превышающей стрессорную) мезотоцин инакти-вирует супрареналовую железу, что проявляотся в снижении объёмов ядер хромаффинных клеток. •

8JB условиях in vitro адреналин в концентрации 0,1 икМ/л, а такко сочетание его с мозотоцином или вазотоцином в концентрациях I и 10 нМ/л не вызывают изменений в функциональном состоянии интор- и супрареналовой желёз. Данные опытов по одновременному введению адреналина и нонапептидов свидетельствуют'о том, что этот катохолашш снимает' эффект действии вазотоцшш и мезотоцина на интер- и супрареналовую жолезы. Результаты опытов позволяют предположить, что регуляция интер- и супрареналовой желёз осуществляется при взаимодействии катехоламиновых и нонапептидных нейрогормонов, 1 •

' По теме диссертации опубликованы и переданы в печать следующие работы;

П Лукьяненко Е.О., Беленький М.А., Поленов А.Л. Реакция железистых клеток интерреналовой железы лягушки Dana temporaria на адренокортикотропннй гормон,.аргинин-ваэотоцин и мезотоцин в опытах in vitro // Тез. докл. Всесоюзн. симпозиума '.'Физиологическое и клиническое значение регуляторннх пептидов".- Горь-' кий, 1990.- С. 112.' .

2. Лукьяненко Е.О., Беленький М.А. Влияние аргинин-вазотошша на кптерреналовую железу лягушек Rana temporaria in vitro

// Тез. докл. X Всесоюзного совещания, посвященного памяти академика Л.А.Орбели.- Ленинград, 1990.- С.333. ...

3. Лукьяненко Е.О., Беленький М.А., Кравцов A.A., Поленов А.Л. Влияние инъекций аргшшн-вазотоцина и мезотоцина на состояние интерреналовой нелозы лягушки Baña temporaria спустя два месяца после удаления передней доли гипофиза, //Журнал эвол. биохим. и физиол..- 1992.- 28, К I.- С..123-125. . .

•Лукьяненко Е.О., Прозоровская М.П., Боленышй М.А., Поленов А.Л. Влияние вазотоцииа-.и мезотоцина на супрароналовую железу . 'травяной лягушки..// Журнал эвол. биохим. физиол..- (в печати). 5. Лукьяненко Е.О., Поленов А.Л. Влияние вазотоцина, мезотоцина и адреналина на интер- и супрареналовую железы травяной лягушки., в опытах in vitro. // Журнал эвол. биохим. физиол..- (в печати).

ILíSIlOO^V