Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние длинноцепочечных N-ацилэтаноламинов на свойства плазматических мембран клеток нейробластомы С1300 N18

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние длинноцепочечных N-ацилэтаноламинов на свойства плазматических мембран клеток нейробластомы С1300 N18"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУ1БН НАРОДОВ ЙКДЕЫИЯ НАУК УКРАИНЫ

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им.А.В.ПАЛЛАДИНА

на правах рукописи

МЕЛЬНИК АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ ДЛИННОЦЕПОЧЕЧНЫХ N-АЦИЛЭТАНОЛАНИНОВ НА СВОЙСТВА ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН КЛЕТОК НЕЯРОБЛАСТОЫЦ Ci 3 О О N18

03.00,04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1991

Работа выполнена в Институте биохимии им. А.В.Палладина йкдемии наук Украины.

Научный руководитель: член-корреспондент АН Украины, доктор биологических наук ГНЛПЯ II,Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ведуцая организация: Киевский медицинский институт

в ___часов на заседании специализированного совета

К 016.07.01 в Институте биохимии им. А.В.Палладина АН Украины

по адресу: 252030, г.Киев-30, ул.Леонтовича, 9. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

К0СТЕРИН С.А.

доктор биологических наук МЙГЫРА И.С.

им. А.А. Богомольца

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

КИРСЕИК0 О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Однин из компонентов апологических нембран являются липияы. которые составляют от 20 до 80/. их массы. Согласно современным представлениям данный класс биохимических соединений организован в мембране преимущественно в виде бислоя, Функция которого состоит в Формировании замкнутых барьеров типа плазматической мембраны и мембран внутриклеточных органелл. Свойства этих барьеров определяются прехде всего Физико-химическими характеристиками липидов (Финдлеп Д.. Эванз. . 1990),

Однако до недавнего времени практически не были исследованы так называемые минорные "необычные" липиды, к которым относятся ПАРЕ. lnafe. nae, семилизобисфосфатидная кислота, фактор активации тромбоцитов. Мало что известно о их функциональной роли в биомембранах.

особое место среди указанных соединения занимают апильные производные фосфолипидов. считалооь. что жирные кислоты, соединенные с аминами, встречаются в природе в основном в сФинголипи-дах как часть их нерамидного (н-аиидсФингозинового) остова, а аминогруппы глицерофосфолипидов. таких как РЕ и PS, не ацилиру-ются через азот. Однако, в середине 60-х годов Бонстейн (Bomstein к.А.. 1965) выделил н-ацилФосФатидилэтаноламин (ПАРЕ) и соответствуют® лизофосфолипид (LHAPE) из пшеничной ну-ки, а дальнейшие исследования показали его наличие у высших растения и микроорганизмов,

Чрезвычайно важными и интересными свойствами обладают нета-болиты Н-апилированных фосфолипидов - н-аиилэтаноламины. на которые исследователи обратили внимание еше в 50-я годах (Long. D. А., 1950, Ganley О. Н.. 1958), Оказалось, что минорные липидные компоненты обладают широким спектром биологических и Фармакологических свойств.

в работе приняты следующие сокращения: НАЕ - н-аяилэтаноламин. РЕ - ФосФатидилэтаноламин. PS - ФосФатидилсерин. FC - фосфати-дилхолин. PI - фосфатидилинозитол.

- г.-

ЭФФект действия ацильных производных этаноламина на транспорт катионов в тканях млекопитающих был обнаружен недавно (Epps D.E. е. а. 1981). этот процесс изучен не в полной мере, обьектон наших исследования являлись клетки неяробластомы, в которых при диФФеренцировке увеличивается количество каналов, принимающих участие в транспорте катионов, что сопровождается одновременным изменением липидных компонентов в клетке, липиды, в свою очередь, могут принимать участие в транспорте катионов. Изучение этих процессов будет способствовать расширению представлений о Физиологическом действии N-аиилзтаноламинов.

