Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние экзометаболитов цистицерков кошачьего цепня HYDATIGERA TAENIAPORUIS (BATSH,1786, LANARCK, 1816) на органные и клеточные культуры

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние экзометаболитов цистицерков кошачьего цепня HYDATIGERA TAENIAPORUIS (BATSH,1786, LANARCK, 1816) на органные и клеточные культуры"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ ШДШМ НАУК СССР

На правах рукописи

АДОЗВА Елена Яковлевна

УДК 576.89:599.323.4:611.37

ВШШШ ЗКЗО^ЕТАБОЖТТОЗ ЩСТгЩЕРКОЗ КОШАЧЬЕГО ЦЕПНЯ НУСАИЗЕНА ТАЕШАБРОЖК (ВАТЗСН, 1766; ЬАНАДСК, тетб) НА ОРГАННЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРА

03.00.25 - Клеточная б'-тология

А В Т О Р В £ Е ? А Т лнссерташги на соискание ученой степени кандидата бислогически: наук

Ленинград 12ЭС

Работа выполнена в Ленинградском санитарно-гигиеническом медицинском институте Ю РСФСР.

Научный руководитель - доктор биологических наук • профессор Березанцев Ю.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Т.В.Бейер;

кандидат биологических наук А.Д.Харазова.

Ведущее учреждение - Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М.Сеченова АН СССР.

юнова АН СССР/)

г. в &

Защита состоится 'ж<7 " 1990 г. в часов

на заседании специализированного совета Д 002.73.01 при Институте цитологии АН СССР по адресу: 194064, Ленинград, Тихорецкий пр., 4« . .

С диссертацией монно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР. О

Автореферат разослан 1990 г_

Ученый секретарь /?л (----

специализированного совета I » ,, _ а

кандидат биологических наук ^Л

1.Н.Писарева

© - Институт цитологии АН СССР

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРНОТИКА FABOTJ

Актуальность проб пет. Широкое распространение гельминто- -зов у населения всех стран привлекает пристальное внимание исследователей к изучению вопросов взаимоотношений паразита я хозяина как биологической системы. Часто встречающиеся инвазии человека и гивотных, такие как цистицэркоз, трихинеллез, эхино-коккоз и альвеококкоз, представляют собой тканевые гельминтоза. Тканевый паразитизм является особой формой паразитизма, при которой средой обитания паразита слунзга ткань, хозяина, обладающая комплексом заиштных реакций. Взаимоотношения паразита и хозяина в таких системах осуществляются на разных уровнях организации: организменном, органном, тканевом и клеточном. Б них участвуют различные формы адаптации паразита и хозяина. Б процессе эволюции тканевые паразиты приспособились к 'физиологическим особенностям своих хозяев. Выделяя комплекс биологически активных веществ в составе секреторно-экскреторных продуктов (экзометабо-литов), они вызывают в организме хозяина целый ряд местных и . общих изменений, направленных на обеспечение себе длительного существования: подавляют реакцию лейкоцитоз хозяина, изменяют защитную реакцию его соединительной ткани,. которая выражается в,индукции формирования хозяином обильно васкуляризованной капсулы специфического строения, функционирующей как биологический барьер с избирательной проницаемостью (Березанцев, I9S3-I989). Однако механизмы влияния экзометаболитов тканевых паразитов на организм хозяина в настоящее время исследованы еще мало и требуют дальнейшего изучения. Для выяснения характера взаимоотношении в системе паразит-хозяин широко используются цистицерки кошачьего цепня fiydatigera taeniaeforoia (Batsch, I78S; La-nsrck, I81ô), инкапсулирующиеся в печени грызунов. В литературе подробно описаны строение капсулы цистицерка и ее роль в транспорте питательных веществ (Березанцев, 1955, 1973; Varute,. liore, 1970; Yarute, Pillai, 1974; Березанцев, Борщуков, 1977, 1978). Изучены морфологические и функциональные особенности основных клеточных элементов капсулы - фибробластов, эндотелия капилляров (Чеснокова, 1983).-Имеются сведения о воздействии паразита на организм хозяина в целом.(Blaies, Williams, 1983; Березанцев и др., 1985). Однако в экспериментах-на животных сло.тнэ выделить первичнуэ рэакцпэ клеток па какоз-лнбо воздей- ^

ствие из совокупности.последующих- реакций организма, от роста и развития которого завиоит поведение отдельных клеток. Вместе с тем известно, что любой патологический процесс первоначально реализуется на клеточном уровне и сопрововдается, как правило, изменением ультраструктуры и метаболизма клеток, что в дальнейшем проявляется нарушением деятельности тех или иных органов и систем организма.'В1связи с этим становится очевидной необходимость изучения влияния экзометаболитов цистицерков на уровне клетки.

Использование в качестве модельных объектов органных и клеточных культур позволило получить новые сведения о регулирующем влиянии экзометаболитов.цистицерков на процессы цроли-: ферации и дифференцировки клеток в культуре, что, в свою очередь , приводит к выявлению некоторых общих закономерностей действия экзометаболитов цистицерков на клеточном уровне. Очевидно, что такие данные необходимы для дальнейшей расшифровки биологических механизмов, лежащих в основе.адаптация личинок гельминтов к тканевому паразитизму.

Цель исследования - изучение реактивных изменений в органных и клеточных культурах после воздействия экзометаболитов цистицерков кошачьего цепня Н^аеп1ае:£огш.з.

