Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Осмотическая регуляция трансмембранного транспорта К+ в клетках центральной нервной системы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Осмотическая регуляция трансмембранного транспорта К+ в клетках центральной нервной системы"

>Г6 Ой

_ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ 1 9 И10Н 18Р?3 ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

На прапах рукописи УДК 577.352

МОНГИН Александр Анатольевич

ОСМОТИЧГ.СКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСМЕМБРАННОГО ТРАНСПОРТА К+ В КЛЕТКАХ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссср гации на соискание ученой степени кандидата 6110.101 .(чеекнх наук

Минск - 1995

Работа выполнен.) в лабораториях биофизики и фотобиологии мембран Мнсштуга фотобиологии АН Беларуси (зав. лаб. - академик- АН Беларуси C.B. Конев) и фитико-г.нмии биомембран биологическою факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова (зав. лаб. - академик РАЕН С.Н. Орлов).

Научные руководители: академик АН Беларуси С.В Конев

доктор биологических наук, сг. науч. corp. С.Л. Аксенцев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор li.A. Чершщкии

- кандидат биологических наук, ст. науч. сотр. М.В. Шолух

Ведущая организация: кафедра биофизики Беларуского Государ-

ственного Университета им. В.If. Ленина

Защита сосюится " J 1995 г. в . _Х часов на заседании

спеинилширов иною Совета по присуждению ученом степени доктора биоло-I цческих наук в Институте фотобиологии All Беларуси по адрес;' i.sMiihck, уч. Ф. Скоркиы, 27( С^ tvtârq &01 •

С дисссршцион можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии АН [¡¿паруси.

7

Автореферат ра телам J' IW5 г.

Ученый секретарь

спеииализирзуанног о Cone га-

доктор биологических наук, профессор

11.М. Мажуль

I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации

Изучение механизмов регуляции клеточного объема является одной из основных проблем физиологии и биофизики. Неконтролируемое набухание животной клетки - которая в отличие от растительной лишгиа жесткой клеточной стенки - приводит к разрушению плазматической мембраны, а сравнительно небольшие изменения объема в значительной степени нарушают сложный гомеостаз знутриклето"чых химических реакций. При нарушении осмотического равновесия вследствие накопления низкомолекулярных метаболитов в цитоплазме или в ан-изотоническнх условиях в мембранах клеток различных тканей активируются исполнительные системы транспорта, которые создают ретуляторные потоки осмотически активных веществ в клетку или из нее, возвращая клеточный объем к исходной величине. г ;новной вклад в этот процесс вносят потоки калия, натрия и хлора. За последние полтора десятилетия ионные механизмы, участвующие в регуляции объема клеток, в большинстве тканей в значительной степени расшифрованы (для обзора см. Hoffmann ¿t áimonsen, 19tí9; Sarkadi & Parker, 1991; Lang et al., 1993). Наименее изученной в этом отнс тении оказалась центральная нервная систем а (ЦНС). Вместе с тем уже в экспериментальны: работах рубежа 60-70 гг. было показано, что в патофизиологических условиях происходят некомпен-сируемые изменения объема клеток и экстраклеточного пространства мозга. Это явление лежит в основе цитотоксических отеков мозга, которые развиваются после ишемических инсультов, при черепно-мозговых травмах, нарушениях функции печени, как осложнение после нейрохирургических вмешательств и являются одной из основных причин смертности в странах с развитой медициной (дл. обзора см. Baüanyi & Gräfe, 1988; Kimelberg & Goderie, 1988. Чивин и Чой, 1991; Arieff, 1993; Lobato, 1993).

Связь работы с крупными научными программами

Различные этапы этой работы выполнялись в рамках Республиканской программы фундаментальных исследований (регистрационный № 01.89036810), программы "Университеты России" (грант М-221), грантов 93-04-7518 Российского Фонда Фундаментальных Исследований и Б8-305 Фонда Фундаментальных Исследований Республик» Беларусь

Цель работы

В рамках данного исследования предполагалось идентифицировать ионные и внутриклеточные механизмы, вовлеченные в процесс регуляторного уменьшения объема в глиальных н нейрональных клетках центральной нервной системы.

Задачи исследования

- изучение транспортных систем, формирующих входящие и выходящие потоки К+, в четырех клеточных моделях ЦНС (изолированнных нервных окончаниях мозга крысы и культурах клеток нейробластомы NIХТ02, глиомы С6 и первичных астроцитов мозга крысы);

- выяснение характера влияния гипотонического набухания на тестируемые системы транспорта К+;

- определение направления нетто-потоков К+ при набуха'пи изучаемых типов клегок и анализ возможного вклада этих потоков в ;гуляцию клеточного объема;

- оценка роли кальция и кальмодулина в гипотонической активации ионного транспорта в клетках центральной нервной системы,

- изучение возможного участия различных типов фосфорилнрочания мембранных белков в трансдукции осмотического сигнала в клетках ЦНС;

- выявление сходства и различая в ионных механизмах регуляции объема и путях трансдукции осмотического сигнала в клетках пшального и нейронального происхождения.

Научная новизна полученных результатов

Установлено, что гипотоническое набухание всех изученных клеточных моделей сопровождается формированием направленного из клетки нетто-потока К+, опосредованного активацией двух типов катионных каналов: кальций-чувствительных калиевых и, предположительно, механочувствителы ых неселективных катионных, но не электронейтрального симпорта калия и хлора.

Впервые показано, что набухание клеток ЦНС вызывает активацию не только оттока, но и накопления калия. Этот процесс связан со стиы,ляцией натриевого насоса и направленного внутрь клетки Ыа+,К+,2С1"-котранспорта. Предполагается, что физиологическая роль активации этих транспортных систем состоит в востановлении высокого трансмембранного градиента К+, который диссипирует в процессе регуляторного уменьшения клеточного объема.

В синаптосомах мозга крысы и клетках глиомы Сб продемонстрировано ~ существование активируемых набуханием кальциевых каналов. В синаптосомах выявлены кинетические и фармакологические отличия этих каналов от потенциал-чувствительных кальциевых.