Цель и задачи исследования. Исходя из того, что NAPE и ПАЕ были обнаружены в клетках нейробластомы, была поставлена цель: изучить содержание, субклеточное распределение и обмен этих соединений в клетках нейробластомы, их влияние на транспорт катионов через плазматическую мембрану.

непосредственными задачами были следующие:

- исследовать изменение содержания NAPE, LHAPE и NAE в процессе днфференцировки;

- изучить распределение N-ацилэтаноланинов по субклеточным фрак, циям клеток нейробластомы.

- определить степень влияния этих минорных липидов на транспорт катионов через плазматическую мембрану в дифференцированных и незрелых клетках.

- исследовать возможные пути деградации и метаболизма "необычных" липидов.

- в опытах, проведенных на клетках нейробластомы и на животных, выяснить биологическую роль данных соединений.

Научная новизна, в клетках нейробластомы ci300 N18 впервые обнаружены минорные липидные соединения Н-ацилэтаноламшм, исследованы пути их метаболизма. Установлены отличия ФосФолипид-ного состава клеток нейробластомы в процессе дифференцировки. Показано влияние N-ацилэтаноламинов на транспорт рубидия-йб в этих клетках, вход кальция-45 в фосфатидилхолинопые липосомы. Обнаружено, что указанные соединения влияют на' процессы перекис-ного окисления как в клетках нейробластомы, так и в субклеточных «Рйкцачх. Экспериментально доказано действие ПАЕ на реакции ме-

- 3 -

тзстазирования в условиях in vivo.

Практическая значимость. Получение данные, касающиеся проявляемого Н-ацилэтаноламинами антиоксидантного и, соответственно, связанного с ним антиметастатического эффекта, перспективны для последующего внедрения этого соединения в медицинскую практику (создание новых лекарственных препаратов, разработанных на основе минорных липидных компонентов - nae).

Апробация работы и публикации. Результаты исследований доложены и Обсуждены на:

- конкурсе молодых ученых института биохимии АН украинц,

Г. Киев, 1988 г. ;

- IV Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран", Черноголовка, декабрь, 1989 г. ;

- III Всесоюзной конференции по нейронаукам, г.Киев, 1990 г.

- конференциях лаборатории биохимии клеточных культур, г. Киев, 1991 г.

По теме диссертации опубликовано 5 работ..

Структура и объем диссертации. -Диссертация состоит из введения, трех глав обзора литературы, описания методов исследования, трех глав экспериментальных исследований, их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы содержит 172 источника (32 отечественных и но зарубежных, ) работа изложена на 127 страницах машинописного текста. Текст диссертации иллюстрирован Ю 'таблицами н 7 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И HETOAU

Эксперименты проводились на клетках нышиной нейробластомы С1300 Н18. Для выращивания клеток использовали среду Игла (Институт полимиелита и вирусных энцефалитов АНН СССР) с добавлением юн бычьей сыворотки. Для диФФерениировки культуры был использован 5"-бромдезоксиуридин, который добавлялся во Флаконы при смене ростовой среды после прикрепления клеток к подложке. Через 96 часов диФФерениировки культура достигала синхронности 82Х и использовалась в экспериментах.

В экспериментах по влиянию НАЕ на объем и количество метастазов, а также на образование продуктов перекисного окисления липидов использовали мышей линии С57В1/6. '

Количественное определение н-ааилэтаноланинов проводилось на газовом хроматографе GC-9A (Schimadzu, Japan) с использованием синтетических стандартов и FQ-капиллярной колонки О.2x25 (ммхм) с химически связанной ov-ioi,

Экстракцию липидов осуществляли, применяя метод фолча для получения липидного экстракта в модификации Блай и Дайера (Blight e.g. and Dyer w. i,, 1959). содержание фосфолипидов в липидных экстрактах рассчитывали по количеству в них фосфора, которое определяли с помощью молибдатного реактива по методу Васьковского (Уазкоузку V. Е. at al., 19Т5).