Задачи исследования:

1) разработать методику длительного органотипического культивирования соединительнотканной капсулы, образующейся под влиянием цистицерков в печени крыс. Изучить последовательность морфологических изменений в органных культурах капсул цистицерков;

2) провести сравнительное изучение пролиферативной активности и дифференцировки фибробластов в органных культурах соединительнотканной капсулы цистицерков при культивировании как в присутствии цистицерков, так и без них;

3) изучить влияние экзометаболитов цистицерков на пролиферацию и субмикроскопическую организацию эпителия экзокринной и эндокринной частей поджелудочной железы эмбрионов крысы в условиях органотипического культивирования;

4) выяснить характер воздействия экзометаболитов цистицерков на пролиферативную активность и морфологические особенности трансформированных фибробластов мыши постоянной клеточной линии 1-929. .

••• Ншиз"^ .пр^^щ, шзутгт.татод. Есзрсаэ проведено- комплексное иссзэдавашгэ влиян&ч экзотдэгяболлтоз грвзтэдзрков. козьзчьег'о -деппя •Я*^еп1авг'на-.вязии грнзунсз в сиетшах 1л тп• ••.. Ислользоваяя®-ггатсдак.оркаваетптесхого кузьтавзровзяля•.•и метода •• культура ■ жеэток шзваятю ■ -получить новые - сведения, касашшэся ■ ■ : рэгулируаззго. влияния. эюоиатабозттов дасшсерков на- щмзифзра-

-клзт0к.'

■■■■■■ Впервые проведано длительное ортааотяшг-геекое -яультивирова- . ■кие соединительнотканной капсулы, -образующейся под влиянием цис- ■ тадарвов в печени крыс, и детально' изучена динапшка морфологических. изменений в эксплантатах капсулы. • Органная культура -капсула использована в ■"■качестве иоде ян для изучешга непосредственно-то влияния-экзшетабалйтов цистицерков на соединительнотканные клетки.

На.данной модели проведено оригинальное исследование влияния - цистицерков на дифференцнровку фибробластов. Установлено, что это влияние вцракаетсяв замедлении дифференцировки значительного количества фибробластов, снижении интенсивности синтеза 'имя коллагена, активировании процессов его катаболизма. : Представлены убедительные факты з пользу возмолзгаго участия про-: цессов фиброкяазии в регуляции' роста соединительной ткани капсулы изстицерка и продукции коллагена фибробласташ в условиях организма хозяина.

. Впервые изучены морфофункциональные особенности эпителия в органных - культурах эмбриональной подвв'лудочной- железы краен, куяьтивлрзгешх.'-в присутствии цнетицеркоз. Показано, ' что экзом-з-таболиты цистицерков усалиааат 'лрол^рашга^лалоди^е|)енцзрован---. нкх 'клеточных элементов, ускоряэт вгоричнуа ди-а^рэшофовку эк- . зокринного эпителия, стимулируют развитие островкового аппарата эмбриональной.подаэлудочной железы.

Впервые установлен двойственный- дозозавискшй характер влияния экзометаболитоз цистицерков на- прошгфератизную активность трансформированных фибробяасгов .аьш постоянной клеточкой линии ЬЭ29. Показана воз-лолзшеть стгмуляаяя- яиф^ерзнцаравки флбробла-" стов 1929 .ш адагодатноиу- пути под воздействием экзометаболн-тоз цистицерков.

йзучкз-ггеактическая ценность работы. Проведенное псследова-

' ние расширяет современнее представдэнЕЯ о тканевом паразитизме как биологическом йвео-шз. .-Пэдуязшззэ в работе данннз до дито-. физиологии и уяьхраструктурз «.поток,- подвергшихся in vitro ■воздействию гйзшэтайогптаз -яйсзящархов, даат «опоявятешше . сведения. о-.тштиах здагп'аитуштата» гздыкштоз к ткадевоау -•аараэитаэглу. Это югезт ш» :значшшэ-д2Я цравальаого' понимания . взаямоотвсашжй в-..систем© даразвт-хозяш а пагогензза ие-'невых личиночных гвльмйнтЬэов человека и кивэтшес, что в ко--нечноа -итога открнвазт новые подхода для выбора ■ оптимальной терапии этих паразитарных заболевании.

В качестве.новой экспериментальной ьюдеди предложена органная культура соединительнотканной капсулы цпстицзрков кошачьего целая, которая могет быть широко использована ддя изучения влияния на соединительнотканные клетки биологически активных веществ, -ввдэляешх .тканевыми личзнкама геяъюштов. Данная модель шает-такке найти применение при изучении целого ряда проблей, касазднхся цитадифференцировки, -межклеточных • взаимодействий, гистогенеза соединительной-ткани.

Полученные -результаты исследований,используются при чтении лекций студентами -и слушателя?® факультета повышения квалификации преподавателей на кафедре биологии с общей генетикой Ленинградского санитарно-гигиенического медицинского института.

Аггробастя работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 43, 45 и 4-5-й отчетных научных конференциях аспирантов, клинических ординаторов и молодых ученых ЛСК£' (Ленинград -1983, 1935, 1986), на I9-ii научно-практической конференции врачей санэпкдслузбн Ленинграда (ноябрь, 1983), на 27 и 28-й конференциях студентов и.аспирантов морфологических кафздр и лаборатории ленинградское вузов и научно-исследовательских институтов (ишь, 1984; юй, 1985), на заседании .Ленинградского пара-зитологаческого общества (декабрь, 1984), на заседании Ленинградского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов (декабрь, 1935), на конференции молодых ученых ;; специалистов Красногвардейского района Ленинграда (февраль, 1933), на обьедп ненном заседании проблемной комиссии "¡«оррогенез клетки, ткано:: организма" и кафедры биологии с об^ел генетикой ЛСЕХ-1 («а2, 1987), на научных .семинарах отдела клеточных культур 1-1нституга цитологии АН СССР (ноябрь, 1987; ноябрь, 1990).

