Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль холестерин-зависимых регуляторных механизмов в структурно-фyнкциoнaльнoй организации биологических мембран

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль холестерин-зависимых регуляторных механизмов в структурно-фyнкциoнaльнoй организации биологических мембран"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛАДІНА

РГ8 ОД

- 8 ОКТ ІЬУЬ Но правах рукопису

ВОЛКОВ Георгій Леонідович

РОЛЬ ХОЛЕСТЕРИН-ЗАЛЕЖНИХ РЕГУЛЯТОРНИХ МЕХАНІЗМІВ В СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІЙ ОРГАНІЗАЦІЇ БІОЛОГІЧНИХ МЕМБРАН

03.00.04 - Біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Київ - 1996

Дисертацією є рукопис. Робота виконана у відділі біохімії' ліпідів Інституту біохімії ім. О.В. Паладіна НДН України.

Науковий консультант - член-кор. НАН України,

член-кор. АМН України, доктор біологічних наук ГУЛА Надія Максимівна

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

ТУГАЙ Василь Андрійович

доктор біологічних наук професор ВАСИЛЬЄВ Олександр Миколайович

доктор біологічних науі ЛЕВИЦЬКИЙ Евген Леонідович

Провідна установа - Інститут біоорганічної хімії т

нафтохімії НАН України

Захист дисертації відбудеться 23 вересня 1996 р. о 14 годині н засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.84.01 в Інституті біохім ім. О.В. Паладіна НАН України за адресою: 252030, м. Киів-30, вуї Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інститут біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України.

Автореферат розісланий 19 серпня 1996 р.

Вчений секретар .

спеціалізованої вченої ради /У Кірсенко О.Е

кандидат біологічних наук

з

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Бурхливий розвиток протягом останніх с десятиріч у галузі біохімії мембран спричинився до глибшого по-шіння ролі ліпідів у забезпеченні їх функційних властивостей. Ще їдавна цим сполукам відводилася роль “будівельної цеглини” кліти-Сьогодні ж численими дослідженнями показано їхню роль у регу-ії напівпроникливості мембрани, активності мембранозв’язаних фер-гів, експресії рецепторів, транспорту органічних та неорганічних ре-ш, клітинного сигналювання тощо. На сьогодні вже запропоновано депцію про динамічний стан ліпідів у моделях молекулярної ор-зації мембрані! [Toplak,1989; Van Blitterswijk,1977;]. іагальновизнано, що виняткова чутливість клітинних мембран до і у зовнішньому середовищі пов’язана зі струїстурно-функційними іливостями ліпідного бішару. Значна кількість публікацій засвідчує зність у різних компартментах клітини специфічного набору фер-гів, під впливом яких здійснюється синтез, взаємне перетворення та >адація ліпідів [Tijburg et al., 1989]. Кожна жива клітина забезпечена со регульованою потужною ферментною системою, яка й забезпечує, ірмонії з іншими гомеостатичними реакціями, відповідний ліпідний ід біологічних мембран. Саме тому порушення фізичного стану •ини легко спричиняється до модифікації ліпідної структури мем-

і. У 1974 році Sinensky вперше показав, що мікров’язкість мембрани ьтивованої при 15 та 43°С клітини Е.соїі не змінювалась, незважаю-на перебудову ліпідного складу. Здатність клітин “вирівнювати” зов’язкість плазматичних мембран за різних температурних умов зжала назву *гомов’язкіспої адаптації". Ця концепція ефективно ;нює процеси регуляції функцій мембран через модифікацію ліпід> складу і є загальновизнаною. Згідно неї, жива клітина за фізіоло-их умов успішно компенсує раптові зрушення за допомогою меха-іів гомов’язкостної адаптації, що включають модуляцію різних ла-метаболізму ліпідів. Щоправда, попри фізіологічної перебудови

ліпідів мембран необхідно розрізняти ще й патологічну. Адже відоме що ураження клітини та її загибель супроводжуються зміною їх ліпід ного складу. Очевидно, що в таких випадках адаптаційний потенціа. клітини виснажений, а зміни у ліпідному складі вже не носять хаактер; компенсації мікров’язкості мембрани, й тому є летальними. Проте мож на сподіватися, що вивчення механізмів гомов’язкостної адаптації мож озброїти науковців якісно новим підходом до терапії патологічних ста нів, - за допомогою модифікації ліпідного складу хворої клітини.

Для пойкілотермних організмів, що зазнають як сезонних, так і ко роткочасних добових температурних коливань, структура ліпідів та ї: динаміка у плазматичній мембрані досить добре представлена у літера турі останнього десятиліття, що дозволило Hazel [1988] узагальнити ме ханізми “гомов’язкісної адаптації”, що включають: 1) перебудову мета болізму ліпідів; 2) модуляцію біосинтезу та складу ацил-СоА; 3) вибір кове використання ацильних ланцюгів та азотистих основ при синтес фосфоліпідів de novo; 4) зміну деацилюючої/реацилюючої та десату разної активності. На підставі величезного експериментального матеріа лу доведено, що зміна температури навколишнього середовища спричи няє зміну фізико-хімічного стану мембрани. Це, в свою чергу, вмика наведені механізми, які докорінно модифікують ліпідний склад мембра ни, внаслідок чого її мікров’язкість та функційний стан відновлюються.

Дані про залежність фізичного та функційного стану мембрани від ї ліпідного складу у живих гомотермних клітинах нечисленні, ще наяві: протиріччя в результатах, отриманих різними авторами, зумовлек різними об’єктами досліджень та методичними підходами. Тимчасої вплив деяких PL та Chol на функцію окремо взятих структур клітин) добре відомий. Під сучасну пору добре встановлено, що інтегральні біл ки мембран оточені спеціальним, принаймні моношаровим ліпідним ан нулюсом, який забезпечує їхню специфічну активність [Yeagle, 1989]

За декоторих патологічних станів, пов’язаних з порушенням синтез; та транспорту ліпідів, відбуваються серйозні зміни у функціюванні ба-

гатьох систем клітини. Так, гіпохолестеринемію пов’язують з дитячим захворюванням на рахіт, а знедавна накопичуються факти про зв’язок дефіциту Chol зі злоякісним ростом. Гіперхолестеринемія є провідною

ланкою у патогенезі атеросклерозу, котрий спричиняється до розвитку

, і ! І '

ішемічної хвороби серця, інфаркту міокарда та церебрального інсульту

- захворювань, які, згідно зі статистичними даними ВООЗ, є головною

. 1 ! • - .

причиною смертності. Брак деяких поліненасичених жирних кислот (PUFA) у ^цієті також є чинником, що сприяє розвитку атеросклерозу. Ясно, що без глибокого знання механізмів впливу ліпідів на функцію мембрани вирішення багатьох медичних проблем, на кшталт ефективної терапії ряду захворювань, кріоконсервації клітин, є неможливе.

Мета роботи полягала у вивченні біохімічних механізмів регуляції фізико-хімічного стану мембран клітин за умов спрямованої модифікації ліпідного складу живої клітини гомотермного організму та їх значення у перебігу декоторих мембранопов’язаних процесів.

Основні задачі дослідження :

1. Створити модель життєздатної клітини зі спрямовано зміненим ліпідним складом, встановити максимально допустимі межі для прижиттєвої модифікації ліпідного складу живої клітини.

2. Дослідити біохімічні механізми модифікуючого впливу екзогенного холестерину та фосфатидилхолину на ліпідний склад мембран модельних клітин на рівні різних ланок метаболізму основних ліпідних класів.

3. Вивчити зв’язок між зміненим ліпідним складом мембран модельних клітин гомотермного організму та їх мікров’язкістю.

4. Встановити роль мікров’язкості та специфічного ліпідного складу в забезпеченні йонної проникливості та активності декотрих мембранопов’язаних ферментів.

5. Дослідити можливу участь нещодавно відкритого класу ліпідів -N-ацилфосфатидилетаноламінів та його похідних - у модифікації ліпідного складу та функціональної активності мембрани.

Наукова новизна роботи. Вперше одержана модель життєздат клітин гомотермних тварин із зміненим ліпідним складом шляхом с ження чи підвищення вмісту Chol за допомогою фосфатидилхоліна (ФхЛ) та фосфатидилхолінхолестеринових (ФхФЛ) ліпосом на кулі вованих клітинах мишиної нейробластоми С 1300 N18. Проведено по няльний аналіз ліпідного складу інтактних та модельних клітин. В< новлено, що зміна вмісту Chol в плазматичній мембрані (ПМ) кліт спричиняє точно розмежований у часі каскад реакцій модифік ліпідів, а також їх міжмембранний транспорт. Реалізація виявлених ханізмів спрямована на підтримку нормальної прижиттєвої мікров кості ПМ живої клітини, тобто вони є компенсаторними. Основним цих механізмів в порядку реалізації є: 1) лецитинхолестеринаї трансферазний; 2) деацилюючий/реацилюючий та десатуразний: міжмембранного транспорту; 4) Chol- та FA-синтезуючий.

Включення Chol-залежних компенсаторних механізмів живої кл ни у відповідь на зміну вмісту Chol у фізіологічних межах не виклі суттєвих змін функції ПМ. Накопичення Chol вище фізіологія рівней послідовно вичерпує компенсаторні резерви механізмів міжь бранного транспорту, FA- і Chol-синтезуючого, деацилюючого/ре; люючого, активуючи десатуразний та лецитинхолестерилтрансфе ний. Це призводить до надфізіологічного накопичення в ПМ ліп стимулюючих утворення гексагональної фази, - ефірів холестер (EChol), лізофосфатидилхоліну (LPC), PUFA і т.і., тобто зруйнувс мембрани та загибелі клітини. Таке ж надфізіологічне витягнення ( з клітини повністю вичерпує резерви вище названих механізмів у ротньому порядку, що веде до руйнування мембрани та загибелі кл ни. Вказані коливання вмісту Chol понад фізіологічними ріви призводять до різкої зміни мікров’язкості ПМ та порушенню її фуш В мембранах клітин виявлені та ідентифіковані N-ацилфосфати; етаноламін (NAPE) та N-ациллізофосфатидилетаноламін (LNAPE також фізіологічно активний продукт їх метаболізму N-ацилетанола

,'NAE). Вперше встановлена та доведена біологічна роль NAE - регуляція активності мембранозв’язаної лецитинхолестерилацилтрансферази ■JIXAT) у фізіологічних концентраціях: 5x10’7-5х10'5 М.

Показано, що в момент екстремальної ситуації у ПМ (можливого її розриву та загибелі клітини) при надфізіологічному накопиченні Chol різко активується гідроліз NAPE, утворення з нього LNAPE і, в кінцевому результаті, NAE. Останній інгібує ЛХАТ, тобто накопичення EChol га LPC. Однак, зважаючи на вкрай низький резерв попередників та самого NAE в ПМ, його протекторний ефект є короткочасним, загибель клітини визначена наперед. У випадках надфізіологічного зниження рівня Chol NAE виступає як конденсуючий агент внаслідок своїх фізичних властивостей та короткочасно компенсує нестачу Chol.