Жирные кислоты определяли с помощью газо-жидкостной хроматографии после метилирования. Метиловые эфиры жирных кислот из обшего липидного экстракта получали по методу icarreau i.D., 1978.). Идентификацию жирных кислот проводили по нетоЬу (AKman R.G. , 1969).

Для определения этилового спирта и адетальдегида в культу-ральной среде и клетках нейробластомы использовали ■ метод Успенского (Успенский А. Е., 1962).

Принцип метода синтеза н-^'Ь-пальмитоилэтаноламина предложен Высоцким (Высоцкий Н. В.. 1988) и состоит в получении бутилового эфира жирной кислоты, а затем в переводе его в КАЕ. Для.

14

изучения распределения метки 1- С(1б:о) по субклеточным фракии-ян брали 20 флаконов Карреля диаметром 10 см с клетками нейро-бластоны. В каждый флакон добавляли по 100 тыс. имп/мин l-^ueiO), После инкубации среду сливали и определяли обшую радиоактивность. Клетки трижды промывали по 3 мл средой Игла, снимали со стеклянной подложки раствором Версена, ресуспедирова-ли в Ю мл натрий-ФосФатного буфера, клетки нейробластомы в буферном растворе озвучивали в течение 3 мин на дезинтеграторе ULTRASON (франция). Центрифугировали 15 мин при 2000 g на центрифуге (MLB К£3). Надосадочные Фракции отбирали, к осадку добавляли буфер и снова озвучивали, затем центрифугировали в тех же условиях. Все Фракции подвергались анализу на объем, коли-

чество белка и обшую радиоактивность, Плазматические мембраны, ^фракцию микросом и цитозольных белков получали по методу, разработанному Волковым (Волков Г. Л. . 1989).

При изучении транспортных процессов использовали диФФеренци-

56 *

рованные клетки нейробластомы, предварительно нагруженные Kb в

течение 75 мин в бессывороточной среде, которая содержала изо-6

топ в количестве 6x10 инп/мин (Palfrey с. and Littauer u.Z., 1976). в работе использовали ФосФатидилхолиновые липосоны, полученные методом "обращенных Фаз" (SzoKa F. е. а. , 1978).

образование продуктов перекисного окисления в клетках неп-робластомы С1300 N18 и в легких мышей с привитой карциномой Льюиса под действием ацильных производных зтаноламина определяли. используя методы (Андреева А. и. ■ 1988, орехович в. н., 1977).

результаты и обсуждение

Содержание NAPE и НАЕ в дифференцированных и недифференцированных клетках нейробластомы СГ'ЗОО N16.

Свои исследования мы проводили на культуре клеток нейробластомы, широко используемой в лабораторной практике, так как дифференцированные клетки нейробластомы обладают практически всеми свойствами зрелых нейронов.

Первым этапом в нашей работе являлось изучение содержания данных минорных липидных компонентов в процессе дифферениировки и распределения их по субклеточный фракциям нейробластомы.

Из таблицы 1 видно, что NAPE локализованы в основном в плазматической мембране недифференцированных клеток, где они составляют более 50/í содержания, характерного для целостных клеток, в микросомальной Фракции их в 17 раз меньше, чем в плазматической менбране. По нере созревания клеток нейробластомы количество HAFE в целостных клетках уменьшается приблизительно в г раза, в субклеточных фракциях находим лишь следовые количества этих соединений. В целостной недифференцированной клетке преобладавшей является лизо Форма КАРЕ, где ее в 1,7 раза больше по сравнению с нативной Формой и. приблизительно, в 4 раза больше в целостной диФФеренцированой клетке.

- б

Таблица 1.

9

Содержание ы-ацилфосфатидилэтаноламинов (нмоль/10 клеток) в субклеточных Фракциях дифференцированных и недифференцированных клеток нейробластомы С1300 Nia. (HtMi n=4).

