Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние факторов криоконсервации на гидратацию глобулярных белков

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марковский, Александр Леонидович

Введение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Характеристика сил, действующих на биосистемы при криоконсервации.

2. Критерии выбора защитных веществ-криопротекторов

3. Молекулярные аспекты крпопротекции биосистем . . 29 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4. Материалы и методы.

5. Влияние концентрации и молекулярной массы на диэлектрические и гпдратацпонные свойства растворов криопротекторов.

6. Влияние криопротекторов на структурное состояние сывороточного альбумина и иммуноглобулинов

7. Влияние факторов криоконсервации на структуру и свойства нативных иммуноглобулинов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние факторов криоконсервации на гидратацию глобулярных белков"

В настоящее время уровень молекулярных основ крпо-бпологпп - наукп, изучащей проблемы сохранения жизнеспособных бпосистегл под действием нпзкпх тегшератур, - еще недостаточен для объяснения совокупности процессов, приводящих как к повреждениямр так п крпозащпте, п требует более детального анализа с позиций физико-химической бпологпп.

Успехи в области хранения биообъектов при температуре -196°С позволили по-новому подойти к вопросу о роли воды в живых системах п предложить методы повышения выживаемости /1,219/. Общепринято /8,61/, что выживание крпокон-сервированных биообъектов обычно зависит от двух факторов: температурного - возможности контролировать скорости замораживания - отогрева и от специфической обработки биообъектов, по крайней мере, одним химическим агентом - крпопро-тектором.

Традиционный подход к вопросу крпоконсервацпи биообъектов - снижение повреждающего действия кристаллов льда и обусловленный этим фактором выбор антифризов и скоростей замораживания - отогрева /179,30/ - в настоящее время претерпевает значительный поворот в сторону количественных фпзпко-хпшческпх параметров, характеризующих процессы крпоконсервацпп. Основная заслуга в этом направлении принадлежит крпобиохимпп - наукп, изучающей влияние низких температур на реакционную способность биоспстем при условии компенсации физико-химических параметров среды к их значениям в нормальных условиях /24/. Исследования в этом направлении дают криобиологии очень ванную информацию о прямом действии низкой температуры на кинетические параметры ферментативных процессов в бпосистемах /47,73/.

Существующая на сегодняшний день практика криокон-сервацпи биообъектов базируется не на точных количественных фпзпко-хпглпческпх параметрах среды консервации как до, так и после охлагденпя « отогрева, а на эмпирически подобранных концентрациях крпопротекторов и скоростей заморагл-ванпя - отогрева.

В общих чертах, физико-химический анализ процессов, происходящих црп криоконсервацни доляен включать: а) явления, обусловленные взаимодействием биосистемы с водным раствором крпопротектора, в общем плане это касается поведения биоструктур в смешанном растворителе; б) поведение биоспстем, обусловленное снижением температуры до образования льда; в) механо-фпзические ешшэкты, обусловленные кристаллообразованием среды.

Как показывает анализ литературных данных, большинство авторов /94,88,185/, обсугдая возмопные механизмы крпозащпты п крпоповрецценпя биоструктур различного уровня организации, не рассматривают исходное состояние этих структур перзд охлагдением, обусловленное контактами со средой с измененными параметрами. К таким параметрам среды, имеющим первостепенное значение в поддержании структурной целостности и функциональной активности бпосистегл, следует отнести: диэлектрическую проницаемость среды, дсфпльность молекул крпопротекторов (иалпчие гидрофобных и гидрофильных групп), растворимость молекул крпопротекторов, соотношение свободной и связанной воды в крпопротектпрующей среде, активность понов в растворах криопротекторов, кислот-но-ооновной баланс п рН-зависимость в среде.

Биофизический подход к анализу процессов взаимодействий бпоспотегл в среде с измененными параметрами основывается на привлечении таких вакнейших физико-химических характеристиках, как водородные, электростатические и гидрофобные взаимодействия /48,110/.

Учитывая большой прогресс в понимании поведения изолированных белковых структур в смешанных растворителях /13, 52,63,34/, мы поставили перед собой цель провести исследование стабильности подобных систем для некоторых щшопро-текторов с учетом измененных параметров среды.

Известно /90/, что стабильное состояние белковой глобулы зависит от сил меплолекулярных электростатических взаимодействий в растворе. Исследования диэлектрических свойств среды в микроволновом диапазоне позволяют получать информацию о характере сил, действующих на включения среды, о гидратации понов и макромолекул. Так как вещества, применяемые в криобиологии (криопротекторы), изменяют диэлектрическую проницаемость среды, то, очевидно, что биосистемы, находящиеся в контакте с ними, будут изменять своп физико-химические свойства. Погашение температуры, в свою очередь, такие изменяет физико-химические параметры среды, что, по-видимому» долзшо сказываться на структурно-функцпоналышх свойствах биообъектов.

Влияние криопротекторов на молекулярном уровне биообъектов во многом остается неисследованной областью криобиологии /213,220/. Предполагая, что криопротекторы могут влиять на структуру биомакромолекул путем непосредственного взаимодействия ляп в результате изменения свойств растворителя /33/, мы полегл по изучению такого интегрального параметра, так количество связанной воды биополимером, оценить возможность этих взаимодействий.

Определение корреляции мепду изменением как осповных параметров среды, так и уровня структурно-функциональных свойств бпосистем является для криобиологии основной проблемой в развитии теоретических представлений о молекулярных механизмах криозащпты.

В связи с вышесказанным, целью настоящей работы явилось изучение структурных изменении глобулярных белков под действием крпопротекторов и заморадпвания - отогрева.

В работе были поставлены задачи исследовать: диэлектрические и гидратационные свойства крпопротекторов в зависимости от молекулярной массы и концентрации; влияние глубокого заморашвания на спектроскопические свойства глобулярных белков; влияние крпопротекторов на мпкроокрупенпе и гидратацию изолированных белков; влияние факторов крпокон-сервацпи на гидратацию и специфическую активность нативных иммуноглобулинов.

В качестве объекта исследования были выбраны такие глобулярные белки, как альбумин и иммуноглобулины, которые обладают не только специфической структур011, но и функциональными особенностями в организме.

Сывороточный альбумин - крупный мономерный белок, состоящий из трех функциональных доменов в одной полппеп-тпдной цепи, - выполняет вашше транспортные функции, является "универсальным" комплексообразователем /55/. Еммуно-глобулпн ( Уд & ) - олпгомерный белок. Четыре полппептццнне цепп молекулы расположены такш образом, что обра« зугот трп большие области: две идентичные Faß - области, калдая из которых содержит антигеневязнващпй центр и одна Fe - область, участки которой ответственны за связывание коглплеглепта, проникновение через мембраны и другие ватные функции.

Для определения диэлектрических параметров растворов криопротекторов и биополимеров был использован метод диэлектрической радиоспектроскопии, являюцпйся одним из наиболее чувствительных методов физико-химического исследования веществ /38,151,192/. Для характеристики структурного состояния и изменения в блпгайшегл окружении исследуемых глобулярных белков были использованы методы дифференциальной спектрофотометрпи, сольвентной пертурбационной дифференциальной спектроюотометрип и собственной флуоресценции белков /23,56,12/.

Экспериментальные исследования позволили охарактеризовать молекулярные взаимодействия как в криопротектпвных средах, так и в растворах белка под влиянием факторов крио-консервацип.

Впервые изучены диэлектрические свойства криопротектпвных растворов в микроволновом диапазоне, широком интервале концентраций и молекулярных весов, что позволило выявить процессы взаимодействия растворенных молекул криопротекторов и воды, оценить степень гидратации криопротекторов.

Показано, что меплолекулярные взаимодействия глобулярных белков претерпевают изменения после глубокого заморагл-ванпя до -196°С.

Установлено, что добавление криопротекторов к натпв-ныг.т растворагл глобулярных белков (сывороточный альбумин лошади, противостолбнячный -глобулин) вызывает изменение в количестве воды, входящей в гидратацпонный слой этих белков.

Показано, что замораглванпе нативных противостолбнячных растворов -глобулинов до -196°С приводит к потери некоторого количества связанной воды этпглп белкаг.ти, а такие к снппенпю специфической активности.

Крпоконсервация и длительное хранение растворов нативных Щ6 -глобулинов (сроком до 9лет) под защитой криопро-тектора полпэтиленглпколя не приводила к потере специфической активности и сольватационных свойств исследованных белков.

Практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные о влиянии криопротекторов на блпглйшее окру-пение белков найдут применение в разработке теории крнозащиты биологических объектов. Определяемый диапазон изменения диэлектрических параметров (статическая диэлектрическая проницаемость) в широкой области концентраций криопротекторов мопет слуглть в качестве критерия устойчивости биоструктур при изменении состава растворителя.

Основные полопения, подлежащие защите.

1. Изменения диэлектрической проницаемости среды, обусловленные добавлением криопротекторов или спилением температуры, влияют на мешолекулярные взаимодействия, стабилизирующие натпвную структуру глобулярных белков.