. ППо материалам диссертациолнойрабогы опубдиксь- > вано 8 статей. . ■ ■

• ■ -Сттотеста п лтесдртааш.. Работа состоит. из введения, .;. .'шеста, глаз,, заключена, ;вшадов.:3 -стека.аизгераяда.;.Фсаювной-.V ■штерзал: диссертации.'-"издсвен-:щ;-135 страницах тзашнсашсного -: . текста. Работа шхлюстрйрована; 6Г рисунком и 22 таблицами. Синеок щтируегяойлитературы включает 475 наикзаований, из них \ 154. отечественных и 311 иноет!анш1х; авторов. .' V '

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ .■...:'Материал'и методика -

'. Объект исследования. В.качество объектов исследования в Г работе были использованы:

1) органная кузьгура соединительнотканной капсулы, форшг- . рующайся в печенигрызунов вокруг цистицерков кошачьего, цепня

н. 1;аеш.аеГогш.з: са'яюв крас линии. Виетар заразали в 30-дневном возрасте (в состоянии толерантности к инвазии) яйцами (по 25-30 яиц).выделенными из зрелых члеников цестоды, полученной . от кошки (окончательного хозяина); 625 эксплантатов;

2) органная кужьтура:соедшштельноткалной капсулы, образованной вокруг инородного тела (парафиновых шариков), введенных в ткань печена крыс; 33 эксплантата;

3) органная культура подазлудочяой явлезы 20-днзвных эмбрионов крысы; 187 эксплантатов;

4) трансформированные фибробласты кыиш постоянной клеточной линии 1.929; 301 культура.

Органотипическое культивирование проводили по методу мно-кзетвеиных органных культур (Лурия, 1972) в стеклянных чашках Петри на среде следующего состава: среда 199 - 70 %; сыворотка крупного рогатого скота - 20 %; куриный зглбрлокальшй экстракт - 10 %; аскорбиновая кислота - 0,07 -мг/еяц глюкоза - 4 гдг/мл; пенициллин - 50 ЕД/мл и стрептомицин - 50 жг/мл.В опытгых вариантах эксплантаты культивировали в присутствии.цистицерков в среде в соотношения 1:10 г/т при культивировании капсул и 1:20 г/ет при культивировании подкелудочной железы. Питательную среду меняли через каддые 48 часов, цпстнцзрков - через 7 дней. . .

О

- Клетки L529 чя^зЕвщродаадл.-яа срздэ .Игла с-добавдавввм "-. •чХО-%'агафояюгзфршо!» фотсшо-. скота (базактЕбкотзоков)' во флаконах Кщзеля при 37 °С. При проведении экспериментов клетки культЕвзровали на средах, . кощщцианировашшх цзстицерками, в чашках Петри, которые-даиепши. в термостат с автоматической : подачей С02 (5 %).

flwtypm. спгти Цвскщарков извлекали

■-..-■из -печени ,крыс, -триады по--.20'мин промывали в среде ]1гла с ан-• тнбнотикаш CI50 Щ/мд пенициллина и 150 икг/мя стрептомицина). Трвды отмывали от антибиотиков средой Игла и помещали на оп-: ределенный срок в ■"'чаики Петри в средудня культивирования клеток, в соотношениях 1:10, 1:20 и 1:40 г/мл. Цистицзркав содер-калз в среде: I) .24 часа; 2) 48 часов; 3) 48 часов, но со сменой среда -через ,суткн, в опыт брали вторую порцию среды, кон-'.дидаонировашой в -течение последних .24 часов. Засть культур ; веди, на средах. - не содаргаадх сыворотки.

■ • Дяя тиотояогического и гистохимического исследований.зкс-• плаятаты капсул цпетилорков, подголудочной железы -и клетки на стеклах .фиксировали в 10-процентном забуференном формалине, - жидкости Бузна, сиаси .-Карнуа. Препараты-окрашивали -гематоксилином Карачи с подкраской эозином, азур-П-зозином, по Ван Ги-. зон.^ . Нуклеиновые кислоты, выявляли методами .Браше и Эйнарсона; гликозаьиногливаны - с помощью диалдаирозаяного железа ко ¿ей-'.- лу и тояуидиновым синим при рН 2,7; нейтральные липнды в клетках на стеклах выявляли инкубацией препаратов в смеси судана Ш и Судана 1У. 'Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лактат-дегадрогеназы СДДГ) в фиброблаетах капсул определяли на 1фио-статных срезах тетразолиевым катодом в прописи 'Лилли (1959). . .. Результаты гистохимической реакции ферментов оценивали полуколичественным .методом визуальной оценки (Соколовский, 1971).

Для эдактронно-тн^оскопического исследования культуры фиксировали в 2,5-яроцентном растворе глутарового альдегида на О,IM фосфатном буфере (рн 7,2) и\ дофиксировали 1-працеятщЕЛ раствором тетраокиси осмия по общепринятым методикам. Материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и .задавали в ' аралдит. Контрастирование осуществляли частично на-этапах проводки в спиртах уранид-ацетатом, частично- на срезах цитратом свинца. Ультратонкле срезы получали на удьтратоме 1КЗ-Щ и

О

'изучает'э алэктрсшом едифоскощ. щщ• усадршщом напря-

кении-во кз. ■'-". :■'■;, ■ г'-:

Лвтохадиоггеу&яческиё исследования'. /Для исследования дина-. • гатки синтезов' ДНК и белка эксплантаты инкубировали с .-мечеными'- '. предшественниками.этих макромолекул. .В- качестве' предаю ствешк- ■ ■ ка ДНК использовали %-тж©д*гн (отечественного производства, : удельная-активность - 730 ГБк/ммоль). Изучение синтеза белка осуществляли с помощью -^С-метионина ■ (Англия, удельная активность >540 ГБк/шо ль). В культуральную среду за I час до фик- . оацяи вводили радиоактивны!! тнмидин и за 6 часов радиоактивный метпонин в дозе 3,7.ГО4 Бк/мл. Эксплантаты фиксировали 10-про-даиишм нейтральным- формалином и - смесью Карнуа. Полученные препараты покрывали фотоэмульсией типа М(ГосШТтйотопроект) по . общепринятой методике. На автографах определяли индекс пэраич--но меченых ядер (ЖШ) — количество меченых ядер на ЮС клеток;. • • интенсивность белкового синтеза оценивали путем подсчета зерен восстановленного серебра с помощью окулярной сетки.