Доказана роль кальмодулина и кальций/кальмодулин-зависимого фосфо-рилирования белков в объемной активации калиевых каналов и Ыа+,К+,2СГ-котранспорта.

Практическая значимость работы

Результаты работы существенно расширяют и углубляют современные

предстаплення об огмотическои регуляции ионного трансгорта в клетках центральной нервной системы. Полученные данные позволяют разрабатывать новую стратегию поиска лекарственных средств для лечения цигоюксических отеков головного мозга.

Основные положения диссертации, выпооимые на защиту

1. Набухание клеток центральной нервной системы сопровождается акт-влциеП выходящи:; (опосредованных стимуляцией кальцчй-чувствмтельных калиевых ч неселективнь' < катионных каналов) и входящих (формируемых натриевым насосом и направленным внутрь Ка+,К.+,2С1'-когранспорто,у() поюков К'1. Нетто-поток катиона направлен из клетки и определяет регугьторнос уменьшение объема.

2. Гипотоническое набухание сопровождается активацией объем-чувствительных кальциевых каналов, которые в ссналтосомах мозга крысы г к ¡етках глиомы С5 по своим кинетическим к фармакологическим свойствам оглчча-отся от потенциал-чуястзпгельных кальциевых.

3. В осмотическую регуляцию к ..лиевых каналов, натриевого насоса и !\?+,К+.2С1"-котранспсрта возлечен кальмоаутин. Функциональная активность калиевых каналов н электрснейтрального симпорча Na+, К.+ и С1" находится под контролем ферментатизпой пары протеинкиназа С / лротемнфосфатаза. Гипотоническая стимуляция этих систем опосредована акгигацией процессов кальиий/ кальмодулин-завнеимого фосфорилировлилл белков.

Апробация результатов диссертации

Результаты исследований апробированы на заседании Московского общества испытателен природы ( г. Москва, 27 марта 1993 г.), I Европейской конференции "Функции глиальных клеток в Hopve и при патологии" (Heidelberg, March 24-27, ¡994), Конференции Жака Моно "Фосфоршырование белков: от структуры к функции" (Aussois, September 19-22, 1994), XV Конгрессе IL'BME (New Delhi, September J 8-22, 1994;, I Съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков (г. Минск, 22-23 ноября 1994 г.). I Международной школе молодых российских нейрохнмиков "Новые достижения в изучении метаболизма мозга" (С.-Петербург, 1-3 февраля 1995 г.).

Публикации

По теме цнссерташш опубликовано 13 работ. .

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из общей характеристики работы, введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и мь годов исследования, изложения полученных результагоп и и;с обсуждения (3 главы), заключения, выводов и списка

литературы, включающего 24я наименований Работа изложена на 135 страницах, содсрх.ит 45 рисунков и '7 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ методы ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве основных обт-ектов исследований использовали изолиропанные нервнме окончания (синаптосомы) головного мозга крыс, культуры клеток нейро-бластомы N18 Т02, глиомы С6 и первичных астроцитов гсяовного мозга крысы.

Синаптосомы получали из бопьших голушарин головного мозга самцов белых крыс по метод)' Хайоши (На^оз, 1975)

Клетки нейробластомы N18 ТС2 и глиоми С6 получены из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (С.-Петербург). Первичные культуры асгроглиальных клшок получали из головного мозга новорожденных крысят по методу МакКарчн и Де Веллиса (МсСаЛу & Ое уе№$. 1980). В качестве ростовой среды для нейроСшасток.ы и глиальных клеток использовали ОМЕ с добавлением 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Все этапы культивирования проводили в СОз-инкубатор.* в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2 и 95"/, воздуха при 37°С. Для измерений ионного транспорта клетки пересевали в 24-луночные культуральные планшеты С' 1аг на г>олнлии<новос покрытие и выращивали до конечной плотности 120-300 тнс. клеток иа лунку. '*

ТрансмембраиниП транспорт К ¥, Са2+ и Ыа+ измеряли как накопление в клетках радиоактивных аналогов этих катионов - 86ЯЪ+, и - как это

описано в работах Аксенцев-! и соавт., Конеьг. и соавг., Орлова и соавт. (Ак5еш$еу е| ¿1., 19ЬЗ; Конгв и др., 1ОД9: Ог1оу а а;., 1992). Скорость входящих потоков расчитывали по формуле:

У — А / (а с О (I)

где /' - скорость транспорта (нщмит белка/мин), А - радиоактииность образца (ими/мии), а - удалим радиоактивность шотопа я пересчете на содержание его нерациоактивкого аналога (имп/мин/нмоль), с - содержание белка в пробе (мг), / --время инкуб»1ши кпет0к в среде, содержащей-»«отоп (ми11)^Величину аыходящйх-потоков расчи гывалн но формуле".

<2=1<г.г)-(.4-г)! т/(т-2) (2)

где {) • количество оставшегося изогона в % к величине загрузки, У - общее количество загруженного изотопа, определяемое после лнзиса кисток (имп/ мин), X - поправка на сорбцию изоюпа на поверхности•клеток и полнлизиновом субЛрате (или фгпьтре) (имп/мин), А - радиоактивность образца (имп/ мен).

Идентификацию отдельных транспортных систем проводили в присутствии нх специфических ингибиторов - уабаина, буме.анида, хинидина, всрапамила и др.

Величину трансмембранного электрического потенциала оценивали по распределению липофильного катиона 3Н-тетрафч1илфосфония по методу, предложенному в работе Потно с соавт. (Ponzio et ul., ¡480) в модификации Окуня (Окунь, 1987). В качество альтернативной методики исполыовали регистрацию флуоресценции потенциал-чувствительного зонда diS-C;j-(5) (Blaustem et а!., 1975).