2. Крпопротекторы - полимеры модифицируют блппайшее окружение белков и образуют сольватный комплекс, защшцащий белковые системы от криоденатурацпп и потери специфической активности.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. ХАРАКТЕРИСТИКА СИД, ДЕЙСТВУЮЩИ нл БИОСИСТШЫ

ПРИ КРИОКОНСЕРВАЦИИ

Исходя пз физико-химических свойств хфпоцротекторов (дифильностп, наличии реакцпошшх групп, поляризуемости, декремента диэлектрической проницаемости), а такие процессов, паблюдаемых при охлацценпп (обезвоживание, гиперконцентрирование электролитов, изменение рН), следует выделить такие взаимодействия: водородные связи, гидрофобные и связывание воды - которые тлеют одно пз основных значений в существовании стабильного состояния патпвной структуры био-г.:а1сро:лолекул /49, 91,157/.

Водородные связи являются одним пз факторов, стабилизирующих натпвную структуру биополимеров и определяющих их пространственное строение. Вместе с тем вклад водородных связен в стабилизацию нативной пространственной структуры биополимера, по мнению /130/, невелик, поскольку выигрыш в свободной энергии переноса групп, образующих водородную связь, пз растворителя - воды в интерьер макромолекулы мал. Это утверцценпе основывается, в частности, на экспериментальных результатах, полученных Кпотцем /175/ при измерении констант образования дилеров /И- метплацетампда в различных растворителях. Там пе было показано методом ИКС, что в водном растворе дилеров мочевины не образуется, хотя ранее считалось, что комплексы мочевины в водном окружении существуют, и этот факт использовался в качестве подтверцдения возмошгостп термодинамической выгодности образования пептидной водородной связи. Аналогичные отрицательные выводы о стабилизирующем характере пептидных водородных связей были получены прп теоретическом рассмотрении переходов спиралмслубок в пол пашшокпслотах.

В то яе время ряд авторов осторопно подходит к выводам, сделанным на основе модельных систем. Ламрн /41/ полагает, что система водородных связей в белке монет качественно отличаться от таковой в полипептиде. В работе /14/ авторы обращают внимание на то, что внутри глобулы диэлектрическая проницаемость понижена. Проведенная шли оценка позволяет исключить влияние поляризации растворителя, обладающего высокой диэлектрической проницаемостью, на потенциал водородной связи, если она находится на расстоянии более 6,5 А от поверхности белковой глобулы. При этом перенос реагирующих групп из растворителя будет сопровождаться усилием электростатических взаимодействий в 6<х/Еа раз, где 8г. и 8н ~ диэлектрические постоянные белка и раствора соответственно (для водного раствора примерно в 40 раз), в этом случае вклад водородных связей в стабилизацию пространственной структуры биополимера был бы значительным.

Использование этой оценки для водородных связен нушю рассматривать лишь как качественное, поскольку природа водородной связи окончательно не установлена и в настоящее время отсутствуют надешше доказательства, подтверждающие гипотезу, что водородная связь мецду амиднымп группами обеспечивает энергию стабилизации, необходимую для поддер-глния натнвной структуры белков /9,62,165/.

Гидрофобные взаимодействия феноменологически могло определить как взаимодействие мепду молекулами, которое является более сильным, чем взаимодействие этих молекул с водой, и которое не может быть обусловлено ковалентной или водородной связью,электростатическим притяжением. Так, например, углеводородные цепи дифильных молекул ПАВ ассоциируют таким образом, чтобы иметь минимальную площадь поверхности соприкосновения с водой. Для теоретической интерпретации этих взаимодействий многими исследователями привлекается понятие о дисперсионных силах: поскольку распределение электронов в данный момент времени в молекуле, не обладающей постоянным дипольным моментом, не является однородным, в связи с чем появляется переменный диполь, который индуцирует, дополнительный диполь. Эти осцилляции приводят к возникновению сил притяжения - лондоновеких дисперсионных сил /96/.

Рис. I. Влияние температуры на взаимодействия, обеспечивающие стабильность нативной структуры глобулярных белков /110/

Центральное место прп обсуждении вопроса о стабильности белков отводится, как правило, гидрофобным эффектам. Отчасти это обусловлено той ролью, которая принадлежит структуре растворителя в определении стабильности белковой молекулы, но еще в большей степени связано с легкостью экспериментального обнаружения гидрофобных эффектов, возникающих в результате кооперативного взаимодействия большого числа молекул воды и подверженного благодаря этому интенсивному возмущению при незначительных изменениях температуры, давления или состава растворителя /59,114,209/.

Большое число гидрофобных боковых цепей, скрытых во внутренней части молекулы нативного белка, вступает в контакт с растворителем в результате разупорядочеванпя структуры.

Как отмечено в /9,29/ существует тенденция рассматривать упорядочение растворителя как отрицательный фактор прп собллизации неполярных групп. В пользу этой точки зрения приводится следующий аргумент: неполярные группы плохо растворимы в воде из-за неблагоприятного изменения энтропии при упорядочении растворителя. Поэтому любой фактор, препятствующий образованию этих структур, должен увеличивать растворимость неполярных групп. В то же время, как показано на опыте /41/, возрастание температуры приводит к уменьшению растворимости непалярных групп, несмотря на то, что оно неблагоприятно сказывается на упорядочение растворителя. Дело в том, что "упорядоченные структуры представляют собой наилучший, хотя, по-видимому, и не слишком хороший, способ размещения неполярных групп в воде прп низких температурах" /НО/. В противном случае они не занпглалн бы столь исключительное положение. Любое возмущение, уменьшающее стабильность этих структур (при низких температурах), будет на самом деле уменьшать растворшлость неполярных групп, если только указанное возмущение не приводит к возникновению нового, лучшего способа и:: размещения /184,216/.

Таким образом, биополимеры, находясь в смешанных водных растворителях, испытывают влияние со стороны добавок (для криобиологии это - криопротекторы) на гидрофобные связи посредством различных молекулярных механизмов. Возрастание концентрации любой органической добавки, не вписывавшейся в трехмерную упорядоченную структуру белка, образуемой водой вокруг неполярной поверхности в растворе при низких температурах, в конечном счете /33/ приводит к "плавлению" этих структур, подобно тому, как растворение любого вещества в воде приводит к понижению температуры замерзания. Если имеет место предпочтительная сольватация, то она облегчает процесс плавления и делает его проявление более кооперативным. "Плавление" само по себе вызывает увеличение прочности гидрофобных связен /113/, хотя оно монет открыть дорогу другим сольватацпонным эффектам, оказывающим противоположное действие.

Исследование гидратационных свойств белков важно с целью понимания физических процессов, происходящих с белками при их низкотемпературной консервации. Изменения, которые испытывают биосистемы при криогенной консервации, во многом обусловлены состоянием воды, находящейся в них в свободном состоянии и связанном.

Кинетическая теория гидратации 0.Я.Самойлова /66,67/ представляет интерес для интерпретации криобиологических процессов, так как позволяет оценить изменение гидратации с изменением температуры. Если мерой гидратации является отношение средних времен Ъь /Т , то изменение блшшей гидратации с изменением температуры должно быть связано с неодинаковой температурпой зависимостью постоянных времени воды в объеме и в гццратной оболочке. Дифференцируя по температуре, нетрудно получить условие увеличения гидратации с ростом температуры:

Таким образом свойства воды в объеме долхшы меняться более резко с ростом температуры, чем свойства гндратной воды /103/.

Сшшение температуры приводит к тс:.ту, что к системе белок-вода добавляется третий компонент-лед, который играет, как известно, Еаяную роль в структурных изменениях белка. Это обусловлено тем фактом, что действие замораглванпя на белок затрагивает один из ванных факторов его стабильности - гидратацию белка.

Большинство современных моделей гидратации белка принимают без доказательства существование нескольких классов молекул воды, которые различаются степенями "структуры", подвшшости и энергией взаимодействия с белком. Обобщение представлений об этих классах связанной воды дает таблица I /176/.

С целью выяснения свойств воды у гидрофобных поверхностей было проведено /45/ исследование диэлектрической

Ж ^ Ъ | шш 9Т ^ 2 Т

Таблппа I

Классификация молекул воды, входящих в гпдратационную оболочку белка

1 Энергия! Время вра-связп !щательной

Класс релаксации

Кол-во !Степень !Тенд. молекул!гидр. !к выводы на!гр/гр !мора-ост. ! ! шгван.

Связанная с белком: внутрисвязанная сильная ю-6 0,1-0,5 0,02-0,1 — поверхностная средняя ю-9 1-3 0,2-0,6 объемно-связанная слабая ю-11 — + монослой — 4-7 0,7-1,2 — проницаемости растворов аминокислот алифатического ряда. Аминокислоты обладают большим диполышм моментом в нейтральной области рН, а алифатический радикал существенной поляризуемостью не обладает. Поэтому в простейшем случае могло ожидать, что диэлектрическая проницаемость будет монотонно уменьшаться с ростом числа углеродных атомов вслед-ствип вытеснения все большего объема растворителя. Оказалось, что это приближение неверно. Данные показали, что существует немонотонная зависимость диэлектрического инкремента, т.е. увеличение диэлектрической проницаемости при растворении I моля вещества, от длины углеводородного радикала. Эти результаты трудно объяснить без предположения о структурированности растворителя.

