Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние длительности и температуры хранения до и после замораживания на приживляемость эмбрионов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние длительности и температуры хранения до и после замораживания на приживляемость эмбрионов крупного рогатого скота"

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА

: ОД

} '‘¡ПН ' На правах рукопису

Кот Віктор Семенович

УДК 591.15.16

ВПЛИВ ТРИВАЛОСТІ ТА ТЕМПЕРАТУРИ ЗБЕРІГАННЯ ДО І ПІСЛЯ ЗАМОРОЖУВАННЯ НА ПРИЖИВЛЕННІСТЬ ЕМБРІОНІВ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ.

Спеціальність: 06.00.27 - біотехнологія •

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

Харків - 1996

* Дисертація е рукопис

Робота виконана в відділі біотехнології відтворення нових генотипів сільськогосподарських тварин Інституту тваринництва УААН.

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук

Безуглий Микола Дмитрович

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

член-кореспондент УААН Сахадькин Микола Іванович

кандидат ветеринарних наук

- Стегній Борис Тімофійович

_ Провідна установа: ,

Інститут свинарства УААН, м. Полтава

Захист дисертації відбудеться 26 червня 1996 року о 10 годині на засіданні спеціалізованної Ради Д02.30.01 при Інституті тваринництва УААН, 312120, м.Харків, п/в Кулиничі

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту тваринництва УААН, 312120, м.Харків, п/в Кулиничі -

Автореферат розісланий 22 травня 1996 року -

Вчений секретар спеціалізованної Ради

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуальність теми. В теперішній час біотехнологічшгіі метод трансплантації ембріонів широко застосовується в скотарстві країн, що мають розвинуте сільськогосподарське виробництво, в тому числі і в Україні. Зробити цей метод доступним для практики тваринництва дозволила розробка методів заморожування та довготривалого зберігання ембріонів сільськогосподарських тварин. В нашій країні колективами вчених під керівництвом академіка Ф.І.Осташко та професора О.Д. Вугрова розроблені вітчізняні технології, які дозволили достатньо широко використовувати метод трансплантації ембріонів в племінному скотарстві. Основні наукові та методичні питання метода трансплантації вже вирішені, однак технологія має деякі вузькі місця, що знижають її ефективність. Так, на практиці досить часто доводиться вилучати ембріони від декількох донорів, і від отримання до пересадки або заморожування минає декілька годин, що створює певні труднощі при зберіганні ембріонів. Велике значення має зберігання ембріонів у виробничих умовах. Це пов’язано з можливим транспортуванням деконсервовашш ембріонів віл лабораторії до місця пересадки. Вибір умов зберігання є важливіш не тільки для отримання максимальної збереженності, але й з точки зору технологічності процесів кріоконсервації і трансплантації ембріонів. Всі існуючі методи обчислення збереженності базуються на придатності ембріонів до трансплантації після деконсервування. Кількісних методів урахування зміни якості ембріонів при кріоконсервації у доступній нам літературі не виявлено.

Мета та завдання досліджень. Основною метою роботи було визначення максимального часу та оптимальної температури зберігання ембріонів до заморожування та після відтавання для вдосконалення технології кріоконсервації ембріонів великої рогатої худоби. Для досягнення поставленої мети виконувались такі завдання:

1. Визначити максимальну тривалість зберігання ембріонів перед заморожуванням при позитивних температурах.

2. Вивчити вплив різних температур зберігання до заморожування на збереженність деконсервованих ембріонів.

3. Розробити технологічний метод короткочасного зберігання ембріонів до заморожування.

4. Вдосконалити метод кріоконсервації, включивші до нього короткочасне зберігання деконсервованих ембріонів.

5.Розробити об’єктивний метод обчислення збереженності деконсервованих ембріонів.

6. Провести виробничі випробування метода кріоконсервації з короткочасним зберіганням ембріонів До заморожування та після

-НЬОГО. -

.' Теоретична і практична цінність дослідження. Вивчена можливість і визначена максимальна тривалість короткочасного зберігання ембріонів до заморожування та після відтавання. Для цього вдосконалена установка для заморожування ембріонів сільськогосподарських тварин. Тепер вона дозволяє поєднати в собі короткочасне зберігання ембріонів при проміжних температурах та їх глибоке заморожування. Розроблено метод обчислення

і

збереясенності деконсервованих зародків, який враховує зміну якості зародків після відтавання.