Характеристики клеточных "культур.- ЦролЕ^е'оатавнки потенцп- :'. ал клеток Ь929 определяли по эффективности клонирования - до--' ле клеток, способных образовывать клоны, от общего числа клеток, посеянных на чашку Петри (50 ш, "1?1о-л", Англия) . Высевала по 200 клеток, ка чашку, через 12-15 суток образовавшиеся клоны фиксировали, окрашивали кристаллическим фиолетовым и подсчитывали..

Динамику размножения клеточных■культур прослеживали по кри-внм роста. Клетка высевали на чашки с начальной плотностью 5.103 клеток на I Ежедневно клетки снимали с .3-5 чашек и додсча- '•' тываяи. На фиксированных препаратах определяли мнтотический индекс (Ш) путем подсчета делящихся клеток на 1000 исследованных. •

Числовые данные всех исследований обработаны методами вариационной статистики (Урбах, 1954; Катинас и др., 1969).

Эксперименты на культивируемых клетках выполнены в■отделе клеточных культур Института цитологии АН СССР (зазздротй отде- . лом - д.б.н., профессор Пинаев Т.П.). Гистологические', автора-дпографнческпе п эдэктрояно-мгкросколическиз исследования цро-зодкяись на базе тлорфологического отдела ЦЖИ ЯСХЪш (заведуз-;шя отделом - д.ы.н., с.н.с.Иванова З.Ф.).

.'Изучение ■ влияния экзомотабояитов цисткцзрков ■ . .. кошачьего цепня на органные культур« ■их соединительнотканной капсулы

В результата лроВ'Э.дзцкых.исследований была разработана методика.'.ддитедьного'-.органотш^аского >культивирования соединительнотканной -капсулы цзсгацарков -кошачьего цопняи дэтадь-.. но изучена/последовате льиость и характер ■ морфологических из- ' -менений 6 эксплантатах капсул. В качества контроля использовали капсулу, 'образованную вокруг -инородного тела. В нашах-акс~ ■ перимэнтах все эксплантаты капсулы инородного тела, - образованной зрелой.:ф1!йрозной .;Т1саньш, погибают в'■первые сутки культивирования ,так как вксокодифферешпгрозашщз неактивные • фиброциты ' этой ткани, вероятно, не способны к структурно^доодионаяъной перестройке и, пролиферации и в условиях культивирования дегеив рируют. ■

■ ■ Культивирование соедавитальнои;акной -капсулы цистицерков кошачьего цепня впервые осуществлялось на протяжении 30 суток. В течение' 5-6 суток культивирования длится период адаптации. ■'.Он сощювсшается дистрофэтаскиш л некробиотлчзсюш процессами, .'гибелью клеток и дезорганизацией межклеточного вещества, фагоцитозом ::цродуктов распада. Затем следует период пролиферации И'дзффвренцаровет, который длится с 5-Э-л по 9-11-е сутки ■культивирования и 'сопровождается интенсиишм .разиногэнием шток, продукцией коллагеновых белков-й фибриллогенезом. Период дегенерации :-еля старания культур .начинается -через 11-15 суток ку^тизирования и заканчивается гибелью эксплантатов. Исследование гистологшескох! и:Суб|.с1кро,скопической -организации эксплантатов "показало., -что присутствуздая в- культура?: 'популяция фибробластов.неоднородна. На протяжении 17 суток культивирова-"нйя в эксплантатах встречаются юные фибробласты, которые .ак- , .тивно.разшокаются.. Это создает условия.для поддержания липу-лязпп фибробластов з куяьтуро, -роста и.дифферещргровки.-'ткани -капсулы.-Дифферешхаравка фибробдастов .в культуре вдет асин-лрошо. Часть;фйбробластов быстрее едэиобретаэт черты' специалк-/зации, связанные с выработкой коллагена, другие же продолжают делиться и сохраняет строение, характерное для юных форм. Цре-датущесгвенное содержание в .цитоплазме юных фибробластов - свобо;

ньа рибосом свидетельствует о том, что основной фушщ1ей фибро-./ ; бластов на этой .стадии развития является. синтез ¿елка,-- исполь-.. ■-.,- зуемого клеткой для собственных кузд, связанных с размксЕОНиегл.. Кйш; выполняет функцию

.сивтеза'гяикозавнногдашанов /(ГАГ), -что обзснзчивает. нронинде--. -. «ость соединительной • ткани- капсула;« Зреянв Шбробласты, активно .синтезирующие коллаген, встречаются в. эксплантатах в двух йор-.... аш-.-чкояяазгенобла«^;.I и П типов."В ранние сроки культизирова-

-яияприсутствует :коллагенобласты: J- т:та. В цгшшлазме такнх/''/ '.'-.'клеток'содержится .хорош:фазвияй'.ксмив^'Тольдаи.,':уаастэуювдй: в синтезе ГАГ и транспорте коллагеновнх белков. Коллагенобласты '/• П типа характеризуются интенсивным синтезом коллагена. Об этом свидетельствует резкое расширение цистерн и канальцев шероховатой эндоплазматической сети, которая:занимает практически всю . цитоплазму этих клеток. 3 процессе культивирования клетки не до- . стигают высшей степени дифаеренцировки - и. не превращаются в (фиброциты. Таким.'- образом, характер морфологических изменений ,в экс-. -плантатах указывает на активный рост в органных культурах соединительной ткани капсулы-цистицерков. При этом оснозные клеточные-элементы- фибробласты - претерпевают ткянеспецифичеекую дифше-ренцировку, заключающуюся в продукции углеводно-белковых кош- -кексов основного вещества и коллагена.