Измерение теплоемкости Ср, спектров ЭПР спинового зонда и ферментативной активности при различных степенях влаж* ностп позволяет /203/ нарпсовать следующую картину изменения характера гидратации при увеличении Ь ( г Н20/г белка) :

1 - при Ь ^ 0,07 гидратиругзтся только ионизирущие группы;

2 - при Ь =0,25 насыщаются все полярные группы;

3 - при Ь =0,38 завершается формирование первичной гидратной оболочки. При дальнейшем увеличении Й не наблюдается никаких аномалий в зависимости Ср от ¡] вплоть до разбавленных растворов. Ферментативная активность становится заметной при Ь = 0,25, при этом же значении й наблвдается резкое увеличение подвишюсти спиновой метки.

Исследования /91/ диэлектрической проницаемости влажного лизоцима обнаружили два времени релаксации связанной воды, которое авторы объяснили наличием слоя сильно связанной воды у поверхности молекулы и второго, более протяженного , слоя измененной воды. Эту точку зрения развивает Ламрп /41/. По аналогии с моделью гидратации ионов он выделяет два слоя гидратной воды: "А" - слой, ближайший к поверхности белка и образованный за счет взаимодействия воды с полярными группами, "Б" - слой, обладающий специфической упорядоченностью, которому уделяется очень большое внимание. Ламрп полагает, что наличие этого слоя объясняет компенсационные энтальппйно-энтроппйные эффекты и может играть даже большую роль в реакциях белков по сравнению с "А" - слоем.

Такое рассмотрение, очевидно, связано с представлением о поверхности белка, как об однородной полярной поверхности, экранирующей компактное гидрофобное ядро от взаимодействия со средой. Это слишком упрощенный подход, так как поверхность белковой молекулы представляет собой сложную мозаику гидрофобных и гидрофильных групп. Так например, в работе /54/ было погазано на основе рентгенострук-турных данных, что значительная часть гидрофобных аминокислотных остатков о^ - химотрппспна находится ъ поверхностном слое белковой глобулы. Гидратация полярных п неполярных групп, как известно, носит разный характер и обладает принципиально разными свойствами. Поэтому, данные по связанной воде можно трактовать как регистрацию двух типов гццратацип - гидрофобной и гидрофильной, а не как образование двух гидратных слоев воды вокруг глобулы белка.

В то же время, ряд новых экспериментальных данных подтверждает данные о существовании воды, связанной с внутренней поверхностью белковой глобулы /131,148/. Было обнаружено такие, что время корреляции орпентацпонной релаксации связанной воды соответствует временам корреляции вращательной релаксации белков. Это говорит о наличии прочного связывания воды с молекулой белка и, по-видимому, лишь в глубоких полостях белковой глобулы.

По данным /57/, понижение температуры растворов белков от 0° до -196°С вызывает резкие ступенчатые сдвиги спектров триптофановой флуоресценции, причем у белков с внутренними трпптофановымп остатками эти сдвпгп происходят в диапазоне от -20° до -90°С, а у белков, имеющих только внешние трпп-тофановые остатки, - в области более высоких температур -от -20° до 0°С. Этот эффект исчезает при исследовании тщательно высушенного белка и появляется с увлажнением. Наблюдаемые явления описываются замораживанием релаксационной подвижности кооперативной системы белок - связанная вода.

Еще более сложная картина была получена в /92,93/. На основании тепловых измерений в области низких температур и измерения изотерм адсорбции иг.ш было обнаружено существование трех форм связанной с белком воды.

В работе /136/, изучая влияние растворителя и полярных взаимодействий на структурную стабильность и динамику белков, авторы пришли к выводу, что прямые полярные взаимодействия (внутренние и с растворителем) определяют общую форму нативной структуры глобулярных белков, а внутренние взаимодействия без водородного связывания контролируют тонкую структуру молекулы, обеспечивая ее гибкость и динамику.

Мнение многих исследователей о неповреждаюцем действии низких температур на белковые системы в настоящее время подвергается существенному пересмотру /24,46,219/.

Показано, что инактивация ферментов в водном растворе при замораживании и оттаивании может быть связана с тем, что вода, окружающая молекулу белка, при замораживании при температурах выше -75°С кристаллизуется в гексагональную форму льда, при этом связанная вода на поверхности белка, которая, как полагают, имеет кубическую пентагональную полиэдрическую структуру /175/, может превращаться в гексагональную форму льда, нарушая в процессе кристаллизации гидрофобные взаимодействия и разрывая затем внутримолекулярные водородные связи /129/.

Анализируя роль водородных связей в стабилизации белка при низких температурах, в работах /110,150,220/ отмечается, что поскольку низкие температуры усиливают формирование водородных связей, то следует ожидать увеличение структурной стабильности белковых молекул, обусловленное силами водородного связывания. Это усиление относится как к межмолекулярным связям (между группами доноров и акцепторов и группами белков), так и внутримолекулярным взаимодействиям (между группами белка и молекулами воды).

Несмотря на важность электростатических взаимодействий в поддержании структурной целостности белковых систем, характер их изменений с понижением температуры не ясен. Отчасти это обусловлено как трудностью оценки прямых взаимодействий заряженных остатков на поверхности белка, так и отсутствием информации о значении эффективной диэлектрической проницаемости, которая характеризует эти взаимодействия /192,129/.

Изменение гидрофобных взаимодействий монет такие играть ванную роль в инактивации на холоду ферментов-олпгоме-ров, так как эти взаимодействия, как видно из рисунка I /110/ ослабевают с понижением температуры, являясь причиной диссоциации на субъединицы /140/.

Полагая, что при низких температурах вода в объеме, окружающем белок, становится более структурированной (упорядоченной) , следует ожидать, что экспонирование неполярных групп во внутрь глобулы будет уменьшаться. Б этом случае стабилизация структуры белка, обусловленная гидрофобными взаимодействиями, будет ослабевать. Экспериментальное подтверждение роли этих взаимодействий в "низкотемпературной денатурации белков" обсуждается во многих работах /47, 175,213,214/.

Уверенность, что белки являются криоустойчивыми, основывалась на том факте, что в охлажденных тканях животных до низких и сверхнизких температур выделенные белки-ферменты не теряли, в большинстве случаев, своей активности. Но достижения нового направления в биохимии - криобиохимии, показали существенную разрушительную роль низких температур на энзиматпческуто активность ферментов, если среда, в которой они находятся, при охлаждении не тлеет компенсаторных параметров, нивелирующих действие низких температур. Если белки подвергаются замораживанию в изолированном виде, то разрушительное действие низких температур проявляется в их денатурации, но, как отмечается многими исследователями, обратимой /24/. По поводу исследований действия замораживания на белки в тканях можно высказать предположение, что среда микроокружения белковых структур, создавая проектирующее действие, компенсирует эффекты разрушения, обусловленные низкими температурами.

Заключение Диссертация по теме "Криобиология", Марковский, Александр Леонидович

ВЫВОДЫ

1. Криопротекторы по степени влияния на молярный инкремент диэлектрической проницаемости водных растворов располагаются в такой последовательности: ПЭГ, ;> сахароза,> глицерин, >- этиленгликоль.

2. Установлено, что диэлектрическая проницаемость защитных сред принимает значения 66 - 67 при температуре 25°С для всех изученных 1фиопротекторов в эффективном диапазоне концентраций (0,3*3 М).

3. Показано, что с увеличением концентрации и степени оксиэтилирования глицерина и пентаэритрита гидратация этих полимеров изменяется нелинейно, что свидетельствует об усилении межмолекулярных взаимодействий при увеличении гидро-фобности криопротекторов.

4. Установлено, что замораживание до -196°С нативных сывороточных альбуминов и иммуноглобулинов приводит к крио-агрегации и частичной дегидратации этих белков.

5. Показано, что с ростом концентрации криопротекто-ров происходит изменение в ближайшем окружении глобулярных белков, обусловленное взаимодействием молекул криопротекто-ров с поверхностью глобулы.

6. Криоконсервация под защитой криопротектора ПЭГ-400 предохраняет сывороточные С/д(т-глобулины от криоагрегации и потери специфической активности.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ

1. Материалы диссертационной работы по гидратацион-ным и диэлектрическим свойствам криопротекторов использованы в монографии "Криоконсерванты" (A.M.Белоус, М.И.Шраго, Н.С.Пушкарь - Киев; Наукова дуглка, 1979, 197 е.).

2. Результаты исследований гидратации глобулярных белков при изменении температуры и состава среды используются в лекционном курсе кафедры молекулярной и прикладной биофизики Харьковского государственного университета им. А.М.Горького (справка о внедрении от 2 декабря 1984 г.).

3. По результатам диссертационной работы опубликовано в открытой печати II работ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время тлеются убедительные экспериментальные доказательства того, что в повреждениях, вызываемых замораживанием, определенная роль принадлежит белковым структурам.

Одним из подходов к решению вопроса о роли белков в развитии повреждения являются экспериментальные исследования, проводимые на изолированных белковых системах /2/.

В одной из последних работ, Levitt , развивая химическую теорию крпоповреждения, предположил, что влияние низких температур на изолированные белковые системы можно описать двумя взаимозависимыми стадиями /180/:

I. д/^ а

Выше.5°С

Первая стадия характеризует влияние охлаждения на четвертичную структуру, вызывая спонтанную диссоциацию высокомолекулярных мультимеров на два и более мономеров.

Вторая стадия характеризует влияние на третичную структуру - развертывание (денатурация) нативных белков.

В обоих случаях изменения происходят за счет ослабления межмолекулярных, гидрофобных взаимодействий /213/.