Практичне значення роботи. На підставі даних роботи запропоновано теоретичну модель пошкодження ліпідного біслою ПМ нервових клітин тваринного організму, яка може служити методичним підходом до вивчення процесів розвитку атеросклерозу, інфаркту міокарда та т.і.

Фізіологічна роль NAE стала передумовою для створення біологічно активних препаратів для медицини, котрі розробляються у відділі біохімії ліпідів Інституту біохімії НАН України та в кількох науково-дослідних установах. Крім того, NAE може служити інструментом визначення JIXAT-залежної природи біохімічних процесів та захворювань.

При заморожуванні сперми биків та баранів виявлено реалізацію ЛХАТ.-механізму компенсації підвищення мікров’язкості мембран клітин через зниження температури середовища розведення. На основі NAE розроблено та запробовано препарат “Кріоліс”, що додається до середовища розведення сім’яної рідини для глибокого заморожування та зберігання. Автором разом із співробітниками Інституту біохімії НАН України, Інституту біології моря ДСВ РАН та Українського Агроунівер-ситету (м. Київ) одержано авторське свідоцтво “Способ криоконсервации спермы” (A.c. № 1690736 Бюлетень “Открытия и изобретения”, 1991, стор. ЗО). Ще у 1989 році рішенням ПО “Україна” препарат

“Кріоліс” було апробовано та впроваджено на станціях штучн запліднення облплемоб’єднань України, на ряді племстанцій Білорусі Росії. За допомогою препарату вперше стало можливим ефективно морозити-розморозити сім’яну рідину баранів з вихідом більш ніж £ та запліднюючою спроможністю 65-80%.

Запропоновано нові методичні підходи для вивчення взаємодії клі’ та ліпосом, що можуть бути легко використані біохіміками в дослі, міжмембранного обміну ліпідів між клітинами різноманітних типів. Основні положетня, які виносяться на заахист:

• розробка і вивчення еспериментальної моделі клітин зі змінеї ліпідним складом, що спричиняє взаємодія клітини та ліпосої підвищенним та зниженим вмістом Chol;

• обгрунтування наявності в клітині чи її мембранах механізмів обк ліпідів, які є залежними від концентрації Chol в клітині, та до того, що ці механізми є компенсаторними при зміні фізичного ст ліпідного бішару мембрани; визначення можливої послідовна реалізації компенсаційних реакцій;

• визначення та доказ біологічної ролі NAE в ПМ, встановлення ханізму прояву цієї біологічної активності, визначення впливу еі генного NAE на фізіологічні функції клітини та застосування і при заморожуванні сперматазоїдів сільськогосподарських тварин. Апробациія роботи та публікації. Основні положення роботи де

відалися на: IX Загальносоюзній конференції по біохімії нервової стеми, 1983 р., м. Єреван; XVI конференції ФЄБТ, 1984 р., м. Мос: двосторонньому симпозиумі “Макромолекули у функціонуючій кліт: AH СРСР та Італії, 1984 р., м. Київ; Загальносоюзній нараді “Актуа. питання клітинної біології”, 1984 р., м. Ленінград; V Загальносоюзн біохімічному з’їзді, 1986 р., м. Київ; V Українському біохімічному з’'

1987 р., м. Київ; Загальносоюзному симпозиумі по біохімії ліпідів, ! р., м. Алма-Ата; III міжнародному симпозиумі “Аналіз стероїдів”, У щина, 1987 р., м. Сопрон; XVIII конференції ФЄБТ, Чехословаччі

1988 p., м. Прага; XIX конференції ФЄБТ, Італія, 1989 p., м. Рим; За-■альносоюзній конференції по розвитку вівчарства, 1989 p., м. Ставро-толь; І міжнародній конференції в Детройті, СІЛА, 1989 p., Міжнарод--юму симпозиумі “Транспорт іонів і механізми його регуляції”, 1989 p., я. Тбілісі, IX міжнародному симпозиумі “Аналіз стероїдів”, Угорщина, L990 p., м. Будапешт.

По темі роботи опубліковано 40 статей та тез у вітчизняних та за-зубіжних періодичних виданнях, одержано 1 авторське свідоцтво.

Об’єм і структура роботи. Дисертація складається з вступу, огляду пітератури, результатів власних досліджень, обговорення, висновків, списку цитованих джерел, списку власних публікацій автора і додатків. Робота викладена на 253 сторінках, має 43 таблиці та 34 малюнки. Бібліографічний вказівник вміщує 367 джерел. •

МЕТОДИЧНІ ПІДХОДИ ДО ДОСЛІДЖЕНЬ

Культури клітин. Дослідження проводили на клітинах мишиної ней-робластоми С1300 N18. Диференціювання клітин стимулювали зниженням концентрації бичачої сироватки, доданням до середовища 40 мкМ 5-Вг-дезоксиурідину [Dierich et al.,1980], 2% диметилсульфоксиду

'Weinstein et al., 1969], ImM дибутирил-сАМР [Croiset and Gros, 1982], гангліозидів з мозку бика у концентраціях 12,5-25,0 мкг/мл.

Мишині перитонеальні макрофаги G-744 культивували у середовищі RPMI та використовували у експерименті наступної доби після пасажу.

Узяття, розведення, еквілібрацію, заморожування, зберігання, розморожування та підрахунок сперматозоїдів проводили згідно з вимогами Інструкцій на станціях племоб’єднання АР Крим, м. Симферополь та лі; Джанкой. Осіменіння тварин здійснювали техніки-осіменителі племоб’єднання АР Крим по затвердженими інструкціями.

Підготовка клітин до експерименту. Клітини нейробластоми брали до експерименту через 96 годин культивування. Відмиті клітини обробляли розчином Версена, клітини знімали, ресуспендували та центрифугували, відмивку фізрозчином проводили тричі.

Клітини, у яких досліджували біосинтез ліпідів, вирощували з данням до середовища [2-иС]оцетовокислого Na. В інших випадках

• • • • 80ТЛІ + 23»т + 45^ 2+ 28ц* 2J- го

редовища містили такі радіоізотопи: Rb , Na , Са , Mg , [2-

гліцин, Б,Ь-[1-иС]лізин, [2-иС]глюкозу, тимідин-5-метил[3Н].

Морфологічні, електронномікроскопічні дослідження проводила методами Гулої та співр. [1988], Хомутовського та співр. [1987].

Одночасне виділення иікросом та ПМ. За основу методу одчас; виділення мікросом та ПМ взято метод Maeda et al. [1983], що розроблений для клітин нейробластоми Chakravarthy et al. [1Q8E нашій модифікації у ступінчатому градієнті густини Percoll та Ficoll.

Екстракція та аналіз ліпідів. Ліпідний екстракт з клітин чи і бранних фракцій одержували хлороформ-метанольною екстрак [Bligh and Dyer,1959], продовжували сумішшю хлороформ-метанол і метанолом. Фракцію ліпідів, ковалентно зв’язаних з білками, оде^ вали м’яким лужним гідролізом білкового осаду [Marinetti et al.,1982 Хроматографічне розділення, виявлення та ідентифікація ліг Ліпідний екстракт піддавали розділенню за допомогою високоефен ної мікротонкошарової хроматографії {ВЕМТШХ) (Б.Г. Білєньки: співр., 1984), а також газо-рідинної (ГРХ) та високоефективної капі ної газо-рідинної хроматографії (ВЕКГРХ). Розділення ліпідів по кл проводили одновимірною, a PL - двувимірною ВЕМТШХ, ВЕКГР ГРХ, їх виявлення, ідентифікацію та кількісне визначення прово загальноприйнятними методами [Васьковський та Висоцький, 1985 рещагин та Скворцова, 1982; Akman,1969; Marinetti & Cattien, Svetashev & Vaskovsky, 1972; Vaskovsky & Dembitzky,1975; Vask< & Latyshev, 1975; Vaskovsky & Suppes, 1972; Vaskovsky et al., 1975] Визначення радіоактивності ліпідів та інших речовин лровс після повного розчинення зон силікагелю у 0,2-0,5 мл HF та внесен у 10 мл РС-8 чи РС-103 на рідинних сцинтиляційних спектромі SL-4000 та 1214 RackBeta Flexivial LSC по кривим гасіння та з у

занням люмінісценції. Радіоактивність інших сполук вимірювали таким же чином, але не використовували HF. ,

Одержання ліпосом. Моноламелярні бішарові фосфатидилхолінові ;ФхЛ) та фосфатидилхолінхолестеринові (ФхХЛ, 1:1 моль/моль) ліпо-:оми (товщина бішару 4,3 нм, зовнішній та внутрішній радіус 13,7 та 9,4 нм відповідно) одержували з яєчного лецитину при озвучуванні на УЗДН-2Т чи методом обернення фаз [Szoka et al., 1980].

Визначення активності ферментів. Активність лужної фосфатази, фосфатилхолінестерази, Naf,Kf-ATP-a3ii, глюкозо-6-фосфатази, сук-цинат-дегідрогенази, кислої фосфатази, десатурази, ЛХАТ та ацилхо-лестерилацилтрансферази (AXAT), ферментів синтезу FA та Chol визначали загальноприйнятими методами [Вендт та співр.,1978; Верещагин та Скворцова, 1982; Капля та співавт.,1988; Chakravarthy et al., 1985; Chesterton,1968; Dushkin et al.,1991; Hansen & Rossi, 1991; Hasler et al.,1991; Neary et al.,1991; Onyeneke et al.,1991] та відносили до кількості білка мембран, що визначали за методом Lowry et al. [1951].

Вивчення транспорту йонів клітинами нейробластоми проводили за методом Palfrey та Littauer, 1976.

Вимірювання флуоресценції клітин та мембранних фракцій. Флуоресценцію клітин з 6-карбоксифлуоресцеїном реєстрували на спектрометрі MPF-43 при довжині хвилі збудження та емісії 490 та 520 нм відповідно. Приготування проб та вимірювання поляризації флуоресценції 1,6-дифеніл-1,3,5-гексатрієна (ДФГТ) та перілена проводили згідно з методичними рекомендаціями McVey et al. [1981] в Інституті біоорганічної хімії РАН (м.Москва). Ступінь ексимеризації бензофенантрена (піре-на) вимірювали там же за методом Т.Б. Макарової та співавт. [1988].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВО»РЕННЯ

Розробка методичних : підходів до створення модаелі клітин із зміненим вмістом Chol.

Клітини мишиної неробластоми С 1300 N18, стимульовані до диференціювання 5-Вг-дезоксиуридином, синхронні та ідентичні, з досить

грунтовно описаним нами складом ліпідів, мають фізіологічні функ клітини гомотермного організму, що є необхідною умовою для вивчен біохімічних механізмів. Необхідно біло підібрати фактор, який змінюі би фізичний статус мембрани та, таким чином, викликав би перебуде у ліпідному метаболізмі клітини. Важливе значення у виборі такі фактора мала робота Soejima et al. [1991], де було показано чітку ко] ляцію між чутливістю клітин до гіпертермії та вмістом у них Chol.

