Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Объем клетки и влияние трансмембранного потока воды на ионные токи мембраны нейронов виноградной улитки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Объем клетки и влияние трансмембранного потока воды на ионные токи мембраны нейронов виноградной улитки"

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи Айрапетян Володя ЕрЕавдович

ОБЪЕМ КЖГКИ И ВЛИЯНИЕ ТРАНСМЕМБРАННОГО ПОТОКА ВОДЫ НА ИОННЫЕ ТОКИ МЕМБРАНЫ НЕЙРОНОВ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой отепени кандидата биологических наук

I

Ереван - 1992

Работа выполнена в Отделе Биофизики АН Армении.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник М.А.Сулейыанян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник С.А.Баджинян

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник А.Л.Оимонян

Ведущая организация: Институт криобиологии

АН Республики Украина

Защита диссертации состоится " ¿¿¿л^реЛ а 1992 г. в /¿г часов на заседании специализированного совета К.005.01.08 по присуядению ученой степени кандидата биологических наук при биологическом факультете Ереванского государ ственного университета по адресу: 375049, г.Ереван, Мравяна,:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЕГУ.

Автореферат разослан ¿> 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

\ Л.ГоАнанял

ОБЩЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время накопилось очень много работ по проблеме изучения регуляции объема клетки, однако эта проблема не получила своего адекватного разрешения, а данные не допускают однозначной интерпретации. Так как регуляция объема клетки сопровождается потоком воды через мембрану, то естественно предполагать, что этот поток воды будет сказываться на свойствах потенодал-зависимых ионных каналов мембраны.

Большой интерес представляет исследование действия потока воды на проводимость мембраны, особенно тех мембран, зольт-ампер-ная характеристика которых имеет участок "отрицательного" сопротивления.

Цель и задачи исследования. Вышесказанное выдвигает как одну из важных задач современной биофизики клетки раскрытия механизмов регуляции объема клетки в изотонических и анизотонических средах и действие трансмембранного потока воды на мембранные характеристики.

Исследование вышеуказанных проблем в свете их актуальности явилось целью настоящей работы.

В связи с этим перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать изменение объема нейронов виноградной улитки Helix pomatia и культивированных клеток феохромопитомы PC-I2 при изменении тоничности окружающей клетки среды и в условиях активации и инактивации электрогенного натриевого насоса.

2. Исследовать зависимость натриевых токов нейронов улитки от уровня фиксации мембранного потенциала и величины тестирующего импульса в присутствии и отсутствие выходящего потока воды через мембрану.

3. Изучение влияния выходящего и входящего потока воды через мембрану на амплитуду и кинетику выходящего калиевого тока.

4. Изучение влияния изменения объема нейрона и потока воды на сопротивление мембраны вспышкообразно активных нейронов.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые на нейронах улитки Helix pomatia и культивированных клетках PC-I2 выявлено частичное восстановление исходного объема после гиперосмотического шока, т.е. доказано существование механизма pei"y~ ляторного увеличения объема (РУвО) в этих клетках.

Наличие этого механизма не зависит от активности электрогенного натриевого насоса.

Апетилхолин при концентрации Ю-4 M не вызывает какое-либо существенное изменение объема у основной массы клеток (8085%), тогда как у части клеток (15-20$) такая же концентрация АХ вызывает уменьшение объема. Показано, что повышение осмотического давления среды в два раза приводит к полному необратимому подавлению отрицательного сопротивления (ОС) мембраны, тогда как поток воды как выходящего направления существенно не влияет на величину ОС мембраны.

Установлено, что выходящий поток воды приводит к уменьшению амплитуды входящих натриевых токсе, замедлению кинетики m активации и инактивации и перемещению максимумов кривых токов по оси времени. Такой же поток воды увеличивает пиковое и уста новившееся значение выходящего тока и ускоряет кинетику его aî тивации.

Научно-практическая ценность работы. Проведенные исследования позволили установить наличие механизма РУеО е нейронах виноградной улитки и в культивированных клетках PC-I2, а также выявить важную роль потока воды в модуляции ионных токов черег 'электровозбудимые ионные каналы. Б частности, они дают возможность качественно оценить роль потока воды в формировании и зг вершении потенциала действия (ПД) мембраны: во время восходящ« фазы ПД входящий поток воды через мембрану увеличивает амплит] ду натриевого тока и ускоряет кинетику его развития и, наоборс уменьшает амплитуду калиевого тока и задерживает его кинетику. Этим поток воды через мембрану способствует лавинообразному рг витию процесса возникновения ДЦ. Полученные данные позволяют глубже понять молекулярные механизмы, лежащие в основе функцш нирования ионных каналов, мембран и клетки в целом.

Апробация работы. Материалы диссертации неоднократно пре; ставлялясь и обсуждались на международных и всесоюзных симпоз) умах: Ш симпозиуме СССР-ФРГ "Возбудимые мембраны" (Киев, 1987! заседании нейрофизиологов Института психиатрии им. Макс-Планк; (Мюнхен, 1988), Международном симпозиуме "Транспорт иоков и м< ханизмы его регуляции" (Тбилиси, 1989), Всесоюзном совещании "Ионный транспорт и регуляция функций клетки" (Ленинград, 1991

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 110 ст; машинописного текста. Иллюстрированный материал представлен в

2 таблицах и 25 рисунках.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и литературного указателя, содержащего 17 отечественных и 168 иностранных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились на нейронах центральной нервной системы (ЦНС) наземной улитки Helix pomatia и на культивированных клетках феохромоцитомы крыс линии PC-I2. В зависимости от задачи готовили два типа препарата: нейрон в составе изолированного ганглия и полностью изолированный нейрон.

