Сиалидазная активность и морфологические изменения опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения

Прошин, Сергей Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сиалидазная активность и морфологические изменения опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Сиалидазная активность и морфологические изменения опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения"

На правах рукописи

ПРОШИН

Сергей Николаевич

ИАЛИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК НЕЙРАЛЬНОГО И МЫШЕЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология 03.00.13 - физиология

Санкт-Петербург 2009

0034624'^

003462432

Работа выполнена во ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационн медицины им. А.М.Никифорова» МЧС России

Научный консультант доктор медицинских наук профессор Петр Дмитриевич ШАБАНОВ

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук Дмитрий Эдуардович КОРЖЕВСКИЙ

доктор медицинских наук Ирина Алексеевна ОДИНЦОВА доктор медицинских наук профессор Сергей Викторович ЧЕПУР

Ведущее учреяздение

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова

Защита состоится " " марта 2009 г. в 13.00 часов на заседании совета по защит докторских и кандидатских диссертаций Д 001.022.02 при ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

Автореферат разослан "_" февраля 2009 г.

Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук

Павел Андреевич ДЫБАН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изменение морфологических свойств клетки в ответ на воздействие внешних и/или внутренних факторов характеризует её состояние. В связи с этим необходимо исследование механизмов, регулирующих эти изменения. Возможность клеточного ответа на определённый стимул - будь то трофический фактор (синтез факторов роста или дифференцировки) или физико-химическое воздействие, -обеспечивается комплексным взаимодействием сопряжённых молекулярных систем, которые расположены как на мембранах, так и в ядре клетки. Плазматическая мембрана является динамичной структурой со сложной организацией. Гликосфинголипиды и ферменты, модулирующие их, способны образовывать надмолекулярные системы плазматической мембраны, которые особенно насыщены ганглиозидами. Ганглиозиды. являясь неотъемлемой составной частью плазматической мембраны любой эукариотической клетки, подвергаются гидролизу ферментом сиалидазой, элиминирующим молекулы сиаловой кислоты из их структуры. Изменение количества молекул сиаловой кислоты приводит к качественным изменениям ганглиозидов, что активирует или тормозит ряд протеинкиназ. Протеинкиназы, в свою очередь, осуществляют фосфорилирование ряда белков, что стимулирует или снижает транскрипцию определённых генов. Несмотря на значительные достижения в исследовании клеточного генома, нет полной ясности о том, как реализуют своё действие уникальные гены в клетках эукариот.

К настоящему времени уже не вызывает сомнения, что сиалидазы играют важную роль в изменении морфологических свойств клеток. Показано, что накопление сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в области окончания одного из отростков способствует его росту (Rodriguez et а!., 2001). Ассиметричное перераспределение сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ) локально повышает активность тирозинкиназы А, которая, в свою очередь, стимулирует активность фосфатидил-инозитол-3-киназы (ФИ-З-К) и следующую за этим деполимеризацию актина в отростке и его развитие в виде аксона (Da Silva et al., 2005). Матричная рибонуклеиновая кислота, с которой происходит трансляция фермента сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной, выявляется в коре головного мозга, мозжечке и гиппокампе у мышей. Экспериментально вызванная с помощью трансфекции высокая активность данного типа сиалидазы инициировала феномен дифференцировки в клеточных линиях нейрального происхождения. При этом дифференцировка клеток сопровождалась морфологическими изменениями, что регистрировалось как образование отростков (Hasegawa et al., 2000). При аксонотомии регенерация аксонов происходила в тех нейронах, в которых выявлялась высокая активность/'

САПМ. В нейронах с низкой активностью САПМ аксонотомия, как правило, не сопровождалась восстановлением аксонов, что было показано на клеточной культуре нейральных клеток, полученных из гиппокампа крыс (Rodriguez et al., 2001). Предполагается, что данный эффект сиалидазы сопровождается изменением в плазматической мембране содержания высших ганглиозидов и накоплением содержания ганглиозидов с одной молекулой сиаловой кислоты (Kato et al., 2006).