Ми мали намір вивчити можливий модифікуючий вплив Chol ліпідний метаболізм клітини, а в подальшому і на її функції, як аген що викликає перш за все зміну фазового стану ліпідного бішару. І цього спершу необхідно було створити дві різні моделі клітин н робластоми: 1) з підвищеним вмістом Chol, 2) зі зниженим вмістом СІ охарактеризувати їх ліпідний склад та основні функції.

Методичні підходи до вивчення взаємодії клітин та ліпосом різ го складу. Використовуючи відомі методи мічення ліпосом, вивчеі ендоцитозу [Барсуков та співавт., 1980; Trunch'et аі.,1985], ми показе що клітини нейробластоми С 1300 N18 взаємодіють з дрібними нейт льними ліпосомами за механізмом міжмембранного обміну ліпідів. С] відношення Chol/PL в мембранах є рушійною силою транслокації С по градієнту концентрації. Наші дані по визначенню переносу Chol : цілими живими клітинами та ліпосомами в залежності від градіє концентрації Chol, що створюється за рахунок зміни співвідноше Chol/PL у ліпосомах, представлені на мал.1. На графіку чітко вирая 5 частин. Частина “N”, що відповідає інтактному вмісту Chol у : тинах та ПМ, відображає відсутність переносу Chol по градієнту і центрації між штучною та біологічною мембранами, оскільки співві; шення Chol/PL у ПМ (0,62-0,64) та в ліпосомах (0,58-0,78) практі однакове. Саме в цьому випадку вдається найбільш чітко зафікс; ти власне еквімолярний обмін ліпідами як по відношенню до кільк ліпідів, що обмінюються між ліпосомою та мембраною клітини, т по відношенню до кількості обмінюваних Chol та PL. Частина “М

відповідає мінімально можливому вмісту Chol у клітинах (13,06+0,28 імоль/106 клітин) та ПМ (66+8 нмоль/мг білка). До цього призводить геренос Chol по градієнту концентрації з клітин та ПМ у ліпосоми, що відображений частиною “-Chol” графіка. Відповідно, частина “МАХ” -максимально можливий вміст Chol у клітинах (32,68+0,86 нмоль/10е слітин) та ПМ (409+23 нмоль/мг білка), зумовлений переносом Chol по 'радієнту концентрації з ліпосом до клітини (мембрани). Цей процес зідображено частиною “+Chol” графіка. Описані нами горизонтальні частини графіка “MIN” та “МАХ”, з нашої точки зору, свідчать не про зідсутність транслокації стерину між мембранами, а про природний процес “виходу” з експерименту клітин з мінімально чи максимально припустимим вмістом Chol через їх загибель. Відзначено, що чим довше ‘контакт” клітин та ліпЬсом, чим віище концентрація ліпосом навколо

"+Chol"

Chol/PL клітин

Мал. 1. Вплив співвідношення Chol/PC (при PL ma PC—const) в ліпосомах на зміну вмісту Chol в клітинах нейробластоми С 1300 N18, що відбито упіввідношеннялі Chol/PL. Показано, що вміст загальних PL в клітинах гтатистично вірогідно не змінюється при інкубаціі з ліпосомами):

1. клітини, 2. плазматичні мембрани.

клітини, тим швидше наступає максимальний ефект у зміні вмісту Chol, тим швидше клітина гине. Отже, вміст Chol у клітині, вірніше у ПМ клітини, є фактором, що відповідає не тільки за підтримку мікров’язкості ліпідного бішару, але й за реалізацію такої найважливішої фізіологічної функції як виживання.

Розрахунок зміни вмісту ліпідів у клітинах та ліпосомах при і користанні методу подвійної ізотопної мітки. В дослідах ми ви: ристали метод подвійної ізотопної мітки: ліпосоми готували з [3Н]-лі дів, а ліпіди клітин нейробластоми, вирощених на середовищі, що в щувало 1,0 мБк/мл [2-14С]-оцтовокислого Na, були радіоактивні по в лецю.

У випадку, коли ліпід не підлягає перетворенню у клітині, засто

вується запропонована нами формула О:

Щ14С]-Лкл Щ 3Н]-Лкл О

С -------------------+---------------,

<1[ИС]-Лкл х N d[ 3Н]-Лл х N

С - вміст ліпіда (нмоль/мг білка чи нмоль/Kf клітин);

R[,t С]-Лкл - загальна радіоактивність ліпіда клітин по [ С]-R[' Н]-Лкл - чи І Щ-ізотопу;

d[' С]-Лкл - питома радіоактивність ліпіда клітин до інкубацгі ( розпади /хв/нмоль); d[ Н]-Лл - питома радіоактивність ліпіда ліпосом до інкубацгі (розпади/хв/нмоль);

N -кількість мембранного білка (мг), чи кількість клітин (10 ).

Для підрахунку вмісту ліпідів, що утворюються з двох джерел, м бранного та ліпосомального, формула О набуває такого вигляду:

ИЩ’Щ-Лкл х (1[мС]-Ацил, : . €

Щ мС]-Лкл + К------------=------------- ,

d[ HJ-Лл И1[ Н]-Лкл

С --------------------------------------------+----------------- ,

d[ С]-Лкл х N с!И3Н]-Лл х N

де: '

С jna інші позначення - див. формулу О;

d[ С]-Ацил - питома радіоактивність клітинного джерела, що бере учасг перетворенні ліпідів - у цьому випадку 2-ацильного залишка клітинного PC (розпади/хв/нмоль); ' ■ . ■ ■ "

К - коефіцієнт малярної кількості єн до- та екзогенних джерел, які берут ушетъ у перетворенні ліпіду у клітині - при утворенні Echol дорівню

Метод швидкого одночасного виділення мікросом та ПМ дифер ційованих та недиференційованих клітин. У вивченні динаміки ш носу ліпідів між біологічною та штучною мембранами та подальи залучення у цей процес внутрішніх мембран клітини необхідне шви та одночасне виділення плазматичних та ендоплазматичних мембран

Основою для розробки методу одночасного виділення мікросом ПМ став метод Maeda et al., 1983; що був використаний для клітин нейробласто-ми Chakravarthy et al., 1985. Розробленим методом дворазового центрифугування на ступінчатому градієнті густини Percoll/Ficoll без’ядерного гомогената клітин нейробластоми С 1300 N18 вдалося одночасно виділити мікросоми та ПМ, придатні для подальшого вивчення ліпідного складу. Фракції мембран одержані з хорошим виходом білка, у досить очищеному як один від одного, так і від інших клітинних фракцій, вигляді. Використані вперше у даній роботі нові маркери - DPG та PG (міто-хондрії) та Chol-синтезуючий комплекс ферментів (мікросоми) спільно з стеринтранспортуючим білком (СТБ) (цитозоль) - можуть служити надійними критеріями чистоти при виділенні клітинних фракцій.

Клітини пейробластомш С 1300 N18 із зміненим вммістом Chol -динамічна система ліпідів.

Зміни ліпідного складу живих клітин супроводжуються певною перебудовою метаболізму ліпідів [Blond and Bezard, 1991; Daniels et al., 1981; Davis et al., 1982; Hermetter et al., 1988; Slotte and Bierman, 1987], але не позначається на фізичному стані їх мембран, та, скоріше за все, направлена на адаптацію організму до умов, що штучно або природньо трансформуються. Проте, до цього часу не вияснено механізмів реалізації такої адаптації на рівні ліпідного матриксу за виключенням пой-кілотермних організмів [Yeagle, 1989]. Для гомотермних організмів описані суперечливі факти, одержані на цілком різних клітинах.

Ліпідний склад клітин нейробластоми С 1300 N18 із зміненим вмістом холестерину. Інкубація клітин з ФхХЛ вже через 10 хв. призводить до суттєвих змін ліпідного складу (Табл.1.). Відзначається накопичення загального Chol, різке підвищення Echol та LPC у еквімоляр-них кількостях, але тільки до 45 хв., що відбувається на фоні незмінного вмісту загальних PL (спостерігали інші автори [Zhou et al., 1991]), наслідком чого є зниження молярного співвідношення PL/Chol з 2:1 до 1:1. Вже в перші 15-30 хв. інкубації клітин з ФхЛ кількість Echol зни-

жується на 35-50%, а через 45 хв. їх не вдається виявити. В» вільного Chol через 60 хв. знижується на 26% і більше не змінюєт при збільшенні часу інкубації з ФхЛ. Кількість PL у клітинах при і му постійна, а співвідношення PL/Chol суттєво зростає.

Таблиця

Вміст ліпідів у клітинах нейробластоліи С 1300 N18 після інкубації

з ФхХЛ (конг^ттрація ліпосом - 5 мкмоль РС/мл).М ± т; п=5.

Z тз .. : „ m ~ і ~ і Z : Z . /та

Час ін-куб.(хв.) Вміст ліпідів (нмол ь/10 клітин)

Chol EChol Chol+EChol PL LP

0 18.14±0.23 0.13±0.01 18.2710.25 35.7510.41 0

10 19.3811.15 2.6610.44*** 22.0411.55 * 36.3510.40 2.181

20 22.27±0.99 ** 3.6610.03*** 25.9311.02*** 36.6710.92 2.591

ЗО 26.92±1.40 ** 4.54+0.23*** 27.4611.63*** 34.7611.48 4.091

45 26.70±2.41 ** 4.8410.48*** 31.5512.88*** 36.9411.48 4.351

60 26.03Ю.27*** 5.22±0.43*** 31.2510.69*** 37.5211.91 3.521

75 28.4010.45*** 6.89±0.27*** 35.2910.22*** 36.5911.81 4.501

90 27.5911.14*** 6.9110.11*** 34.5011.19*** 36.6110.94 4.691

*-р<0.05;**-р<0.01;***-р<0.001 по підношенню до інтактних клітин (0 хвилі

Отже, при взаємодії ліпосом з клітинами відбувається два проц На ранніх строках інкубації переважає перенос Chol за градієнтом і центрації між біологічною та штучною мембранами. Після вирівнюва градієнту концентрації Chol між мембранами відбувається влг ліпідний обмін, що виражається у еквімолярному обміні PL.

