Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние экзогенных рибонуклеаз на размножение дрожжей рода Candida

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние экзогенных рибонуклеаз на размножение дрожжей рода Candida"

РГ 6 и«

\ и иА<1

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени В. И. УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА

На правах рукописи

КОЛПАКОВ Алексей Иванович

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ РИБОНУКЛЕАЗ НА РАЗМНОЖЕНИЕ ДРОЖЖЕЙ РОДА САНОЮА

03. СО. 07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени капдадата биологических наук

КАЗАНЬ - 1993

Работа Быполлена в лаборатории биосинтеза к биошгаенериъ ферментов Казанского ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственного университета им.Б.И.Ульянова-Ленина

Научный руководитель : доктср биологических наук,

вед.н.с. Ф.Г.КУПРИЯНОВА-ЯШНР,

Консультант

доктор биологических наук, профессор, академик АН РТ И.Б. ЛЕНИНСКАЯ

Официальные оппоненты: дзктор биологических наук

вед.н.с. Г.И.ЗЛЬ-РЕГИСТАН

кандидат биологических наук, с.н.с. «.Н.ДАВЫДОВА

Ведущая организация : Научно-исследовательский

институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи

Защита состоится "__а"__и»ня________1993 г. в __14— часов

на заседании специализированного Совета К 053.29.19 в Казанском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственном университете им.В.И.Ульяноаа-Ленина по адресу: 420008, Казань, ул.Ленина, 18.

С диссертацией мокно ознакомиться в научной библиотеке Им.Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета им.В.И.Ульянова-Ленина по-адресу: 420008, Казань, ул.Ленина,35.

Автореферат разослан Ав^к^Л__1993 г.

Ученый секретарь специализированного'

совета, кандидат биологических

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. К числу кардинальных проблем микробиологии относится вопрос регуляции роста и развития культур микроорганизмов. Решение этого вопроса неразрывно связано с изучением внутренних и внешних факторов, определяющих развитие как отдельных микробных особей, так и всей популяции в ц*лом. В связи с этим большое внимание уделается микробным метаболитам. выделяемым в окруяавщуи среду, играющим сигнальную роль в регуляции роста и развития микроорганизмов (Хохлов 19?S, 1988; Зль-Ре.гистан и др., 1979 ).

Вместе с тем накоплен обширный материал о влиянии на рост и развитие микроорганизмов внешних факторов. В этом плане особый интерес представлянт продукты яизнедеятельноити микробных клеток. Добавленные в среду культивирования в определенных концентрациях, они участвувт в регуляции численности популяции (Коротяев 1973; Иигаева и др., 1986].

Широко известно, что на размновение клеток оказывают влияние многие биологически активные вещества, обладавшие мутагенным или ДНК-поврезданщим действием. Эти вещества в микродозах стимулируют рост и развитие клеток, индуцируют репликатив-ный синтез ДНК (Cohn et al., 1994; . Иваницкая с соавт, 1996; Иангин-Барезовский и др.. 1986 ). По мнении авторов, в основе стимуляции клеточной пролиферации мутагенами леаат модификаци-онные события, приводящие к увеличению активности внутриклеточных нуклйодеполимераз, в том числе и рибонуклеаз (РНКаз), Активация щелочной РНКазы мутагенами была показана авторами в модельных экспериментах и опытах La vitro. Наблыдаемый факт корреляции усиления пролиферативных процессов с повышением активности РНКаз определяет интерес к этим ферментам в плане исследования роста и развития культур микроорганизмов при непосредственном воздействии на них экзогенными РНКазами. Изучение этих вопросов будет способствовать познанию фундаментальных закономерностей, леяаиих в основе регуляции клеточного роста и деления. Помимо этого, результаты исследования роста микроорганизмов в присутствии экзогенных РНКаз могут позволить реиить ряд конкретных задач биотехнологии, таких,как увеличение выхода биомассы практически ценных микроорганизмов и продуктов их

_ 3 -

метаболизма.

Среди первых работ, посвященных изучению влияния экзогенных РНКаз на пролиферативные процессы, заслуживают внимания испытания их в ферментотерапии опухолей. Было показано, что нуклеодеполимеразы микробной и тканевой природы наряду с распадом опухолей визываот стимуляция роста клеток карциномы Эр-лиха особенно в опытах с резко сниженным (на 5-6 порядков) количеством введенного фермента (Кюне и др., 1988; Беляева и др., 1969; Габдуллина. 1980).