Клетки PC-I2 были выращены в чашке Петри в специальной среде при 37°С.

Используемый комплекс методических подходов включил в себя:

1. Регистрация изменения объема.

Исследования велись под микроскопом фирмы Nikon (Япония) . типа Optiphot-Pol и фирмы Zeiss (Германия) типа Axiovert-35 Одновременно с визуальным наблюдением велась видеорегистрация при помощи видеокамер фирмы nec, типа TI-23, TI-23P, в комплексе с высокоскоростным процессором изображения (image procès--. sor) типа PIP-4000. Весь, ход эксперимента записывался на видеомагнитофоне, а фотоснимки снимались с экрана телевизора.-Нейроны Helix pomatia и культивированные клетки PC-I2 помещались под тонкой стеклянной пленкой для наблюдений под микроскопом.

2. Внутриклеточное отведение электрической активности гигантских нейронов и фиксация напряжения на мембране целостного и диализированного нейронов.

Для внутриклеточного отведения электрической активности и • фиксации напряжения на мембране использовались стеклянные микропипетки из стекла "пирекс", заполненные 2,5 M KCl. Микропипетки вытягивались из предварительно приготовленных трубок-заготовок диаметром 1-2 мМ со впаянным внутри капилляром. Форма и толщина микропипеток контролировались микроскопом под водной иммерсией. Наружный диаметр кончика микроэлектрода составлял около 0,5 мкМ и меньше. Микропипетки вытягивались и заполнялись с помощью шприца непосредственно перед опытом. Для наших исследований отбира-

лись микроэлектроды имеющие сопротивление 5-10 Мом и собственный, потенциал кончика менее 5 мВ. Погружение микроэлектрода в сому нейрона производилась под контролем микроскопа с помощью микроманипулятора KM-I. Для электрофизиологических исследований гигантских нейронов нами была собрана установка, позволяющая регистрировать мембранный потенциал, импульсную активность нейрона, поляризовать мембрану, измерять ее сопротивление, контролировать температуру омывающего ганглии раствора и фиксировать мембранный потенциал на любом исследуемом уровне.

В настоящее время наиболее детальный анализ происходящих в клетке процессов осуществляется с применением метода фиксации напряжения. В основе этой методики лежит автоматическое поддержание мембранного потенциала на исследуемом уровне с помощью электронных усилителей со следящей обратной связью.

Для исследования электрических пропессов на мембране пер-фузирозаннкх нейронов использовался метод, разработанный Костю-ком и соавт. Kostyuk et all., 1975). Б контуре внутренней перфузии использовалась полиэтиленовая микропипетка с порой на кончике (Крышталь, Пидопличко, 1977; Kostyuk and Krishtal, 1984; Kostyuk, 1982).Основной принцип метода заключается в следующем: изолированная клетка помещается в пору, меньшую по диаметру, чем диаметр клетки, проделанную в полиэтиленовой микропипетке, образующий контур внутренней перфузии. Клетка подсасывается к поре за счет гидростатического давления между внутренним и наружным растворами. Затем часть клеточной мембраны, затянутая в пору, разрушалась скачком гидростатического давления или электрическим пробоем этого участка мембраны. Разорванные края мембраны слипались со стенками поры, что предотвращало утечку тока между стенками. Через отверстие в мембране можно было достаточно быстро заменять среду внутри клетки. При регистрация токов, симметричный емкостный ток и линейные токи утечки вычитались путем сложения ответов на деполяризующие и гиперполяризующие смещения потенциала одинаковой амплитуды и • длительности на анализаторе сигналов Ф-37. Кривые токов выводились на графостроитель.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Регуляция объема клеток в анизотонической среде

В экспериментах на нейронах центральной нервной системы

виноградной улитки не наблюдались объем восстанавливающие механизмы ни после набухания нейрона в гипотонической среде, ни после сморщивания в гипертонической среде.

В настоящей работе было исследовано изменение объема нейронов виноградной улитки Helix pomatia и культивированных меток феохромоцитомы крыс линии PC-I2 в различных условиях и объем регулирующие механизмы по более совершенной и чувствительной методике.

В экспериментах, выполненных на нейронах Helix pomatia (Ayrapetyan and Suleymanian, 1979) изменение объема клетки В растворах с различными осмотическими давлениями, нэ сопровождалось последующим восстановлением их исходного объема. Исходя из этих данных было предположено, что эти восстанавливающие механизмы в нейронах улитки либо отсутствуют, либо так медленно функционируют, что мы не замечаем либо они так незначительны, что мы не улавливаем. Исследование изменения объема по более совершенной методике показали, что в нейронах улитки существует механизм регуляторного увеличения объема нейрона, отчасти восстанавливающего объем нейрона после первоначального уменьшения в гипертонических растворах.