Л И п И д ы Недифференцированные клетки Дифференцированные клетки

целост. клетки плазм, мембр. микрос. фракция целост. клетки плазм, мембр. микрос. Фракция

ПАРЕ 244 + 10 152+ го 9 + 1 133 + 10 следы следы

ЛИЗО-НАРЕ 411 + гз 297 + 1Т 161t в 502 + 5 388 + 16 153 + 15

Производные hafe - к-пальиитоилэтаноламин и н-стеароилзтано-ланин зафиксированы лишь в недифференцированных клетках (Таблица 2), причем практически весь уровень НАЕ (16:0) локализован в плазматической мембране. В недифференцированных же клеткак находят лишь следовые количества этих соединений.

Таблица 2.

я

Распределение н-а«илэтаноламинов (нноль/ю клеток) по субклеточным Фракциям дифференцированных и недифференцированных клеток нейробластомы С1300 N18. (М+м; п=4).

Л И П И Д H Недифференцированные клетки Дифференцированные клетки

целост.. плазм, клетки мембр. микрос. Фракция целост. плазм, клетки мебр. микрос. фракция

К-пальмитоил-этаноламин 1. 00} 1. 13 + 0. 05 0. 04 следы Следы следы следы

N-стеароил- о. 30 + следы следы следы следы следы

этаноламин О. 04

Метаболизм новообнаруженпых лшшдных компонентов - Н-аиил-этаноланинов.

Полагают, что Физиологический эффект ЛАЕ реализуется именно на плазматических мембранах клеток. В связи с этим важно было выяснить, каким образом происходит распределение ЫАЕ в СУбкле-. точных Фракциях. После инкубации клеток с синтетическин 1-1<Ь-н-пальмитоилэтаноламином измеряли распределение радиоактивной метки (рис. 1. ). линия з отражает суммарное содержание метки в клетках за весь период инкубации и четко свидетельствует о том. что меченный ПАЕ, встроенный в плазматическую мембрану, даже в случае его деградации полностью утилизируется клеткой нейроб-ластомы и не экскретируется во внеклеточную среду.

в$щяя рвдиоакт., % 100 ¡0 60 но ¿0 о

15

30

HS

60

мим

iH

Рис. I. Распределение 1- С-Ы-пальмитоилэтаноламика в субклеточных фракциях нейробластомы С1300 N18.

1 - питозоль

2 - плазматические мембраны

3 - никросоны

S - суммарное содержание метки

Постепенное снижение концентрации метки в плазматической

мембране (кривая 2), накопление ее в цитозоле (кривая 1) и фракции микросом (кривая 3) показывает, что метка из КАЕ, встроившаяся>в плазматическую мембрану, быстро транспортируется цитоэольныии белками внутрь клетки и накапливается в микросомах, Уже через 15 минут инкубации клеток с НАЕ внутри клетки (цитозоль ♦ никросомы) содержалось практически в 2 раза больше метки, чем в плазматической мембране.

Было изучено содержание ^Ь-нетки в НАЕ. свободных жирных кислотах и липидах, содержащих апильные радикалы. Как следует из данных, представленных на рис. 2. после полного включения 1-1'Ь-Н-пальмитоилэтаноламина в плазматическую мембрану (15 минут инку-бапии) практически вся радиоактивность сконцентрирована в КАЕ.

Рис.2. Распределение 1- С-Н-пальмитоилэтаноламина и продуктов его метаболизма в нейтральных липидах плазматической мембраны клеток нейробластомы.

1 - эстериФицированные жирные кислоты

2 - 1-^С-НАЕ (16:0)

3 - жирные кислоты

Б - сумнарное содержание метки однако, уже на зо нин инкубации содержание метки в КАЕ снижается почти в 2 раза, и она накапливается в свободных жирных кислотах. Это свидетельствует о высокой скорости гидролиза НАЕ до жирной кислоты и этаноламина. В это же время метка накапливается в липидах, содержащих жирные кислоты, т. е. меченная по жирная кислота включается в синтез липидов. К 45 мин инкубации

Фактически наступает равновесие в распределении рал ^-активной нетки: количество лирной кислоты, отщепляемой от НАЕ и переходящее в пул свободных жирных кислот, соответствует тону количеству. которое идет на синтез эстериФипИРованных липидов. снижение содержания *Ь-метки в липидах между 45 и во нин свидетельствует скорее всего о включении части 1- ^С-пальнятата из пула свободных жирных кислот в процесс растепления и в:л>аботки энергетических ресурсов.