Вместе с те« в литературе имелись единичные сообщения о стимулирующем влиянии панкреатической РНКазы на размноаение ряда бактериальных клеток (Солдатова. Беляева, 19?2). Однако к началу настоящей работы С 1988) в литературе отсутствовала информация о возыокннх механизмах действия экзогенных РНКаз, в том числе о способности этих ферментов проникать в микробные клетки. Все это не позволяло однозначно оценить вклад, который вносят РНКазы в процессы регуляции роста и развития культур микроорганизмов. Для решения этого вопроса необходимо значительное накопление экспериментальных данных о действии экзогенных РНКаз на рост и развитие микробных культур с учетом таких факторов, как каталитическая активность ферментов. Физиологическое состояние и проницаемость микробных клеток для РНКаз.. Все излоаенное свидетельствует об актуальности изучения механизмов регуляции размножения микроорганизмов с участием экзогенных РНКаз.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось выяснение основных закономерностей влияния экзогенных РНКаз на клетки дровней в связи с регуляторным действием этих ферментов на рост и развитие микроорганизмов.

В задачи экспериментальных исследований входило: .

1. Изучение влияния экзогенных РНКаз на размножение аспо-рогенных дрожжей в зависимости от физиологического состояния инокулята и активности рибонуклеаз.

2. Определение возможности проникновения экзогенных РНКаз в клетки дрожией.

3. Изучение влияния экзогенных РНКаз на биосинтетические процессы в клетках дрожжей.

4. Рассмотрение биохимических аспектов стимулирующего

- Ч -

действия РНКаз.

5. Разработка способов применения экзогенных РНКаз в качестве стимуляторов роста культур микроорганизмов и растений.

Научная нозизна работы. Впервые збнарумена способность экзогенных РНКаз (РН.Каза 1, РНКаза В.intermedius ^отличающихся по свойствам . оказывать регуляторное действие на рост культуры аспорогенных дрояней рода Candida.

Установлено, что РНКазы при добавлении их в начале лаг-Фазы роста культуры в высоких концентрациях угнетают рост и деление клеток, а в низких дозах стимулируют эти процессы.

Подобраны оптимальные условия для проявления стимулирующего эффекта РНКаз: доза фермента, добавляемого в среду культивирования, и фаза роста культуры, используемой в качестве инокулята. При этом установлено, что стимулируищая доза РНКазы является строго определенной, при отклонении от нее в сторону увеличения или уменьшения эффект ускорения разынояения клеток уменьшается или полностью утрачивается.

Впервые показано, что стимулирующий эффект обусловлен избирательным влиянием РНКаз на активно размногавщиеся клетки культуры экспоненциальной фазы роста, коррелирующий со стимуляцией синтеза РНК и белка и с повнвением активности хрсмаги-нассоциированной РНК-полимеразы.

С помодью иммунохиыических методов исследования установлена избирательность поступления экзогенных РНКаз (нативных и инактивированных) в клетки, достигшие фазы замедления роста.

Обнаруяено изменение параметров ионного гомеостаза у клеток дрояжей, подвергнутых действии экзогенных РНКаз. Установлено, что-под действием РНКаз происходит изменение активности мембранного фермента аденилатциклазы с последующим изменением содержания уровня цйМФ и активности цйНФ-зависимых протеикки-наз у дрояжей С.tropicalis.

Практическое значение работы. Разработаны способы выращивания культур бактерий, дроаяей, а такае ряда растений при добавлении в ростовую среду в малых дозах РНКаз. Способы могут быть использованы при разработке более эффективных технологий получения микробной биомассы для медицинской, пищевой промышленности, для сельского хозяйства, в частности при получении кормовых белковых концентратов и создании средств защиты сель- 5 -

скохозяйственных растений.

Апробация работы. Основные полонения диссертационной работы доловены на Всесовзных конференциях "Регуляция микробного метаболизма" С Пущино, 1989), "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" (Рига, 1989), Всесоюзном симпозиуме "Структура и Функция клеточного ядра" (Гродно. 1990), Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения Ферментов" (Рига, 1990), 9 конференции межотраслевого проекта "Ферменты "микроорганизмов" (Казань, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них - 4 авторских свидетельства.