Принято считать, что существование четвертичной структуры белков связано с различными типами взаимодействий -это электростатические силы между заряженными группами, образующими солевые мостики; водородные связи между донорами и акцепторами водорода; гидрофобные взаимодействия

- 91 между соседними субъединицами; дисперсионные силы, дополнительно стабилизирующие ассоциаты, образовавшиеся благодаря наличию других сил. Таким образом, субъединицы могут ассоциироваться, а следовательно, и диссоциироваться различными способами.

Конформационные свойства биополимеров в растворе в значительной мере определяются равновесной диссоциацией ионогеиных макромолекул.

Так как денатурация существенно модифицирует геометрическую структуру молекул белка, она сопровождается изменениями в окружении и доступности некоторых функциональных групп. Это означает, что взаимодействие белка с другими молекулами изменяется при денатурации. Следовательно, денатурация должна приводить к изменению таких разнообразных свойств, как растворимости, связывания красителя или иммунологическое поведение.

Вследствие такого изменения энергии взаимодействия может измениться и степень дисперсности молекул в растворе. Так, при денатурации может возникать ассоциация или полимеризация, а в более общем случае - агретация. При этом ассоциация и полимеризация происходят в мягких условиях, в то время, как агрегация - при сильном воздействии на белок. В основном природа связи в агрегате - водородная, между карбоксилами и аминогруппами.

Результаты наших исследований влияния замораживания на нативную структуру иммуноглобулинов показали, что низкие температуры действительно приводят к изменению агрегатного состояния и функциональной активности белковых макромолекул.

Возможным механизмом этого нарушения может служить изменение как параметров среды, так и индивидуальных свойств поверхностных групп /200,165/, обеспечивающее стабильное состояние молекулы белка.

Исследование влияния криопротекторов на ближайшее окружение и поверхностные свойства глобулярных белков, выполненное с помощью методов диэлектрической спектроскопии, дифференциальной спектрошотометрии и собственной флуоресценции, показало существенную зависимость процессов связывания от молекулярных свойств криопротекторов. В основном взаимодействия криопротекторов с белковыми глобулами зависит от таких параметров как длина цепи неполярной части, наличия гидрофильных групп и концентрации молекул 1фиопро-текторов.

Изучение диэлектрических и гидратационных свойств криопротективных сред показало, что увеличение молекулярной массы и концентрации криопротекторов приводит к гетерогенности растворов, обусловленное, по-видимому, образованием ассоциатов или комплексов между молекулами криопротекторов. Основанием для такого предположения может служить изученная зависимость гидратации молекул полиоксисоедине-ний от. концентрации.

Исследованные процессы взаимодействия глобулярных белков с криопротекторами, показало важную роль не только образования водородных связей, но и гидрофобных взаимодействий между белками и полимерами-криопротекторами.

При анализе поведения биомакромолекул в криопротективных средах следует учитывать доминирующую роль гидрофобных взаимодействий в поддержании нативной структуры белков.

Дифильные свойства криопротекторов , а не только гид-ратационные будут определять эффективность этих веществ для криоконсервации биообъектов. Выбор таких веществ в настоящее врегля в криобиологии не обоснован, так как отсутствуют общие критерии для подбора оптимального, с молекулярной точки зрения криопротектора, обеспечивающего баланс гидрофобных и гидрофильных взаимодействии с биообъектами.

Как показано в работе /197/, устойчивость мицелл, которые могло рассматривать так модель мембранных структур, в различных растворителях определяется сольвофобными взаимодействиями.

Оценивая вещества по их сольвофобныгл свойствам, выделил три класса вещества: I - вода, глицерин, этиленгли-коль, формамид; 2 - метилформамид, диметилформамид; 3 - метанол, этанол, толуол. Причем, в наибольшей степени сольво-фобные взаимодействия реализуются в растворителях первой группы, что по мнению Яоц обусловлено способностью молекул этого ряда к образованию водородных связей. В результате мешлолекулярных взаимодействий водородные связи образуют жесткие, термодинамически невыгодные каркасные структуры растворителя вокруг сольвофобных растворенных молекул. Оценивая по величине критической концентрации мицеллообра-зования (ККГ.Т) эффективность реализации сольвофобных взаимодействий, в работе /34/ предложен такой сольвофобный ряд: вода глицерин > этиленгликоль.

По мнению авторов работы /34/, универсальный критерий для выбора оптимального растворителя основывается на эффективности сольвофобных взаимодействии, которые определяются прежде всего природой растворителя.

Результаты проведенной работы, позволяют прийти к заключению, что защитное действие криопротекторов может осуществляться путем непосредственного взаимодействия ди~ фильных молекул с молекулами белка. Этот процесс сопровождается изменением гидратации молекул белка, как это показано на рис. 20. /183/.

Полученные результаты расширяют существующие представ*-ления о действии замораживания на нативные свойства изолированных белков и имеют практическую значимость для обоснован ния оптимальных криопротективных сред с целью разработки способов криоконсервации биообъектов. Кроме того, результаты работы имеют и общебиологическое значение, как с точки зрения более глубокого понимания молекулярных механизмов

Рис. 20. Изменение гидратации молекул белка при взаимодействии с криопротекторами /183/ гидратации биополимеров, так и с позиций изучения стабильного состояния нативных белков в смешанных растворителях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марковский, Александр Леонидович, Харьков

1. Актуальные проблемы криобиологии. Под редакцией Н.С.Пушкаря, A.M.Белоуса. К., Наукова думка, 1981, с. 606.

2. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура. JI. 1975, с. 328.

3. Абатуров Л.В. Тепловое движение белка: мелкомасштабные флуктуации и конформационные состояния. Молекулярная биология, 1983, 17, вып. 4, с. 683-704.

4. Аскоченская H.A., Петинов Н.С. Структура воды и ее роль в биологических системах. Успехи современной биологии, 1972, т. 73, в. 2, с. 288-306.

5. Ахадов Ю.Я. Диэлектрические свойства чистых жидкостей. М. Изд-во стандартов, 1972, с. I61-165.

6. Ахадов Ю.Я. Диэлектрические свойства бинарных растворов. М., 1977, с. 399.

7. Ахудов Е.И. Гидратация в двух- и трех компонентных растворах. У1 Менделеевская дискуссия. Результаты экспериментов и их обсуждение на молекулярном уровне. Тезисы докладов. Харьков, 1983, с. 388.

8. Белоус A.M., Шраго М.И., Пушкарь Н.С. Криоконсерванты. К. Наукова думка, 1979, с. 5-106.

9. Бирштейн Т.М. Гидрофобные взаимодействия неполярных молекул. В сб.: Состояние и роль воды в биологических объектах. М., 1963, с. 16-30.

10. Богач П.Г., Филенко A.M., Зима В.Л. Структура микроокружения молекул триптофана при наличии добавок органического вещества в водных растворах. Допов1д1 АН УРСР, 1975, sb 3, с. 245-249.

11. Бурштейн Э.А. Собственная лкглинесценция белка как методизучения быстрой структурной динамики. Молекулярная биология, 1983, 17, вып. 3, с. 455-467.

12. Бурштейн Э.А. Изучение быстрой подвижности белковых структур методом собственной флуоресценции. В сб.: Равновесная динамика нативной структуры белка. - Пущп-но, 1977, с. 60-83.

13. Брандс Д.Ф. Конформационные переходы белков в воде и в смешанных растворителях. Структура и стабильность биологических макромолекул. М., Мир, 1973, с. 174-254.

14. Брусков В.И., Полтев В.И. Макромолекулярная структура как усилитель специфичности взаимодействия в водных растворах. Биофизика, 1974, т. 19, В 6, с. 1095.

15. Верстаков Е.С., Ястремский П.С., Кеелер Ю.М., Гончаров В.В. Диэлектрические и структурные свойства водных растворов ДМФА и .ЩЛСО. Журнал структурной химии. 1980,т. 21, В 5, с. 91-95.

16. Видершайн Г.Я. Углеводосодержащие соединения, их биосинтез и роль в животной клетке. Молекулярная биология, 1976, т. 10, в. 5, с. 957-980.

17. Гаврилова И. И. Изучение влияния низкой температуры и криопротекторов на структурно-конформационные переходы в некоторых белках и мембранных эритроцитов. Канд.дисс. ., Харьков, 1982.

18. Гаврилов В.П. Физико-химические свойства внутри- и внеклеточных сред при низких значениях температуры. Влияние ионов. Биофизика, 1974, т. 19, в. 2, с.285-288.

19. Гайдук В.И., Кудряшова В.А., Паршина Л.А., Фалеев A.C., Хургин Ю.И. Поглощение миллиметрового излучения водпыми растворами аминокислот. Препринт JS 3 (152) (АН СССР. ИРЭ) М., 1974, с. 28.

20. Девятков H.Д., Бэцкий О.В., Завпзпои В.Л., Кудряшова В.А., Хургин Ю.И. Поглощение электромагнитного излучения мм-диапазона длин волн и отрицательная гидратация в водных растворах мочевины. Доклады АН ССОР, 1982,т. 264, Гз 6, с. I409-I4II.

21. Демченко О.П., Зима В.Л. Температурно-пертурбац1йна спектрофотометр1я тирозину I триптофану. Укр. б1ох1м. журнал, 1974, 46, J," 3, с. 345-350.