Состояние натриевого насоса в синаптосомах мозга и изолированных синаптических мембранах тестировали по связыванию •'Н-уабаина как это было описано ранее в работах Эрдмана и Шонера (E'dman &. Schoner, 1973) и Лыско-Boii г соавт. (Лыскова и др., 1991).

Цитоплазматическую концентрацию натрия в синаптосомах мозга определяли на пламенном фотометре, по методике Ли и Уайта (Li & Wh'te, 1977).

Целостность плазматической мембраны синаптосом мозга и культивируемых клеток нервной ткани, а также величину гипотонического лизиса синаптосом оценивали по выходу в супернатант цито; тзматического маркера лактат-дегидрогеназы.

Количественное определение белка проводили по методу Лоури (Lowry et а)., ¡951), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Результаты экспериментов подвергали статистической обработке методами вариационной статистики (Рокицкий, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ I! ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние гипотонического набухания на скорость трансмембранниго транспорта К+ в клетках ЦНС

Как видно из результатов, представленных на рис. 1, в изотонических условиях захват К+ в основном опосредован работой натриевого насоса и №+,К+,2С1'-котранспорта, причем в клетках нейронального происхождения основной вклад в формирование входящих потоков этого катиона вносит натриевый насос, в то время как в глиальных клетках велика активность электронейтральною симпорта катионов и хлора. Выходящие потоки К+ связаны с работой кальций-чувствительных калиевых каналов и неспецифической утечкой катиона через структуры, природу которьг идентифицировать не удалось. Кроме того, в глиальных клетках оттек этого катиона на 30% определяется работой направленного из клетки Ка+,К+,2С1*-котранспорта. Аналогичная компонента транспорта в синаптосомах и нейробластоме N18 TG2 не выявлена.

Г!1поток.:чее><ое набухание всех щученных типов нервных.клеток вызывает активацию как выходящих, гак н входящих потоков калия (Табл. 1). Ингибл-торный анализ с использованием хмнидина, Ва-+, фуросемида п буметанида пока-

А

В

Рис. 1. Удельный вклад (%) натриевого насоса (ингибитор - 1 мМ уабаин - 1), Na+,K+,2Cl"-K0TpaHciiopTa (10 мкМ буметанид - 2), Са •"•'-активируемых калиевых каналов (250 ikM хннидин - 3) и путей иеснецнфи^еской уте -и (компонента транспорта, не чувствительная к комбинации 1 мМ уабаиип, 10 мкМ буметанида, 250 мкМ хииидин - 4) в формирование входящих (А) и выходящих (В) потоков К+ Rb+) в синаптосомах мозга ^1), нейроблалтоме N18 TG2 (II), глиоме С6 (III) и первичных астроцитах мозга (IV),

зал, что активация выходящих потоков, как и в большинстве других типов клеток млекопитающих, опосредована открытием хинпдин-чувсгвительных калиевых каналов, но не стимуляцией электронейтрального симпорта К+ и С1". как это описано в эритроцитах и некоторых эпителиальных клетках. Сходные данньк были получены электрофизнологическими методам, на клетках нейробластомы N1 Eil5 (Falke & Misler, 1989). Для первичных астр оцтов этот вывод подтверждается результатами работ лабораторий Кимельберга и Пасантес-Моралес (Kimelt.ig & Kettenmann, 1990; Sanchcz-Olea et al., 1993; Pasantes-Morales ;t al., 1993, 1994). Кроме того в нейробластоме N. TG2, глиоме Сб и первичных астроцитах увеличивается отток катиона по механизму, не чув-ствительному ни к одному из иепользованнчх ингибиторов. Мы полагаем, что эта компонента транспорта опосредована механочувстрмтельными неселективными катионными

Таблица 1

Влияние гипотонического шока на трансмемб[ чшые потоки К+ в клетках центральной нервной системы.

Гпп клеток Осмолярность Активация Активация Направление _среды. мОсм захвата оттока К 1 нетто-потока

Синаптосомы 230 xl,5 ч2,Х Из клетки

мозга крысь.

Нейробласто- 180 X 1,3 хЗ,2 Из клетки

ма N18 TG2

Глиома 180 х2,0 уЗ,5 Из клетки

Сб

Act роциты ' 180 '1,7 <3,2 Из клетки

мозга крысы

Приведены средние значения трех-восьми жсперим .мтов.

каналами, которые ранее были изучены лтектрофизиологическими методами в клетках неиробластомы N1 El 15 (Falke & Wisler, 1989) и первичных астроцитах мозга крысы (Sokabe, 1990). Активация захвата калия определяется работой натриевого насоса и направленного внутрь Ыа+,К+,2С1"-котранспорта. Сравнение величи м активации выходящих и входящих потоков К+ показывает, что нетто-потсж катиона в гипотонических условиях направлен из клетки и определяет процесс регуляторного уменьшения объема (Табл. 1). Физиологическая ^оль ст"чуляцпи натриевого насоса и котранспорта, по нац..му мнению, состоит в восстановлении высокого градиента К+, который нервная клетка теряет в процессе восстановления объема.

2. Изучение роли экстраклеточного К+ и цитоплазматического Na+ п осмотической регуляции входящих потоков К+ в клетках нервной ткани

Одной из основных причин, активации натриевого насоса является увеличение цитоплазматической концентрации Na+ или экстраклеточной концентрации К+ (Walz & Hinks, I986;Walz, 1987; Stimers et al., 1993; Kinard et al„ 1994). В контрольных экспериментах на синаптосомах в низконатриевых средах и в присутствии ингибиторов различных систем ионного транспорта, которые потенциально могут быть вовлечены ч увеличение внутриклеточной концентрации натрия, гипотоническая ак" твация Na.K-АТФазы сохранялась (Табл. 2). Аналогичные эксперименты с использованием низконатриевых сред были выполнены

Таблица 2.

Влияние ингибиторов ионного транспорта и низконатриевых сред на бшальпую и стимулируемую набуханием активность натриевого насоса в синаптосомах мозга крыс.