Впровадження наукових розробок. Метод короткочасного зберігання ембріонів до заморожування та після відтавання використовується для транспортування та накопичення їх до заморожування і пересадок реціпіентам в Охтирській виробничо-науковій лабораторії кріоконсервації та трансплантації ембріонів великої рогатої худоби АПО “Світанок”, держплемзаводах “Василівка” та ' “Михайлівка” та колективних сільгосшдприємствах Сумської області. Метод обчислення збереженності деконсервованих зародків впроваджено у відділі біотехнології відтворення нових генотипів сільськогосподарських тварин Інституту тваринництва УААН та пунктах і лабораторіях трансплантації, які працюють під його методичним керівництвом.

Апробація роботи. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на Вченій раді Інституту тваринництва УААН, республіканській науково-виробничій конференції молодих вчених і спеціалістів, Львів, 1987р., першій республіканській науковій конференції “Біотехнологічні дослідження і перспективи їх розвитку’’, Львів, 1990 р.;’ першій міжнародній науковії! конференції молодих вчених та спеціалістів "Селекційно-біотехнологічні методи використання генетичного потенціалу сільськогосподарських тварин”, Київ, 1994 р.; науково-виробничої конференції “Теоретичні й практичні аспекти породоутворювального процесу у молочному та м’ясному скотарстві”, Київ, 1995 р., міжнародному симпозіумі “Бесплодие. Вепомагательньїе репродуктивные техно-

логин”, Київ, 1995 р., 11-й щорічний конференції Європейського товариства трансплантації ембріонів, 1995, Гановер, Німеччина;

Наукові результати, що виносяться на захист.

•' 1. Методика короткочасного зберігання ембріонів- великої

рогатої худоби при білянульовпх температурах до заморожування та після відтавання. .

2. Еспериментальні результати впливу температури та терміну зберігання ембріонів до заморожування та після відтавання на їх збереженность.

3.Удосконалена технологія заморожування ембріонів великої рогатої худоби, що включає короткочасне зберігання.

4. Метод обчислення збереженності деконсервованих зародків, що враховує зниження їх якості після відтавання.

5. Результати виробничої перевірки методу короткочасного зберігання ембріонів великої рогатої худоби до заморожування та після відтавання до пересадки.

Особистий внесок пошукувана. Дисертант виконав переважну частину робіт самостійно. Методологія та схема досліджень були відпрацьовані разом з науковим керівником, дослідницька робота проводилась пошукувачем самостійно. Із спільних дослідів і публікацій дисертант використав для оформлення роботи тільки свою частину результатів. -

Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 140 сторінках машинописного тексту, включає 22 таблиці, 23 -малюнки. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів власних досліджень і їх обговорення, висновків і пропозицій, списку використаної літератури. Список літе-

ратурп складається з 194 джерел, в тому числі 141 на іноземних мовах.

ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ.

Дослідження проводилися з 1987 по 1995 роки у відділі біо-технології відтворення нових генотипів сільськогосподарських тварин Інституту тваринництва УААН і в Охтирській виробничо-науковій лабораторії кріоконсервації та трансплантації ембріонів великої рогатої худоби АПО “Світанок” Сумської області.

Дослідження проводились на ембріонах корови, що отримувались за стандартними методиками. Життєздатність ембріонів після отримання або проведення дослідів визначалась декільками способами: морфо логично, по здатності ембріонів до розвитку in vitro, по реакції ембріонів на дію гіпертонічних розчинів та по приживленності після пересадки реципієнтам.

Заморожування ембріонів проводилось на установках, що були розроблені у Інституті тваринництва УААН. Як контейнери для ембріонів використовували пробірки Уленгута та пайєти.

Як кріопрогектор використовувався гліцерин в концентрації 1.2М на фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) з фетальною сироваткою. Для вилучення кріопротектору застосовували 0.5М розчин цукрози. Насичення та вилучення кріопротектору проводили в один ступінь.

■ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Досвід нашої виробничої роботи в Охтирській лабораторії трансплантації, а також досвід біотехнологів інших пунків трансплантації показує, що від моменту отримання ембріонів до їх пересадки або заморожування минає від 1 до б годин. Це обумовлюєть-

ся віддаленістю донорів та реципієнтів від лабораторії, а також кількістю операцій по вилученню та пересадці зародків протягом дня. Як впливає тривалість зберігання ембріонів при температурі 22"С на їх прижив ленність, показано на мал. і .