. Культивирование эксплантатов капсулы .цистицерков в присутствии паразитов привело к появлению-значительных изменений в морфологии культур, уровне продиферативной активности клеток, а таете вызвало изменение степени и направления даффзренцировки йибробластов. Было установлено, что экзометабодиты цистицерков оказывают - общее ростстшлулнруюяее действие на. органные культуры'-'/ их-капсулы. В присутствии цистицерков эксплантаты капсул быстрее, адаптируются к условиям роста in vitro; менее'выражены дистро- • фические процессы;■замедляется старение культур и увеличивается, выживаемость эксплантатов. Зкзокетаболиты цистицерков стимулируют пролиферацию фпбробластов в -экоплаагатах капсул (табл.1). При культивировании соединительной ткани капсулы цистицерков в присутствии самих паразитов отмечается замедление .дифференцзровки • фибробластов. В первые сутки культивирования" в эксплантатах.капсул цистицерков присутствует- все Форш фибробластов, отличающихся друг от друга по-степени зрелости. В дальнейшем нктенсдвяая'

дролЕфзрацаа фжЗроб ластов приводит к таг/, что цре обладатели клеточный чашш в культурах становятся шнв фибробласты, которые присутствуют в эксплантатах до конца наблюдения.

Таблица I

Изшаашэ показателей цролифэрагивной активности • фибробл&стов в органных культурах капсул цисткцерков Н. taeniaeíoг¡¡u.s под влиянием экзоыетаболитов цистицарков & <- 5-; а = 9-21)

Сроет исследования, сутки йадекс первично меченых ядер, % Митотический ивдекс, %е

без щхс-тицерка в присутствии ИКС- ' тицерка в * среде баз цас-тицерка в присутствии цис- _ тицерка в ^ среде

2 0,71±0,09 1,57±0,08 /.0,05 0,00±0,01 1,21±0,08 <0,05

4 1,77±0,11 2,18±0,04 <0,05 0,85±0,01 1,44±0,П <0,05

7 1,Б8±0,03 3,05^0,18 <0,05 0,94±0,0о 1,91*0,18 <0,05

9 2,01±0,13 4,41±0,13 <0,05 1,01*0,05 .2,35±0,П <0,05

II 2,34±0,08 4,62±0,03 <0,05 0,89*0,03 2,03±0,04 <0,05

15 0,76±0,06 1,92±0,12 <0,05 0,00±0,01 0,91*0,03 <0,05

30 0,0(^0,01 0,Г7±0,01 (0,05 0,00±0,01 0,0^0,01 >0,05

Коллагенсинтезируащие клетки в эксплантатах представлены исключительно коллагенобластами I типа, продуцирующими не только коллаген, но к ГАГ- В присутствии цистицерков в цитоплазме фибробяастов наблюдается более высокая активность ЦДГ по сравнению с контролем и медленное. нарастание активности ДЩ?, что также свидетельствует о замедлении созревания соединительной ткани эксплантатов капсулы.

В составе эксплантатов, культивируемых с цистицерками, -впервые обнаружены кодлагенрезорбирующие клетки. Присутствие в их составе хорошо развитой системы канальцев шероховатой эн-доплазматической сети, большое число свободных рибосом и полисом, хорошо развитый комплекс Гольдхи - все это указывает на фибробластическую природу таких клеток. Известно, что при определенных условиях фибробласты могут функционировать как фтгйро-класты, играя существенную роль в структурно-химической 'пере-

стройке соединительной ткани (Серов, Шехтер, 1981). Экзометабо-литы цистицерков активируют процессы коялагенолиза, направленные на удаление избыточного коллагена. Часть фибробластов при этом превращается в фиброкдасты и участвует в катаболизме коллагена в эксплантатах капсул. Можно предположить, что в организме промежуточного хозяина фиброклазия является одним из механизмов ауторегуляциз роста соединительной ткани капсулы цис-тицерна и продукции коллагена фибробластами.

Изучение влияния экзометаболитов цистицерков на органные культуры эмбриональной поджелудотаой железы крысы

Для оценки общего непосредственного действия экзометаболитов цистицерков на клеточном уровне решено было изучить хп т1-Ьго морфофункциональше особенности клеток органа, который в естественных условиях не инвазируется цястицерками. В качестве такого органа избрана поджелудочная железа.

В результате проведенных нами исследований было установлено, что присутствие экзо-датаболитов цистицерков в культуральной среде стимулирует пролиферацию эпителия трубок и выводных^протоков (табл.2). Интенсивно делятся и включают радиоактивный ти-мядин также стромальныа и эндокринные элементы. Под влиянием экзометаболитов цистицерков отмечается улучшение состояния-эксплантатов во все сроки культивирования, увеличивается доля развивающихся эксплантатов. Усиление пролиферативной активности эпителия способствует более длительному выживанию культур по сравнению с контролем. В процессе культивирования ускоряется и темп вторичной дифференцировки, которая сопровождается усилением реакции на РНК в цитоплазме клеток эпителиальных трубок, увеличением в их составе количества органоидов: митохондрий, элементов комплекса Гольдяи и шероховатой эндопяазттической сети. В дальнейшем в цитоплазме клеток появляются крупные вакуоли комплекса Гольдки, гипертрофированная шероховатая эндо-плазматическая сеть. Все это свидетельствует об активном процессе секретообразования, который заканчивается в конечном счете формированием, гранул прознмогена и зимогена. Последние выявляются в апикальных частях цитоплазмы вторично дифференцирован-