Объем и стрнктара работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав обзора литературы, 5 глав собственных исследований и раздела ".Материалы и методы исследований", заключения, выводов и списка литературы. Материалы иэловены на 167 страницах машинописного текста, вклачая 25 таблиц и 11 рисунков. Список литературы содержит 125 отечественных и 137 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение влияния экзогенных рибонуклеаз на рост микробных куитур было проведено на культурах дровней Candida tropicalis K-t и Candida vaiida BKM Y-2328.

В исследованиях били использованы следующие ферментные препараты: панкреатическая РНКаза фирмы "Serva", рибонуклеаза Bacillus interuedius (биназа). а такяе бинаэа, инактивирован-ная фотоокислением, структурно идентичная исходному ферменту (Голубенко и др.. 1982).

Аспорогенные дрояии С.tropicalis выращивали на среде Ридер (Нейсель, 1950), С.vaiida на среде 11Е (Ерошин и др., 1974).

Контроль за ростом культуры осуществляли учетом числа клеток в камере Горяева под микроскопом с Фазово-контрастным устройством.

•Репродуктивный возраст дромей устанавливали по числу почечных рубцов на клетку (Штрейблова, 1964).

Активность рибонуклеаз .определяли по накоплению кислото-

этих случаях эффект биназы не проявлялся (таблица 2). •

Таблица 2

Влияние стимулирующей дозы биназы на размножение Candida tropicalis в среде Ридер с различным содержанием дрожжевого экстракта и сахарозы через 3 часа культивирования

Барианты Количество клеток, илн/кл Стимуляция,

среды без биназы с биназой 7Í

Дрожжевой экстракт, 7.

0.50 47.0+3,2 70.2+2,9 50

0,25 40,072,3 61,3+4,2 50

0,1 34.0+3,0 37,3+3,1 0

0 26.0+3,2 25,9+4,1 0

Сахароза. У.

2,0 40,0+2,3 ,61,3+4.2 50

1,0 36,074.3 35,8+3,8 0

0 21,5+2.1 20,9+0.6 0

Стимуляция, 7. - размножение дрожжей, выраженное в процентах по отношении к контролю

Принимая во внимание литературные данные о появлении в культуральной зидкости в лаг-фазе аутогенных регулятиров роста микроорганизмов (Пиеничнов и др., 1975; Эль-Регистан и др., 1979), исследовали ростстиыцлирушщуп активность фильтратов культуры С.tropicaliS; выращенной в присутствии РНКазы и без нее. После выращивания дрожжей в течение лаг- фазы (рис.2а) культуралькая жидкость освобождалась 'от клеток и фермента (нейтрализовали специфическими антителами), и з нее вносили новую порцию инокулята. Через 3 часа роста инокулята в фильтратах культур опытного, контрольного вариантов и в свежей среде Ридер существенных различий о скорости размножения клеток отмечено не было (рис.26).

Итак, ряд вышеизложенных фактов с достоверностью указывает, что эффект РНКазы не связан с увеличением в среде культивирования предшественников нуклеиновых кислот, или дополнительных источников энергетического и конструктивного обменов,

- II -

1 2 3 4

ЕЯ-о ffl-к ЕЗ-К1

Рис.2. Изменение культуральной аидкости С.tropicalis б роста дрожвей в среде, содержащей стимулирующую дозу РНКазы. Ш- Отбор культуральной хидиости через 15(1), 30(2), 45(3), 60(4) минут выращивания дроккей с РНКазой(О) и без РНКазы (К). ($) - Прирост биомассы через 3 часа роста дрожжей в культуральной жидкости вариантов рис,2ñ, по сравнению со сзеаей средой Ридер (К1)

а такяе накоплением эндогенных факторов роста. Следовательно, мояно заключить, что стимуляция размнонения вызвана непосредственным действием на клетки фермента," добавленного в среду одновременно с инокулятом.

2. ПРОНИЦАЕМОСТЬ КЛЕТОК ЛР088ЕЙ ДЛЯ ЭКЗОГЕННЫХ РИБОНШЕАЗ

Была изучена способность дрояаевых клеток сорбировать из внешней среды РНКазы в зависимости от фазы роста культуры.—-Оказалось, что достаточно 2-х минутной экспозиции с биназой для максимального сорбирования ее клетками. Причем, наиболее высокой сорбирующей способностью обладали дрожяи культуры фазы замедения роста (таблица 3).