22. Демченко А.П. Зависимость спектра флуоресценции сывороточного альбумина человека от длины возбуждающего излучения. Укр. биохим. журнал, 1981, 53, вып. 3, с.22-27.

23. Демченко А.П. Ультрафиолетовая спектрофотометрия и структура белков. Киев , Наукова думка, 1981, с. 208.

24. Дузу П. Криобиохимия. М., Мир, 1980, с. 280.

25. Дуров Б.А. О структуре и диэлектрических свойствах жидких растворов. Журнал физической химик, 1981, т. 55, JS I, с. 38-45.

26. Душейко О.И., Муравьев Б.В., Степин Л.Д. Изучение диэлектрических свойств клеточных взвесей. Биофизика, 1971, т. 16, в. 2, с. 254-259.

27. Жолп М. Физическая химия денатурации белков. М., Мир, 1968, с. 364.

28. Зиннеман X. Криоглобулины и пироглобулины. В кн.: Иммуноглобулины. М., Мир, с. 422-442.

29. Зила В.Л., Демченко А.П. Температурно-зависшлые кон-формационные переходы белков и состояние хромофорных групп. Молекулярная биология. К., Наукова думка, 1975, с вып. 14, с. 42-53.

30. Ивкова М.Н., Веденкина Н.С., Бурштейн Э.А. Флуоресценция триптофановых остатков сывороточного альбумина. -Молекулярная биология, 1971, 5, вып. 2, с. 214-224.

31. Измайлова В.Н., Ребиндер П.А. Структурообразование в белковых системах. М., Наука, 1974, с. 7-124.

32. Кабанов A.M., Семенов А.Н., Самохин Г.П., Мартинек К. Ферментативные реакции в водно-органических смесях: критерий выбора оптимального растворителя. Биоорганическая химия, 1978, 4, lb I, с. 82-88.

33. Кабанов В.А., Топчиева И.Н., Казанский К.С., Петров Р.В., Хаитов P.M., Хаустов Л.И. Антигенные свойства нитроаро-матическпх производных полиэталенгликоля. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1984, Г? 5,с. 15-20.

34. Кату Р. Конформация иммуноглобулинов в растворе. Сеггден-тативная гибкость. В кн.: Иммуноглобулины. М., Мир, 1981, с. 58-85.

35. Кашпур В.А., Малеев В.Я., Щеголева Т.Ю. Состояние воды в растворах белков по данным сверхвысокочастотных измерений. Молекулярная физика и биофизика водных систем. 1976, в. 3, с. 94-99.

36. Кашпур В.А., Малеев В.Я., Шеголева Т.Ю. Исследование гидратации глобулярных белков дифференциальным диалект- 102 рическигл методом. Молекулярная биология, 1976, т. 10, 3, с. 568-575.

37. Коган Г.А. Применение метода дифференциальной спектроскопии для изучения структуры белков. В сб.: Молекулярная биология, (Итоги науки и техники), М., ВИНИТИ, 1973, 3, с. 216-286.

38. Кочуровская Г.Г. Физико-химической исследование в ряду окопэтилпрованных ПЭ. В кн.: Актуальные вопросы консервации и трансплантации костного мозга. Харьков, 1972, с. 154-161.

39. Ламри Р., Билтонен Р. Термодинамические и кинетические аспекты конформацпй белков в связи с физиологическими функциями. В кн.: Структура и стабильность биологических макромолекул. М., Мир, 1973, с. 7-173.

40. Левин В.В., Подловчешсо Т.Л. Дисперсия диэлектрической проницаемости и строение ПЭГов. В сб.: Физика и фпзи-ко-химпя жидкостей., МГУ, 1973, с. 27-45.

41. Лемешко В.В. Влияние различных режимов замораживания и криопротекторов (ПЭ0-400 и глицерина) на дыхание и окислительное фосфорилпрование. Автореф.канд.дпсс., Харьков, 1973.

42. Лемешко В.В. Функциональное состояние митохондрий печени крысы в различные фазы медленного замораживания и хранения суспензии митохондрий при температуре -25°С. -Научные доклады высш.школы, сер. биол. науки, 1975,1. Я 2, с. 56-60.

43. Лобышев В.И., Калпниченко Л.П. Изотопные эффекты Д20 в биологических системах. М., Наука, 1978, с. 215.

44. Луговой В.И. Крпоповреждения ферментов и ферментных систем. В сб.: Актуальные проблемы криобиологии. Киев,

45. Наукова думка, 1981, с. 15-40.

46. Луговой В.И., Моисеев В.А. Влияние низких температур на растворимые ферменты. В сб.: Итоги науки и техники / ВИНИТИ серия "Биофизика"/, 1978, т. 9, с. 53-79.

47. Малеев В.Я. Исследование структурных переходов биополимеров в растворе. Докт. дисс., Харьков, 1974.

48. Малеев В.Я. Гидратация биополимеров. Новые результаты и нерешенные проблемы. 1У Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров, 1981 г.

49. Мосолов В.В., Соколова Е.В. Взаимодействие гликолей и глицерина с активным центром трипсина и хиглотрипсина. -Доклады АН СССР, 1972, т. 207, !Ы, с. 228-231.

50. Моисеев В.А., Манк В.В., Зинченко В.Д., Марковский А.Л., Леонов Б.Н. Гидратационные и дегидратационные свойства гемоглобина. В кн.: Механизмы криоповреждения и крио-защиты биологических структур. Киев, Наукова думка, 1977, с. 44-47.

51. Моравец Г. Макромолекулы в растворе. М.,Мир,1967, с.398.

52. Наберухин Ю.И. Кооперативные явления в водных растворах неэлектролитов. У1 Менделеевская дискуссия. Результаты экспершлентов и их обсуждение на молекулярном уровне. Тезисы докладов. Харьков, 1983, с. 217.

53. Недев К.Н., Хургин Ю.И. Исследование поверхностного слоя белковой глобулы. Гидратация молекулы сХ ~ химотрипси-на. Молекулярная биология, 1975, т. 9, Г? 5, с.761-767.

54. Няглаа Д., Бат-Эрдэн 0., Бурштейн Э.А. Влияние среды на функциональные и структурные свойства сывороточных альбуминов. I. Влияние ионной силы на сывороточный альбумин в -форме.Молекулярная биология,1984,18,вып.3,с.839-847.

55. Окулов В.И. Применение спектрофотометрпи в ультрафиолете для исследования белков. Успехи биологической химии, 1971, т.12, с. 28-61.

56. Пермяков Е.Л. Кооперативное замораживание внутримолекулярной подвижности белков, В сб.: Равновесная динамика нативной структуры белка, Пущино, 1977, с. 83-99.

57. Поляк Р. Исследование пространственной структуры иммуноглобулинов. В кн.: Иммуноглобулины. М., Мир, 1981, с. 9-51.

58. Привалов П.П. Вода и ее роль в биологических системах. Биофизика, 1968, т. 13, в. I, с.

59. Пушкарь Н.С., Емец Б.Г., Калугин 10.В., Наконечный A.A., Степин Л.Д.,Шульга H.H.,Бабийчук Г.А.Гидратация криопро-текторов. Харьков,Препринт ИПКБиМ АН УССР,1972, с. 23.

60. Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус A.M., Калугин Ю.В. Криопротекторы. К., Наукова думка, 1978, с. 133-188.

61. Пчелин В.А., Волынская A.B., Измайлова В.Н. Внутренняя гидрофобная структура белков по данным солюбшшзации углеводородов. -Доклады АН СССР,1969,т.186, J5 I, C.I39-I4I.

62. Пфайль В., Привалов П.П. Конформационные изменения в белках . В кн.: Биохимическая термодинамика. М., Мир, 1982, с. 95-137.

63. Рэ Л. Консервация жизни холодом. М., Медгиэ, 1962,с.155

64. Ричарде Ф., Варга Дж., Розенстайн Р., Конигсберг У. Ап~ тигенсвязывающая область иммуноглобулинов. В кн.: Структура и функция антител., М., Мир, 1983, с. 76-112.

65. Рязанов М.А. К молекулярной теории влияния растворенных молекул на структуру воды в области дальней гидратации. Журнал физической химии, 1979, т. 53, JS 2, с.367-370.- 105

66. Самойлов О.Я. Общие вопросы теории гидратации ионов в водных растворах. В сб.: Состояние и роль воды в биологических объектах. ГЛ., Наука, 1967, с. 54-59.

67. Самойлов О.Я. К основам кинетической теории гидрофобной гидратации в разбавленных водных растворах. I. Об эффектах препятствий. Журнал физической химии, 1978, т. 52, в. 8, с. I857-1862.

68. Седунов Б.И., Франк-Каменецкий Д.А. Диэлектрическая проницаемость биологических объектов. Успехи физических наук, 1963, т. 79, в. 4, с. 617-625.

69. Смит А. Биологическое действие замораживания и переохлаждения. М. , ИИП, 1963, с. 253.

70. Старцева A.B., Ишмухаглетова H.H. К вопросу о роли состояния воды в изменениях структурной вязкости цитоплазмы при обезвоживании. Доклады АН СССР, 1973, т. 212, ib I, с. 254-256.

71. Стыоард М. Аффинность реакции антитен-антитело и ее биологическое значение. В кн.: Структура и функции антител. М., Мир, 1983, с. II3-I47.