ник ацинозшх .казтохс,

л Л- ; Таблица £

^йзкенвета .показатеяей цровзфратишой активности , ' . ; крысы

.. л'1:- в . оргашвд куатурах при воздействии экзомзтабоштоз цяеа,ЕцарковН»*аеп1ае£от18 (2 ± Э-; п = 9-18)

V Явдекс деДОдо шчеша; .; №оТ1Пес1ШЙ: ИНДвКС, >-Сроки ■ • ; ядер, % -

.яссле-дова-нет, -сутки без цисти- -церков в присутствия да-стщерков б среде - Р : . . без дасти-церков в присутствии хщ-стицерков ^ в среде

9 4, §¿0,9 10,8±1,2 ¿0,01; ; 1,9±0,4 4,0ь0,4 < 0,0]

II 8,0*0,5 13,3±0,3 40.001 3,3±0,7 8,2±0,5 ^ о,о;

12 7, £>±0,6 11,5*0,2 <0,01 . 2>0±0,7 ' 5,3±0,3 ¿0,0]

13 5,3±0,2 7,0*0,1 ¿0,001 0,3;$, I -0.8±0,3 <0,0*

' 15 - 3,2±0,1 ■6,0±0,1 <0,001 0,0±0,1 о.оьо.! >о,о:

.-. Экзоштабояигы цзстидарков, вероятно, содержат компонент ( ней компоненты), стимулирувдий развитие островкового аппаратг в ортаншгх культурах эмбриональной поджелудочной явдвза. Об . этом свидетельствует •.внтенешшя прошферацая;шсулоцитов, их -.активная диЗфэрани^ровка и внесшая, функциональная активность, а такта разрастание эндокринной паренхимы с образованием, характерных пдастоз - обширных участков эксплантатов, состоящих только из эвдокринянх элементов. В -присутствии цистздерков на зсгротяаанги.-17 суток культивирования в 'эксплантатах выявляются как.В-каэтки, так и А»клетки. Эндокринные клетки -имеют ультраструктурные признаки,, свидетальсгвувдие об активной, горгдонооб-разоваяди и :внвздениа. секрета. Цитоплазма таких клеток содер-' жиг - хорошо.развитую шероховатую андоплазматическую сеть.. Отмечается гипертрофия кожквкса Гольдаз, представленного большим числом цистерн, крупных и мелких вакуолей, в которых происходит -интенсивное шорзировшпге я созревание гранул секрета. Тес-ннй контакт гранул с плаз:лале«агои, наличие в цитоплазме пустш вакуолей.является доказательством активного выведения секрета. Присутствие в культуратанок среде зкзокзтабодитоз цистицерков

стимулирует да|форенцаровку А-шюток. Ультраструктурше особенности кнсулоцитоз свидетельствуют о поеепшшой фуккщтонадькой нагрузке на островковый' аппарат, которая, вероятно, является результатом общего воздействия экзометабояитов цлскщэрков на ', эясгогазтати додаэлудотаой аелезы. В присутствии цистинэрков ■ но только повышается функциональная активность уза' существующих островков, ко и наблюдается интенсивное новообразование эхщо-лфиншвс. элетантов,. Появление эндокринных элементов отмечается в состава эпителиальных трубок и выводных протоков, эпителий которзх.:маяно: рассматривать' как источник образования- инсулощ- . тов (Богомолова, 1976).. В присутствии экзометабояитов цистицер-ков в культуральной среде наблюдается ацяно-инсулярная трансформация шгсулоцитов, чтотакже является результатом повышенной функциональной нагрузил на эндокринный аппарат иода®дудочной' аэяозы. Бозмокно, изменение функциональной активности А-клеток и В—клеток в условиях организма под ■ влиянием экзометабояитов цистицэрков кошачьего цепня служит одним из адаптационных механизмов, обеспечивающих поступление к тканевому паразиту глюкозы через обильно васкуляризованную капсулу, окружающую его.-

Изучение влияния экзометаболитов цистицерков кошачьего цепня на пролифератцвную активность и морфологические особенности трансформированных-■фибробластов клеточной линии'1<929 '

полученные■результаты свидетельствуют о том, что экзомета-болиты цастицерков кошачьего цепня содержат биологически активные вещества, оказывающие влияние на проллфератнвную активность ■и дафференцзровку. не только нормальных, но и внсокотрансформи-ровакных клеток. При;этом з культурах фибробяастов-линии .1929 зкзсметабаяиты проявляют Двойственный характер воздействия на пролиферацию-этих хохеток.

Как следует из результатов определения эффективности клонирования (табд.з), экзометабояиты цистицэрков могут оказывать ■ какростсткмуяирующее влияние на клетки 1929, так а ростинги-бирующее, что зависит от условий давдиционирования культураяь-ной среды, а следовательно, от дозы-экзомётаболитоз. Исследование зависимости действия экзометаболитов цзсткцерков от плотно-

сте ..клеточной тапудяцгн ;д ■ присутствия сыворотка. б дультураяь-яой среде показало, -"."чта роетстэдящ>рвдй и росгангабзфуэдяй

■ -эффекты;црстзяяются .как в культурах с:редким посевом,.так и в ■ ' культурах- с плотина'."посевом, как в присутствии сыворотки, так и без лее.'