Физиологический эффект и возможные механизмы действия Н-ацилэтаноламинов. Н-ацилэтаноламины могут оказывать влияние на функцию быстрых натриевых каналов в клетках неяробластомы счзоо ше.

В экспериментах использовали дифференцированные клетки ней-робластоны. По начальной скорости выхода рубидия-86 из предварительно нагруженных данным катионом клеток неяробластомы, судили о том, как влияют размчные концентрации Н-ашшэтанолами-нов и соотношение длины их анильной цепи на выход рубидия-8б из клеток.

Данные экспериментов показали, что добавление всех трех

ацильных производных этаноламина в концентрации 5x10 Н на Фоне

вератрина вызывало примерно одинаковый эффект, в значительной

-6

степени снимая действие вератрина. При концентрации 5x10 Н полностью снимался вератриновый инкримент выхода рубидия из клеток

для нае 1б:о, 18:о, а эффект для 14:0 был несколько менее выра-

-5

женным. При использовании большей концентрации 5x10 М НАЕ 16:0 и 18:0 снижалась скорость выхода рубидия по сравнению с базаль-ной. нае и:о в данном случае не затрагивал баэального выхода

(Таблица 3).

для объяснения этих данных можно выдвинуть слудлошие предположения:

1. Вератрин. связываясь с одним из участков натриевого канала, приводит к увеличению проницаемости, для катионов, а добавление пае изменяет липидное микроокружение канала, инактивируя его.

2. НАЕ может непосредственно связываться с вератрином и образовывать неактивный конплекс.

Таблица 3.

-1

Значения констант скоростей (с : %) выхода рцбидия-86 из клеток нейробластомы С1300 N18 под действием вератрина и НйЕ (Н + в; п=4;

НЙЕ базальннй выход рцбидия-86 вератрин 640ыкг/мл -5 НЙЕ 5x10 V + вератрин 640 мкг/кл -6 -НЙЕ 5x10 Н + вератрин 640 мкг/мл -7 НАЕ 5x10 М + вератрин 640 мкг/мл

14:0 0.11 + 100 0.03 0.27 + 251 0.03 0.12 + 112 0.03 0.12 + 116 0.01 0.17 + 12В 0.07

!6:0 0.12 ± 100 0.04 0.31 + 250 0.05 0.08 + 69 0.01 0.12 ± 100 0.04 0.15 + 128 0.03

18:0 0.1? + 100 0.03 0.58 + 276 0.06 0.14 + 74 0.04 0.18 ± 102 0.02 0.22 ± 129 0.05

з. нае по своей структуре, имея гидрофобный хвост, способен внедриться в липидный бислой и тем самым уплотнить мембрану.

Возможно, эти эффекты, проявляемые НАЕ. связаны с влиянием вератрина.

Результаты экспериментов, которые были проведены по входу ру-бидия-86 в клетки нейробластомы уже без вератрина, оказались противоположными данным по выходу этого катиона. .

Данные по входу рубидия-8б в клетки нейробластомы представлены на рис.3. Из рисунка видно,что при использовании концентрации НАЕ 1б:о - 5x10 М в среде инкубации наблюдается увеличение проницаемости мембраны клеток.

срм/ мг белка, iscoo

■iCOGC

5000

О

/

10 SO 50 to SO 60 мин

Рис. з. влияние и-пальнитоилэтаноламина на вход рубидия-еб в клетки нейробластомы С1300 Н18.

1 - базальный вход

2 - вход рубидия-86 в присутствии НАЕ 16:0,

Сложность организации липидного бислоя мембраны, гетерогенность состава и распределение липидных компонентов на внешней и внутренней стороне скорее всего объясняют неоднозначные результаты по входу и выходу катионов.