Использованный ингибитор

Контроль IмкМ ТТХ 0,5 мМ амилорид 0,1 мМ верапамнл 0,5 мМ фуросемид + 10 мкМ буметанид [Ыа+]„ = 10 мМ

Активность натриевого насоса, нмоль/(мг мин) 310 мОсм 230 мОсм

3,7S ± 0,20 ? 64 4 0,44 4,12*0,57 3,90 t 0,42 4,87 ± 0,54

1,52*0,58

6,42 0,27** 5,54 ±0,52** 7,49 ±0,52 * 7,12 ± 0," 1** 5,68x0,43 .

3.88 ± 1,03 *

Приведены средние значения 3-5 экспериментов ± Sj условий достоверны р < 0,05. ** • р < 0.01,

отличия от изотопических

для нейробластомы N18 TG2 и глиомы Сб. Метдом пламенной фотометрии мы измерили содержание натрия в цитоплазме изолированных нервных окончаний в изотонических условиях и при гипотоническом набухании (рис. 2). Как видно из Содержание N а* икыоль/мг бе/1ка 150-

о 1 ш 2 о п . йш 4 „ , и

Рис. 2. Влияние гипотоничг чого шока (230 мОсм) на содержание Na+ в синаптосомах го..овиого мозга крыс, измеряемое методом пламенной фотометрии. 1 - контроль, 2 - + 1 мкМ тетродотокси-на (ТТХ), 3 - + 100 мкг/ ил верат-рнна (Вер), 4 - + (Вер + ТТХ). Приведены средние значения чегтрех экспериментов i S^r-4—— отличия от контроля достоверны, р < 0,05.

100

50

310 мОсм

Z30 мОсм

рисунка, снижение осм! лярности среды инкубацин не влияет на содержание катиона в синаптоплазме. Для сравнения приведен эффект вератрина, действие

которого опосредовано открытием потенциал- чу вс in и гельнь: х натриевых каналов и полностью подавляется специфическим блокатором этого типа ганалоз - гезро-

Иак эплени.' Са . * мвксимапкного

100|-J.

8040-

гп. о

* \ч \ Ч \ ft

. , \ \

Д f> v

\

•v

k 3

L

0',01 0,1 i 10 ¡0(1 loijo iИнгибитор], мхМ

(1я*оп/|е.шв Ca , % MatfHHanbm.ro

0,0! 0,1 1 10 100 1000 I Ингибитор!, УКМ

Рис. 3. Зависимость ингнбировання потенциал-чувствительных (А) н осмочувствхтельных (8) кальшквых каналов в сннаптосомах меня от концентрации всрепамил» (!), C11CI2 (2) и н:1«ардипинэ (3). Приведены средние значения тр.-х жтериментоь.

дотоксином. В процессе регуляторчото уменьшения объема увеличивается отток К+ из клетки, что потенциально может повиси! ь его экстра клеточную концентрации и активировать натриевым насос и. Ка+,К.+,?С1"-котрзнспор*\ Чтобы проверить это предположение, мы изменили соотношение внутри- и внеклеточного объема путем разбавления инкубационных сред. Эта процедура также не повлияла на степень гипотонической стимуляции натриевого насоса и N а*,К+,2С1"-котракс. порта й сннаптосомах, неГфобластоме N18 ТС2 и глиоме Сб. Совокупность приведенных данных позволяет сделать вьиоц, что изменение концентрации кятногев как внутри югет/,11, так и вне ее но участвует в активации тестируемых систем ионного транспорта при понижения осмоляркости среды. Пусковой механизм объемной регуляции находится в пломатической мембране илч цитоплазме нервной клетки.

3. Природа вктиачруемого набуханном захва та Са**

В ряде тканей ключевым факгором регуяяториого уменьшения клеточного объема служит увеличение цитоплазмагической концентрации опосредо-

ваннее увели"екнем егэ потоков через гтланштическую мембрану и освобождением из эндоплазм;« ичгского рстикулума (для обз. см. Hoffmann & Simoasen. IV89; Sarkadi & Parker. ¡«91; McCarty & O'Mei!, 1992; Hoffmann ct al„ 1493). Мы проье-

рили, не связано ли набухание нервных клеток с изменением трансмембранных потоков этого катиона. Оказалось, что в гипотонических условиях в нервных

0,8

0,6

относ ед.

1 »

0 2 4

Т, мин

Рис. 4. Влияние гипотонического шока на трансмембранным электрический потенциал спнсптосом мозга, измеряемый флуоресцентны,» зондом ¿¡Б -С'3-(5), В моменты времени, обозначенные стрелками, вносили синап-госомы (I), содержимое кюветы разбавляли изотопической или гипотонической средой (2), увеличивали концентрацию экстраклеточного К+ до 10 (3) и 75 (4) мМ. Не заре гис-трировано достоверной разницы между флуоресцентными сигналами в изотонических и гнлогоническнх условиях.

Накопление Га'\.ныопь/(ьт.ыин)

Ж

ш:

а I

СИ г з

сЬ

Рис, 5. Влияние предварительной деполяризации (*) на захват Са2+, индуцируемый калием и гипотоническим набуханием в еннап.оюмах мозга |срысы. 1 - контроль, 2 -|К+|0 = 70 и,VI, 3 - 1М> мОсм. Приведены средние значения трех экспериментов. ** -отлична от варианта без предварительной дениляризации достоверны, р < 0,001

окончаниях и клетках глиомы С6 активируются кальциевые 1.ак 1Ы. В еннапто-сомах они блокируются всрапамилом, кадмием и кобальтом, но не дигидропири-динамн. а в клетках глиомы С6 кроме того и никардипином. Мы сопоставили кинетические и фармакологические свойства этих каналов с потенциал-чувствительными кальциевыми каналами. Оказалось, что эти системы не идентичны. В