3 Таблица 3

Сорбция Н-биназн клетками С.tropicalis в зависимости от фазы роста популяции.

Время Величина сорбции биназы

инку- лаг-фаза экспоненциаль- замедления стационар-

бации, ная роста ная

мин имп/мин X имп/мин У. имп/мин У. имп/мин У.

1 32198+875 21,3 39572+935 23,1 45988+917 38,1 35418+921 25,1

2 41275+913 27.3 49914+911 29.1 65135+998 53,9 48717+934 34,5 5 41577+498 27,5 49117+987 28,6 85014+951 53.8 48101*399 34,1 20 41498+715 27,4 49514+979 28,9 64918+906 53,7 48125+893 34,1

имп/мин - разность величины радиоактивности в супернатанте образцов контрольного и опытного вариантов после инкубации клеток с биназой.

V. - адсорбция фермента на клетках по отношению к контролю, принятому за ЮОХ.

В связи с полученными данными возникает вопрос, ограничивается ли действие РНКазы адсорбцией на клеточной поверхности или возмонно поступление экзогенного фермента в клетку? При

- 13 -

исследовании клеточных лизатов дроаией различного физиологического возраста было обнаружено, что после 5-нинутной инкубации микроорганизмов в присутствии меченной по тритии, биназы наибольшее количество фермента выявлялось в клетках культуры фазы замедления роста. В клетках лаг-фазы роста фермент практически не выявлялся. Аналогичная картина наблюдалась при использовании метода ИФА, который позволил выявить антигены в лизатах протопластов после инкубации дровней как с активной, так и фотоокисленной биназой, т.е. инактивация биназы in vitro не влияет на способность фермента проникать в клетку.' Существенно, что наиболее проницаемыми для РНКазы являются кле.тки Фазы замедления роста, в то время как роетстимулирующий эффект РНКаз максимально проявлялся по отношению к клеткам культуры дрожжей экспоненциальной фазы роста. Это может указывать на то, что проникновение РНКазы в дрожжевые организмы не является единственным фактором, определяющим ускорение клеточной пролиферации.

3. ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ РНКаз НА БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В КЛЕТКАХ ДРОМЕИ

Учитывая, что ускорение роста микробных культур связано с усилением биосинтетических процессов, в следующих-экспериментах .исследовали влияние РНКаз на синтез основных клеточных биополимеров. Было установлено, что после 3-часового культивирования С.tropical is в присутствии стимулирующей дозы биназы, увеличение численности популяции коррелирует с повышением интенсивности .включения меченых предшественников в ДНК, РНК и, белок. Наблюдалось усиление включения меченых предшественников РНК и белка в расчете на клетку в присутствии биназы на 45 % и 30 X, соответственно (табл.4). Стимуляция синтеза макромолекул РНК и белка выявлена также при воздействии на клетки фотоокисленной биназой. Подобный эффект не обнаружен при измерении включения меченого предшественника ДНК в расчете на клетку. Следовательно, наблюдаемую стимуляцию включения метки в ДНК можно объяснить увеличением количества клеток в культуре, растущей в присутствии биназы,

/

Таблица 4

Интенсивность включения меченых,предиес.-онников в ДНК, РНК и белок клеток дровней С.tropicalis через 3 часа инкубации с биназой (опыт) и без биназы (контроль).

Фазы ДНК РНК Белок

роста •

культуры 1 2 1 ■2 1 2

лаг-фаза к 10111 12,3 120112 1501 330056 800

0 12930 12,3 . 204445 1966 509475 1248

У. стимуля-

ции 27,8 0 70.2 30,9 50,3 15,6

экспонен- К 13250 9.9 540937 406? 909919 6841

циальная 0 17779 9.8 1195814 6228 1138822 8530

У. стимуля-

ции 34.6 0 120 53,1 79,9 24.6

замедле- К- 13450 11,3 193851 1629 437920 2923

ния 0 i 7436 11,2 332457 2131 517639 3318

1 стимуля-

ции 29,6 0 71,5 30.8 48,8 13,5

стационар К 12084 11,6 136255* 1155 306800 2600

0 1525? 11,4 236687 1489 448777 2822

У. стимуля-

ции 26.2 0 73.? 28,9 46,2 8,5

1 - имп/мин/ мл пробы 2 - имп/мин/ мкг белка

Вероятно, однсй из причин усиления синтеза РНК и белка в клетках могет быть повышение активности РНК-полимеразы, В связи с этим нами был определен уровень активности этого Фермента. ассоциированного с хроматином в системе in vitro. В результате было установлено, что в клетках, выращенных в присутствии стимулирующей дозы биназы ( как активной, так и фото-окисленной), РНК-полимеразная активность значительно выше, чем