В дальнейшем была использована - более простая модель - ли-

посомы из чистого ФосФатидилхолина для опытов по исследованию ч5

транспорта са , т. к. данный катион широко используется в таких .

экспериментах, а также исходя из того, что данные литературы

показывают : длинноиепочечные Н-ацилэтаноламины влияют на про-

„ 2*

ниааемость внутренней митехондриальной мембраны для ионов Са, £+ 2+

вызванную действием Са и са -освобождающих агентов. Результаты,

представленные на рис, 4. показывают, что скорость входа са в

липоссмы с ЫАЕ (16:0) существенно выше, чем в контроле. Из

15 г*

рисунка видно, что скорость включения Са в липосомы с МАЕ (линия г) была приблизительно в I. 5 раза выше по сравнению с контролен (линия 1). 1+

Са, накоплен. §липосЛ'/о) 2

Рис. <ь Влияние НАЕ 16:0 на, зход фосфатидилхолиновые

липосомы. За 100Х принято значение радиоактивности

изотопа, внесенного в среду инкубации. 49 г*

1 - вход са в фосфатидилхолиновые липосомы

45 ¿+

2 - вход Са в фосфатидилхолиновые липосомы с нае 16:о. По-видимому, вход одновалентных катионов в клетки нейроблас-

томы, так же как и проницаемость-■липосом для са . определяется непосредственным воздействием ИЛЕ на липидный бислой мембраны, а также тен, что добавление ЫАЕ в среду инкубации может приводить к формированию мииеллярных комплексов типа кати-он-фосфолипид и тем самым инициировать транспортный процесс.

Наряду с теми Физиологическими эффектами, которые присуши нае, он обладает свойствами ингибитора перекисного окисления липидов, Известно, что при всем многообразии эффектов, вызываемых продуктами перекисного окисления липидов на клетку, наиболее важно их действие на проницаеность биомембраны.

Для культуры клеток нейробластомы было проверено влияние нае 16:0. как ингибиторе, перекисного окисления липидов. Для этих опытов брали четыре различные концентрации нае 1б:о - 50. юо.

1бо и 200 мкМ, растворенного в этиловом спирте. В качестве ин-

й*

дуктора переокисления было использовано юо мкН Ге . На рис. 5

видно, что ингибиторныл эффект более выражен в конпен'1 рапионноя области от 50 до 150 мкМ НАЕ. При более высоких концентрациях влияние НАЕ не наблюдается.

имольЩЛ/ Л1Г 5елка. / час

V0

30

го ю

гЬ

} ч

б

Рис.5. Действие НАЕ 16:0 на перекисное окисление липидов в клетках иейробластомы. 100 мкН

2»-

Г - Fe ,

контроль

г+

Fe

4 - Fe

5 - Fe'

б - Fe

2r

НАЕ (50 НКМ>

КАЕ (100 НКН)

N/J3 (150 ИКН)

ПАЕ (£00 MKM)

ческой мембране вании Fe . а также

Содержание малонового диальдегида определяли в плазмати-и микросомах клеток нейроластомы при индуциро-в смеси (Ре2* + Н-пальмитоилзтаноламин) (рис.6). НАЕ 16:0 ингибирует процесс образования конечного продукта реакции - малонового диальдегида в обеих фракциях. В плаэнаическоя мембране этот процесс более выражен.

нмоль МДЙ/ кс Senna. / 5 час

Ч з 2 i О

гЬ

гЬ

м

Рис. е. Влияние N-пальмитоилэтаноламина на содержание

малонового диальдегида по реакции с тиобарбитуро-вой кислотой в плазматической мембране и микросомах клеток нейробластомы С1300 Hl в.

1 - контроль

г - Fe2* loo мкм

3 - Fe* 50 мкн НАЕ *

4 - Fe2* + 100 нкк НАЕ

5 - Fe*+ ♦ 150 МКМ НАЕ

Исходя из полученных результатов, можно предположить, что, очевидно, имеется взаимосвязь между влиянием NAE на проницаемость для клеток нейробластомы и перекисным окислением липидов в клетках нейробластомы.