Вище була показана залежність складу PL від забезпеченості кл Chol. Відомо, що найбільш перемінним компонентом PL та інших сю них ліпідів є FA, регуляцією ненасиченості яких підтримується і цифічний рідинно-кристалічний стан ліпідного матриксу мембран. Т в умовах зміненого вмісту Chol у клітині особливого значення наб; вивчення молекулярного складу FA-вміщуючих ліпідів. При згоїж на 51% чи підвищенні на 37% вмісту Chol у клітинах вміст ковале: зв’язаного з білками Chol не зміняювався у порівнянні з інтактн клітинами. Наші дані свідчать, що модуляція вмісту Chol у кліті суттєво впливає на якісний склад FA ліпідів як гідрофобно, так і к лентно зв’язаних з білками. Основні зміни у молекулярному складі зводяться до перерозподілу вмісту їх насичених чи ненасичених вщ

В результаті цього у клітинах із зниженим вмістом Chol ступінь не-насиченості ліпідів як гідрофобно, так і ковалентно зв’язаних з білками збільшується, а у клітинах із підвищеним вмістом Chol знижується. Таким чином, результати експериментів свідчать, що зміна вмісту Chol є процесом, який не обмежується пасивним обміном ліпідів та переносом їх по градієнту концентрації, а й зачіпає клітинний метаболізм.

Трансмембранний перенос Chol при взаємодії живих клітин ней-робластоми С 1300 N18 з ліпосомами. Взаємодія клітин з ліпосомами є взаємодією двох мембран: плазматичної біологічної та ліпідної штучної. Через те зміни вмісту ліпідів, що викликані зміною концентрації Chol, повинні швидше даватися взнаки у біологічній мембрані, ніж у цілій клітині. Величина співвідношення PL/Chol у плазматичних мембранах (ПМ) клітин становить 1,59, у мікросомах - 2,67, тобто мембрани відносно багатші на Chol, ніж ціла клітина. Вміст загальних PL у ПМ та мікросомах (Табл.2.) після інкубації не відрізняється від такого в інтактних клітинах. Кількість вільного Chol у ПМ через 20 хв. інкубації з ФхХЛ підвищується на 51%, після чого залишається незмінним. Певно, це максимально припустимий рівень Chol у ПМ. Подальше надходження Chol у клітині супроводжується його переносом з ПМ до мікросом та накопиченні там, де max концентрації стерина спостерігається через 1 год. інкубації, що відповідає даним літератури [Treistan et al., 1987; Voelker, 1991]. І в ПМ, і в мікросомах підвищення вмісту Chol активує процес його етерифікації. Так, у ПМ при підвищенні вмісту Chol на 30% (10 хв. інкубації) відбувається 10-ти кратне збільшення рівня Echol, а при надходженні ще додаткових 20% стерина (20 хв. інкубації) вміст Echol збільшується у 15 разів. У мікросомах накопичення Chol активує утворення його ефірів у меншій пропорції. Якщо вміст стерина перевищує контрольний рівень на 65%, то кількість його ефірів збільшується у 8 разів, на 225% - у 24 рази, на 245% - у ЗО разів. Вміст вільного Chol у ПМ значно знижується вже через 30 хв. інкубації клітин з ФхЛ, а Echol повністю відсутні (Табл.2). При цьому молярне співвідношення

PL/Chol наближується до 6,0 та не змінюється до кінця експеримеї Певно, Chol, що залишився у ПМ, не здатен до обміну та являє соб необмінюваний, структурний пул [Клебанов та співавт., 1986; Bar et 1986; Elyandouzi and Legrimellce, 1992; Leibei, 1987]. У мікросої кількість вільного Chol та його ефірів залишається практи незмінним у перші ЗО хв. інкубації з ФхЛ. Проте, після того, як ] втрачають весь обмінюваний пул Chol, його рівень швидко падає і е редині клітини. При цьому вміст стерина у внутрішніх мембранах де гає min низького рівня та більше не змінюється. До цього моменту лярне співвідношення PL/Chol у мікросомах становить 7,7.

У ПМ клітин зміна рівня EChol супроводжується відповідною еі молярною зміною концентрації LPC протягом всього періоду інкубаи ліпосомами. Це дозволяє припустити, що Chol етерифікується жирі кислотою, що переноситься ацилтрансферазою від PC. Вивчення вмі радіоактивної мітки у EChol, що утворилися у результаті інкуб [3Н]фофатидилхолін-[3Н]холестеринових ліпосом з [иС]клітинами, пс зує, що у склад заново синтезованих молекул Echol входить [HC]F клітинного джерела, яка частіше всього є олеїновою. Вона практи відсутня в утвореному LPC, хоча в інтактному PC становить приблр 31%. У EChol до інкубації це молярне співвідношення дорівнює ' Після інкубації: у LPC - 1:30, а у EChol - 1:3. Отже, процес етериф ції Chol у ПМ клітин відбувається за рахунок переносу в основи олеату від PC з утворенням LPC. Така реакція може здійснюваї специфічним ферментом лецитинхолестерилацилтрансферазою (ЛХ; Вміст загальних PL при інкубації з ліпосомами у мембранах не нюється. Вміст же індивідуальних PL піддається зміні тільки для tj компонентів. Вище було обговорено факт утворення LPC з PC. І того, при інкубації з ФхЛ достовірно знижується вміст РЕ як в ПМ, і в мікросомах. Цей процес супроводжується практично еквімоляр накопичуванням малополярних PL. При інкубації з ФхХЛ вміст N]

Таблиця 2.

Вмгстп ліпідів (нмоль/мг білка) у мембранах клітин иейробластоми С 1300 N18 після інкубації з ФхХЛ та ФхЛ (концентрація ліпосом 5 мкмоль РС/мл). М ± т; п—3

Час В м і с т л і п і д і в (нмоль/мг білка) У

інку- плазматичних мембранах мембранах мікросом

бації після інкубації клітин з фосфатидилхолінхолестериновими ліпосомами

(хв.) СЬоІ ЕСИоІ РЬ ЬРС СЬої ЕСЬоІ РЬ ЬРС

0 271± 9 1.7510.01 433117 1.6110.30 1141 6 3.1810.02 312126 2.03+0.44

10 354117** 1712** 420124 19+3** 109111 2.9710.09 321+30 2.2910.38

20 390126** 26+3** 441121 24+4** 128116 3.29Ю.11 336128 2.7610.63

ЗО 381120** 25+7** 430126 2714** 121120 3.41+0.33 319+17 2.1310.27

45 376118** 2214** 438119 2513** 189114 ** 271 6 * 307+21 2.2010.31

60 371110** 24+3** 427+15 2412** 256121 ** 771 9 ** 311114 2.53Ю.50

75 409123** 26+6** 438120 2718** 278118*** 941 7*** 324126 3.0710.34

'90 385119** 2315 * 446124 2516** 262126 ** 93+12 ** 301128 3.1910.46

'■■¿'■'■'"."г' після інкубації клітин з фосфатидилхоліновими ліпосомами

0 2711 9 1.7510.01 433117 1.6110.30 114+ 6 3.1810.02 312126 2.0310.44

15 115+11 ** 0.3210.01 ** 439124 0.2910.01** 1161 9 2.9610.05 306114 2.5610.32

ЗО 711 4 ** 0.01+0.001*** 421118 108111 3.2610.05 331+28 3.1110.27

45 66+ 8*** - 420+26 891 7 0.48+0.01 *** 320124 2.1710.25

60 751 7*** - 438+19 431 8 ** 0.01+).001*** 307117 2.24+0.31

75 78+ 6*** - 440121 411 2*** - 319126 1.4810.48

90 74+ 7*** - 437128 401 4*** - 309+22 1.0810.23*

*-р<0.05; **~р<0.01; ***-р<0.00і по відношенню до інтактних клітин (див. час інкубації 0 хв.).

в обох фракціях мембран достовірно знижується при тенденції до наї пичування РЕ, що має місце.

Раніше було відзначено, що у цілій клітині при зміні вмісту С відбувається відповідно зміна насиченості ацильних залишків ліпі; Накопичення Chol тягне за собою ще більш виражене збільшення по ненасиченості ацильних залишків мембранних PL у порівнянні з ; гальними ліпідами цілих клітин. Суттєві, але протилежно направл( зміни зареєстровані і для ацильних залишків мембранних PL із зниї ним вмістом Chol. Характерно, що зміни у кількості насичених та неї сичених залишків, що входять у молекули мембранних PC та РЕ, с суються в основному визначеного ряду FA: 16:0, 16:1, 18:0, 18:1 n9, 1 пб, 20:0, 20:3, 20:4 пб, 22:0 та 22:4 пб. У деяких випадках зниження/п вищення вмісту насиченого ацильного залишку (наприклад, 18:0) в< за собою підвищення/зниження моноєнового ацила PL (18:1 п9) на е повідний рівень. При накопичуванні Chol насиченість ацильних зали ків мембранних PL знижується у 1,5-2,0 рази, а при зниженні вмії стерину цей показник підвищується на таку саму величину.

Виявлено зниження вмісту чи накопичення iso- та antetso-ацилы залишків PL при інкубації з ліпосомами як у цілих клітинах, так мембранних фракціях. Наприклад, для ліпідів цілих клітин вміст роз лужених FA (15:0 г+16:0 аї+16:0 г'+17:0 аг+17:0 г) складає 1,04%. Одн після інкубації з ФхЛ цей покажчик збільшується у 2 рази і ся 2,28%. Тенденція до зниження концентрації FA при накопичуванні С у клітинах менш виражена (з 1,04 до 0,87%). Але з іншого боку, у і клітинах виявляється різке зниження вмісту коротколанцюгових FA рази (2,58%) в той час, як при інкубації з ФхЛ має місце лише тенд ція до їх накопичення (11,39%) у порівнянні з інтактними (8,16%).

Таким чином, нами визначено, що зміна вмісту Chol у живій кліт викликає цілий каскад реакцій, що спричиняють перебудову ліпіди складу як цілої клітини, так і її мембран.

Активність ферментів обміну ліпідів як функція концентрації холестерину у клітинах нейробластоми С 1300 N18. Виявлена нами у попередніх розділах перебудова вмісту ліпідів, що викликана зміною концентрації Chol, була можлива тільки у випадку швидкої реакції ряду ферментів, що регулюють обмін ліпідів, що розкривали і інші авторі [Blond and Bazard, 1991; Momchilova et al., 1991; Murakami et al., 1992; Ruhling et al., 1992].

Наші безпосередні експерименти показали, що активність ЛХАТ зосереджена у ПМ, а АХАТ - у міїсросомах. Активність ЛХАТ у ПМ може регулюватися різними рівнями Chol: при накопичуванні стерину у активність ЛХАТ різко зростає та накопичуються EChol та LPC; зниження вмісту стерину викликає зворотній ефект. Після надходження Chol з ПМ у мікросоми (45 хв. інкубації з ФхХЛ) активність АХАТ зростає у 2 рази та сягає більш ніж 3-х кратного збільшення при max накопичуванні стерину у мікросомах. З іншого боку, витягнення Chol з мікросом (інкубація з ФхЛ) призводить до зниження активності фермента аж до повної його інактивації. Позитивні коефіцієнти кореляції (г=+0,93 та г=+0,89) між концентрацією стерину у ПМ та активністю ЛХАТ, концентрацією стерину у мікросомах та активністю АХАТ відповідно, свідчать про пряму залежність активності ферментів та концентрації Chol у мембранах. Рівень Chol регулює також активність де-сатураз: підвищений вміст стерину активує ферменти, знижений - інгібує. Крім того, рівень Chol у клітинах регулює як власний біосинтез, так і синтез високомолекулярних FA: чим вищим є вміст стерину, тим нижче швидкість включення мітки з [2-нС]ацетата Na у вказані ліпіди та навпаки. Накопичення мітки при підвищеному вмісті Chol відбувається у PUFA з довгим ланцюгом, а при зниженому вмісті у більшій мірі накопичується в коротколанцюгових SFA.