На рис.1 показаны результаты одного из таких экспериментов. В исходном состоянии (рис.1а) нейрон находился вJ бескалиевом растворе в набухшем состоянии. Его перенос в нормальный раствор Рингера вызывало уменьшение объема нейрона на 21% (рис.16) обусловленное как было сказано выше, активацией электрогенного натриевого насоса. При добавлении 265 мМ сахарозы, что соответствует увеличению осмотического давления среды в 2 раза, объем нейрона уменьшается и через 1,5 мин достиг 57% значения своей исходной величины в нормальном растворе Рингера (рис,1в). Затем несмотря на то, что нейрон продолжал находиться в том же гипертоническом растворе, изменение его объема изменяло свое направление и нейрон начал набухать. Через 5 мин объем нейрона достиг 12% значения своей исходной величины в нормальном растворе Рингера (рис.1г). Это свидетельствует о существований механизмов регуляторного увеличения объема нейрона.

Механизм регуляторного увеличения объема в гипертонических растворах наблюдался также в клетках PG-I2 (рис.2).

Как видно из рисунка, перенос клетки из нормального раствора (а) в раствор с повышенным осмотическим давлением (б) вызывал

Рис.1. Наличие механизма регуляторного увеличения объема нейрона в гипертоническом растворе, а. - фотоснимок нейрона через 30 мин пребывания в бескалиевом растворе; б. - "через 10 мин после переноса в нормальный калий-со-держащий раствор; в. через 1,5 мин после добавления 165 мМ сахарозы; г. - через 5 мин после добавления сахарозы.

уменьшение объема клетки, который через 1,5 мин достиг 65$ значения своей исходной величины. Дальнейшее пребывание'клетки в том же растворе вызывал частичное восстановление исходного•объема. Через 5 мин пребывания клетки в гипертоническом растворе ее объем увеличился и достиг 80$ значения своей исходной величины в нормальном растворе (рис.2в). Перенос клетки в нормальный раствор Рингера полностью восстанавливал ее исходный объем; который даже в некоторых случаях был больше, чем в исходном состоянии (рис.2г).

Серия экспериментов была проведена для исследования действия ингибиторов электрогенного натриевого насоса на объем-ре-гулирующие механизмы клеток при различных осмотических давлени-

10мк,

Рис.2. Наличие механизма регуляторного увеличения объема культивированной клетки феохромоцитомы крыс линии PC-I2 в гипертоническом растворе, а. - фотоснимок клетки в нормальном растворе Рингера; б. - через 1,5 мин после добавления 265 мМ сахарозы; в. - через: 5 мин после добавления сахарозы; г. - через 10 мин пребывания в нормальном растворе Рингера.

ях среды. Было показано, что уменьшение объема клеток в гипертонических растворах не зависит от присутствия уабаина. На рис.3 показаны фотоснимки одного из таких экспериментов. Как видно из рисунка, уменьшение объема клетки в гипертоническом растворе без уабаина (рис.36) и с Ю-4 М уабаином (рис.Зг) одно и то же. Так как уабаин при такой концентрации увеличивает объем.клетки (Ayrapetyan and Suleimanian, 1979), а гипертонический раствор, наоборот, уменьшает объем, то независимость эффекта гипертонического раствора на объем клетки от присутствия уабаина говорит о том, что изменение осмотичности в таких пределах является наиболее сильным фактором действующим на объем клетки, чем фактор

уабаина подавляющим метаболизм. Это говорит о том, что эффект уабаина на объем клетки можно снять увеличением осмотического давления среды.

Рис.3. Независимость изменения объема нейрона в гипертоническом растворе от уабаина (I0~^ М). а. - фотоснимок нейрона в нормальном растворе Рингера; б. - в нормальном растворе Рингера без уабаина через 10 мин после добавления 265 мМ' сахарозы; в. - восстановление объема в нормальном растворе Рингера; г. - в нормальном растворе Рингера, содержащем 10"^ М уабаина через 10 мин после добавления 265 мМ сахарозы; д. - через 10 мин после пребывания в нормальном растворе Рингера.

Этот результат подтверждает высказанное Айрапетяном и со-авт.(Ayrapetyan et all., 1984) предположение о том, что изменение объема может играть роль защитной функции клетки.

Уменьшение объема клетки сопровождается также определенными структурными изменениями как самой мембраны, так и всей клетки, влияющие на ее физические характеристики (например, оптической плотности). При этом четко наблюдается гетерогенность мем-

браны. Такие изменения отчетливо видны на рис.4, где показано влияние Ю-4 М ацетилхолина (Ach) и 260 мМ сахарозы на объем клетки. Как видно из рисунка, апетилхолин не вызывал сколько-нибудь значительных изменений величины объема клетки и ее структуры (рис.46). Однако добавление 260 мМ сахарозы в раствор, вызывало уменьшение объема клетки через 1,5 мин на 57$ исходной величины (рис.4г), которое затем сменилось частичным (на 10$)

а 5 В

Рис.4. Структурные изменения нейрона при изменении его объема.

а. - фотоснимок нейрона в нормальном растворе Рингера;

б. - через 10 мин после добавления Ю-4 М ацетилхолина;

в. - через 15 мин после пребывания в нормальном растворе Рингера; г. - через 1,5 мин после добавления сахарозы; е. - через 10 мин пребывания в нормальном растворе Рингера.