Мал, 1. Прижквленність ембріонів великої рогатої худоби після зберігання при кімнатній температурі протягом різного часу. Символами позначені ембріони, що зберігали: від отримання до заморожування - •; після відтавання до пересадки - □ ; після отримання до пересадки - Д.

На усіх трьох технологічних етапах, де необхідне зберігання ембріонів, максимально допустима тривалість склала 3 години, після чого спостерігалось достовірне зниження приживленності. Після шестигодинного зберігання ембріонів до заморожування або після відтавання, а також після восьмигодинного зберігання свіжо-отриманних ембріонів, зародки не приживлювались. Щоб максимально збільшити тривалість зберігання, ми використали добре відомий у експеріментальній біології факт зниження метаболічної

V

10

з -

' активності прп охолодженні. Як впливає зберігання протягом 12 годин перед заморожуванням при різних знижених температурах на збереженнісгь деконсервованнх ембріонів, показано в таблиці 1. В пій та наступних таблицях- однакові суперскрттт означають значення, які вірогідно не відрізняються одне від одного, а різні -ті, що відрізняються з імовірністю не менш 0.95. Контролем у всіх дослідах були ембріони, що зберігались при кімнатній температурі не довше двох годин як до, так і після заморожування.

Таблиця 1.

Збереженнісгь деконсервованнх ембріонів при зберіганні протягом

12 годин перед заморожуванням при знижених температурах.

Температура | Кількість ембріонів, пп. Збереженні, сть , % Кількість ембріонів, що прижились, шіЛ%)

зберігання, І °С ! в досліді ! що збереглися нісля відтавання

+22 і 9- 0 ' ■ 0‘ 0 <0)‘

+10 1 11 ' 0 81.2“’ 2 (18.2)“

+4 10 - 9 30.0“ 4 (40.0)“

0 1 11 і 10 90.9° 5 (45.5)“

Контроль | 12 ' і 11 91.7" 6 (50.0)“

Зниження температури зберігання від кімнатної до т10°С вже дозволяє отримати прижіш.тенність ембріонів, хоча і на низькому рівні. Зберігання при +4°С і 0°С дозволяє отримати збере-жегагість і рівень приживленності, що вірогідно не відрізняються від контролю. Таким чином, зниження температури дозволяє збільшити тривалість зберігання свіжоотрнманих ембріонів до заморожування. "

Для-отримання позитивних білянульовпх температур вико- -ристовували побутовий холодильник, для отримання температури

0°С використовували льодову баню. В зв’язку з тіш, що приготування льодових бань більш технологічне та доступне, ми використовували для короткочасного зберігання ембріонів температуру льоду, що тане. Щоб визначити максимально можливу тривалість зберігання, ми вивчили приживленність ембріонів, що зберігались при (ТС до заморожування протягом 4...48 годин. Результати цього досліду наведені в таблиці 2.

’ Таблиця 2.

Збереженність деконсервованнх ембріонів після різного часу зберігання при 0°С до заморожування.

№ п/п Час до заморожування, год. Кількість ембріонів, нп. Кількість ембріонів, що збереглися після відтавання, шт. Збережен- ність ембріонів, о/ /о Прижив ле-нність ембріонів, %(а)

~ 1 ~ 4 19 17 89.5 4 40.0'(10Г

2 _ 8 13 11 84.0* 44.449)

3 12 10 9 90.0 і 44.4‘(9)

4 16 ЗО 24 80.0 м 40.9'(22)

5 24 10 8 80.0 й’ 37,5‘(8>

6 36 20 14 70.0 і'ь 30.0С,<І(10)

і 48 14 8 57.1ь 14.34(7)

- контроль | - 34 І 31 91.2 і 41.9431)

Зберігання до 12 годин не знижувало збереженність ембріонів по морфологічній оцінці, а зберігання до 24 годин не знижувало їх приживленність. При зберіганні від 1& до 36 годин спостерігалась тенденція до зниження збереженності, а після зберігання протягом 48 годин зниження збереженності та приживленності було вірогідним. Таким чином; зберігання до 24 годин перед заморожу-

ванням вірогідно не змінює приживленність деконсервованих ембріонів.

Мал. 2. Схема установки для заморожування ембріонів по закону пассивного остигання з короткочасним зберіганням прн біланульових температурах.