Зауважена нами зміна вмісту ізомернихРА ліпідів ПМ та мікросом клітин при модифікації вмісту Chol пов’язана зі зміною активності групи ферментів (фосфоліпаза та ацилтрансфераза), що відповідають за

деацилювання/реацилювання молекул PL. До цього ж типу реакції треба віднести й утворення плазмалогенних форм PL [Hazel, 1988]. Та: при інкубації клітин з ФхХЛ у мембранах вміст пламалогенів PC, PI PS суттєво знижується, а під час інкубації з ФхЛ - вірогідно зростає.

Таким чином, при направленій зміні вмісту Chol у клітинах активу ються реакції перебудови ліпідного бішару плазматичних мембран т мікросом, які зумовлюють у мембранах зміну концентрації деконден суючих агентів, компенсуючих вплив Chol як фактору, що сприя ущільненню ліпідного бішару, а саме: EChol, LPC, низькомолекулярни та розгалужених FA, PUFA, деацильних (неплазмалогенних) форм PL.

Фізичні властивості ПМ та мембран мікросом живої клітини ней робластоми С 1300 N18 зі зміненим ліпідним складом. Chol виклика зменшення мікров’язкості ліпідного бішару [Cogan et aL, 1973; Feinstei et al., 1975; Oldfield and Chapman, 1972; Pasenkiewiezgierula et al., 199 Silvius, 1992; Vanderkooi et al., 1974]. З іншого боку, експерименти, в* конані на ряді мембранних препаратів, суперечать загальноприйнятом погляду на цей стерин як на конденсуючий агент. Автори не виявил помітної зміни мікров’яакості мікросом та ПМ при накопичуванні у ни Chol [Baldassare and Silbert, 1979; Gard and Brenner, 1985; Rintoul et a 1979]. Нами показано, що холестерин-залежні процеси носять яскраЕ виражений характер компенсації конденсуючого ефекту Chol на ліпід ний бішар ПМ. Розв’язати протиріччя, що виникло, можна було тільк у експерименті по визначенню мікров’язкості ПМ клітин із змінени вмістом Chol, що і стало ціллю досліджень даного розділу. У всіх ек< периментах час затухання флюоресценції ДФГТ (т=8,0-8,4 сек), пері лена (т=5,4-5,8 сек) та пирена (т=46-51 нсек) практично не змінювався відповідав результатам, одержаним у подібних експериментах інш* авторів [Gala and Sackmann, 1974; McVey et al., 1981].

Поляризація флюоресценції ДФГТ та перилена, ступінь ексимері зації пирена у цілих клітинах залишалася незмінною на протязі дул короткого часу інкубації з ліпосомами (не більше ЗО хв.), що відповіде

збільшенню чи зниженню вмісту Chol на 9-11% у цілій клітині. При подальшій зміні концентрації стерину параметри флюоресценції зондів різко змінюються. Рівнозначно поведінці зондів у цілій клітині реєструється їх поведінка у мікросомах. Це свідчить про зміну щільності упакування ацильних ланцюгів PL, тобто про підвищення/зниження мікро-в’язкості мембран мікросом при накопичуванні/видаленні в них Chol.

Поведінка зондів у ПМ клітин протягом всього часу накопичення чи зниження вмісту в ній Chol не змінюється. Слід зважити на те, що max можлива зміна вмісту стерину у ПМ клітин досягається вже через 1030 хв. інкубації з ліпосомами різного складу. Але не можна залишити без уваги катастрофічну зміну поляризації флуоресценції і ступеню ек-симеризації зондів ПМ на останніх строках інкубації (75-90 хв.). Як раніше зазначалось, ці зміни безпосередньо не зв’язані із підвищенням чи зниженням вмісту Chol у ПМ. Скоріше за все відбувається наступне. Перші 60 хв. інкубації підвищений чи знижений вміст Chol у ПМ компенсується роботою ферментів ліпідного обміну, трансмембранним переносом стерина, а також інгібуванням/активуванням ферментних систем мікросом, що відповідають за синтез власного Chol та високомоле-кулярних FA. До 75 хв. інкубації механізми компенсації повністю вичерпують власні резерви. Тепер будь-які додаткові вбудова/витягнення стерину ПМ компенсувати не в змозі. Отже, зміни у поведінці зондів ПМ через 75-90 хв. інкубації клітин з ліпосомами відображують фізичний стан ліпідного бішару клітини, що загинула під час інкубації з ліпосомами, коли усі можливі резерви компенсації вичерпані.

Таким чином, наші досліди переконливо свідчать, що Chol живої клітини виконує найважливішу функцію: активуючи відповідні ферментні системи, викликає зворотню модифікацію ліпідного складу та здійснює регуляцію мікров’язкості ліпідного бішару плазматичної мембрани.

Згідно з, нашими даними, Chol у ПМ функціонально поділений min на три пули: структурний, обмінюваний та міцно (ковалентно) зв’язаний з білками. Обмінюваний Chol може етерифікуватися у процесі тран-

спорту через мембрану, що підтверджують L інші автори [Davis et al 1982; Ruhling et al., 1992], а структурний - тільки у крайньому випадк; компенсації збурювань мікрон’язкості плазматичної мембрани, що ви никають. Виявлені нами зміни у ліпідному бішарі клітинних мембраї включаючи модуляцію структурного Chol, реально можуть позначатис як на функціональній активності, так і на їх життєздатності.

Транспорт катіонів та органічних сполук, активність мембрано зв’язаних ферментів у клітинах нейробластоми С1300 N18 із різни] вмістом Chol у плазматичній мембрані. Значна зміна вмісту Chol ПМ (підвищення на 70% та зниження на 74%) зовсім не впливає на ба зальний вхідний струмінь досліджуваних катіонів, але суттєво гальму вхід у клітину усіх досліджуваних органічних сполук. Надлишок Chol ПМ на 70% знижує накопичення у клітині ацетата на 28%, гліцина н 45%, лізина на 34%, тимідина на 36% та глюкози на 45%. У той же ча нестача Chol на 74% знижує вказані показники на 26%, 30%, 20%, 12' та 25% відповідно. Вивчення активності мембранозв’язаних ферменті показало, що при зниженій чи підвищеній концентрації Chol активніст ферментів інгібується до певної міри. Важливо підкреслити, що як випадку транспорту органічних сполук, так і активності ферментів най дані практично повністю спів-падають із даними літератури [Cradio е аі., 1982; Hazel, 1988; Madden et al., 1979; Yeagle, 1985].

Відмічене нами протиріччя - інгібування активності мембранозв’я-зг них ферментів, транспорту органічних сполук та цілковита відсутнісі будь-якого ефекту високих чи низьких концентрацій Chol на транспор одно- та двовалентних катіонів - знаходить своє пояснення у сучасні концепції ліпід-білкової взаємодії. Нині немає сумнівів у тому, що ліп ди мають здатність змінювати функціональну активність мембранозв’; заних білків за допомогою двох можливих механізмів. По-перше, різі концентрації ліпіда(ів) можуть змінювати “вільний об’єм мембрани”, н< обхідний для конформаційних флуктуацій білка у процесі його фуш ціонального циклу [Yeagle, 1991]. По-друге, частина ліпідів у мембран

міцно зв’язана з інтегральними білками [Yeagle, 1989], у тому числі ферментами [Yeagle, 1989]. Дослідження з використанням методів спін-електронного резонансу та Н-ЯМР досить переконливо показали, що ліпіди формують навколо інтегрального білка міцно зв’язаний моношар (“ліпідний аннулюс”). Причому, швидкість обміну ліпідів аннулюса білка складає = 1 сек’1 [Yeagle, 1989]. Таким чином, ліпідний бішар мембрани у спрощеному варіанті можна розглядати як власне класичний ліпідний бішар та вбудований у нього ліпідний аннулюс, який у свою чергу містить у собі інтегральний білок. Очевидно, регуляція мікров’яз-кості відбувається тільки у класичному бішарі і не зачіпає ліпідний аннулюс [Yeagle, 1989]. Однак, як у випадку класичного бішару, так і у випадку ліпідного аннулюса при зміні концентрації Chol у ПМ відбуваються відповідні зміни складу ліпідів. Але у бішарі вони можуть бути скомпенсовані спеціальними механізмами, у аннулюсі ж такі механізми відсутні. Тому ми і спостерігаємо уявне протиріччя, відзначене вище.

Вератрин-залежний транспорт Rb' у клітин нейробластоми С1300 N18 із зміненим ліпідним складом. Вератрин у дозах 90, 170, 690 та 1030 мкг/мл культурального середовища в умовах даного експерименту (t=20°C) підвищував вихід ізотопу з клітин у 1,3; 1,5; 2,0 та 3,0 рази відповідно. Для подальшої роботи була обрана доза 690 мкг/мл. Вератрин збільшує швидкість виходу ізотопа у культуральне середовище у 4,5 рази у порівнянні з базальним потоком (t=37°C). У клітинах з підвищеним вмістом Chol приріст вератринового інкременту становить 40%, а із зниженим вмістом спостерігається його дефіцит на 33% у порівнянні з таким у інтактних клітинах. Причому тетродотоксин у всіх трьох випадках повністю знімав активуючий вплив вератрину на транспорт Rb'.

Виживання клітин нейробластоми СІ300 N18 при сапрямованій зміні вмісту Chol. Результати електронно-мікроскопічних цитохімічних досліджень клітин, що були оброблені кон’югатами лектину зародків пшениці з колоїдним золотом (WGA-Au), інтактних та інкубованих з ФхХЛ протягом 10, 15, ЗО та 90 хв. показали, що ПМ інтактної клітини

чітко позначена, кон’югати WGA-Au розміщені тільки на поверхи клітини, які у випадках 10 та 15 хв. інкубації з ліпосомами, тобто у ви падках фізіологічного накопичування Chol у ПМ. Коли рівень стерин; сягає надфізіологічного рівня (після ЗО хв. інкубації) у мембран з’являються зруйновані ділянки, а при подальшому накопиченні стери ну (90 хв.) у багатьох клітин мембрана являє собою окремі цілі ділянк: чи повністю зруйнована, що підтверджується виявленням частин: мітки всередині клітини. Великі ж кластери кон’югатів свідчать про не специфічне зв’язування з цитоплазматичним матеріалом.