Получив результаты, которые совпадают с данными других авторов, однако, проведенные in vitro, мы поставили эксперименты на хорошо отработанных моделях мышей с привитой карциномой Льюиса.

Продукты перекисного окисления липидов у мышей С57В1/6 после прививки карциномы Льюиса определяли на 3, 7 и 14 сутки после начала введения НАЕ. из табл,4 видно, что действие NAE практически не оказывает влияния на .образование диеновых коныо-гатов, лишь незначительно уменьшая их количество по сравнению с контролен. В то же время содержание гидроперекисей уменьшается практически в два раза на протяжении всего времени после введения НАЕ. Снижение уровня налонового диальдегида особенно отчетливо видно на 7 и 14 сутки после введения НАЕ. Его уровень также снижался пратически в 2 раза,как и количество гидроперекисей.

таблица 4.

Влияние НАЕ 16:0 на образование диеновых коныогатов. гидроперекисей и малснового диальдегида в кровеносных сосудах легких нышей с гривитой карциномой лыоиса. Показатели выражены в единицах оптической плотности, к - контроль о - опыт. (Hih¡ п= 3).

Продукты пере-кисного окисления 3 сутки (10 сутки) 7 сутки (14 сутки) 14 сутки (21 сутки)

Диеновые коньюгаты к - 1. 67+0. 20 0 - 1. 5840. 20 к - 2. 00+0. 15 0-1. 60+0. 09 К - 1 72 + 0. 21 0-1. S310. 04

Гидроперекиси к - 0. 09+0. 02 0 - 0. 05 + 0. 01 к - 0. 06 + 0. 01 0 - 0, 03+0. 01 к - 0. 03+0. 01 0 - 0.02 + 0. 01

Малоновый диальдегид к - 0. 43+0. 06 0 - 0. 38 + 0. 05 к - 0. 80+0. 10 0-0. 47 + 0. 07 К - 0. 70 + 0. 15 0-0. 35+0. 06

3 сутки - срок после начала введения МАЕ 10 сутки - срок после прививки опухолей

Проведены также эксперименты по определению влияния Н-паль-нитоилзтаноламина и н-стеароилэтаноламина на количество и объем метастазов у нкшей. нае 1б:0 и 18:о в этиловом спирте вводили с 7 по 14- сутки три раза в день по 37 мг на кг веса животного.

Наибольший эффект в данной постановке опытов оказывал НАЕ 1б:о (табл. 5). он практически в два раза уменьшал количество метастазов по сравнению с контролем, эффект NAE 18:0 был несколько менее выраженным, хотя он достоверно снижал количество метастазов.

При определении влияния НАЕ 1б:0 на объем метастазов( оказалось, что НАЕ 16:0 более, чем в два раза снижал' этот показатель. НАЕ 18:о уменьшал в 1.25 раза.

Таблица 5.

действие нае 16:о и 18:о на количество и объем метастазов у

мышей после прививки карциномы Льюиса. (Н+м; ).

Вещество Количество метастазов шт. Обьем метастазов (мм ) кол-во жив-ных

КОНТРОЛЬ S6. 5 1 8. 9 75.4 i 19. 4 б

этиловый спирт 56. 6 * 5. 3 135. 4 í 35.4 7

ПАЕ 18:0 34.5 ± 3. а 59. 9 i 11. 7 а

КАЕ 16:0 28. 3 ± 3. 9 33. 9 i б, 6 9

Таким образом, получены результаты, характеризующие метаболизм минорных лишшшх компонентов в клетках нейробластомы, их влияние на транспортные процессы. В опытах ш vivo показано, что н-ацилэтаноламины могут оказывать влияние на перекисное окисление липидов и процессы метастазирования.

В итоге следует отметить, что полученные результаты могут в дальнейшем быть применены для получения новых лекарственных препаратов и их внедрения в медицинскую практику.

выводы

1. Впервые в клетках нейробластомы С1300 N16 обнаружены малополярные липиды - н-апилэтаноламины.