Щоб реалізувати на практиці запропонований спосіб зберігати ембріонів, ми вдосконалили режим зниження температури протягом заморожування. Як базову ми використали технологію заморожування по закону пасивного остигання, що була запропонована Ф.І.Остаїшсо та співавторами (Осташко Ф. І. та співав., 1991).Головного відмінністю цієї технології від інших е те, що режимом заморожування є зміна температури при остиганні термоблоку з певними теплофізичними характеристиками у горло-

віші сосуднгаї Д’юару. Схема установки наведена на мал.2, а відповідні режими заморожування - на мал.З.

' т-с ?

Мая.З. Зниження температури при заморожуванні ембріонів великої рогатої худоби в пробірках Улеигута без короткочасного зберігання (А) та з ним (Б). - ~

При зануренні термоблоку на глибину, що вказують автори установки (113 мм). буде відбуватися охолодження до -30°С- протягом 90 хвилин, а потім ембріони переносять у рідкий азот. Цьому відповідає лінія А на мал.З. Для зберігання при білянульовпх температурах ми запропонували втримувати термоблок на деякій проміжній глибині. В серії фізичних дослідів було показано,-то при .зануренні термоблока, в якому знаходяться пайєти з ембріонами, на глибину 62 мм температура зразків буде знижуватися до +4°С протягом 15 хвилин, а потім до 0°С протягом 12 годин. Аналогічні вимірювання були проведені для пробірок Уленгута, де глибина занурення була 69 мм. Конструкція установки забезпечує вільний доступ до термоблоку та дозволяє занурювати чергові кон-

тейнери для накопичення генетичного матеріалу перед заморожуванням. Заморожування проводиться при глибшому зануренні термоблока. Відповідний режим зниження температури при короткочасному зберіганні ембріонів до заморожування відображає лінія Б на мал.З. Таким чином, остигання термоблоку в горловині сосуди-ни Д’юара на двох рівнях дозволяє сполучити в одній установці, що працює по закону пасивного остигання, зберігання при проміжних температурах та глибоке заморожування. Ми провели перевірку удосконаленого методу заморожування, результати якої наведені в таблиці 3. Тестом на збереженність була здатність ембріонів до розвитку в культурі. Збереженність зародків по морфологічній оцінці і по розвитку in vitro в обох дослідних групах не відрізнялись від контролю.

. Таблиця 3.

Збереженність деконсервованих ембріонів корови, що зберігались до заморожування при 0”С від 2 до 4 годин.

Тип контейнеру Кількість ембріонів , шт.

в досліді життєздатних по | морфологічній І оцінці {%) J розвивалося в культурі, ‘ (%)

Пайети 18 - 16 (88.9)“ j 12 (66.7)ь

Пробірки Уленгута 19 17 (89.5)1 і 13 (68.4)ь

Контроль 16 14 (S7.5)1 j і 11 (68.8)ь

Аналогічно зберіганню ембріонів до заморожування ми запропонували використовувати температуру 0°С для зберігання деконсервованих ембріонів. Як впливає тривалість зберігання на збереженність ембріонів після відтавання показано в таблиці 4.

ІЗ

_ _ _ Таблиця 4.

Життєздатність деконсервованих ембріонів після короткочасного зберігання при 0°С.

Час зберігання прж 0°С, год. Кількість ембріонів , ПГГ. - Життєздатність, {%)

. В ДОСЛІДІ -- жкттездатких

4 10 9 90 *

12 13 11 . 88*

24 12 10 83*

36 9 . 1 IIі

Контроль 10 9 90*

Прн зберіганні протягом 24 годин життєздатність деконсервованих ембріонів вірогідно не відрізнялась від контролю, в той час як після 36 годин зберігання тільки 11% ембріонів були здатні до розвитку. .

Запропонований нами метод короткочасного зберігання не -виключає нагрівання ембріонів від білянульових температур ло кімнатної, а потім їх повторне охолодження. В досліді при повторному охолоджуванні 22 ембріонів нами було показано, при ньому вірогідно не знижується життєздатність ембріонів.

В ході численних експериментів з великою кількістю свіжо-отриманих та деконсервованих. ембріонів постає задача визначення їх збереженності після циклу заморожування-відтавання. В основу розробки метод>' обчислення збереженності було покладено вивчення результатів пересадок свіжоотрдманпх та деконсервова-ипх ембріонів, які проводились в Центрі трансплантації Інсттуту тваринництва УААН, Охтирській лабораторії да деяких інших пунктах трансплантації в 1987...1995 роках. В масиві існуючих

експериментальних даних з 2084 ембріонів були сформовані 9 груп по стадіям розвитку; компактна морула, рання та розширена бластоциста; та по якості ембріонів до заморожування: відмінні, добрі та задовільні. В кожній -групі був проаналізований стан ембріонів після відтавання та визначений рівень приживленності шсля їх пересадки реципієнтам. Контролем були свіжоотримані ембріони.