72. Сергеев Г.Б., Батюк В.А., Сергеев Б.М. Кинетические особенности биохимических реакций при низких температурах. Криобиология и криомедицина, 1979, в. 5, с. 47-51.

73. Тернер М. Структура и функция иммуноглобулинов. В кн.: Структура и функция антител., М., Мир, 1983, с. 8-75.

74. Топчиева И.Н., Применение ПЭГ в биохимии. Успехи химии, 1980, т. 69, в. 3, с. 494-517.

75. Троицкий Г.В., Завьялов В.П., Кирюхин й.Ф. Обратимые конформационные изменения Уд & -глобулинов в области температур, близких к физиологическим. Биофизика, 1971, с. 16, 1Ь 5, с. 785-793.

76. Троицкий Г.В. Конформация белка и ее устойчивость в организме. Молек. биол., К., 1972, вып. 8, с. 3-11.

77. Троицкий Г.В., Матвеева М.Г., Тэтин С.10. и др. Эффект, оказываемый пертурбантами (этиленгликолем, глицерином, сахарозой) на конформацию иммуноглобулинов. 1У Всесоюзная конф. по спектроскопии биополимеров. Харьков, 1981, с. 176-178.

78. Троицкий Г.В., Матвеева М.Г., Тэтин С.Ю. Изменение кон-формации иммуноглобулинов под влиянием этиленгликоля и неорганического фосфата по данным дифференциальной спектрофотометрпи. Доклады АН УСОР, 1983, 2,с.83-86.

79. Троицкий Г.В., Тэтин С.Ю., Ефетов К.А. Исследование кон-формации при частичной дегидратации. Данные температур-но-пертурбационной спектрофотометрпи. Доклады АН УССР, 1984, & 2, с. 84-96.

80. Троицкий Г.В., Тэтин С.Ю., Ефетов К.А. Влияние дегидратации на междоменные взаимодействия в иммуноглобулине и кто фрагментах. Биофизика, 1984, 29, вып.4, с.578-582.

81. Фарант Д. Пересмотр некоторых криобиологических концепций. Криобиология и криомедицина, 1977, в. 3, с.12-20.

82. Френкель Я.И. Кинетическая теория жидкости. Л., Наука, Ленинградское отд., 1975, с. 478.

83. Фрэнке Ф. Взаимодействие низкоглолекулярных Ееществ вводных растворах. Применимость модельных исследований в биохимических исследованиях. В кн.: Биохимическая термодинамика. М., Мир, 1982, с. 25-92.

84. Халоимова А.И., Сидорова А.И. Влияние неполярных групп молекул неэлектролитов на ИК-спектры поглощения воды.- В сб.: Молекулярная физика и биофизика водных систем. ЛГУ, 1973, в. I, с. 24-29.

85. Хенох М.А., Першина В.П., Лачинская Е.М. Влияние глубокого замораживания на белковые растворы. Цитология, 1966, 8, с. 769-772.

86. Хенох М.А., Першина В.П. Образование гибридных ферментов под влиянием глубокого охлаждения. Криобиология и криомедицина, 1980, в. 7, с. 98-101.

87. Хименко М.Т. Поляризуемость частиц (ионов и молекул) и проблемы сольватации. У1 Менделеевская дискуссия. Результаты экспериментов и их обсуждение на молекулярном уровне. Тезисы докладов. Харьков, 1983, с. 38.

88. Хиппель П., Шлейх Т. Влияние нейтральных солей на структуру и конформационную стабильность макромолекул в растворе. В кн.: Структура и стабильность биологических макромолекул. М., Мир, 1973, с. 320-480.

89. Хургин Ю.И. Гидратация глобулярных белков. Журнал Всесоюзн. хим. общества игл. Д.И.Менделеева, 1976, т. 21, .$ 6, с. 684-690.

90. Хургин Ю.И., Шерман Ф.В., Тухсупкалиев У., Дапук В.А., Шмакова Ф.В., Климова В.А., Каверзнев Е.Д. Роль углеводных групп в иммуноглобулинах М. II. Изотермы гидратации иммуноглобулинов М. Биоорганическая химия, 1975, т. I, К 8, с. 1140-1146.

91. Хургин Ю.И., Шерман Ф.Б., Тусупкалиев У. Изотермы гидратации глобулярных белков в динамическом режиме. -Биохимия, 1977, т. 42, !Ь 3, с. 490-497.

92. Чекалин Н.В., Шахпаронов М.И. Диэлектрическая релаксация и структура воды, спиртов и водных растворов. В сб.: Физика и физико-химия жидкостей. М., МГУ, вып. I, 1972, с. I51-175.

93. Шахпаронов М.И. Введение в современную теорию растворов. М., Высшая школа, 1976, с. 296.

94. Шраго М.И., Гучок М.М., Калугин Ю.В. Некоторые принципы направленного синтеза криопротекторов. В сб.: Актуальные проблемы криобиологии, К., Наукова думка, 1981, с. 157-188.

95. Щраго М.И., Гучок В.М., Ханина Л.А., Калугин Ю.В. О некоторых путях создания криопротекторов. Проблемы гематологии и переливания крови, 1981, т. 26, J5 6, с. 3-6.

96. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. №., Мир, 1982, с. 354.

97. Щеголева Т.Ю. Исследование гидратации биополимеров методом СВЧ диэлектрометрии. Автореферат дисс. канд. ф.-м.,наук, М., МГУ, 1981.

98. Эскин В.Е. Рассеяние света растворами полимеров. М., Наука, 1973, с. 321.

99. Эме Ф. Диэлектрические измерения. М., Химия, 1967, с.223.

100. Эрдеи-Груз Т. Явления переноса в водных растворах, wi., Мир, с. 595.

101. Ястремский П.С., Харысин B.C., Гончаров B.C., Ляшенко А.К. Действие полярных молекул на воду. II1.0 мекмолекулярном взаимодействии в водно-спиртовых смесях по диэлектрическим данным. Журнал физ.химии, 1983, т.57, № I, с.91-95.

102. Яминский В.В., Пчелин В.А. Гидрофобные взаимодействия и влияние электролитов на структуру воды. Доклады АН СССР, 1973, т.210, В I, с.157-160.

103. Arakav/a Т., Timasheff S.II. Stabilization of protein structure by sugars. Biochemistry, 1982, v.21, IT 25, p.6536-6544.

104. Bellemans A., Plaitin II. On the dielectric constant of dilute solutions of polar molecules in non-polar solvents. -Bull. CI.Sci. Acad.Roy.Bolg. 1975, v.61, N3, p.324-335.

105. Bordev/ijk P. Comparison between macroscopic and molecular relaxation behaviour for polar dielectric. Adv.I.Iol.Relax. Processes, 1973, v.5, И 4, p.285-300.

106. Brandts J.P., Halvorson H.R., Brennan LI. Consideration of the possibility that the slow in protein denaturation reactions is clue to cis-trans isomerism of proline residues. -Biochemistry, 1975, v.И, И 22, p.4953-4963.

107. Brandts J.P. The low temperature denaturation of chymotryp-sinogen in aqueous solution and in frozen aqueous solutions. In: The Frozen Cell (G.E.V7. Wolstonholm and M.O'Connor eds.) p.189-209, 1970, Churchill, London.

108. Brill A.S., Castleman В., Wayne, McKnight И.Е. Associationof methanol and othanol v/ith heme proteins. Biochemistry, 1976, v.15, IT 11, p.2309-2311.

109. Buckingham A.D. The theory of diolectric polarisation. -LIol.Struct, and Properties. London e.a. 1972, p.241 -264.

110. Bull H.B., Breose K. Temperature dependence 01 partial volumes of proteins. Biopolymers, 1973, v.12, IT 12, p.2351-2358.

111. Bull H.B., Breese K. Stability of proteins in guanidino-HCl solutions. Biopolymers, 1975, v.14, N10, p.2197-2209.

112. Bull H.B., Breose K. Interaction of alcohols v/ith proteins.-Biopolymers, 1978, v.17, II 9, p.2121-2131.

113. Christian S.D., Taha A.A., Gash B.Y7. tlolecular complexes of v/ater in organic solvents and in the vapour phase. Chem. Soc. Quarterly Rev., 1970, v.24, IT 1, p.20-36.

114. Cooke B.J., Walkers S. Influence of dipole inclination to principal axes on molecular relaxation time. Adv.Hoi.Relax. Processes, 1975, v.7, N 3, p.221-236.

115. Cole R.H., V/'arz 0. Dielectric properties of ico I. In: Physics of Ice. Proceedings of the International Symposium on Physics of Ice. Plenum Press, 1969, p.546-554.

116. Cole R.H. Evaluation of dielectric permittivity by time domain spectroscopy. J.Phys.Chem., 1975, v.79, IT 1, p.93-94.

117. Cooke R., Kuntz J.D. The properties of water in biological systems. Annu.Rev.Biophys. and Bioeng., 1974, v.3, p.95-126.

118. Doobblcr G.F., Buchheit R.G., Rinfret A.P. Recovery and in vivo survival of rabbit erythrocytes. nature, 1961,1. 3842, p. 1405-1408.

119. Desnica D. Self-association of hemoglobin. A dielectric dispersion study. Biopolymers, 1979, v.18, II 7, p.1685-1694.