Накопичення неламелярних ліпідів у плазматичній мембрані кліти при зростаючій концентрації у ній Chol чітко корелює із загибеллі клітин та даними по зруйнуванню ПМ, що одержані за допомогою за барвлення клітин трипановим синім та електронної мікроскопії.

Раніше показано, що утворені у ліпідному бішарі мембрани Echol т лізофосфоліпіди внаслідок своїх фізичних властивостей “викидаються з мембрани [Shoemaker ancl Nicols, 1992]. Можливо, що завдяки таком Механізму здійснюється транспорт Chol та PL через ПМ за участі ЛХАТ [Ruhling et al., 1992] тоді, коли концентрація Chol ще знаходить ся на нормальному фізіологічному рівні. Але у випадку надфізіологічНс го накопичення Chol у мембрані та масивному “викиді” LPC та Echi може відбуватися руйнування мембрани). У всякому випадку, щ толітичний ефект високих (скоріше за все надфізіологічних) доз Chol і бактеріальних клітинах підтвердили Л.П. Мел’янцева та співр. [1992], на культурі клітин китайського хом’яка А.Н. Хохлов з співавт. [1991].

Таким чином, припущення про визначну роль “неламелярни> ліпідів у загибелі клітин при надфізіологічному накопиченні у них СЬ має експериментальне підтвердження. Загибель клітин нейробластом при зниженні вмісту у них стерину зв’язана із зміною у мембраї співвідношення ліпідів на користь “неламелярних”, наприклад РЕ, яі клітина не в змозі компенсувати. Chol відіграє важливу роль у 6iuiaj конденсуючи, об’єднуючи полярні головки PL та ацильні ланцюги, oj

, 27 ганізуючи їх у жорстку структуру. Зниження концентрації стерину

нижче фізіологічних меж веде до виникнення ефекту деконденсації, у першу чергу та max вираженого у зоні полярних головок PL. Отже, витягнення структурного Chol з мембрани також веде до загибелі клітин.

0 10 15 20 ЗО 45 60 75 90

, і. Час (хвилин)

Мол. 2. Залежність зіситтєздатності клітин нейробластоми С 1300 N18 від ліпідного складу плазматичних мелібран.

N-Ацилетаноламіниі як фізіологічний фактор ксампспсаціі ' ' ' ушкоджуючих змін у ліпідному бішаріп.

У наших експериментах знайдено особливий механізм в ПМ, що перешкоджає її руйнуванню та загибелі клітин. У фракціях мембран були виявлені PL з високою хроматографічною рухомістю. Між їх концентрацією та вмістом РЕ при інкубації клітин з ліпосомами виявилась пев-

ла законч^ірність. Тому виникло припущення про можливу присутність

' •’ і у зоні PL з високою хроматографічною рухомістю >7-ацильованих РК

Виявлення та ідентифікація ЙДЕ та їх попередників у клітинах нейробластоми С 1300 N18. Методом ВЕГРХ відносно синтетичних стандартів після хімічної деградації до вільної ГА та етаноаміна встановлено, що клітини вміщують ^пальмітоїл- та ^стеароїлетаноламіни ^АЕ-16:0; НАЕ-18:0). PL з високою хроматографічною рухомістю ідентифікували по хроматографічній поведінці основних сполук та продук-

тів їх хімічної деградації на основі синтетичних стандартів NAPE ті LNAPE.

Вплив холестерин-залежної компенсаторної перебудови мета болізму ліпідів на вміст NAE та його попередників у клітинах ней робластоми С 1300 N18. Перебудова метаболізму ліпідів, викликані Chol-залежними ферментативними реакціями, призводить до різко зміни вмісту вказаних ліпідів у диференційованих клітинах (Табл.З.' але фактично тільки при екстремальних концентраціях Chol у ПМ.

Накопичення Chol у мембрані викликає 50-ти разове збільшенн концентрації NAE, а вміст його попередників знижується: NAPE - д залишкової кількості, LNAPE - на 30-35%. Проте, NAE швидко утилі зується клітиною та його вміст до 45 хв. інкубації знижується практич но до нормального рівня,' що узгоджується з flá^JÜNÍiji’ літератури1 аїр його короткий період напівжиття in vivo [Мельник, 1991]. Зниженн вмісту Chol у клітині майже не позначається на вмісті N-ацильовани PL, проте, кількість NAPE та LNAPE має тенденцію до зменшення д 30-45 хв. інкубації з ФхЛ, а вміст NAE досить різко зростає - у 1 разів. В обох випадках утворення NAE відбувається “лавиноподібно”, з короткий період інкубації між 20 та ЗО хв., тобто у той момент, колі

Таблиця 3.

Вміст N-ацильсніаних PL и NAE в плазматичній мембрані клітин нейробластоми С 1300 N18, гнкубоеаних з ФхХЛ (1:1 моль/моль) та ФхЛ ___________(концентрація ліпосом-5 мкліоль РС/мл). М±т; п=4.__________________

Лі- Час ін- В м і ст ліпідів в мембрані

по- кубації NAPE LNAPE NAE-16.0 NAE-18.-0

со- (хвилин) нмаль/10 мг білка пмоль/10 мг білка нмоль/10 мг білка нмоль/10 Мі білка

ми контроль 3.5010.18 274.6+12.9 0.80±0.02 > 0.01

ф 10 3.86±0.11 269.3+14.7 1.23+0.05 > 0.01

X 20 1.1110.08** 248.9+13.2** 17.96+0.84*** 1.13±0.18**ч

X ЗО > 0.L0 210.2± 8.6** 36.75+1.40*** 7.09Ю.59**і

Л 45 залишки 216.4± 7.7 7.2110.23*** > 0.01

10 3.2710.23 285.3+11.4 0.73+0.06 > 0.01

Ф 20 3.01±0.19 270.01 9.6 1.0910.08 > 0.01

X 30 2.24+0.16* 267.9±18.1 9.3610.67*** 0.4510.03**^

Л 45 2.00+0.09** 270.8± 9.2 2.2810.12** > 0.01

* - р<0.05, ** - р<0.01, *** -р<0.001 по віднаиіенню до інтактних клітин.

концентрація Chol у ПМ сягає практично високих чи низьких величин.

Вбудову NAE у ПМ клітин нейробластоми С 1300 N18 вивчали при використанні синтетичних препаратів, а також індивідуальних кристалічних N-мирістоїл- (NAE-14:0), N-пальмітоїл- (NAE-16:0) та N-стеаро-їлетаноламінів (NAE-18:0). Інкубація клітин з NAE, що є сумішшю з 13 синтезованих молекулярних форм, у кількості 5x10'6 М протягом ЗО хв. веде до вбудови у ПМ виключно насичених молекулярних форм NAE (NAE-14:0;-15:0;-16:0;-17:0;-18:0;-20:0) у суворій закономірності від вмісту у мембрані FA з такою ж довжиною вуглецевого ланцюга.

Розподіл NAE, вбудованого у ПМ, по клітинним органелам вивчали за допомогою синтетичного М-[1-мС]-пальмітоїлетаноламіну. NAE, що вбудувався до ПМ, повністю утилізується клітиною та не екскрету-ється у зовнішньоклітинне середовище. Мітка з NAE швидко транспортується цитозольними білками у мікросоми, у зв’язку з чим можна було чекати відщеплення жирної кислоти та утворення етаноламіну, які .{ і.-’- і . ^ ‘ • ' можуть піддаватися подальшим перетворенням.

Перетворення Н-[1-11С]-пальмітоїлетаноламіну у ПМ клітин нейробластоми С 1300 N18. Максимальна кількість мітки накопичується' на перших хвилинах інкубації у ПМ саме у вигляді NAE-16:0. До ЗО хв. майже половина мітки виявляється у пулі вільних FA, потім вона поступово переміщується у пул етерифікованих FA, що свідчить про синтез складних ліпідів. Зниження вмісту сумарної мітки після 45 хв. скоріше за все відображає процес транспорту FA у цитозоль, що у клітині відбувається з високою швидкістю, та утилізацію у циклі ß-оки-слення. З даних випливає, що час напівжиття NAE у ПМ досить короткий та для даних умов інкубації становить близько 17,5 хв. .

Подальші шляхи деградації NAE у клітинах нейробластоми С 1300 N18. Доказом ферментативного гідролізу NAE у клітині стало виявлення хроматографічним методом етаноламіну, утворюваного у екві-молярних кількостях з пальмітоїлом. В кінцевому результаті FA іде на синтез нових ліпідів, як показано вище, чи окислюється у енергетично-

зо

му циклі, а етаноламін може зазнавати перетворення в етанол та в аце тальдегід, що була докладно розглянуто О.О. Мельником [1991]. Крії того, ним же було доведено, що жоден з можливих продуктів деградац NAE не має біологічної активності, властивої для NAE [Мельник, 1991].

NAE - біологічно активний фактор ПМ клітин нейробластоми і 1300 N18. У наших експериментах NAE-16:0, що був присутній у сере довищі інкубації у концентраціях, достатніх для накопичення у мем брані помітної його кількості, модифікував як базальний, так і вераї рин-залєжний вихід 8бПЬ+ із клітин. Причому, пригнічення базальної потоку катіону спостерігалося тільки при високих концентраціях NA1 що відповідає даним літератури [Epps et al., 1982]. Вератрин призводш до різкої зміни метаболізму ліпідів. Накопичування EChol, LPC та LP при цьому зв’язане з активацією ЛХАТ (Табл.4і), a MG, Dfr та FFA - : підвищенням активності ліпаз [Hermetter et al., 1988].

Преінкубація клітин з NAE-16:0 не тільки різко знижує вміст EChc LPC та LPE (Табл.12-13.), а й активність JIXAT у мембранах клітин і нормального рівня (Табл.14.). Причому, слід відзначити, що незначни вміст LPC та LPE у мембранах при вбудові NAE, а також відсутніст його будь-якого впливу на накопичення у вератрин-оброблених кліті нах MG, DG та FFA свідчать про те, що активність фосфоліпаз та іі ших ліпаз не пригнічується, що узгоджується з даними Broekemeier < al., 1985, які не спостерігали впливу NAE на активність фосфоліпази А

Таблиця 4.

Вплив вератрини та NAE на активність ЛХАТ (гімаль гідралізованого Echc за год.на мг білка) в плазматичних лі&лібранах клітин нейробластоми С 13(

Час Активність ЛХАТ в плазматичних мембранах клітин,

інку- інтак- інкубованих з

бації (хвилин) тних вератрином вератрином та NAE NAE

5 2.15±0.43 28.3312.06 *+* 2.0810.51 1.8310.17

15 2.09±0.37 49.8112.74 *** 2.3610.42 0.9410.12 *

ЗО 2.21±0.51 52.3714.11 *++ 2.7110.37 0.38+0.14 **

* * р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.003 по відношенню до інтактних клітин

Таким чином, N-пальмітоїл- та N-стеароїлетаноламіни, що вміщуються у ПМ клітин нейроблаетоми С 1300 N18 у залишковій кількості, у критичних ситуаціях для плазматичної мембрани активно накопичуються у ній шляхом гідролізу попередників NAPE та LNAPE. У концентраціях 30-50 нмоль/мг білка ПМ (приблизно 1 нмоль/106 клітин) NAE виявляють свою біологічну активність - інгібують JIXAT, стимульовану критичними дозами Chol, та гальмують накопичення EChol та LPC, що утворюють гексагональну фазу у ліпідному бішарі. Так за-побігається руйнуванню ПМ, виникає “лагперіод” загибелі клітин. Проте, концентрація біологічно активного фактору та його попередників у ПМ досить низька, а швидкість гідролізу NAE висока, що й обумовлює короткочасність протекторного ефекту. Насичення ПМ синтетичним NAE подовжує процес захисту ПМ та запобігає загибелі клітин.