В усіх вивчених нами літературних джерелах головним критерієм збереженності деконсервованих ембріонів була можливість їх трансплантації реципієнтам. В кількісних термінах це означає, що ембріон придатний або непридатний до трансплантації Іншими словами, збереженність ембріонів може бути або 100%, або 0. Безумовно, що це явно спрощений підхід, і тому дослідники розглядали ступінь приживленності в залежності від якості ембріонів до та після кріоконсерваци. - _ -

Ми припустили, що метод обчислення збереженності декон-сервованпх ембріонів повинен враховувати зміну їх якості після відтавання і базуватися на спиіні приживленності ембріонів різної якості. Як зберігаються ембріони корови протягом кріоконсерваїгії показано у таблиці 5. .

' Спостерігається досить складна картина зміни якості ембріонів протягом кріоконсерлації. Так, свіжоотримані ембріони відмінної якості після відтавання можуть зоставатися відмінними, або стати добрими, задовільними чи незадовільними. Аналогічні зміни відбуваються з ембріонами доброї та задовільної якості

Таблиця 5.3береженність деконсервованих ембріонів великої рогатої худоби різної якості.

Кількість ембріонів вказаної якості, шт. (%)

Стадія до заморожування після відтавання 1

розвитку якість кількість відмінна добра задовільна незадовільна

ПІЗНІ МОРУЛИ відмінна добра задовільна . . всього 122 (43.6) 68 (24.3) 90 (32.1) 280 82 (67.2) 82 (29.3) 29 (23.8) 54 (79.5) 83 (29.6) 10 (8.2) 12 (17.6) 21 (23.3) 43 (15.4) 1 (0.8) 2 (2.9) 69 (76.?) 72 (25.7)

РАННІ БЛАСТО- ЦИСТИ відмінна добра задовільна всього 122 (38.3) 113 (35.4) 84 (26.3) 319 91 (74.6) 91 (28.5) 23 (18.9) 87 (77.0) 110 (34.5) 7 (5.7) 23 (20.4) 17 (20.2) 47 (14.7) 1 (0.8) 3 (2.6) 67 (79.8) 71 (22.3)

РОЗШИРЕНІ БЛАСТОЦИСТИ відмінна добра задовільна всього 80 (28.5) 130 (46.2) 71 (25.3) 281 63 (78.8) 63 (22.4) 12 (15) 98 (75.4) 110 (39.1) 5 (6.2) 27 (20.8) 47 (66.2) 79 (28.1) 5 (3.8) 24 (33.8) 29 (10.3)

ВСЬОГО відмінна добра Задовільна разом 324 311 245 880 236 (72.8) 236 (26.9) 64 (19.8) 239 (76.9) 303 (34.4) 22 (6.8) 62 (19.9) 85 (34.7) 169 (19.2) 2 (0.6) 10 (3.2) 160 (65.3) 172 (19.5)

Для урахування зниження якості ембріонів після відтавання

нами була вивчена прпжігвленність свіжоогріїманих та деконсерво-

ваннх зародків. Остання наведена в таблиці 6.

. _ “ Таблиця 6.

Прпжпвленність деконсервованпх ембріонів в

- залежності від їх якості. -

Якість і Кількість ембріонів . гат і і іірижішлєншсть. 1 о/ і •" і

ембріонів * 1 шо і пересажені і що | прижилися

відмінна і. 213 1 1 І 109 ! 1 51.1 |

добра і 177 і 67 37.1 і

задовільна і 42 ! 8 19.1 1

всього \ 432 і | 184 ! 42.3 ! І

Для того щоб врахувати факт зниження якості ембріонів під час кріоконсервації, ми запропонували ввести коефіцієнт збере-женності 5,, і, який дорівнює відношенню прпжпвленності ембріонів якості, яку вони мають після відтавання І7К, до прижив-ленності ембріонів тієї якості, яку вони мали до заморожування /7,

И±

п.