120. Diets W., Noerpel W., Stockhausen M. Fluctuations in the vicinity of probes in solutions as indicated by the induction contribution to dieloctric relaxation. Adv.ïîol. Relax. Processes, 1975, v.7, IT 4, p.307-319.

121. Donovan J.ÏÏ. Ultraviolet absorption. In: Physical principles and Techniques of Protein Chemistry, London-ITew York. Acad.Press. 1969, p.101-170.

122. Drost-Hansen W. Phase transitions in biological systems: manifestations of cooperative processes in vicinal water. -Annals Hew York Academy of Sciences, 1973, II 204, p. 100-112.

123. De Haven J.C., Shapiro 1.1.L. Speculations of physicochemical fluid propertios in physiological regulation. In: Perspectives in Biology and Medicine, Autumn 1968, p.3-60.

124. Ebert B., Schwarz D., Laosmann G. Study of Brov/nian rotational motion in dense solutions of hemoglobin. Studio Biophysica, Berlin, 1981, v.82, II 2, p.105-112.

125. Edward J.T., Parrell P.G., Job J.L. The dieloctric increments of amino acids. J.Amer.Chem.Soc., 1974, v.96, IT 3, p.902-906.

126. Eibl H., V/ooloy P. Electrostatic interactions of chargod lipid membranes. Hydrogen bounds in lipid membrane surfaces. Biophys.Ghom., 1979, v.10, II 3-4, p.261-271.

127. Engol J. Hydrogen bonds in biological systems. In: Physics of Ice. Proceeding of the International Symposium on

128. Physics of Ico. II.-Y. Plenum Press, 1969, p. 138-151.

129. Farrant J., Woolgar A.P. Possible relationship betv/een the physical properties of solution and coll damage during freezing. In: The Frozen Cell, London, 1970, p.97-120.

130. Forslind E. Ligued water at interfaces. Progr. Colloid and Polym.Sci., 1975, v.56, p.12-15.

131. Finer E.G. Interpretation of denteron magnetic resonance spectroscopic studies of the hydration of macromolecules. -J.Chem.Soc. Farady Trans., 1973, part 2, v.69, N 11, p.1590-1600.

132. Fröhlich H. The extraordinary dielectric properties of biological materials and the action of enzymes. Proc.IIat. Acad.Sei., 1975, v.72, IT 11, p.4211-4215.

133. Farmer R.E.L., tlacey R.L. Perturbation of red cell volume. Determination of membrane transport parameters for rapid penetrans. Biochim. et Biophys. Acta, 1972, v.290, p.290-299.

134. Forsythe K.H., Hopfinger A.I. A quantative model of biomo-lecular solvation. Biomol.Struct.Conform., Funct. and Evol.Proc.Int.Symp. Madras, 4-7 Fan, 1978, vol.2, Oxford e.a., p.563-573.

135. Fridman H.L. Theory of the diolectric constant of solutions.

136. J.Chcm.Phys., 1982, v.76, IT 2, p.1092-1105.

137. Fink A.L. Enzyme-catalysed réactions in unfrozen, noncellu-lar systems at subzero temperatures. In: Proteins at Low Temperaturos, p.35-54, 1979.

138. Fichbein W.IT., ïïinkert J.W. Parameters of freezing damage to enzymes. In: Proteins at Low Temperatures, p.55-82, 1979.

139. Gagliardi L.J. Protonic mobility and hydration. J.Chcm. Phys., 1974, V.61, Ii 12, p.5465-5466.

140. Gailcwad 1.1. G., Donskar S., David S.K. Dielectric constant of liquidus on free volume. Solid State Commun., 1981, v.39, II 1, p. 65-69.

141. Gough S.L., Davidson D.W. Dielectric behaviour of cubic and hexagonal ices at low temperatures. J.Chem.Phys., 1970, V.52, II 10, p.5442-5449.

142. Grant E.H., Sheppard R.J. Dielectric relaxation in water in the neighborhood of 4°0. J.Chem.Phys., 1974, v.60, IT 5, p.1792-1796.

143. Grosse С., Greffe L.L. Constanto diélectrique dos solutions polaires-apolaires. I.Etude generale en concentration. -J.Chim.Phys. et Phys.Chim.Biol., 1975, v.72, IT 11-12,p.1297-1ЗОЗ.

144. Grosse С., Greffe L.L. Constanto diélectrique des solutions polaires-apolaires. 2.Components polaires a dilution infinite. J.Chim.Phys. et Phys.Chim.Biol., 1975, v.72, IT 1112, p.1304-1308.

145. Haggis G.H., Hasted J.B., Buchnan J.J. The dielectric properties of water in solutions. J.Chem.Phys., 1952, v.20, p.1452.

146. Hallo B., Andersson Th., Fargon S., Lindman B. Protein hydration from water oxygon-17 magnetic relaxation. J.Amer. Chem.Soc., 1981, v.103, II 3, p.500-508.

147. Hanafusa IT. Denaturation of enzyme protein by freeze-tha-v;ing and freozo-drying. Contr.Inst. Low Tcmp.Sci., S.B. 1972, IT 17, p.1-38.

148. Hanafusa IT. Freezing and drying of enzyme protein. Bull. Inst. Int. Froid, 1973, IT 5, p.9-18

149. Hasted J.B. Dielectric properties of water and aqueous solutions. In: Dielectric and Related Ilolecular Processes, vol.1 » 1972, p.121-161.

150. HaBted J.B, Dielectric properties. In; Water Comprehensive Treatise, vol.2, Water. Crystalline Hydrates Aqueous Solutions Simple ITonelectron., IT.-Y.-L., 1973, p.405-458.

151. Hebor U. Freezing injury in relation to loss enzyme activities and protection against froezing. Cryobiology, 1968, v.5, IT 2, p. 188-201.

152. Hebor U., Tyankova L., Santarins K.A. Effects of freezing on biological membranes in vivo and in vitro. Biochim.et Biopnys. Acta. Biomembranos, 1973, N 291 (II 21), p.23-37.

153. Henderson Th.R., Henderson R., York P., Lyndal I. Effects of dimethyl sulfoxide on subunit proteins. Am.IT. J.Acad. Sci., 1975, v.243, p.38-53.

154. Horrfeld J., Stanley H. A general approach to co-operativi-ty and its application to tho oxigen equilibrium of hemoglob in and its electors. J.Ilol.Biol., 1974, v.82, N 2, p.231-265.

155. Hopfinger A.J. Solvent-dependent conformational transitions in proteins. J.Ilacromol.Sci., 1974, v.9, IT 3, p.483-509.

156. Hubbard J.В., Colonomos P., V/olynes P.G. Molecular theory of solvated ion dynamics. III.The kinetic dielectric decrement. J.Chem.Ehys., 1979, v.71, N 6, p.2652-2661.

157. Ichimura H., Feinstein D., Schwarts R.F. Double dielectric relaxation of non-confocal mombrane-covered ellipsoidal particle suspensions. Z.Naturforsch., 1975, v.ЗОЛ, H 12, p.1675-1679.

158. Inesi G., Uillman M., Elbert S. Temperature-induced transitions of function and structure in sarcoplasmatic reticulum membranes. J.Ilol.Biol., 1973, v.81, IT 4, p.483-504.

159. Jonscher A.K. lieu interpretation of diolectric loss peaks.-nature, 1975, v.256, IT 5518, p.566-568.

160. Jernigan R.L., Lliyazawa S., Ssu S.C. Stabilization of regular conformational regions in protein by intraregion electrostatic interactions. IJacromolecules, 1980, v. 13, IT 3, p.518-525.

161. Jacobson A.L., Turnor C.L. Specific solvont effects on the thermal denaturation of ribonuclease. Effect of dimethyl sulfoxide and p.dioxane on thermodynamics of denaturation.-Biochemistry, 1980, v.19, IT 19, p.4534-4538.

162. Janine J. Surfacc and inside volumes in globular protein.-ITature, 1979, v.277, H 5696, p.491-492.

163. Kaatze U. Dielectric relaxation in aqueous solutions of polymers. Losungen und Adsorption. Vortr.28. Hauptversan-nul., Kiel, 1977. Darmstadt, 1978, p.214-224.

164. Kaatze Ü. Dielcctric relaxation in aqueous solutions of po-lyvinilpyrrolidone. Adv.Llol.Relax. Proc., 1975, v.7, II 2, p.71-85.

165. Kaatze U., Henzo R., Seegers A., Pottel R. Dielectric relaxation in colloidal phospholipid aquoous solutions. -Bern. Buns enge s.Phys.Chom., 1975, v.79, H 1, p.42-53.

166. Kaatze U. Dielectric relaxation in aqueous solutions of polymers. In: Losungen und Adsorption. Vortr.28, Hauptvor-sammel, Kiel, 1977. Darmstadt, 1978, p.214-224.

167. Kaat so Ii«, Glese K« Diolectric relaxation spectroscopy of liquids: frequeas domain and time domain experimental methods. J.Phys., 1980, V.E13, H 2, p.133-141.

168. Kahn P.C., Schwandev/ede J.M., Ippolito A. II., I.lihalyfe B. Volume changes of globular protein association. Biophys. J., 1980, v.32, N1, p.86-87.

169. Karon A.LI. J. Cryoprotectants a now class of drugs. - J. Pharm.Pharmac., 1969, v.21, II 4, p.203-223.

170. Kenneth G.J. Polyethylene glycol in aqueous solution: solvent perturbation and gcll filtration studies. Arch.Biochom. and Biophys., 1977, v.184, D1, p.59-68.