з

сннаптосомзх плато накопления наблюдается менее, чем Через 10 сек после

нлСухьния, н только через 30-50 сек после деполяризации в высококалиевых условиях. Как видно из рисунков ЗА и ЗВ, эти два тмпа проводимости также сильно разли"аются по своей чувствительности к днгидропиридинам. Используя флуоресцентный зонч сЛ5-Сз-(5), мы не нацциг достоверных изменений трансмембранного электрического потенциала в условиях гипотонического шока (рис. 4). И, наконец, предварител1ная калиевая деполяризация полностью ннактивирует потенциал-чувствительные каналы, никак не влияя на захват кальция, индуцируемый набуханием (рис. 5). На основании этих данных был сделан вывод о существовании в мембра.:е объем-чувствительных кальциевых ка^алсв, отличных от потенциал-чувствительных, что для нервной ткани является новой информацией. В ранних пассажах глиомы С л ведущей свое происхождение от олигодендроцитов. потен-циал-чувстствительиые кальциевые каналы ие экслресснрованы, что подтверждают изотопные измерения, однако при набухании происходит активация захвата изотопа, которая" по своим характеристикам напоминает работу осмочув-ствительных кальциевых каналов почечных канальцев (МсСапу & О'ЫеП, 1992).

4. Анализ роли кальмодулина и кальцин/кальмодулин-зависнмого фосфори-лнрования в объемной регуляции трансмембранного транспорта К* в ЦНС.

Основываясь на литературных данных о ключевой роли кальция п процессах объемной регуляции в большинстве изученных типов клеток и результатах предыдущего раздела, мы прозернлн гипотезу о кальшнИавнснмостн гипотонической активации транспорта К+. Как видно и" рис. 6 и 7, устранение экстраклеточного кальция не сказывается на осмотической активации калиевых каналов в клетках глчемы С6 и слабо ингибирует активацию натриевого насоса и №+,К+,2С1'-котрапспорта. Не снимается гипотоническая регуляция этих систем и после блокады объем чувствительных кальциевых каналов никардипином. Ранее низкая чувствительность процесса объемной регуляции к экстраклеточному зарегистрирована в лимфоцита.-! (вгшяет е! а)., 1987), культивируемых клетках НТ29 (Г\И5с|1к." е1 а1., 1993), клетках астроцитомы человека (Мсйегапо & Огиепне'п, 199.1). Как мы полагаем, это явление связано с тем, что основной вклад в увеличение шпоплазматпческон концентрации кальция вносит не поступление катиона через объем-чувствительные каналы, з его освобождение из эндоплазма-тического регикулума, как это описано в клетках НТ29 (КкзсЬке е! а!.,- 1993). К сожалению, технические трудности не позволили нам изучить этот процесс, но аналогичные исследования выполнены недавно на первичных астроцшах, где обнаружено стимулируемое набуханием освобождение Са*+ :п эпдоплазматичес-кого ретикулумэ и доказана ключевая роль этого катиона в развитии регулятор-

ного уменьшения клеточного объема (Вепс!и' ее а1„ 1994). Вовлечение кальция в процесс осмотической активации тестируемы.-; типов транспорта К+ доказывает

Отток Rt. % aarpyjKM/4 мии 1

l_J 310 мОсы

ffij ieo ко-'м fH , Л

ш ^ $ И # п -

ПП ;i N и п N

j J___ÜJil.IsÜJS!-

3 1 1 2 И 4

lolfl

Рис. о. Влияние устранения внешнего Са*+ в присутствии 0,5 м.М ЕСТА (IV, 5 мкМ ни-кардииина (?) иЮмкМ ингибитора каль-модулина К24571 (4) на величину выходящих потоков ) по сравнению с контролем (1) в культуре клеток глиомы СЁ в изотонических и гипотонических усло-ечях. Приведены средние значения трех-пя-ти экспсримягтое 4 Б;. * - Отличил от контроля достоверны, р < 0,01.

Накопл-мв Ь". име.-ц/(мг.мнн)

i.e К*. Mrf'j »/(нГ'Чан)

310 UVCU ШЙ 180 моем

fir

¡Iii

si

И fii .....

Шъ

m yntiS

I NN Hi ЫШ

A

[ ~'i ЭЮ мисы Ej 140 uOc w

ft

Г'

1

p

HiH

M ffi p! • И pi

в

1'ис, 7. Влияние устранении внешнего Са** в г.рнсутствни 0,5 мМ ЕСТА(2); 5 мкМ кнкар-дитша (3) и 10 мкМ ингибитора кальмодулина 1124571(4) на актнсность ьатриево.о насоса (А) и 2С1"-котранспог,та (В) по сравнению с контролем (!) в культуре клеток глиомы С6 в изотонических и гипотонических условиях. * - р <0,(4.__

тог факт, что ингибитор кальмодулина R2-!571 полностью блокирует гипотоническую активацию калиевых каналов и котранспорта и усиливает стимуляцию натриевого насоса при набухании клеток (рис. 6, 7).

Кальмоцулин непосредственно входит в состьв кальций-чувствительных калиевых каналов (Орлов, 1987), доказано его участие в регуляции активности сиипорта натрия, калия и хлора (Owen & Villereal, 19S5; Smith & Smith. 1987). Однако наши данные показывают, чго активация кглисвых каналов к Na+.K+,2CI"-

котраиспорта опосредована не прямо этим белком, а кальций/кальмодулин-зависимым фосфорилированием. Как видно из рис. 8 п 9, ингибиторы протсин-

Отток ^ И Ь % лагруэки/4 мин

30

20'г

10

310 мОсм 100 мОсм

гг;

ГП !

гЬ

№ Й

Й Й* Щ [I

¡.3 ^ Н

И >!?

щ I

к й

Г! '

3 4

.¡У м ^ к N

ш!

12 3 4

Рис. ?. Влияние ингибиторов протеннфос-фатаз 5 мМфторнда (2), ¡00 мкМ ваналата (3) и 0,5 мкМ окадоевой кислоты (4) на выходящие потоки К+ в культуре клеток глиомы Сб но ерззпенига с контролем (1) в изотонических и гипотонических условиях Приведены средние значения трех-пкгн экспериментов ± * -отличия от контроля достоверны, р < 0,01.