(О

де: субскрптттгг і та к означають якість ембріонів до заморожування і після відтавання, відповідно. Обчислені коефіцієнта збережен-ності 5,/к наведені в табл. 7. _

Якщо всі зародки зберегли свою якість (і-к), коефіцієнт збереженності дорівнює 1.0, якщо всі зародки стали незадовільними - коефіцієнт збереженності 5, к дорівнює -0. Таким чином, в крайніх випадках запропонована формула співпадає з

існуючим методом обчислення збереженності. Але, якщо існує проміжна стадія якості, картина змінюється.

Згідно правилам обчислення середьозваженнх. величіш, середня збереженність 5 буде дорівнювати:

" . . .

5 = -------- (2)

V» ..

і/т ■

4-0

де: п - кількість ембріонів відповідної ЯКОСТІ, 5,/* - коефіцієнт збереженності для ембріонів, що мали якість і і набули якість к. Формула (2) є напівемпіричного, тому що вона є результатом загальновідомого правила обчислення середньозважених величин (роль таких величин відіграють кількості ембріонів певної якості пя), де вага величини визначається емпірично встановеленим коефіцієнтом збереженності £1/к.

Таблиця 7.

Коефіцієнти збереженності деконсервованих ембріонів великої рогатої худоби різної якості, відн. од.

| Якість І після дєконсерваїщ

| до замор. | відмінна добра задовільна незадовільн.

! 1 | ВІДМІННО | 1.0 0.74 0.374 0

і дооре і - КО 0.506 0

1 задовільно і - І 1 і і . _ ■ 1.0 0

З нашої точки зору, запропонований метод розрахунку збереженності більш об'єктивно відповідає біологічним процесам, що мають місце під час кріоконсервації, тому що иін базується на методі розрахунків приживленності деконсервованих ембріонів, а не

тільки на придатності їх до пересадки реципієнтам. Запропонований метод дозволяє пояснити такий широко відомий факт, як зниження середньої прижив.тенності деконсервованих ембріонів у порівнянні з середньою приживленністю свіжоотрнманих ембріонів. Це пояснення ілюструє мал.4.

:ии

X

О

'а.

\о

ф

5 100 і*

51%

49%

Сзг*0Стрим0ні

^бріОни

.нЗ

47.7%

Декоисер&овані ембріони

[ {- біДдеіині { )- добрі £ і - ЯСДОВІЛані {-. ] - Не^ОДОвІЛені

60

40 и

*х

ф

с

зо *

■з:

а

с

Мал.4, Зміни якості та прижив ленності ембріонів протягом кріокои-

серващі.

При цьому важливо відзначити, що деконсервовані та свіжоотрнмані ембріони однакової якості мають рівні прижйвлен-ності, що вірогідно не відрізняються. Це було підтверджено і нашими дослідженнями. В популяції з 635 свіжоотрнманих ембріонів 324 були відмінної якості, а 311 - доброї. Якими вони стали після

деконсервації показано на правій частіші мал.4. Очевидно, що якісний склад популяції ембріонів значно змінився в бік зниження їх якості. В популяції з 623 деконсервованнх ембріонів, що були придатні до пересадки, помітно зменшилась частка ембріонів відмінної якості і збільшилась частка ембріонів більш низької якості Тому середня приживленність, що визначалась по правилу середньозважених величин, вірогідно відрізняється на 7... 14% для свіжоотримаиих та декоксервоЕаних ембріонів. Саме цим пояснюється знижена прижнвленність деконсервованнх ембріонів і ніякі, так звані, “приховані” дефекти не потрібно використовувати для пояснення цього явища.

Таблиця 8.

Збереженність ембріонів, що заморожувались з зберіганням при

О С до заморожування і після відтавання.

Тривалість зберігання при 05С, год.

Кількість ембріонів, вп.

п/п » ! до замо- ; після рожу- * відталая- ВЛШіЯ і іІЯ і ' заморо- жено і і і і відтаяно і життєздатних і пересаджених тільних реципі- єнтів. гол дість. | і і І і 1 і

і -0 і 0 267 ; 61 59 - 24 і 40.7а І

2 0 і 4 60 і 60 58 23 ■39.6 а І

3 < • 0 132 ; 70 65 24 36.9 а |

* 4 : 4 75 ! 75 72 26 36.1і ;

І 6 і 6 - 59 59 58 23 і 40.74 і

6 4 і 24 21 і 21 19 6 і 31.6 а і і і

ВСЬОГО 614 ; 346 331 126 “ ! " | 1 38.1і | !