Нарушение экспрессии сиалидаз имеет значение для развития патофизиологических процессов в организме. При сиалидозах, например, болезни Тэя-Сакса происходит нарушение деградации олигосахаридов и их избыточное накопление в лизосомах. Такие характеристики опухолевых клеток, как способность к метастазированию и инвазивность, непосредственно связаны с состоянием плазматической мембраны клетки, в состав которой входят соединения, содержащие молекулы сиаповых кислот, включая гликосфинголипиды. При этом изменение активности сиалидаз может существенно влиять на злокачественность опухолевых клеток не только вследствие изменения состава гликосфинголипидов, но, главным образом, влияния на активность определённых типов тирозинкиназ, которые могут инициировать перестройку цитоскелета. Как известно, функциональное состояние клеточного цитоскелета оказывает влияние на подвижность и инвазивность опухолевых клеток. Повышенная экспрессия сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии карциномы почки RCC приводила к истощению моносиалоганглиозида GM3 и делала опухолевые клетки карциномы менее чувствительными к факторам, индуцирующим апоптоз (Ueno et al., 2006). Снижение концентрации GM3 также приводило к повышению подвижности опухолевых клеток. Метастатический потенциал опухолевых клеток меланомы В16 мыши также существенно зависит от моносиалоганглиозида GM3 (Kato et al., 2001). Высокая экспрессия сиалидазы сопровождает процесс дифференцировки клеток мышечной ткани. Значительное повышение уровня матричной рибонуклеиновой кислоты для гена сиалидазы регистрировалось в крысиных миобластах уже на 3-й сут после индукции дифференцировки. В то же время, миогенная дифференцировка могла быть блокирована при экспозиции крысиных миобластов к антисенс-олигодезоксирибонуклеиновой кислоте, комплиментарной ДНК, кодирующей с и ал ид аз у (Sato and Miyagi, 1996).

Анализ данных литературы показывает недостаточную изученность взаимосвязи морфологических изменений опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения с их сиалидазной активностью.

Вследствие этого целью настоящей работы явилась оценка морфологических и функциональных изменений опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения и определение взаимосвязи этих изменений с сиалидазной активностью опухолевых клеток.

В задачи исследования входило:

1. Получить клоны клеток с высоким и низким метастатическим потенциалом, используя модель перевиваемой органотропной рабдомиосаркомы РА-23 крыс;

2. Провести сравнительную характеристику активности лизосомальной сиалидазы в контрастных по метастатическому потенциалу клонах;

3. Провести сравнительную характеристику активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в контрастных по метастатическому потенциалу клонах;

4. Охарактеризовать структуру ядер в клетках клонов с высоким и низким метастатическим потенциалом, в том числе в клетках клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс при воздействии химиотерапевтических агентов;

5. Определить уровень матричной РНК гена сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека в ответ на воздействие веществ, способствующих клеточной дифференцировке;

6. Оценить эффект высокой активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной на морфологическую дифференцировку клеток линии NB-1 нейробластомы человека в том числе при воздействии веществ, способствующих клеточной дифференцировке;

7. Оценить активность ацетилхолинэстеразы как маркера нейральной дифференцировки в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека на фоне, вызванном трансфекцией, высокой активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной.

Научная новизна. Впервые в мире обосновано использование показателей сиалидазной активности для оценки морфологических изменений опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения. Выявлена отрицательная взаимосвязь между повышенной активностью лизосомальной сиалидазы и метастатическим потенциалом. На основе гетерогенности клонов перевиваемых опухолевых клеток in vivo показано, что существует положительная взаимосвязь между метастатическими характеристиками опухолевых клеток и изменением структуры ядер опухолевых клеток в виде интерфазных мостов. Установлено, что высокая активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной сопровождает морфологическую дифференцировку нейральных клеток in vitro. При этом доказано, что циклический аденозинмонофосфат индуцирует морфологическую дифференцировку и повышенную активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной. Работа имеет приоритетное значение для изучения молекулярных механизмов регенерации нервной ткани и поиска фармакологических веществ антибластомной направленности.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Клоны перевиваемой рабдомиосаркомы РА-23 крыс с высоким и низким метастатическим потенциалом отличаются по активности

лизосомальной сиалидазы и по частоте клеток со структурными изменениями ядер в форме интерфазных мостов, этот эффект модулируется цитостатиком циклофосфаном.