Кріоконсервуючі властивості NAE. Наші дослідження показали, що у спермі баранів та биків при холодовому шоку крім утрати частини ліпідів (біля 10%, що підтверджується даними літератури [Go and Wolf, 1983; Quirn and White, 1967]) відбувається різка активація JIXAT, внаслідок чого накопичуються LPC, LPE та EChol у спермі бика та барана. Слід відзначити, що активність JIXAT при еквілібрації сперми протягом 2-4 годин збільшується практично у 2 рази. A NAE, уведений у середовище розведення у концентрації 5 мкМ, інгібує не тільки приріст активності ферменту, але й початкову активність більш, ніж на 50%. Тому ми не спостерігали накопичення лізо-PL та EChol у сперматозоїдах, оброблених NAE. Крім того, втрата ліпідів при еквілібрації та кріоконсер-вації різко знижується, і відмінність у ліпідному складі сперми не спостерігається (статистично вірогідної різниці не виявлено). Враховуючи відомі дані літератури про спонтанну міграцію лізо-PL та EChol а мембрани у водну фазу чи на розчинені у ній акцептори [Shoemaker and Nichols, 1992; Stein et al., 1992; Voelker, 1991; Vrtovsnik et al., 1992], стає зрозумілим механізм ’’втрати сперматозоїдами ліпідів” при її екві-

лібрації та кріоконсервації - фактично відбувається десорбція активи утворюваних EChol, LPC та LPE з ПМ сперматозоїдів.

Отже, у відповідь на фазовий перехід при зниженні температур сперматозоїд змінює метаболізм ліпідів таким чином, щоб підтримат життєспроможність мембрани на нормальному рівні. В подальшому пр швидкому розморожуванні консервованої сперми концентрація стим> люючих гексагональну фазу ліпідів (LPC, LPE та EChol) виявляється мембрані дуже високою, що обумовлює низьке виживання та, природні запліднюючу здатність сперми биків, а також практично повну немо» ливість одержати розморожену сперму баранів, прийнятну для технс логічного використовування. Застосування NAE у середовищі еквілібрс ції еякуляту бика та барана у концентрації 5 мкМ попереджує накого чення лізо-PL та Echol та покращує якість сперми. На основі одержг них результатів спільно із співробітниками відділу біохімії ліпідів Ін< титуту біохімії НАН України, Української сільськогосподарської акг демі'і та Інституту біології моря ДСВ РАН розроблено препарат “Кріе ліс” (зареєстрована торгова марка) як кріопротекторний додаток у с< редовище розведення сперми биків та баранів. Одержано авторсы свідоцтво. Рішенням ПО "Україна” препарат був упроваджений і племстанціях України та до 1991 року вже використовувся у всіх о( ластях, а також у Білорусі, Росії та Казахстані.

ЗАКЛЮЧЕНИЯ

Проведена робота була спрямована на розробку уявлень про прирі ду механізмів саморегуляції клітинного гомеостазу на рівні плазмати’ ної та ендоплазматичної мембран.

Розроблена модель клітин зі зміненим вмістом Chol дозволила ви начити взаємозв’язок функціонального стану біологічних мембран з м таболізмом ліпідів в клітині. Вивчення принципів цієї взаємодії призв ло до виявлення каскаду реакцій ліпідного обміну, які спрямовані і регулювання функціональної активності плазматичної мембрани т

клітини в цілому. Можливі шляхи утворення нових ліпідних молекул в мембрані клітини включають:

1) зміну пула ацил-СоА в клітині таким чином, що при накопиченні Chol у мікросомах зростає концентрація PUF А;

2) вибіркове використання специфічних FA з ацил-СоА пулу в процесі синтезу PL de novo\

3) пряму модифікацію PL, які вже вбудовані в мембрану через

• цикл деацилювання/реацилювання,

• безпосередню десатурацію ацильних ланцюгів PL,

4) деградацію PL, які вбудовані в мембрану, фосфоліпазами таким чином, що при накопиченні Chol в ПМ відповідно накопичуються вільні FA, DG та MG;

5) регуляцію синтезу Chol таким чином, що при накопиченні Chol у мікросомах його синтез інгібується, а при зниженні його концентрації - активується;

6) регуляцію JIXAT-циклу у ПМ - синтез/гідроліз EChol шляхом трансдеацилювання/трансреацилювання PC з накопиченням/зниженням рівня LPC.

При надходженні у клітину фізіологічних доз Chol зпрацьовують вказані компенсаторні механізми і клітина залишається життєздатною та порушень цілістності мембрани не фіксується. Надфізіологічні дози Chol, що потрапляють у клітину через ПМ та накопичуються у мікросомах, швидко вичерпують можливості компенсаторних механізмів та накопичення "неламелярних” ліпідів веде до деструкції ПМ та загибелі клітин. При урахуванні того, що ці події розвиваються у часі, запропоновану модель можна використовувати як вихідну для вивчення поведінки клітин при гіперхолестеринемії, розвитку склерозу, інфаркту міокарда та ін.

На час надфізіологічного підвищення концентрації Chol та утворення “неламелярних” ліпідів у клітинах масивно накопичуються NAE-16:0 та NAE-18:0, які є біологічно активними сполуками плазматичної мем-

брани, виявляючи свою дію в концентраціях 5х10"7-5х1(Г6 М. Біологічі ефекти NAE, як ми вважаємо, виходячи з наших та літературних де них, обумовлені його інгибуючим впливом на JIXAT. Крім того, ми прі пускаємо, що локальна чи загальна зміна мікров’язкості плазматичні мембрани тваринної клітини під впливом будь-якого агента має супр< воджуватися досліджуваними нами компенсаторними реакціями.

У нашій роботі такими факторами стали концентрація Chol у мєї бранах та зниження температури для сперми тварин, а у роботг інших авторів - різні FA, підвищена чи знижена температура та і Отже, компенсаторні механізми такого типу нарівні з механізмом прі текції плазматичної мембрани за допомогою N-ацилетаноламінів мі жуть бути універсальними для клітин еукаріот.

ВИСНОВКИ

1. Вперше одержана модель життєздатних клітин нейробластоми С 13(

N18 із зміненим ліпідним складом шляхом зниження чи підвищені вмісту екзогенного холестерину у цілих клітинах та їх мембранах : допомогою фосфатидилхолінових та фосфатидилхолінхолестерин вих ліпосом. Охарактеризовано ліпідний склад плазматичних меі бран, мікросом та цілих інтактних і модельних клітин.

2. Встановлено, що зміна концентрації холестерину у цілій клітині, також у її мікросомах та плазматичних мембранах викликає ро межований у просторі та часі каскад реакцій, що ведуть до змії метаболізму ліпідів, їх модифікації безпосередньо у мембрані, м дифікації міжмембранного транспорту ліпідів, що у кінцевому р зультаті призводить до зміни ліпідного складу клітин.

3. Доведено, що механізми компенсації змін мікров’язкості плазмати ної мембрани у порядку реалізації в клітині включають процеси:

• лецитинхолестеринацилтрансферазний (JIXAT-цикл);

• деацилюючий/реацилюючий (D/R-цикл);

• процес десатурації;

• міжмембранного транспорту холестерину;

• авторегуляції синтезу холестерину та регуляції синтезу жирних кислот;

• вибіркової зміни пула ацил-СоА у мікросомах;

• вибіркового використання специфічних жирних кислот з пула ацил-СоА у процесі синтезу фосфоліпідів de novo',

• деградації фосфоліпідів у плазматичній мембрані фосфоліпа-

I ...

зами з накопичення moho-, дигліцеридів та вільних жирних

кислот.

4. Встановлено, що включення компенсаторних механізмів при нормальному (фізіологічному) накопиченні холестерину в клітині спрямовано на підтримку нормальної мікров’язкості ліпідного бішару плазматичної мембрани і не має впливу на функції мембрани та життєздатність клітини.

5. Виявлено, що хронічні надфізіологічні дози холестерину, що викликають зниження мікров’язкості плазматичної мембрани та, відповідно, стимулюють компенсаторні механізми, призводять до накопичення ліпідів (ефіри холестерину, лізофосфатидилхолін, фосфоліпіди з поліненасиченими жирними кислотами, дигліцериди), що утворюють гексагональну Н(ІІ) фазу. Пригнічуються усі досліджувані функції плазматичної мембрани (активний транспорт катіонів та органічних сполук, активність мембранозв’язаних ферментів, рецепція інсуліну) за винятком базального транспорту одно- та двовалентних катіонів. Утворення неламелярних ліпідів веде до деструкції плазматичної мембрани та загибелі клітини.

6. Доведено, що у момент можливого утворення гексагональної Н(ІІ) фа-

зи через накопичення зазначених ліпідів у плазматичній мембрані активується спеціальний механізм протекції, заснований на масованому утворенні N-ацилетаноламінів, інгибуючих ЛХАТ, а також блокуючих накопичення ефірів холестерину та лізофосфатидилхоліну. У клітинах нейробластоми виявлені та ідентифіковані безпосередні попередники N-ацилетаноламінів - N-ацилфосфатидилетаноламіни

та М-ациллізофосфатидилетаноламіни, також ї<Г-пальмітоїл- та Г стеароїлетаноламін, вивчені шляхи їх деградації і біологічна аі тивність.

7. Показано, що через низьку концентрацію попередників 1М-ацилет. ноламінів та їх короткого періоду напівжиття в клітині нейробласт ми тривала протекція мембрани від руйнівного впливу неламелярні ліпідів стає неможливою. Екзогенне введення М-пальмітоїлетано, аміна у дозі 5х10'7-5х10'5 М забезпечує життєздатність клітин не: робластоми при надходженні надфізіологічних доз холестерину 1 високу біологічну активність сперматозоїдів сільськогосподарські тварин при кріоконсервації.

8. При кріоконсервації сперми сільськогосподарських тварин (бара бик) виявлена реалізація ЛХАТ-циклу як механізму компенсаі фазового переходу ліпідного бішару плазматичної мембрани сперм тозоїда при зниженні температури, що веде до накопичення вис о* кількості ефірів холестерину, лізофосфатидилхоліну та в деяких в падках лізофосфатидилетаноламіну. Швидке розморожування ве до руйнування мембрани та загибелі клітин. Використання фіз: логічних доз синтетичних (з риб’ячого жиру) М-ацилетаноламінів середовищі розведення еякуляту збільшує виживання та заплі нюючу здатність сперматозоїдів.