' .Таблица 3

'•':Г.ВЛИШКв''ЭЕзЬшТаЬоЛИГрЗ ЦНСТПЦЗрКОЗ Н^аепхас£ога1з .;• ~

. на- эффективность клонирования мышиных фабробластов •

■■' '': '--:.7'■■.''. линии Х929

Соотношение

Эффективность клонирования при режимах кон-

веса гельмшгга дапзонировашш ( х-± 2-;, %) 'и-объема среды . г/мл

24 часа

48■часов

:4 часа после смены среду

I : 10 17,2 ¿1,5 15,9 1,8

I,: 20 18,7 ± 1,5 . 35,5 ± 2,3

I : 40 -' - , 58,4 ±3,0^ 90,5 ± 1,6

55.8 ± 2,1

80.9 ± 2,2 83,3 ± 2,5

х)

Птамечания: I. В контроле эЗшектнзаость хяошшовангя -; 60,5±2,0 "

2. х) р?0,05.

Снигшние пролиферативной активности клеток 1929 при культивировании их на кондиционированной хщстацервамн среде сопровождается характерны:,; -Кировым перерождением этих клеток. Образование такими клетками отдельных шкосяойннх участков, отсутствие признаков ловрезэдения цитоплазматнческзх органелл не позволяют рассматривать жкровуе конверсию клеток ь?29 как признак происходящих в них дистрофических процессов. Доля их в процессе культивирования в культуре возрастает, через 17 суток культивирования на кондиционированной цястнцзрками бессывороточной среде они-составляют-более 50 % всей популяции. В некоторой клетках отмечаатся полное'слияние яяшдаос вакуолей в едкнне киро-вые капли. ультраструктурныз особенности такгх клеток позволяют -рассматривать их как зрелые'адапоцзян.

Таким образом, результаты цровэдоншзс г>ксл?р::мэк?ор показали, что. экзомзтаболжты цпетштзрков кокчьего дапнз ст.т,у.гиру-

-ют■■диффврёшсфовку-- клеток Х929 по пути-превращения в жировые клетки. При этом, отсутствие шворотки в куяьтуральной среде . усзшевет;Жфощп конверсио:клеток 1929. ;

. Представленные в нашей работе сведении в сочетании с пока еше ташкггочисленншй литературными данными показали, что экзо-метаболиты цкстицерков кошачьего цепня обладают широким спектром бЕояогичасао'го действия. В заключение отметил, что шогоо<5разйе,эффектов, вшнваогдк:экзсг^таболйташг, вероятно, позволяет паразиту гибко приспосабливаться к условиям, паразитировав в тканях хозяина; воздействовать на многообразие : ; . звеньев регулявди его гомеостаза и поддерживать определенный , уровень спецналязадагг и- функциональной. активности различных кде-ток-кшаеней, тем .самым обеспечивая себе наиболее благоприятные условия существования.

ВЫ В ОД Ы

1. Экзометаболяты цистицзрхоз кошачьего цепня изменяют уровень пролигаератиЕной активности, степень и направление дяфререн-цирозки соединительнотканных и эпителиальных клеток в культурах. Характер этого -влияния опрздедяотся принадла^ностьвз клеток к току или иному тканевому типу, степаньэ их диффарэнцаровки,: а также дозой экзометаболатов и, вероятно, соотношением различных их компонентов.

2. В .результате длительного оргшотишиеского культивирования.. соединительнотканной капсулы', образующейся вокруг цистицер-ков кошачьего цепня в организме промекуточного хозяина (крысы), выявлены, три стадии яocлйдoБaг9ЛЬШíX шрйодогаческшс изменений эксплантатов., характерных для органных культур: I) адаптация, сопровоядающаяся гибелью основной классы клеток и сохранением жизнеспособной ткани по дешзэтаа. эксплантата: 2) лт>олш>еташя и., диэдяердншгоовка-" клеточных элементов и восстановление ткани эксплантата; 3) "старение'' культуры, заканчивающееся ее гибелью.

3. Органнач культура соединительнотканной капсулы цпстицер-коз иоеэт быть использована ..в качестве модели для изучения вопросов гщтодяйфэреяцнровкл, изжяеточныхвзаимодействий и гистогенеза соединительной ткани, а такке влияния на эти процессы -различных биологически активных вешеств, в там числе выделяемых' цясткцерками и другими тканевыми паразитами.

4. .ПрЕсутстш-здастицарков в. культуралъной среда оказывает

.органные культуры соедшдаельно-- тканной капсулы ■ цисищерков. Оно выражается в увеличения-, ыдаг-ваемости эксплантатов, сокращении - сроков адаптации и продленки

• • периода-сщшиферашш -а -дафференцзровки .яудырур. При этом отме-. чается увеличение ;митотического индекса и индекса первично ш-■ченых дцзр фибробдастов капсулы.

5. Экзшатаболитн цкстицзрков изменяют степень и направяе-..- нле даффереицироЕки фабробластов в органных культурах -капсул.

Во все сроки , культивирования-в таких эксплантатах .дреобаадаэ-щей.формой фзбробластов являются етые фибробласты, отличающиеся достаточно низкой степенью дифферекцировки, пролнферирзздие . и синтезирующие -глш®з&*«шюгдиканы. Вприсутствии цистицарков .в среде часть зрелых фвбробластов дифференцируется в фиброкла-сты, осудествлякше резорбцию коллагена. .

6. Изучена последовательность морфофункционадьных изменений в органных культурах-эмбриональной .поджелудочной железы крысы,. культивируемых. как в присутствии цистлцерков в среде, так и без них. Экзомзтаболиты дастицеркоз также оказывают рост-сти^яцруадэе воздействие ш оргашие культуры эмбриональной под&елудочиой Еедезы, проявляющееся в увеличении выживаемости

• эксхиантатоБ,. со2фащении периода адаптации, продлении периода

. щюли-ферацин ; и дифреренцаровки культур. В этих условиях показано.увеличение, штотачеимго индекса и индекса первично меченых ядер эпителиоцвтоз трубок и.даводцых протоков экзокринной час. ти железы. Только в присутствии цастицерков в культуралъной среде отмечена пролифврация эцдо^сриккх клеток. .