восстановлением исходного объема - (РУвО). Объем клетки в том же гипертоническом растворе увеличивался и достиг 68% значения исходной величины. Как видно из рис.4г, д, эти изменения объема сопровождались соответствующими изменениями структуры самой

клетки. Если в растворе Рингера есть четкое разграничение между ядром клетки и ее левой частью в виде просвета (рис.4а, б, в), то в гипертонической среде этот просвет исчезал, а затем после ее замены на нормальный изотонический раствор Рингера, снова восстанавливался. Изменение структуры в гипертонической среде и гетерогенность клеточной мембраны видны и на рисунках I, 2, 3.

2. Зависимость ионных токов нейронов улитки от уровня фиксации мембранного потенциала и величины тестирующего импульса в присутствии и отсутствие потока воды через мембрану

В ранних исследованиях ионных токов мембраны изменение объема клетки и поток воды через мембрану в расчет не принимались, и объем клетки рассматривали как постоянную величину. Однако, работами Тасаки (Tasaki and ivasa, 1982) было показано, что в период восходящей фазы потенциала действия происходит набухание аксона кальмара, а в период нисходящей фазы, наоборот, аксон сморщивается, т.е. происходит уменьшение его объема. Это свидетельствует о том, что во время потенциала действия возникает поток воды через мембрану, который попеременно меняет свое нацравление в такт с восходящей я нисходящей фазами потенциала действия. С этой точки зрения очень интересным являются исследования влияния потока воды на ионные токи мембраны. Этот вопрос тем более актуален для нейронов моллюсков, т.к. многие нейроны обладают регулярной электрической активностью. Исследованиями ряда авторов (Ayrapetyan et al., 1988; Рычков и др., 1989; Kukita and Yamagishi, 1983), было показано, что поток воды влияет на ионные токи мембраны. В тех случаях, когда направления потока воды и ионных градиентов совпадают, ионные токи увеличиваются, а когда они направлены обратно, ионные токи уменьшаются. В настоящей работе мы исследовали зависимость эффекта выходящего потока на натриевые и калиевые токи диализированно-го нейрона от уровня фиксации мембранного потенциала и величины тестирующего импульса.

На рис.5 показаны семейства кривых натриевых токов при различных значениях тестирующего импульса в контроле (а и б), в гипертоническом растворе (виг) и при фиксации мембранного

Рис.5. Семейства входящих натриевых токов мембраны в следующих условиях: а, б - в изотоническом растворе; в, г - в растворе, содержащем 130 мМ сахарозы. Потенциалы фиксации -80 мВ (а и в) и -100 мВ (б и г). Тестирующие потенциалы: а и в от -80 до -45 мВ (кривая I), далее до -30, -15, -5, +5, +15 мВ (кривые 2-6); б и г - от -100 до -65 мВ (кривая I), далее до -50, -40, -25, -15, -3 и +8 мВ (кривые 2-6); калибровка 10 нА, 10 мс.

потенциала на уровнях -80 мВ (а и в) и на -100 мВ (б и г).

Как видно из рисунков, при всех значениях тестирующего им-

пульса при наличии выходящего потока воды через мембрану происходило уменьшение амплитуды натриевого тока и замедление кинетики его активапии. Что касается максимума проводимости мембраны для ионов натрия, то его поведение при наличии выходящего потока воды через мембрану зависело от уровня фиксации мембранного потенциала, а также от индивидуальных свойств метки и было неоднозначным. Хотя в большинстве случаев максимум проводимости мембраны для ионов натрия не сдвигался вдоль оси потенциала при наличии выходящего потока через мембрану, были случаи, когда максимум проводимости мембраны для натрия при наличии выходящего потока воды через мембрану сдвигался влево вдоль оси потенциала. Этот сдвиг имел место предпочтительно при потенциалах фиксации более положительных, чем -80 мВ. А при более отрицательных, чем -80 мВ, уровнях фиксации максимум проводимости мембраны для натрия не измэнялся. Как было отмечено в работе (Ayrapetyan et al.s 1988), в уменьшений амплитуды натриевых токов и замедлении их кинетики могут участвовать несколько механизмов: изменение локальных концентраций ионов натрия у внутренних и наружных устьев натриевых каналов, непосредственно поток и изменение скорости движения ионов через канал. На спиналь-ных ганглиях крыс было показано, что выходящий поток воды оказывает влияние на воротное устройство натриевого канала (Чизмакоз и др., 1986). Возможно, это справедливо и для натриевых каналов нейронов улитки, потому что и здесь происходит замедление кинетики токов.

Была также исследована зависимость натриевых токов от уровня фиксации мембранного потенциала без потока воды. На рис.6а и б.показаны семейства кривых натриевых токов, полученные при разных уровнях фиксации мембранного потенциала и при постоянном уровне тестирующих импульсов. Натриевые токи (рис.6а) получены при поддерживаемых потенциалах, равных (в мВ): -60, -70, -30, -110, тогда как тестирующие импульсы оставались на постоянном •уровне, равном 0 мВ. Kaie видно из рис.6а, амплитуды натриевых токов почти не изменялись< но наблюдалось смещение максимумов вправо при изменении поддерживаемого потенциала от -60 до -110 мВ. При обратном изменении поддерживаемого потенциала от -110 до -60 мВ наблюдалось обратное смещение максимумов влево (рис. 66).