Ипкоплени»* К , пмо.'гь/'(иг.мШ1

10

81-

I

..1

СИ] зю мОсм Ш 180 мОсм

!гь

Т

Рис. 9. Влияние ингибиторов протеннфос-фатаз 5 м , ¡фторида (2), 100 мк.М ваналата (3) и 0,5 мкМ окадосвоЛ кислоты (4) на \а"' ,К+.2С1"-котранспорт в культуре клеток глиомы С6 по сравнению с контролем (!) в изотопических и гипотонических условиях. Приведены средние значения трех-пяти экспериментов ± * - отличия от контроля достоверны, р < 0,01.

3 4

12 3 4

фосфатаз ванадат, фторид и бо;.^е специфичная окадоевая кислота иммитируют де1<1..гвне набухания - активируют ка !евые каналы и котранспорт в изотонмчес-. ких условиях. Напротив, ингибиторы протеин кнназы С полимиксин В и стауро-спорин полностью подавлякг гипотоническую активацию К+,2С1"-котранс порта и несколько еннжают степень активации калиевых каналов, что указывает на вовлеченность этого фермента в объемную регуляцию (рис. 10, II). Неполное

ингибирован.» акт ивации калиевых каналов стауроспорином и высокая чувствительность этого процесса к антагонистам кальмодулнна позволяет предположить также участие в объемной регуляции кальций/кальмодулин- зависимой киназы II,

ОгтокввйЬ* % явгруокн/4 иин

щи 310 мОсм 100 мОсы

201

15

10

п

Ü

I

щ il

т

S 1

Щ И

щ Щ

ш

[iJ ¡vi

и Ш

г 3

Рис, 10. Влияние ингибиторов протеинки-назы С 10 мкМ полимиксина В (2) и 1 мкМ стауроспорнна (3) на величину выходящих потоков К+ в культуре клеток глиомы Сб по сравнению с контролем (1) в изотонических и гипотонических условиях. Приведены средние значения трех экспериментов ±

Накопление К * ныоль/(иг.ынн)

I 1 310 И Оси Ш 180 мОсм

Рис. 11. Влияние ингибиторов протеинки-назы С 10 мкМ полимиксина В (2) и 1 мкЛ: стауроспорина (3) на Г*'а+,К+,2С1--котранспорт в культуре клеток глиомы С6 по сравнению с контролем (I) р изотонических и гипотонических условиях. „ Приведены средние значения трех экспериментов ± * - отличия от контроля достоверны, р < 0,01.

существование которой в глиальны.х клетках показано ранее (Bronstein et al., 1988). Аналогичный вывод был сделан в работе Норенберга с сотр., посвященной объемной регуляции в астроцитах (Bender et al., 1992).

Приведенные в этой работе данные можно с; мировать следующей схемой. Гипотоническое набухание клеток нервгой ткани с участием неизвестного пока осмотического сенсора увеличивает поступление в цитоплазму ионов кальция

4

3

через объем-чувствительные каналы плазматической мембраны и из эндоплазма-тнчсского ретикулума. Рост цитоплазматической концентрации кальция стимулирует поцессы кальмодулии-зависнмого фосфорнлирования мембранах белков, что ведет к активации катионных каналов и направленного внутрь Ха+,К'|*,2С1*-котранспорта. Активация 1 1триевого насоса также зависит ог кальция, но не связана с фосфорнлированнем. Наин: предварительные данные по влиянию цитоскет летных ядов на осмотическую регуляцию специфического связывания 3Н-уабаина , позволяют предположи ь, что -тот процесс опосредован реорганизацией актнно-пого цитоскеле та в гипотонических условиях. Близость данных, пол ученных на синаптосомах, нейробластоме N18 ТС2, первичных астроцнтах и глиоме С6, позволяет предпо. жить, что ион-транспортные механизмы нормализации клеточного объема и пути трансдукции осмотического сигнала близки в неирональных н глиальных клетках ЦНС.

ВЫВОДЫ

1. Изучены входящие и выходящие потоки К+ в синаптосомах мозга крысы, культурах клеток нейробластомы N18702, глиомы С6 и перв"чных астроцнтах мозга крысы. Оценены вклады ..атрневого насоса, ^+,К+,2С1"-котран':порта и

. кальцпп-чувствительиых калиевых каналов в трансмембранный перенос этого катиона в изо тонической среде.

2. Во всех щученных типах клеток в гипотонических условиях обнаружена активация выходящих потоков К+ через кальций-чувствительные калиевые каналы и, предположительно, через механочувствительные катионные каналы.

3. Гипотоническое набухание приводит к стимуляции входящих потоков К+, опосредованных натриевым насосом и К'а+,К+,2С1' -котранспортом.

4. Рост внутриклеточного Ка+ и внеклеточного К.+ не вносит вклад.в гипотоническую стимуляцию натриевого насоса и ¡\'а+,К+,2С1"-котранспорта.

В синаптосомах мозга и культуре клеток глиомы С6 обнаружена активация входящих потоков С а через чувствительные к набуханию кальциевые каналы. В синаптосомах показаны кинетические и фармакологические отличия найденного типа каналов от потенциал-зависимых кальциевых.

6. Кальмодулин вовлече- в обьемную регуляцию калиевых каналов, Ыа+.К+,2С1'-котранспорта и натриевого насоса в синаптосомах, нейробластоме N18 ГС2 и глиоме Сб.

7. Пнгибирование протеинфосфатаз активирует калиевые каналы и №+,1С+,2С1'-котранспорт в изотонических условиях и снижает степень и».

активации прл набухании. Это указывает на участие фосфорилирования белков в гипотонической активации каналов п котранспорта.

8. Специфические ингибиторы протелнкиназы С полностью подавляют гипотоническую стимуляцию Ха+,К+,2С1*-котранспорта и уменьшают стимуляцию калиевых каналов, что свидетельствует о вовлечении протеинкиназы С в объемную регуляцию транспорта К+ в клетках нервной ткани.