Кіль-

кість

Тіль-

Проведені пошукові експерименти дозволили нам удосконалити технологію кріоконсервації, додавши до неї короткочасне зберігання ембріонів перед заморожуванням та після відтавання. Запропоноване нами короткочасне зберігання ембріонів при біля-нульових температурах використовується в пій технології для накопичення ембріонів при отриманні їх у декількох донорів до за-мороясувандя, для зберігання ембріонів після деконсервації протягом транспортування і пересадки ембріонів. Зберігання ембріонів в

* льодовій бані також може бути впкористоване для транспортування ембріонів від місця отримання до лабораторії. Технологічні показники використання цієї технології наведені в таблиці 8.

Таблипя 9.

Результат використання технології заморожування ембріонів в ДПЗ та КСП Сумскої області.

і і Назва | господарств Кількість і Кількість ембріонів, | тільних ре-що пересад- | ципіентів жено, нп. ■ гол. Тільність, в/ /О Кількість телят, гол.

1 1 і АПО "Світанок” ! 181 ! 66 . 36.5 60

і ДПЗ”Мнханлшка" 73 | 29 39.7 27

| ДПЗ’Васнлівка” 41 | 17 41.5 16

! КСП!'Чуіихівський” 18 * 7 38.9 6

І КСП ім.Петровського 10- ■ ! 4 40.0 4

! КСП ім.Крупської 8 ! 3 37.5 3

і ВСЬОГО І ! 331 І 126 І і 38.1 116

Тривалість зберігання ембріонів до заморожування змінювалась віл 0 до б годин, а після відтавання - від 0 до 24 годин. При- -

лашленність у всіх дослідних групах вірогідно не відрізнялась від контрольної, яка складала 38.1%.

Пересадки ембріонів проводились в держплемзаводах та колективних сільськогосподарських підприємствах Сумської області. Результати виробничого використання технології наведені в таблиці 9.

З ході виробничої перевірки технології було проведено 331 ембріопересадку і після отелу 126 реципієнтів отримано 116 телят-трансплантатів. В інші регіони України і Росії було продано 112 ембріонів та 156 ембріонів знаходяться в кріобанку.

ВИСНОВКИ

і .Зберігання ембріонів понад 3 години до заморожування та після відтавання при кімнатній температурі вірогідно знижує їх якість і приживленність у реципієнтів.

2. Зниження температури від кімнатної до субнульових значень дозволяє збільшити тривалість зберігання свіжоотриманих ембріонів до пересадки або заморожування і після деконсервації до пересадки до 24 годин без вірогідного зниження їх якості..

3.Піл час короткочасного зберігання лри білянульовнх температурах перед заморожуванням та після відтавання ембріони корів не знижують своєї якості при повторному остиганні.

4.Установка, яка працює за законом пасивного остигання термоблоку е горловині сосуднни Д’юара, завдяки двом рівням занурення дозволяє сполучити в собі короткочасне зберігання ембріонів при білянульовнх температурах та їх глибоке заморожування.

5. Об’єктивним критерієм врахування зниження якості зародків під час кріоконсервади е коефіцієнт збереженності, що дорівнює відношенню прижпвленності зародків певної якості після відтавання до прнжнвленності зародків тієї якості, яку вони мали до заморожування.

6. Метод обчислення збереженності деконсервованнх ембріонів повинен враховувати зміну якості зародків після відтавання, а їх збережешгість слід обчислювати за правилом середньозважених велечин, де роль ваги відіграє коефіцієнт збережен-носгі.

7. Зниження середньої прнжнвленності деконсервованнх ембріонів в порівнянні з прижнвленністго свіжоотриманпх ембріонів пояснюється зміною якісного складу популяції зародків, а саме, зменшенням частки ембріонів відмінної якості та збільшенням

“частки ембріонів більш низької якості - .

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Метод зберігання ембріонів корови при 0°С пропонується

лабораторіям та пунктам трансплантації для транспортування та накопичення ембріонів після отримання до заморожування, а також для транспортування та зберігання ембріонів після відтавання до пересадки. -

2. Установка для глибокого заморожування шляхом пасивного остигання рекомендується також для зберігання ембріонів при білянульовнх температурах пунктам трансплантації та кріобіо-логічним лабораторіям. ■

3. Метод обчислення збереженності та приживденності де-консервованих зародків, який враховує зміну якості зародків після відтавання та використовує коефіцієнти збереженності, пропонується для визначення життєздатності ембріонів під час кріокон-сервації.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ.