• - 15 -

9 интактных клеток. Более того, наибольшая активность выявляется при обработки РНКазами клеток культуры дроншей экспоненциальной фазы роста.

4. БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СТИМУЛЯЦИИ РАЗМНОЖЕНИЯ КЛЕТОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЭКЗОГЕННЫХ РНКаз

Руководствуясь данными литературы, что клеточный ответ на большинство физиологических воздействий осуществляется через изменение мембранной системы клетки (Кафиани, Маленков. 19?6), мы изучали влияние РНКаз на .состояние мембраны, а именно на. проницаемость ее для ионов. Было обнаружено увеличение электропроводности дрокиевой суспензии при воздействии на нее активной и фотоокисленной биназой. Помимо этого, при воздействии на дроави биназой наблюдалось значительное увеличение скорости поступления экзогенного кальция в клетку (рис. 3 ), что является дополнительным показателем изменения ионной проницаемости мембран дронвевых клеток, растущих в присутствии экзогенных РНКаз.

нМ Са/Ьмин/Ю клеток

Рис.3. Влияние биназы (0) на скорость поступления экзогенного кальция в сравнении с ингактными клетками (К)

Как известно, переходу клеток из одного функционального состояния в другое предшествует кратковременное и преходяцее изменение уровня цпМФ в клетке (Pastan, 1972; Kaever, Resch, 1985). Определение нами содр.рвания цйМФ у дроквей в течение клеточного цикла синхроннорастущей культуры в присутствии стимулирующей дозы биназы показало, что максимальный уровень цйМФ в клетсчном цикле вопите достигается раньше, непосредственно перед началом синтеза ДНИ. Таким образом, -в присутствии РНКазы сокращается продолкительность латентного периода клеточного цикла дрояаей. Существенно, что увеличение пула цйМФ а опытных клетках коррелирует с повышением активности мембранного фермента аденилатциклаз« и цАМФ-зависиыой протеинкиназы (рис. 4).

Для объяснения •выявленных изменений в биохимических процессах у клеток, подвергнутых действию РНКаз, мы исходили из двух гипотез, базирующихся на известных данных литературы и результатов собственных исследований.

Во-первых, нами установлено проникновение РНКаз в дрозже-вые организмы, сопряяенное с увеличением активности хроматинас-социкрованной РНК-полимеразы и усилением биоскнтетических процессов в клетке. В связи с этим моино было выдвинуть гипотезу об активации хроматина проникшей в клетку РНКазой .и,как следствие, усиление синтеза РНК, белка и ускорение клеточной пролиферации.'

Во-вторых, нами было обнарунено отсутствие корреляции мевду проницаемостью клеток для экзогенных ферментов и проявлением стимулирунщего эффекта РНКаз. Кроме того, эффект РНКаз регистрировался как в случае использования каталитически активного, так и инактивировснного фермента, под действием которого активации хроматинассоциированной РНК-полиыеразы in witro не наблюдалось.

Учитывая, что ключевое положение в иерархии системы управления клетки занимает цитоплазматическая мембрана, моано было предполонить, что регуляторное влияние РНКаз на рост микроорганизмов осуществляется именно через изменение свойств мембран. Высказанное полонение подтверздается способностью дрогней за 1-2 минуты сорбировать более 40 У. РНКазы из среды. Причем способностью к. адсорбции на клеточной поверхности обладают ферменты независимо от сохранения у них каталитической

А

Рис. 4, Влияние биназн (0) на уровень цйМФ и интенсивность синтеза ДНК (fl), активность аденилатциклазы (Б) и цАНО-зависиыой протеинкиназы (В) в клетках дрожжей С.tropicalis в сравнении с контролем (К)

активности. Возможно, что под влиянием РНКазы происходит возбуждение мембран, способствующее изменению их проницаемости для ионов. Следствием измененного состояния мембран, вероятно, является активация мембранного фермента аденилатциклазы, ведущая к увеличению продукта реакции (цАЫФ). Являясь аллостери-ческин регулятором определенных ферментов, например, цйМФ-за-висимых протеиккинаэ , циклические нуклеотиды могут оказывать стимулирующее . влияние на реким работы биохимической системы клетки и пролиферативные процессы, как это схематически изображено на рисунке 5.