СП1ICOK РАБОТ, ОПУБЛ1 IKC^AI 1НЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лыскова Т.Н., Монгин A.A., Аксенцев С.Л., Окунь U.M., Конев С.В. Сопряжение Ха.К-АТФазы с натриевыми каналами в синаптических мембранах головного мозга крыс//Цитология.- 1991.Т. 33, № 11.-С. 61-66.

2. Монгин A.A., Аксснцев С Л., Окунь И.М., Ракович A.A., Конев С.В., Орлов С.Н Осмотическая регуляция натриевого насоса в синаптосомах головного мозга крыс // Биофизигх - 1992. - Т. 37, Хя 5. - С. 950-956.

3. Монгин A.A., Аксенцев С.Л., Ракович A.A., Конев С.В., Орлов С.Н. Осмотическая регуляция фуроссмид-чувствительного транспорта К* (S6Rb+) в синаптосомах головного мозга крыс // Биофизика. - 1992. - Т. 37, № 6. - С. 1016-101S.

4. Aksentsev S.L., Mongin A.A., Orlov S.N., Slepko N.G.. Konev S.V. The effect of calmodulin antagonist R24571 on bwelling-induced K+ efflux and influx in C6 glioma cells // First European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease: Abstracts. - Heidelberg. Germany, March 24-27, 1994, P. 49.

5. Mongin A.A., Aksentsev 4.L., Slepko Orlov S.N., Konev S.V. Swelling-induccd changes in transmembrane potassium fluxes in C6 glioma cells II First European Meeting on G.ial Cell Function in Health and Disease: Abstracts. Heidelberg, Germany. March 24-27, 1994. P. 134.

6. Mongin A.A., Aksentsev S.L., Slepko N.G., Kozlova M.V. Swelling-induced potassium uptake in cultured primary rat astrocytes // First European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease: Abstracts. - Heidelberg, Germany, March 24-27, 1994. P. 135._;_____

7. Aksentsev A .A., Mongin A.A., Orlov S.N. Rakovich A.A., Kaler G.V., Konev S.V. Osmotic regulation of sodium pump in rat brain synapto»omes: the role of cytoplasmic sodium // Brain Res. - 1994. - Vol. 644. P. 1 -6.

8. Монгин A.A., Аксенцев C.B., Слепко Н.Г., Конев С.В. Влияние фторида и ванадата на транспорт К+ в культуре клеток глиомы С6 // ДАН Беларуси. - 1994. -Т. 38, Ss 5.С. 68-71.

9. Mongin A.A., Aksentsev S.L.. Orlov S.N., SIepko N.G., Kozlova M.V., Mavmov G.V., Konev S.V. Swelling-induced uptake in cultured primary astrocytes // Brain Res. - 1994. - Vol. 655. P. 110-114.

10. Mongin A.A., Aksentsev S.L., SIepko N.G., Orlov S.N. Protein kinase С Is involved in swelling-induced stimulation of Na+,K+,2C1" «»transport in C6 glioma cells // XVI Internationa! Congress of Biochemistry and Molecular Biology: Abstracts. -New Delhi, September 19-22, 1994. A6145.

П. Монгин А.А., Аксениев СЛ. Роль кальцнй/кальмодулин-завпеимых процессов в объемной регуляции ионного транспорта в клетках нервной ткани//1 Съезд Белорусского общества фотобиологев и биофизиков: Тез. докл. - Минск. 1994. С. 74.

12. Mongin А.А., Nikolskaya V.P. Swelling-activated Ca2+ channels in pinched-off pminaptic nerve terminals (Abstract* II Нейрохимия. - 1995. -Т. 10, № 2. (В печати).

13. Аксенцев СЛ., Монгнн А.А., Орлов С.Н., Слеп ко Н.Г., Козлова М.В., Максимов Г.В., Конев С.В. Индуцированные набуханием изменения входящих и выходящих потоков К+ в культуре клеток глиомы С6 II Биол. мембраны. - 1995. -Т. 12, №4. (В печати).

РЕЗЮМЕ

Монгин Александр Анатольевич

Осмотическая регуляции трансмембранного транспорта К+ а клетках центральной нервной системы

Ключевые с.чо.ш: центральная нервная система, синаптосомы, астроцит, глиома, нейрооластома, объемная регуляция, калиевые каналы, кальциевые каналы, натриевый насос, Ми+Х+,2С1"-котранспорт, цитоплазматнческип кальций, каль-модулин, проггинкинаэа С, ¿альций/хальмодулнн-зависимая протеинкииаза И, прогеинфосфатаза.

Ыа примере четырех клеточных моделей (синаптосомь: мозга крысы, культуры клеюк нейробластомы N18 TG2, глиомы С6 и первичных астроцитов мозга крысы) изотопными и флуоресцентными методами изучены мембранные и внутриклеточные механизмы осмотической регуляции трансмембраниого транспорта К+ в клетках центральной нервной системы (ЦНС). Установлено, что гипотоническое набуханче клеток ЦНС приводит к активации выходящих (опосредованных стимуляцией кальций-чувствительных калиевых и, предположительно, неселективных катиоьных каналов) и входящих (формируемых натриевым насосом и Ыа+.К+,2С1"-котранСпоргом) потоков К*. Негго-поток катиона направлен

из клетки и определяет регуляториое уменьшение обгема. Обнаружена зависимость осмотической регуляции тестируемых систем ионного транспорта от концентрации свободного цитоплазматического кальция. Гипотоническое набухание сопровождается активацией объем-чувствительных кальциевых каналов, которые в синаптосомах мозга и клетках глиомы С6 по своим кинетическим и фармакологическим сьойстам отличаются от пстеншпл-чувстзитсльных кальциевых. 3 осмотическую регуляцию калиевых каналов, ннгриевого насоса и Ка+,К+,2С1"-кстранспорта вовлечен кальмэдулин. Функциональная активность калиевых каналов и алекгронейтралъього симпорти Ка+, К+ и С(" находится под контролем ферментативной пары протеи нкнназа С / протеин-фосфатгеа. Гипотоническая стимуляция этих систем опосредована активацией процессов кальций/ кальмодулин-зазиснмого фосфорилирования оелюв.