Предполагается, что смещение максимумов натриевых токов

Рис.6. Зависимость натриевых токов от величины поддерживаемого уровня мембранного потенциала при постоянном уровне тестирующего потенциала, равном 0 мВ.

а - при смещении от -60 до -110 мВ; б - при смещении от -110 до -60 мВ; калибровка 10 нА, 10 мс.

вправо при увеличении поддерживаемого потенциала от -60 до -110 мВ и влево при уменьшении поддерживаемого потенциала от --100 до -60 мВ обусловлено ростом задержки з первом случае и уменьшением задержки во втором. Как видно из рис.6.а и б, кинетика активации а инактивации натриевых токов почти не изменялась. Сравнительное постоянство амплитуды натриевых токов при изменении поддерживаемого потенциала в вышеуказанном диапазоне показывает, что фиксация мембранного потенциала на уровне -60 мВ уже достаточна для снятия инактивалии натриевых каналов и их перевода в активное состояние с помощью деиоляризационных стимулов достаточной величины и длительности.

3. Эффект осмотического градиента на выходящий калиевый ток в диализированных нейронах HHeiix pomatia.

Исследования в последней декаде показали, что поток воды через мембрану может влиять на химические и физические свойства мембраны, как, например, на потенциалы действия (ЦЦ), (Kukita and Yamagishi, 1983; Ayrapetyan et al., 1988a), ионные токи (Krishtal et al., 1981; Kukita and Yamagishi, 1983; Oaipchuk, 1983; Chizmakov and Sorokina, 1986; 1987; Ayrapetyan et al., 1988 a, b; .Richkov et al., 1989), сопротивление мембраны(Suleymanian and Ayrapetyan, 1990), число функционирующих На, К-АТФ-азных молекул и ионных каналоЕ (Ayrapetyan et al., 1984; Ayrapetyan and Richkov, 1985; Ayrapetyan et al., 1988 а). Исследования эффекта осмотического градиента на

кинетику натриевых токов (Krishtal et al., 1981; Oaipchuk, 1983; Chizmakov and Sorokina, 1986, 1987; Chizmakov, 1988) показали, что поток воды через мембрану действует только на воротные механизмы натриевых каналов. Хотя было показано, что выходящий поток воды не имеет никакого влияния на проводимость одиночного натриевого канала, данные, полученные нами, позволяют нагл сомневаться в точности этих подтверждений. Тем более, что нет никаких данных об эффекте потока воды на проводимость одиночного калиевого канала. Существуют несколько работ об эффекте потока воды на выходящий калиевый ток (Ayrapetyan et al., 1988; Richkov et al. , 1989; Stepanyan et al., 1989). В этих работах показано, что выходящий поток еоды увеличивает К - ток, входящий поток воды уменьшает его. Для выяснения механизма действия потока воды на вызванном осмотическим градиентом, на проводимость калиевых каналов, был проведен анализ кривых, описывающих эффект выходящего и входящего потоков водьт через мембрану на выходящий калиевый ток.

На рис.7 представлены семейства кривых выходящих калиевых токов в растворах с различными тоничностями. Кривые (I) во всех семействах получены в гипотоническом растворе, кривые (2) - в изотоническом, а кривые (3) - в гипертоническом. Во всех семействах кривых, описывающих выходящие калиевые токи, четко видно, что выходящий поток воды увеличивает пиковые и установившиеся значения выходящих калиевых токов и ускоряет кинетику их акти-

.3 ■2 •1

-3 ■2 ■1

■3 ■2 ■1

Ж

Рис.7. Семейства кривых выходящих калиевых токов в растворах различной тоничности. Поддерживаемый потенциал -60 мВ, тестирующие потенциалы от -10 до +50 мВ с шагом 10 мВ. Во всех семействах: I - выходящие калиевые токи в гипотоническом растворе, содержащем на 65 мМ Трис-НС1, чем в изотоническом растворе; 2 - калиевые токи в изотоническом растворе; 3 - калиевые токи в гипертоническом растворе, содержащем 260 мм сахарозы; калибровка 40 нА, 10 мс.

вации. Входящий поток воды имеет обратный эффект - он уменьшает пиковые и установившиеся значения К - токов и замедляет кинетику их активации. Расчеты показывают, что пиковые величины К - тока увеличиваются на 31,5+2,15$ (п=7), а полупериод активации тока £"//2 уменьшается на 26,0±5,7$ в присутствии выходящего потока воды через мембрану. Входящий поток воды уменьша-

- 18 -

ет пиковые значения К - токов на 24,5+2,8^, а полупериод их активации увеличивает на 21,8±3,1$. Средние пиковые значения токов и полупериоды взяты из 7 измерений из семейств кривых, показанных на рис.7 в гипо- и гипертонических растворах В обоих случаях соответствующие пиковые значения К-токов и полупериоды в изотонической среде взяты как 100%. Дпя количественного описания мембранной проводимости для ионов К+ было использовано уравнение Ходжкина-Хаксли , . - ¿/С , л

1Ц)--$кг>Ц{-1 у CI)

где " - максимальная К - проводимость, Г)— - доля открытых калиевых каналов при данном потенциале, когда —>о°.Ш уравнения (I) можно найти значение ¿г-—г~,--ГТ"*

= ЧЪЫ^/Ъ (2)