1.Воронцов В.В., Кот B.C., Кирьянчук А.А. Сроки осеменения коров. /''/Тезисы докладов 2-й республиканской научнопроизводственной конференции молодых ученых и специалистов, 24-26 сентября 1986 г. - 1986. - г. Харьков. - с. 13.

2.0сташко Ф.И., Никитин В.А., Гордиенко H.A., Безуглый Н. Д.. Кот B.C. Микрохирургическое разделение деконсер-вированных эмбрионов крупного рогатого скота // Тезисы докладов республиканской научно-производственной конференции молодых ученых и специалистов, 22-23 декабря 1987 г., - 1987. -м. Львов. - с. 57.

3.Безуглий М.Д., Кобріновнч Ф.М., Масс А.О., Валігу-ра К.Г., Горбунов Л.В., Кот B.C. Початок робіт по створенню кріобанку ембріонів великої рогатої худоби зникаючих порід//Перша міжнародна наукова конференція молодих вчених та спеціалістів 16-17 лютого 1994 р. “С-елекційно-біотехнологічні методи використання генетичного потенціалу с.г. тварин: Тези доповіді/інститут розведення і генетики тварин. - K., -1994 р. - с-12.

4.Безуглпй М.Д., Щегельська O.A., Кот B.C., Зубець М.В., Гузеватий О.Є., Ясинський В.В. Трансплантація ембріонів великої

рогатої худоби, одержаних в культурі in vitro .//'Молочно-м’ясне скотарство, - 1995, віш. 87, с. 13-17.

5. Безутльш Н.Д., Валіпура Е.Г., Кот B.C. Замораживание и долгосрочное хранение эмбрионов крупного рогатого скота аборигенных пород Украины/ / Материалы международной научнопрактической конференции. - X. - 1995. - с. 64. .

6.Зубец М.В., Безуглый Н.Д., Гузеватый O.E., Щегель-ская Е.А., Ясинский В.В., Кот B.C. Нехирургическая трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro//В сб.: “Бесплодие, вспомагательные репродуктивные технологии., - 1995, -К.: Репродуктивная медицина, с. 210-213.

7.Зубець М., Безуглий М., Гузеватий О., Ясінський В., Щегельська О., Кот В. Перші в Україні телята з пробірки //Тваринництво України. - 1995, - №11. - с. 8 -9.

З.Кот B.C. Зберігання ембріонів великої рогатої худоби при температурі 0"С//Теоретичні й практичні аспекти породоутво-рювального процесу у молочному та м’ясному' скотарстві. Мат. доп. науково-виробничої конференції, 22-23 березня 1995 p., -1995.

- К: Асоціація “Україна”. -- с. 257-258.

Кот B.C. Влнянне длительности и температуры хранения до п после замораживания на прижнвляемость эмбрионов крупного рогатого скота. Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных на>тс по специальности 06.00.27 - биотехнология. Институт животноводства УААН, Харьков, 1996.

В работе определены условия краткосрочного хранения эмбрионов крупного рогатого скога при околонулевых температурах до замораживания и после оттаивания. Усовершенствована технология криоконсервацнл эмбрионов крупного рогатого скота при использовании околонулевых температур для краткосрочного хранения. Разработан метод вычисления сохранности деконсервпро-ванных зародышей, который учитывает снижение их качества после оттаивания. Проведена широкая ггроизводстваенная проверка усовершенствованной технологии криоконсервации в госплемзаво-дах и коллективных сельхозпредприятиях Украины.

Kot V.S. Infmence of storage duration and temperature before and after freezing on the cattle embryo viability. Dissertation on the scientific degree competition of candidate of agricultural sciences in the speciality 06.00.27 - biotechnology. Institute of Animal Science of UAAS, Kharkov, 1996.

Possibility for short-term storage of the cattle embryos under nearzero temperatures before freezing and after thawing was shown in the research. Technology of cattle embryos cryopreservation was modified by using nearzero temperatures for short-term storage. Method to calculate depreserved embryos survival was worked out and it takes into account tliier quality decreasing after thawing. Wide productional verification of the modified technolog}' for embryo cryopreservation was carried out in the state pedigree and collective agricultural farms of Ukraine.

Ключові слова: біотехнологія, ембріон, зберігання, заморожування, збереженність, приживлення.