171. Klotz I.II. Protein interactions with small molecules. Account. Chem. Res., 1974, v.7, H 5, p.162-168.

172. Klots I.LT. Role of water structure in macromolecules. -Fed.Proc., 1965, v.24, IT 15, p.924-933.

173. Kuntz J.D. Properties of protein wator at subzero temperatures. - In: Protoins at Low Temperatures, Washington, 1979, p.27-34.

174. Lovelock J.E. Physical instability and thermal shock in red colls. ITaturo, 1954, v. 173, H 4406, p.659-661.

175. Levitt Y. The role of proteins in freezing injury and resistance of biological materials. In: Protein at Low Temperature, \7ashington, 1979, p.141-159.

176. Levy H.B., Sober H.A. A simple chromatographic method for preparation of gamma globulin. Proc.Soc.Exp.Biol, and lied., 1960, v.103, IT 1, p.250.

177. Lubas В., Soltysik-Rasek П., Lesniervska I. Proton nuclear magnotic rosonanco study of the association of monovalent and divalent alcohols with bovine serum albumin. Biochemistry, 1979, v.18, IT 22, p.4943-4951.

178. Ileirovitch H., Rackovslcy S., Scheraga H.A. Empirical studies of hydrophobicity. 1.Effect of protein size on the hydrophobic behaviour of amino acids. Llacromolecules, 1980, v.13, И 6, p.1398-1405.

179. Ileryman H.T. (The cryoprotoctivo agents. Cryobiology, 1971, v.8, IT 7, p.181-190.

180. Ilinton A.P. llote on the diolectric properties of water. -Chemical Physics Letters, 1970, v.7, IT 6, p.606-608.

181. LtLcrov/ave measurements of the complex dielectric permittivity of biological liquids: Int. U.R.S.I.-Symp. 1980, Electromagnetic waves. Munich, 1980. Hunchen, 1980, 122A/1 -122A/3.

182. Llisell D.J., Shepard R.J. Practical problem in the decon-vulution of dielectric data. Adv.Ilol.Relax.Processes, 1975, v.6, II 4, p.319-329.

183. I-Iurphy E.I. The generation of electromotive forces during the freezing of water. J. Colloid Intorface Sci., 1970, v.32, II 1, p.1-11.

184. Pace IT.C., Vanderburg K.C. Determining globular protein stability: guanidino hydrochloride denaturation of myoglo-bulin. Biochemistry, 1979, v.18, H 2, p.288-292.

185. Pace IT.C., IJarshall H.J. A comparison oi the effectivenessof protein denaturants for /b -lactoglobulin and ribonucle-ase. Arch,Bio diem, and Biophys., 1980, v.199, П 1, p.270-276.

186. Pethig R. Some dielectric and electronic properties of biomacromolecules. In: Dielectric and Related Molec.Processes, vol.3, 1977, p.219-252.

187. Pethrick R.A. Dielectric relaxation. Techn. and Appl. Past React.Solut.Proc.ITato Adv. Study Inst., Aberystwyth, 1978, Dordrecht e.a., 1979, p.103-113.

188. Pottel R. Dielectric properties. In: Water Comprehensive Treatise, vol.3, Aqueous Solutions Simple Electrolity, IT.-Y.-L., 1973, p.401-431.

189. Price A.H. Diolectric measurements on liquids in the free-quoncy range 250 MHz to 140 GHz. In: High Frequency Di-elec.Ileas., Guilford, 1973, p.28-33.

190. Ray A. Solvophobic interaction and micelle formation in structure forming nonaqueous solvent. ITaturo, 1971, v.231, N 5301, p.313-315.

191. Redwood W.B., Takashima S., Schwan H.P., Tompson Т.Е. Dielectric studies on homogeneous phosphatidyl choline vesicles. Biochim. et Biophys. Acta. Biomcmbraneo, 1972, II 255, p.557-566.

192. Richards P.II. Area, volumos, packing and protein structure.-Annu.Rev.Biophys. and Bioong., vol.6, Palo Alto, Calif., 1977, p.151-176.

193. Rinfret A.P. Some aspocts of preservation (with) of blood by rapid freoze-thaw procedures. Fed.Proc., 1963, v.22, II 1, p. 94-99.

194. Rocfarsen B., Lier J., Dechan L.L. The influence of the di-eloctric constant of the medium on lysis of erythrocytes. -Proc.Koninel.Nederl. Akad.YJet., 1965, v.B68, H 4, p.249-253.

195. Rupley J.A., Yang P.-H., Tollin G. Water-protein interactions. Biophys.J., 1980, v.32, IT 1, p.88-90.

196. Ruv/art M.J., Holland J.F., Haug A. Fluometric evidence of interactions involving cryoprotectants and biomolecules. -Cryobiology, 1975, v.12, IT 1, p.26-33.

197. Safford C.J., Leung P.S. The structures and molecular dynamics of water. Progr.Surf. and Membrane Sci. vol.7, 1T.-Y.-L., 1973, p.231-269.

198. Saletran J.-L., Dolbos G. Etude de la relaxation dielectrique des solution aqucusos do cC -alanine. C.r.Acad.Sci., 1975, v.281, IT 16, p.B349-B352.

199. Santarins K.A. Freezing, The effect of eutectic crystallization on biological membranes. Biochim. et Biophys. Acta, 1973, v.291, IT 1, p.38-50.

200. Saxena S.K., Saxena LUC. Diclectric relaxation in OH.N bond complexes. Indian J. Pure and Appl.Phys., 1981, v.19, IT 6, p.550-554.

201. Scheraga H.A. On the dominance of short-range interactions in polypeptides and protoin. Pure and Appl.Chom., 1973, v.36, IT 1-2, p. 1-8.

202. Schwan H.P., Sheppard R.Y., Grant E.H. Complex permittivity of water at 25°C. J.Chem.Phys., 1976, v.64, D 5, p.2257-2258.

203. Schwartz G. Dielectric polarization phenomena in biomolecu-lar systems. In: Dielectric and Related Molecular Processes, 1979, p.163-191.

204. Shifrin S., Parrott C.L. Influence of glycerol and other polyhydric alcohols on the quartornary structure of an oligomer! c protoin. Arch.Biochem. and Biophys., 1975» v.116, IT 2, p.426-432.

205. Simatos D., Tuiec J.M. Fundamentals of freezing in biological systems. In: Pood Technol., London e.a. Preeze-Drying Adv., 1975, p.17-28.

206. Sinanoglu 0., Abdulnur S. Effect of water and other solvents on the structure of biopolymers. Fedorat.Proc., 1965,v.24, IT 2, part III, p. 12-23.

207. Skvaril P. Changes in outdated human ¿f -globulin preparations. ITature, 1960, IT 185, p. 475.

208. Smith R.IT. , ITansh C. Hydrophobic interaction of small molecules with o<. -chymotrypsin. Biochemistry, 1973, v.12,1. 24, p.4924-4937.

209. Starkweather H.V/.Jr. Some aspects of water clusters in polymers. IJacromolecules, 1975, v.8, N 4, p.476-486.

210. Suggett A. Dielectric spectroscopy as a tool for studying hydration. Hew Techniques in Biophysics and Cell Biology, 1975, v.2, p.192-228.

211. Frozen Cell. Ed. V/olstenholme G.E.W., O'Connor M., London, 1970, p.316.

212. Toborsky G. Protoin alteration at low temperatures. In: Protein at Low Temperature, Washington, 1979, p.1-27.

213. Travers F., Douaon P. Dielectric constant of mixed solvent used for a low temperature biochemistry. Biochimie, 1974, v.56, IT 4, p.509-514.

214. Thompson D.R., Lacharia G.L. Dielectric theory and bioelect-rical measurements. In: Theoretical Trans. ASAE, 1971, v.14, H 2, p.211-215.

215. Vandenheuvel F.A. Structural role of water in lipoprotein systems. Protoplasma, 1967, v.63, H 1-3, p.188-193.

216. Veldkamp \Y.B., Votano J.R. Temperature dependence of macro-molecular interactions in dilute and concentrated hemoglobin solutions. Biopolymers, 1980, v.19, N 1, p.111-124.

217. Viand P.E. Freezing of water content of porous membranes. -Cryobiology, 1972, v.9, II 4, p.233-239.

218. Walstra P. Non-solvent and steric exclusion of solute. -Kolloid Z, und Z.Polym., 1973, v.251, IT 8, p.603-604.

219. Ward K.B., Wisher B.C., Lattman E.E., Love W.E. Structure of deoxyhemoglobin. A crystalls grown from polyethylene glycol solutions. J.Llol.Biol., 1975, v.98, H 1, p.161-177.

220. Wolf B., Hanion S. Structural transition of deoxyribonucleic acid in aqueous oloctrolyte solutions. II.The role of hydration. Biochemistry, 1975, v.14, N 8, p.1661-1670.

221. Westeim M.S. Theory of polar fluids. Hol.Phys., 1973, v.26, IT 6, p. 1425-1444.

222. Wolff C., Silberberg A., Priel L., Layec-Raphalen LUIT. Influence of the association of macromolecules in dilute solution on their reducod viscosity. Polymer., 1979, v.20, II 3, p.281-287.