• Расчеты показали, что не зависит от потока воды

через мембрану. Эти данные соответствуют данным, полученным для натриевых каналов (Krishtal- et al., 1981). Таким образом, действие потока воды на выходящий К-ток может быть объяснено как результат изменения и ^п * Выбором; ^' и можно объяснить эффект потока воды на кинетику "выходящего К-тока, используя уравнение (I). Важно отметить, что при описании кинетики натриевых токов только лишь соответствующим выбором' постоянных времени активами и инактивации, можно описать экспериментальные кривые. В случае же К-токов мы должны учесть также изменения в присутствии и отсутствие потока воды. Это измене ние может быть-вызвано или изменением числа функционирующих К-ионных каналов, или изменением проводимости одиночного К-ионно-го канала, или оба одновременно. Исходя из наших данных, отделить эффект этих двух факторов невозможно.

4. Об отрицательном сопротивлении мембраны идентифицированного нейрона пачечного типа ППа1 виноградной улитки

Некоторые нейроны моллюсков, классифицируемые как пачечны< или осцилляторные, генерируют медленные колебания мембранного потенциала, которые на гребне деполяризапионной волны запускаю' пачки потенциалов действия. Впервые нейрон с пачечной характеристикой был описан Арванатаки и Халазонитис (Arvanitaki and Chalazonitis, 1955) у морского моллюска Aplisia. Позже та-

кой тип пачечной активности был обнаружен почти воtвсех типах моллюсков. У виноградной улитки пачечной активностью обладают несколько нейронов, в том числе нейроны Ша1 правого париетального ганглия центральной нервной системы, по классификации Сахарова и Шаланки(Sakharov and Salanki, 1969). В последние 1015 лет некоторые авторы, используя метод фиксации потенциала, обнаружили участок отрицательного сопротивления на вольт-амперной характеристике (ВАХ) мембраны пачечных нейронов моллюсков (David et al., 1974; Eckert and lux, 1975; Gola, 1976; Smith et el., 1975; Wachtel and Wilson, 1973Существование ОС на ВАХ мембраны является одним из главных особенностей циклического поведения пачечных нейронов. Однако, до сих пор проблема ОС мембраны еще не получила своего разрешения и остается одной из самых спорных. Главный вопрос; к которому сводится проблема, является следующий: связано ли ОС с пассивной проводимостью мембраны или оно генерируется какими-то активными источниками, прямо связанными с метаболизмом клетки?

Исходя из своих экспериментальных данных Воктел и Вилсон (Wachtel and Wilson, 1973) заключили, что в клетке существует какой-то источник гиперполяризапионного тока, который регенеративным образом активируясь гиперполяризапионными командами дает начало ОС. Фиксирующая схема, чтобы компенсировать этот источник, создает ток выходящего направления. Если бы потенциал на клетке не был бы фиксирован, то изменение мембранного потенциала в гиперполяризационном направлении заставило бы этот источник создавать дополнительный гиперполяризапионный ток, который вызывал бы дальнейшую гиперполяризапию мембраны. С другой стороны, Гола, основываясь на своих собственных данных (Gola, 1976) с использованием тетродотоксина и Со++ и литературных данных, полученных в безнатриевой и бескальпиевой средах smith et al.', 1975; Watanabe et al., 1970), наличие ОС на ВАХ

мембраны связывает с двумя свойствами мембраны: зависимой от потенциала проводимостью мембраны для nS и Са++ медленно инак-тивирующаяся при низких значениях мембранного потенциала и сильной активацией, вероятно, влияющей как на быстрый, так и на задержанный калиевые проводимости.

В настоящей работе нами исследовалось влияние различных факторов, угнетающих активность электрогенного натриевого насоса (ЭНН), на величину ОС мембраны пачечного нейрона ППа! вино-

I М)

Рис.8. Влияние различной концентрации уабаина на ОС мембраны: а - ВАХ мембраны в нормальном растворе Рянгера. б - через 5 мин после действия Ю-4 М уабаина; в, г - через 1,5 и 5 мин после действия 5 х Ю-4 М уабаина; д - через 30 мин промывания в нормальном растворе Рингера.

градной улитки. Предположение о возможной роли ЭНН в создании ОС мембраны можно было проверить с помощью агентов, блокирующих ЭНН.

На рио.8 показано влияние 10""^ М уабаина на ОС мембраны. При такой концентрации уабаин угнетал ОС мембраны на восходящей фазе всего на 50% (рис.86). Это ложно объяснить неполным ингибированием ЭНН при такой концентрации. Увеличение концентрации уабаина в этих же нейронах полностью угнетал ОС (рис.8,в и г).

Другим фактором, который также угнетает ЭНН, является наружный физиологический раствор, лишенный ионов калия (бескалиевый раствор). Теплый бескалиевый раствор (22-25°С) угнетал ОС на 50-80$ обратимым образом (рис.96).