9. На основі біохімічних властивостей І\Г-ацилетаноламінів та досл: жень поведінки ліпідного бішару сперматозоїда при кріоконсерва розроблено препарат з торговою маркою “Кріоліс” як додаток до с редовища розведення еякуляту баранів та биків для збільшен вітальності та запліднюючої здатності. Препарат упроваджено на т риторії України.

10. Показано, що Ы-ацилетаноламши можуть бути ефективним біохім ним інструментом для вивчення процесів, зв’язаних з активніс ЛХАТ, та використовуватися як основа для розробки медичних щ паратів проти захворювань, в основі яких лежить порушення ЛХА цикла.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ АВТОРА

1. Гулая Н.М., Лишко В.К., Волков Г.Л., Говсеева Н.Н. Транспорт Rb+ через активированные натриевые каналы клеток нейробластомы клона N18; Ф1.//Укр.6иохим.журн. - 1983.-55,№6.-С.657-661.

2. Гулая Н.М., Волков Г.Л., Говсеева Н.Н., Артеменко И.П., Латышев Н.А. Изменение липидного состава клеток нейробластомы мыши С 1300 а процессе дифференцировки.//Укр.биохим.журн.-1984.-56,Н6.-С. 677-681.

3. Гулая Н.М., Волков Г.Л., Говсеева Н.Н., Артеменко И.П. Модификация липидного состава клеток нейробластомы С 1300 с помощью липосом.//Укр. биохим.журн,-1986.-58, N1.-C.39-43.

4. Гулая Н.М., Волков Г.Л., Лишка В.К., Говсеева Н.Н.,Клименко Е.П. Зависимость функциональных характеристик быстрых натриевых каналов от липидного состава клеток нейробластомы С 1300,//Укр. биохим.журн.-1986,-58,N1.-C. 44-48.

5. Волков Г.Л., Говсеева Н.Н., Гулая Н.М., Артеменко И.П. Трансмембранный перенос липидов между клетками нейробластомы С 1300 и лецитин-холестериновых липосом.//Биол. MeM6paHbi.-1986.-3,N2.-C. 185-190.

6. Гулая Н.М., Волков Г.Л., Говсеева Н.Н., Артеменко И.П. Трансмембранный транспорт липидов между лецитиновыми липосомами и клетками нейробластомы С 1300 Ш8.//Укр.биохим.журн.-1987.-59, N3.-C 64-69.

7. Гула Н.М., Волков Г.Л., Говсєєва Н.М., Клименко К.П., Артеменко I.II. Вплив вератрину на ліпідний склад клітин нейробластоми С 1300.// Доповіді АН УРСР.-1987.-Ы10.-С.67-69.

8. Гулая Н.М., Васьковский В.Е., Высоцкий М.В., Волков Г.Л., Говсеева Н.Н.., Артеменко И.П. Обнаружение N-ацилэтаноламиновых фосфолипидов ei клетках нейробластомы С1300.//Укр.биохим.журн.-1988.-60,Ы5.-С.58-63.

9. Gulaya N.M., Volkov G.L., Govseeva N.N. Changes of plasma membrane? protein function in differentiated neuroblastoma С 1300 cells with modified! lipid structure.//14th Int.Congr.Biochem. Prague. 1988.-Ph:589, P211.

0. Гулая H.M., Войчук H.H., Говсеева H.H., Волков Г.Л., Аврова Н.Ф., Наливає-ва Р.П., Тюрина А.И. Морфологическая дифференцировка и изменение’ состава липидов клеток нейробластомы С 1300 под влиянием ганглиози-дов.//Укр. биохим.журн.-1989.-61,Ш.-С. 72-79.

1. Клімашевський В.М., Волков Г.Л., Говсеева Н.М., Гула Н.М. Вміст зв'язаних з білками жирних кислот і холестерину в клітинах нейробластоми С 1300 N18 в процесі диференціювання.// Укр. биохим. журн.-1989.-61,НЗ.-С. 80-84.

2. Gulaya N.M., Volkov G.L., Klimashevsky V.M., Govseeva N.N., Melnik A.A. Changes of lipid composition of neuroblastoma С 1300 N18 cells during; differentiation.//Neuroscience.- 1989.-30, N1,- P.153-164.

3. Мельник A.A., Говсеева H.H., Волков Г.Л., Гулая Н.М. Влияние миристо-ил-, пальмитоил-, стеароил-этаноламинов на проницаемость мембраны клеток нейробластомы С 1300 N18 для одновалентных катионов.//Доклады АН’ УССР,- 1989.-N5.-C72-74.

4. Gulaya N.M., Volkov G.L., Baikov D.I., Melnik A.A., Artemenko I.P., Govseeva. N.N. The physiological role of N-acylphosphatidylethanolamine and N-acyl-ethanolamine - the lipids newly found in neurobla-stoma С 1300 cell.//19 th Meeting FEBS. Roma.-1989.-P.382.

5. Волков Г.Л., Гулая H.M., Климашевский B.M., Васьковский В.Е., Ива-ненко Ф,В. Эффективный криоконсервант для семени баранов.//Конференция по развитию овцеводства. Ставрополь. 1989.-II.- С.156-157.

16. Климашевский В.М., Волков ГЛ., Гаврилюк Е.С., Гулая Н.М., Говсеева Н.Н. Изменение молекулярного состава жирных кислот липидов, гидрофобно и ковалентно связанных с белками клеток нейробластомы С 1300 N18 с измененным содержанием холестерина.//Доклады АН yCCP.-1989.-N9.-C. 60-63.

17. Волков Г.Л. Быстрое одновременное выделение микросом и плазматических мембран клеток нейробластомы С 1300 Ш8.//Укр. биохим. журн-1989.-61, №5.-С.71-87.

18. Волков Г.Л., Гула Н.М., Говсеева Н.М., Артеменко І.П., Передерей О.Ф., Хо-мутовський О.Ф. Взаємодія клітин нейробластоми С 1300 N18 та міжмем-бранний обмін ліпідів.//Укр.биохим.журн.-1989.-61,№6.-С.69-75.

19. Волков ГЛ. Изучение межмембранного обмена липидов между клетками нейробластомы С 1300 N18 и липосомами с помощью метода двойной изотопной метки.// У кр.биохим.журн,-1989.-61,№6.-С.76- 80.

20. Gulaya N.M.,Volkov G.L.,Govseeva N.N. Distinct level of cholesterol in

differentiated neuroblastoma С 1300 cell.//4th Symp.Anal Steroids, Hungary.1990.-P. 213. .

21. Gulaya N.M., Volkov Gl., Kiimashevsky V.M., Govseeva N.N., Artemenko I.P., Gavriliuk E.S. Modification of lipid composition of neuroblastoma С 1300 N18 cells with liposomes alters the cholesterol content.//Neuroscience.- 1990.34, N3.- P.785-792.

22. Мельник AA, Валков Д.И., Волков Г.Л., Говсеева H.H., Гулая Н.М. Парадоксальный эффект N-пальмитоилэтаноламина на транспорт катионов через биологические мембраны.//Нейрохимия.-1990.-9,№4.-С. 479-482.

23. Волков Г.Л., Худякова Н.А., Говсеева НД., Гулая Н.М. Холестерин-зависимые компенсаторные реакции в липидном бислое живой клетки мышиной нейробластомы.//Докл. АН УССР.-1990.-№4.-С.63-66.

24. Волков Г.Л. Транспорт катионов и органических соединений в клетке нейробластомы С 1300 с различным содержанием холестерина в плазматической мембране.//Нейрохимия.-1991.-10,№1.-С.48-5 6.

25. Волков Г.Л. Физические свойства плазматической мембраны культивируемой клетки нейробластомы С 1300 с измененным липидным составом./ /Нейрохимия.-1991.- 10,№2.-С.151-158.

26. Гула Н.М., Мельник О.О., Висоцький М.В., Балков Д.І., Волков Г.Л., Говсеева Н.М. Розподіл [1-иС]-пальмітоїлетаноламіну та його метаболітів у субклітинних фракціях нейробластоми С 1300 N18.// Укр.биохимжурн,-1991.-63,№2.-С.115-119.

27. Гулая Н.М., Волков Г.Л.,Высоцкий М.В.,Мельничук ДА.,Иваненко Ф.В. Способ криоконсервации спермы//Авт. свидет. СССР № 1690736, Бюллетень “Открытия и изобретения”, 1991, С.30-33.

28. Gulaya N.M., Melnik АЛ., Baikov D.I., Volkov G.L., Vysotskiy M.V., Vaskovsky V.E. The effect of long-chain N-acylethanolamines on some membrane-associated functions of neuroblastoma С 1300 N18 cells.//Biochim. biophys. Acta.-1093.-1152.-P. 280-288.

олков Г.Л. Роль холестерин-зависимых регуляторных механизмов в структурно-'t ункционапьной организации биологических мембран.

,иссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по споцн-пьности 0J.00.04 - Биохимия

нститут биохимии им. акад. А.В. Паппадина НАН Украины, Киев, 1996. ащищается 40 научных работ и / авторское свидетельство, которые содержат еоретические исследования динамики липидного бислоя биологических мембран зависимости от их физического состояния, а также результаты зксперименталь-ых исследований. Установлено, что изменения физических параметров биологи-еских мембран включает ряд последовательных ферментативных и транспорт-ых процессов, направленность которых приводит к образованию альтернативных юлекулярных форм липидов. Эти липиды нормализуют, как физическое состоя-че мебраны, так и ее биологические свойства. На основе практических данных азработан новый биологически активный криопротектор для замораживания по-овых клеток сельскохозяйственных животных и осуществлено его успешное недрение.

пючевые слова/ биологические мембраны, липиды, фосфолипиды, холестерин, '-ацилфосфатидилетаноламины, криопротекция.

olkov G.L. The role of cholesterol-depended regulative mechanisms in the structural-mctional organization of biological membranes.

issertation for the finding of the scientific degree of the Doctor of Science yeciafizedm 03.00.04. - Boichemistry.

.V. Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv,

tere are defend 40 scientific labors and 1 national patent which include theoretical ecision of the dynamic of biological membranes lipid bilayer m dependence of physi-tl conditions and results of scientific investigations, ft was found that changes of physi-tl conditions of biological membranes stimulated the complex of enzyme and transport rocesses produced alternative molecular forms of lipids. These lipids should carry rough the physical conditions and biological activity of membrane to norma! status, ew cryoprotector with biological activity for freezing of sexual cells of agricultural limais was developed and successfully embedded on the base of investigations. ay words; biological membranes, Hpids, phospholipids, cholesterol, N-acyl-fiosphatidylethanolamines, cryoprotection.

996.