Результаты работы могут быть использованы для выяснения патофизиологических механизмов китотокспчеслих отеков головного мозга, в основе которых лежит неконтролируемое увеличение клеточного объема, и для разработки стратегии поиска лекарственных средств против отеков мозга.

РЭЗЮМЭ

Монпн Аляксаидр Анатольевич

Асматычная рэгуляцыя транешембраннагд трянспарту К+ у клетках цзнгральнай нярвовай астэмы

Ключаиыя славы: цэнтральная лярьовая астэма, сЫаптасомы, астрацыт, глюма, нейрабластома, аб'ёмная рэгуляцыя. калквыя каналы, кальцыевыя каналы, натриевая помпа, Ка+,К+,2С1"-катранснарт, цытаплазматычны кальцый, кальмадушн, прат"||нкчназа С, кальцый/кальмадулш-залежная лратэшкшаза П, пратэшфасфа-таза.

На прыкладзе чатырох клетачных мадэлей (сшаптасомы мезга пацука. культуры клетак нечрабластомы N18 ТС2. глгёмы С6 и першьсных астрацытау мозга пацука) ¡затопным! 1 флуарэсцэнтным1 мстадам1 вывучаны мембранный 1 унутрыклетачныя мехашзмы асматычнай рэгуллцьи трансмембраннага траис-парту К+ у клетках цэнтрадьнай нярвовай астзмы (ЦНС). Вьпначана. ипо гта-ташчнае набухание клетак ЦНС прыводэшьда актывацьп выходзячых (апаерэда-ваных сгымуляцыяи кальцый-адчувальных кал)евых и, магчыма. неселектыуных катыённых каналау) 1 уваходзячых (яктя флрм1руюць натрыевая пемпа 1 Ха^.К.4", 2С1'-катранспарт) патокау К+. Нета-пагок катыёна наыраваны з клеш 1 вызкачае регуляторнае памяньиюнне аб'ёму. Вылучана залежиасиь асматычнай рэг)ляцьи

даследивамых астэм юнната транспарту ад канцэнтрацьн свабоднага цытагшаэ-матычнага кальцыю. Гшатам1чнае набуханне суправаджаецца актывацыян аб'е'м-адчувальных кальциевых каналау, яюя у сшаптасомах мозга 1 клетках пнёмы С6 па кшэтмчным и фарчакалапчным якасцям адрозмшаюццэ ад патзицыял-адчу-вальных' кальциевых. У асматычнай рэгуляцы! кал1евых каналау, натрыенай помпы и Ыа+,К.+,2С1"-катранспаг>ту удзешпчае кальмадулш. Функцыяналытя актыунасць кал1евых каналау I электранейтралыша сымпорту N3*, К.+ I С1" знаходзщца пад контролем ферментатыунай пары пратежклназа С / пратешфас-фатаза. Ппататчная стымуляцыя гэтых с!стзм звязана з актывацыян працэсау кальцьы/ кальмадулш-залежнага фасфарылявання бялкоу.

Вышк1 гэтаг работы могуць быць выкарыстаны дзеля высвятлення пата-фЫялапчных мехашзмау цытатикЫчных ац'екау галаунога мозгу, у асноьо яюх знаходзщца некантралюемае павялшэннс клетачнага аб'ёму, I дзеля распрацоук! стратэгп пошукау лекавых сродкау супраць аце'кау мозгу.

SUMMARY •

A.A. Moftgin

Osmotic regulation of transmembrane K+ transport in ce.'fs of central nervous system Key wonts' central nervous system, synaptosomes, astrocyte, glioma, neuroblastoma, volume regulation, potassium channels, calcium channels, sodium pump, Na+,K+,2C1* cotransport, cytoplasmic calcium, calmodulin, protein kinase C, calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, protein phosphatase.

Using isotopic and fluorescent methods the studies have been performed on membrane and intracellular mechanisms of osmotic regulation of transmembrane K+ transport in four types of cells modeling those of the centra! nervous system (rat brain synaptosomes, cellular cultures of neuroblastoma N18 TG2, glioma C6 and primary rat brain astrocytes). It is established that hypotonic swelling of nervous cells results in activation of outward-directed (mediated by Ca^+-sensitive potassium channels and, iiypothetically, by nonselective cation channels) and inward-directed (formed by sodium pump and Na+,K+ 2CI' cotransport) K+ fluxes. The net flux of cation is externally directed and responsible for reg latory volume decrease. The dependence of osmotic regulation of ion transport systems on free cytoplasmic calcium has been shown. Hypotonic swelling leads to aviivation of the volume-sensitive Ca2+ channels which by their kinetic and pharmacological properties In brain synaptosomes and C6 glioma cells are differed from tfce voltage-dependent calcium channels. The calmoduli is demonstrated to be involved in osmotic regulation of lv+ channels, sodium pump

and Na+,K.+,2CI" cotransport. Functional activity of potassium channels and

ekctroncAtral symport of Na+, K+ and CI" is under control of an enzyme pair protein kinase C / protein phosphatase. Hypotonic stimulation of these systems is mediated by calcium/calmodulin-dependent phosphorylation.

The results can be used for elucidation of pathophysiological mechanisms of cytotoxic brain edema underlined by noncontrollesl increase in cell volume and for developing the strategy of search for drugs against the brain edema.

/

Jca.im. 1,25 T11 pax 100

noximcauo B neioii 12.04.95. Eywara Tnnarp&$cKaji S 2

3aît.}î 37

SopuaT 60x64.1/16. CeiaTi o$c«Tcas JVGT. I13A.JI. 1,16 54CO&&7BO

OTnevaTSKQ oa poTanpmrre E0B AH PE. 22Q6QI. Lùeck

yjj. CypreHOBa, 15,