После переноса нейрона из бескалиевого раствора в калий-содержащий раствор ОС не всегда полностью восстанавливалось (рис.Эв). Угнетение ОС в бескалиевом теплом растворе на 50-80$ также можно объяснять неполным ингибированием ЭНН. Франкенхой-зер и Ходжкин CPrankenhaeuaer and Hodgkin, 1956) показали, что для гигантского аксона кальмара ионы калия даже в бескалиевом растворе полностью не вымываются из наружного примембранного пространства и в складчатостях мембраны остаются в следовых количествах, достаточных для работы ЗНН. Именно наличием таких следовых количеств калия и объясняется неполное ингибирование ЭНН в бескалиевом растворе при комнатной температуре. Чтобы убедиться в этом, мы исследовали также влияние холодного (4°С) бескалиевого раствора на ОС. Как известно, понижение температуры раствора до 4-5°С также угнетает ЭНН. Эффект холодного бескалиевоГо раствора на ОС показан на рис.10.

Как видно из рисунка, холодный бескалиевый раствор полностью устранял ОС мембраны (рис.106). При возвращении нейрона в нормальный раствор Рингера ОС восстанавливалась неполностью. Несмотря на то, что ОС обладают в основном нейроны с пачечной активностью, однако трудно предположить, что ОС и пачечная активность имеют общий механизм, потому что наличие ОС у пачечных нейронов не зависит от режима, в котором находится нейрон с пачечной активностью. ОС присуще не только нейронам с пачечной активностью, но и нейронам, лишенным этой активности. Таким образом, факт подавления ОС уабаином в концентрациях, достаточных

ИпА1

1- -70

Рис.9. Влияние теплого (25°С) бескалиевого раствора Рингера на ОС'мембраны: а - БАХ мембраны в нормальном раствор Рингера; б - в бескалиевом теплом растворе; в - после 20 мин промывания в нормальном растворе Рингера.

Рис.10. Влияние холодного (4°С) бескаляевого раствора на ОС

мембраны: а - ВАХ мембраны в нормальном растворе Рин-гера; б - при действии холодного бескалиевого раствора; в - после 20 мин промывания в нормальном растворе Рингера.

тгобы полностью ингибировать ЭНН и бескалиевым холодным раствором Рингера, предполагает, что источником возникновения ОС на восходящей фазе ВАХ мембраны является либо непосредственно ЭНН, ибо другой механизм, теоно связанный с ЭНН. Вопрос источника рока, являющийся причиной возникновения ОС на нисходящей фазе ЗАХ, остается открытым. Таким образом, наши данные о том, что з некоторых случаях уабаин и бескалиевый холодный раствор Рин-?ера подавляют ОС на нисходящей фазе ВАХ, позволяют предположить, что ЭНН вовлечен в этот процесс. Однако можно предположить наличие другого механизма, отличного от ЭНН, т.к. не всег-1а янгибирование ЭНН приводит к подавлению ОС.

5. Действие потока воды и осмотического давления среды на электрические свойства мембраны нейрона ППа1 виноградной улитки

На рис.11 показано влияние трансмембранного потока воды т ОС мембраны. В норме (рис.НА) ОС присутствовало как на вос-содящей фазе (при снятии ВАХ мембраны линейно-возрастающим ко-гандным потенциалом), так и на нисходящей фазе (при снятии ВАХ шнейно-падающим потенциалом). Известно, что увеличение осмоти-теского давления среды относительно нормы, вызывает выходящий

Рис.11. Отсутствие влияния трансыеморанного потока воды на ОС мембраны и подавление ОС в растворе с осмотическим да: лением в 2 раза превышающем нормальное. БАХ мембраны, построенное с помощью линейно-возрастающего с -30 до. -100 мВ (стрелка вниз - восходящая фаза), а затем линейно-падающего (стрелка вверх - нисходящая фаза) командных потенциалов. Пересечение восходящей фазы БАХ с осью абсписс при положительном сопротивлении мембраны (второе пересечение при наличие ОС) соответствует потенциалам покоя. А - ВАХ мембраны в нормальном изотоническом растворе Рингера; Б - при наличии выходяще го потока воды через мембрану; В - после 15 мин инкубации нейрона в растворе с осмотическим давлением в два раза превышающим нормальное; Г - при наличии входящего потока воды через мембрану; Д - после 20 мин промывания в нормальном растворе Рингера.

поток воды через мембрану и объем нейрона начинает уменьшатьс (Ayrapetya.il ot а1., 1984; Зи1еутап1ап et а1., 1984). Этот пр песо - выход потока воды через мембрану и уменьшение объема нейрона - обычно длится 10-15 мин. Снятие ВАХ сразу после зам

ны нормального физиологического раствора Рингера раствором с осмотическим давлением, превышающим нормальное в два раза, когда имеет место выходящий трансмембранный поток воды, не выявило каких-либо существенных изменений ОС ни на восходящей, ни на нисходящей фазах (рис.23Б). После продолжения инкубации нейрона в растворе с повышенным осмотическим давлением ОС полностью исчезало на обеих фазах (рис.113). При обратной замене раствора - с высокого осмотического давления а нормальное, когда имеет место обратное, входящий трансмембранный поток воды, опять форма ВАХ и величина ОС не изменились относительно предыдущего состояния: ОС как отсутствовало в растворе с высоким осмотическим давлением, так и не появилось во время входящего потока воды (рис.ИГ). По мере промывания нейрона в нормальном растворе Рингера ОС постепенно восстанавливалось, и через 20 мин достигло своего 80$ значения (рис.ИД) в нормальном растворе Рингера.