н-пальмитоилзтаноламин и Н-стеароилэтаноламин выявлены в недифференцированных клетках, причем практически весь RAE 1в:0 локализован в плазматической мембране, в недифференцированных же клетках эти соединения присутствуют лишь в следовых количествах.

2. Установлены отличия в ФосФолипидном составе плазматических ненбран и никросон дифференцированных и недифференцированных клеток. Содержание обших ФосФолипидов выше во фракции плазматических ненбран дифференцированных и недифференцированных клеток,"

чей в ннкросомальноя фракции, уровень содержания PC PS, соответственно, на 30 и 50/ вше в плазматической мембране, а РЕ и PI, соответственно, в 2 и 1. 5 раз больше в никросональной фракции дифференцированных и недифференцированных клеток.

3. С использованием синтезированных меченных произволтах КАЕ

«

показано, что 1- С-Н-пальмитоилэтаноламин, встроившийся в плазматическую мембрану, быстро транспортируется внутрь кле'.'ки и накапливается в цитозоле и внутриклеточных мембранных структурах.

4. Доказано, что НАЕ по-разному влияют на проницаемость клеток нейробластомы и ФосФатидилхолиновых липосон для рубидия-86

-? -в

и кальция-45. В Физиологических концентрациях <5x10 - 5x10 Н) NAE с длиной ацильной цепи 14:0, 16:0. 18:0 подавляет стимулированный вератринон выход рубидия-86 из клеток нейробластоны. Вход кальция-45 в фосфатидилхолиновые липосоны под действием îl-пальмитоилэтаноламина увеличивается в 1,5 раза.

5, н-пальмитоилэтаноламин (бо-гоо мки) ингибирует перекисное окисление липидов как в клетках нейробластомы, так и во фракциях плазматических мембран и микросон.

6, в экспериментах m vivo показано уменьшение количества и объемов метастазов в легких нылей с привитой карциномой Льюиса после действия НАЕ 16:0 и 18:0.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. GuiayaH, н,, VolKov G, L;. KlimashevsKy v, И,, Govseeva N. H. and HelnlK A.A. Changes ln llpld composition of neuroblas-toraa Cl300 H18 cell durlng dlfferentlatlon // lleuroscience - 1989. - 30. - Hl. - P. 153-164.

2. GuiayaH. H., VolKov G. L., HelnlK A. A.. ArtemenKo I.P., Govseeva H. N. The physlologlcal rôle of N-acYlrhosphatl-dyiethanoiamine - the iipids newir found ln neurobiastcma C1300 Hl9 cells // FEBS. - 1989. - 19-th Heetlni.

3. Иельник A. A. , Говсеева H. H., Волков Г. Л., Гулая H. H. влияние миристоил. - пальмнтоил. - стеароилэтаноламинов на проницаемость мембраны клеток нейробластомы Cl 300 Н18 длй одновалентных катионов // Докл. АН УССР. - 1989. - 115. -

С. 72-75.

4. Мельник А. А. , Гулая Н. Н. Изненение липшшого состава клеток нейробластоны в процессе дифферениировки и Формирование возбудимой мембраны // ш всесоюзная конференция по нейронаукам. Тезисы докладов. - Киев. - 1990 - С. 77.

5, Гула Н, И. , Мельник О. О., Висоцький Н. В., Волков Г. Л., Гов-сеева н, н. Розпод1л [1- С)-пальм1то1летанолам1ну та його кетабол1т1в у субкл1тинних Фракшях нейробластоми С1300 HIB // Укр. 610E1M. ЖУРН. - 1991. - 63. - Н2. - С. 115-119.

Подл, в иеч. II.II.91. Формат 60x84/16. Бумага тин. 04о. печать. Усл.печ.л. 1.16. Усл.кр.-отт. 1,16. Уч.-изд.л. 1,0. Тира* 100 экз. Зак. з9£ . Бесплатно.

Отпечатано в Институте' математики АН Украины. 252601 Киев 4, ГСП, ул. Репина, 3