5.РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПРИМЕНЕНИЯ ЭКЗОГЕННЫХ РИБОННКЛЕАЗ В КАЧЕСТВЕ СТИМЗШОРОВ РОСТА

В связи с установленным фактом стимуляции разыновения дрожжей РНКазами, было исследовано влияние этих ферментов на выход биомассы микроорганизмов и выспих эукариот. Из данных таблицы 5 видно, что биназа-способствует увеличению выхода биомассы бактерий, применяемых в медицинской практике. Кроме того, показана возможность использования РНКаз для ускорения роста клеточных культур растений.

Таблица 5

Влияние биназы на рост про- и эукариот

Концентрация, нкг/мл Объект Стимуляция. У.

100 свекла, горох (семена) 10-20

10 меристема картофеля 60-150

1 каллус сои 45

0,1 E.coli К-12 G62 50

0,1 * B.bifiduffl ЛБА-3 50

0,001 L.fermentum 1-20 35

Таким образом, практическое прилсяение данных теоретических исследований свидетельствует о возмовности использования экзогенных рибонуклеаз в качестве стимуляторов роста культур в

- 19 - .

го

О

SO

h О

G2

ДЕЛЕНИЕ

РИС. 5

ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ СХСИЛ КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА НА ВОЗДЕЙСТВИЕ РНКАЗЫ < ПО Pardee АЛ., 1987., СЕВЕРИН» Е.С., 1991 »

Р - рецептор, Ж - ж-белок, АЦ - аденилатциклаза, ПК _ протеинкиназа,

R - рецепторная субъединица, С - каталитическая субъединица

различных отраслях микробиологической и биотехнологической промышленности с целью ускорения.« увеличения выхода биомассы.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что экзогенные РНКазы микробной и тканевой природы в микроколичествах (1 -0,001 мкг/мл) способны оказывать стимулирующее действие на рост аспорогенных дрожжей рода Candida.

2. Стимуляция размножения дрожжей проявляется независимо от физиологического состояния посевной культуры, однако обнаружена тенденция к усилению стимулирующего эффекта для икоку-лята культуры экспоненциальной фазы роете. Стииулирующий эффект. зависит не только or каталитической активности РККаз.

3. Дрожжевые организмы экспоненциальной фазы роста, наиболее чувствительные к действию экзогенных РНКаз, по возрасту клеточного цикла находятся на 2-й стадии почкования и не отличаются от остальной части популяции по репродуктивному возрасту.

4. Эффект РНКазы не связан с увеличением содержания лег-коутилизируемых предшественников нуклеиновых кислот, а также дополнительных источников энергетического или конструктивного обмена или накоплением эндогенных факторов роста. Стимуляция размножения вызывает фермент, добавленный в среду одновременно с инокулятом.

5. Установлено, что экзогенные РНКазы независимо от сохранения у них каталитической активности адсорбируется на поверхности дрожжевых грибков и проникают в клетки. Наиболее проницаемыми являются клетки культуры дрожжей фаьы замедления роста. Проницаемость клеток дрожней для РНКаз не коррелирует с проявлением стимулирующего эффекта,

6. Стимуляция размножения дрожней рода Candida экзогенными РНКазами сопровождается усилением синтеза основных клеточных биополимеров (ДНК, РНК, белка) и повышением активности хроматинассоциированной РНК-полимеразы.

7. Воздействие на культуру дрожжей экзогенными РНКазами в рост стимулирующих дозах приводит к изменению мембранной проницаемости дрожжей для ионов, а также способствует увеличении.

- 21 -

скорости поступления экзогенного кальция.

8. Под влиянием стимулирующей концентрации экзогенных РНКаз в клетках дрожжей наблюдается активация мембранного фермента аденилатциклазы, изменение пула цАМФ коррелирующего с повышением активности цАМФ-зависимой протеинкиназы.