Очень сложно объяснить подавление ОС в растворах с осмотическим давлением в 2 раза превышающем нормальное. Один из объяснений может быть следующее. Айрапетяном С.Н. и соавторами было показано, что осмотическое давление дьояким образом влияет на активность ЭНН - изменением внутриклеточной концентрации натрия и изменением количества функционирующих К-АТФазных молекул мембраны (Ayrapetyan et al., 1984). При повышении осмотического давления среды происходит увеличение внутриклеточной концентрации натрия (Suleymanian et al., 1984; Koatyuk et al., 1972; Suleymanian and Ayrapetyan, 1985), приводящие к активации ЭНН и уменьшение количества функционирующих На, К-АТФазных молекул мембраны, ингибирующее насос. По-видимому, в механизме подавления ОС решающую роль играет уровень внутриклеточной концентрации натрия. В литературе известно, что с увеличением внутриклеточной концентрация натрия активность ЭНН увеличивается, и постепенно выходит на плато, т.е. насыщается ионами натрия (suleymanian et 'al., 19S4; Kos-tyuk et al., 1972; Suleymanian and Ayrapetyan, 1989). Уменьшение количества функционирующих 11а» К-АТФазных молекул ускоряет этот процесс так, что насыщение может наступать при более низких уровнях внутриклеточной концентрации натрия, чем если бы оно не изменилось. Слздовательно, при низких уров-

- 26 -

нях внутриклеточной концентрации натрия, т.е. в нормальном состоянии нейрона, ЭНН работает в умеренном режиме и при подаче гиперполяризующей команды может активироваться и дать начало ОС. При высоких уровнях внутриклеточной концентрации натрия (в гипертонических растворах) ЭНН может насыщаться ионами натрия и работать в режиме максимальной активности так, что при подаче гиперполяризующей команды он уже не в состоянии будет дальше активироваться и дать начало развитию ОС. В пользу такого объяснения ингибироваНия ОС в гипертонических растворах говорит и тот факт, что при низких, чем в 2 раза, осмотических давлениях, ОС хотя и уменьшается, но полностью не подавляется. Таким образом, мы можем предполагать, что для выявления ОС ЭНН должен быть в состоянии активироваться гиперполяризационными или деполяризашюнными командами. Если он не з состоянии активироваться, независимо от того, находится в ингибированном состоянии или работает в режиме максимальной активности, то ОС не выявляется.

ВЫВОДЫ

1. После гиперосмотического иока у нейронов улитки Helix pomatia и культивированных клеток феохромопитомы крыс линии PC-I2 наблюдается частичное восстановление исходного объема, свидетельствующего о наличии механизма регуляторного увеличения объема (РУвО) в этих клетках. Наличие этого механизма не зависит от присутствия уабаина при концентрации Ю-4 М.

2. Выходящий поток воды приводит к уменьшению амплитуды входящих натриевых токов, замедлению кинетики их активации и инактивации и перемещению максимумов кривых токов, влево по оси времени. Это явление не зависит от уровня фиксации мембранного потенциала. Максимум проводимости мембраны для .ионов натрия в основном не сдвигается вдоль оси потенциала при наличии выходящего потока воды. Увеличение -уровня тестирующего импульса на максимуме проводимости мембраны для ионов натрия сдвигает максимумы натриевых токов направо, а уменьшение уровня тестирующего импульса сдвигает по оси времени влево.

3. Аиетилхолин при концентрации Ю-4 М не вызывает какое-либо существенное изменение объема у основной массы клеток (8085$), тогда как у части клеток (15-20$) такая же концентрация

ацетилхолина вызывает уменьшение объема.

4. Повышение осмотического давления среды в два раза приводит к полному и обратимому подавлению отрицательного сопротивления мембраны вспышкообразно активных нейронов, тогда как поток воды как входящего, так и выходящего направления не имеют какой-либо существенный эффект на величину отрицательного сопротивления мембраны.

5. Выходящий поток воды увеличивает пиковое и установившееся значение выходящего калиевого тока и ускоряет кинетику его активации. Входящий поток воды изменяет калиевую проводимость как при данном потенциале так и максимальную калиевую проводимость (£к j. Ни входящий, ни выходящий потоки воды но имеют сколько-нибудь значительного эффекта на фракцию открытых калиевых каналов при данном потенциале (Поо( UjJ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сулейманян М.А., Айрапетян В.Е., Айрапетян С.Н. Об отрицательном сопротивлении мембраны идентифицированного нейрона пачечного типа ШГа1 виноградной улитки. Биологические мембраны, т.8, JE 7. 1991, с.719-726.

2. Сулейманян М.А., Айрапетян В.Е., Айрапетян С.Н. Действие потока воды и осмотического давления среды на электрические свойства мембраны нейрона ГОГа! виноградной улитки. Биологические мембраны, т.8, № 8, 1991, с.876-881.

3. Айрапетян В.Е. Изменение объема нейронов виноградной улитки Helix pomatia .и культивированных клеток феохромоцитомы крыс линии PC-I2. Биол. журн. Армении, т.44, № 3, 1991,

с.240-243.

4. Айрапетян В.Е., Сулейманян М.А. Зависимость эффекта выходящего потока воды на натриевые токи от уровня фиксации мембранного потенциала и величины тестирующего импульса. Биол. журн. Армении, т.44, J6 4, 1991, C.32Q-323.