7. Присутствие экзометаболитов дастнцерков в культуралъной среде приводит к. более раннему наступлению :дифферекцировки эпи-телиоцитов экзокринной части яоджедуцочной железы, их превращению в ацинозные клетка, характеризующиеся субшкраекодическЕми признакшги активного се1фэтообразованвя. Характерной особенность» дифференцаровки эдитвяля эндокринной часта поджелудочной аелвзы в присутстши цистицерков является появление в составе

•островкового аппарата не только В-клеток, но и А-клеток. Отмечается новообразование .эндокринных ■ элементов в составе эпителиальных трубок и выводных протоков. Эндокринные клетки такке ' имеют субмшфоскошгческие признаки, сзадагедьетвуазде об-актив-

; - г? -

ности процессов гормонообразованич и выведения секрета. .

8. Среда, в тоторай предварительно находились цистидаргси, оказывает каа стимулирующее, так и ингибирутааэ влияние на про-лйфератив11ую активность трансформированных фзбробдастов шш клеточной линии'L929., .Характер: влияния экзометабодатов цпста-церков зависит от отноэеншг веса цистицерков к объему культу- . ральной среда, от нрекани, прошедшего с момента эксплантации цистицерков до помещения клеток в среду, а такка от времени нахождения цистицерков в среде. '"Наибольшим стимулирующим влиянием обладает среда, в которой цистицерки находились в отношении 1:40 г/мл в течение 48 часов; наибольшим ингибпрузздкм влиянием обладает среда, в которойцистицерни находились з отношении 1:10 г/мл в. течение 24 часов. Смена среда через сутки от момента эксплантации цистицерков из организма снимает ингибхфухщее влияние экзометаболзтов, а среда, в которой цистицерков в отношениях, равных 1:20 и 1:40 г/мл, содерналз 24 часа, после ее смены обладала стимулирующим эффектом.

Э. Культивирование фибробластов 1929 на ерэдэ, обладающей наибольшим ингибируэдпн влиянием, сопровождалось характер-ям жировым перерождением. этих клеток, которое :ло:шо рассматривать как стимуляцию дифференцировки фибробластов 1,923 до пути превращения в адяиоциты.

Список работ, опубликованных по теме диссертация

1. Яцозва Е.Д. Изменение показателей прояиферативной активности глыппных фибробластов 1929 при действии экзометабодетов цистицерков Hydatijera taeniaefomis // Актуальные проблемы медицинской паразитологии и тропической медицины. - Баку, 1985. -Вып.4. - С.61-64.

2. Адоева З.Я. Энергетический обмен з фибробластах органных культур -соединительнотканной капсулы цлетицерка Hyùatigera taeniaefornis // Там же. - С.35-37.

3. Адоева З.Я. Влияние экзомэтаболитов цистицерков Hyda-tigere taenia ei'arm s (Baisch, 1783; Lanarck, 1813) на пост и диФгоерёнцировку эпителия эмбриональной поджелудочной келеза крыс в органных культурах // Проблемы тканевого паразитизма. -Л., 1935. - С.23-28.

■ ■ ^ -18' • 4.- Адосва Е.Я. £з5рогд£зця с^к восиогльй иохсдиза аутора-роаса ^о^-гс.тььсгг^ксЗ кс.кг-^ ц^стадг-лз дааяь-его Г^тер, X колу,

ского общэсгс;^ &драь'^го;огаз (Сдоееа, 1$С5). - В 2-х ч. - Кгез: ■■'Шукова.дака,: 138а.- ЧЛ.-СД2. -

•:6..'Б0резшщев В.А., АдэеваЕ.Я. Ззшашв акзсвготабощргов • ■ цистацзрков -ьвеп1авгозка1э ка фвбробяаста в орган-

-нах-культурах соедошгйеяьноткзнксй .«алеут // Докаады АН СССР. - 1985.-- Т.291, . й 5.-0.1276-1275.

•6. .Адоева Е.Я. Мировая конверсия мншкнх■фзбробластов ли-■нии- 1.525. ■ икдуцировшшая цястицеркаик .кошачьего -цепня ауйс-^гегь ^аегЛие£о??.Хз ЛШЪвсЪ, 1785'; Хадаге!:,. 1815) // Цаго-ЛОГИЛ. - 1987.' - Т.2Э, Й 4. - С.472-477..

' 7." Адоева .-Е.Я. '.Особенности влияния экзометабоцитов циети-церков кошачьего цепня ка фцоробласты в органных'культурах // -••Цвтблокя. - 1587. - Т.39, * II. - С. 1297-1302.

8. ,Адоева 3.Я. Изучение 'возмо;шцх ..механизмов. .изменения . углеводаого обмена крыс в сксте'ме паразит-хозяин // «¡орфойунк-циопальнае основы кодашгсатораогприспособктешшх реакций ор- • гаипама. - Л., 1988. -С.44-51.

Выракаа глубока благодарность иоеиу.научному руководате-яю--профессору Ираю Александровичу Березанцеву за предоставление интересной шЫ кссяедовагда и заведуюда.1у отделом клеточных культур ¡Института цитологии АН СССР, профессору'Георгию Петровичу Цкнаеву за- предоставдеккуэ-.вогможкость. работать в отделе,; поетошшое'вшианке к работе, полезные советы л консультации.

Считаю своим долго» .выразить признательность за помощь в .работе •' и -'.консультада! по .ряду .вощюсов • заведующей морфологическим отделом Щ11д ЯСГШ, доктору медицинских наук Валентина Федоровне ¡Ивановой -и • научному сотруднику отдела клеточных кудь-'-1ур: Института цктолокгл.А31 СССР, кандидату биологических наук ■Тшхат Борисовне Гоизковой.

-.. -Искрение, -благодарна сотрудника« кафедры -медицинской био~