9, Показана возможность использования экзогенных РНКаз микробной и тканевой природы в качестве стимуляторов роста про-и эукариот, имеющих практическую значимость для решения задач биотехнологии, связанных с получением биомассы и продуктов микробного метаболизма.

Публикации по теме диссертационной работы

1. Куприянова Ф.Г., Егоров С.Ю., Колпакрв ft.И., Лещинс-кая И.Б. Изменение проницаемости клеток дровней Candida tropicalis, подвергнутых действию РНКазы Bacillus intermeriius // Тез.докл. Всесоюз. конф. "Регуляция микробного метаболизма". -Пущино, 1989. -с.118.

2. Колпаков Й.И., Крылова Н.И., Куприянова Ф.Г. Влияние экзогенной РНКазы на накопление биомассы и эффективность роста дроняей рода Candida // Тез.докл. Межресп, совещания "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование". -Рига, 1989. -с.51.

5. Куприянопа-йшина Ф.Г., Колпаков А.И., Егоров С.И. Стимуляция активности хроматкнассоциированной РНК-полимеразы клеток Candida tropicalis экзогенными РНКазами // Тез.докл. X Ьсес. симпозиума "Структура и Функции клеточного ядра". -Гродно, 1990. -с.101.

4. Куириянова-йшина Ф.Г., Егоров С.Ю., Колпаков А.И. Стимуляция роста и жизнедеятельности микроорганизмов экзогенными нуклеазани // Тез.докл. Всес.конф. ''Методы получения, анализа и применения ферментов". -Рига, 1990. -с.184.

5. Колпаков А.И., Куприянова Ф.Г. Биохимические аспекты стимулирующего действия экзогенных РНКаз // Тез. докл. 9'конф. межвузовского (межотраслевого) проекта "Ферменты микроорганизмов" ( "Нуклеазы"). -Казань, 1991. -с.42.

6. Колпаков А.И., Куприянова О.Г., Егоров С.Ю., Крыло-' ва Н.И. Влияние ДНКазы 1 на рост культуры Candida tropicalis г

зависимости от циклического возраста популяции // Микробиология. -1991. -Т.60. вып.5. -с.730-795.-

7. Колпаков А.И., Куприянова-Акина Ф.Г. Бисхимические аспекты стимулирующего действия экзогенных РНКаз // Биол.науки. -1992, N 2. -с.103-108.

8. Куприянова-йиина Ф.Г., Колпаков А.И.. Егоров С.К). Влияние РНКазы Bacillus interaedius на размножение дрожжей Candida tropicalis //'Биол.науки. -1992, N 4. -с.90-100.

9. Колпаков А.-И., Куприянова Ф.Г. Влияние экзогенных РНКаз на размножение дронвей Candida tropicalis // Микробиология. -1992. -Т.61, вып.6. -С.969-974.

10. Егоров С.В., Калина С.А., Колпаков А.И. и др.Способ получения биомассы дрожжей Candida tropicalis К-1. -Заявка Н 4320515 (158729). -Приоритет 26.10.198?. -A.c. N 1507788. -Опубл. в Б.И. -1991, Я 34.

11. Волкова Т.И., Егоров С.И., Колпаков А.И. и др. Стимулятор роста растений. -Приоритет 27.11.1987. -A.c. N 1642973. -Спубл. в Б.И.- 1991. N 15.

12. Захарова Н.Г., Алимова Ф.К., Колпаков А.И. и др. Способ обработки семян растений. -Приоритет 22.05.1989. -А.с, N 174301В. -Опубл. в Б.И. -1992. N 6.

13. Колпаков А.И., Горская E.H., Куприянова Ф.Г. и др. Способ получения биомассы бактерий. -Заявка N 4934886/13 (039626). -Пол.реи. 2.10.1992.

Азтор внранает искреннюю благодарность и признательность за оказанную методическую помощь в работе руководителю'группы вторичных посредников регуляции метаболизма института биологии КНЦ РАН к.б.н., с.н.с. Ф.Г.Каримовой и научному руководителю лаборатории инаенернсй знзимологии д.б.н., профессору Б.М.Ку-риненко за любезно предоставленную для исследований инакти-вированную фотоокислением биназу.