2. Циклический аденозинмонофосфат повышает уровень матричной РНК гена сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной но не влияет на уровень матричной РНК гена лизосомальной скал ид азы.

3. Повышенная активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной сопровождает морфологическую дифференцировку опухолевых клеток нейального происхождения, этот эффект усиливается циклическим аденизомонофосфатом.

4. Повышенная активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, связана с биохимическими маркерами дифференцировки нейральных клеток (ацетилхолинэстераза). Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая

значимость полученных результатов заключается в доказательстве значения двух типов сиалидаз (ассоциированной с плазматической мембраной и лизосомальной) в морфологических изменениях опухолевых клеток нейрального (образование отростков) и мышечного происхождения (изменение структуры ядер в форме интерфазных мостов). Высокая активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной вызывает глубокие морфофункциональные перестройки нейральных клеток, выражающиеся в их морфологической и биохимической дифференцировке. Циклический аденозинмонофосфат повышает активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, но не лизосомальной сиалидазы, что, по-видимому, связано с активацией разных молекулярных сигналов (сигнальных систем) в нейральных клетках. Кроме того, получены данные, указывающие на то, что различные типы сиалидазной активности имеют разное значение в формировании метастатических характеристик злокачественных клеток мышечного происхождения.

Практическая значимость работы состоит в том, что предложен и апробирован оригинальный способ выявления активности разных типов сиалидаз, который может быть использован в экспериментальных и клинических исследованиях для оценки влияния различных стимулов на клеточную дифференцировку. Комплексный подход в оценке молекулярных и морфологических изменений, которые сопровождаются высокой сиалидазной активностью, может быть использован для тестирования пептидных, синаптотропных, метаботропных, гормональных и антибластомных фармакологических средств.

Реализация результатов работы. Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедр нормальной физиологии и фармакологии Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова, кафедры нервных болезней и психиатрии и кафедры специализированной терапии Института медицинского образования Новгородского государственного университета имени Ярослава Мудрого. Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Всероссийского

центра экстренной и радиационной медицины им. А.М.Никифорова МЧС России. Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований при РАН (РФФИ №04-04-49672).

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертационной работы доложены на 18-м международном конгрессе генетиков (Пекин, 1998), 17-м международном конгрессе по исследованию рака (Рио-де-Жанейро, 1998), 14-й объединённой встрече европейского и американского нейрохимических обществ (Вёрлиц, Берлин, 1999)^ 11-м международном конгрессе по гистохимии и иммуноцитохимии (Йорк, Великобритания, 2000), 23-й конференции по исследованию полисахаридов (Токио, Япония, 2002), 27-й конференции по гликолипидам (Бостон, США, 2007), 3-м съезд фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 10 журнальных статей, один патент на изобретение и 5 тезисов. Работы опубликованы в материалах международных конференций и в журналах: «Доклады Академии наук», «Вопросы онкологии», «Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии», «Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях», «Neurochemical Research», «Генетика», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», «Glycobiology», «Медицинский Академический Журнал».

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы из 446 источников, среди которых 411 на иностранном языке. Диссертация изложена на 236 страницах, содержит 7 таблиц, 61 рисунок.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Клеточная линия NB-1 нейробластомы человека (нейральная клеточная линия) выращивалась и поддерживалась в РПМИ-1640 (45%) и среде Игла (45%), содержащей 10%-ю эмбриональную телячью сыворотку на чашках Петри (диаметр 10 см), покрытых поли-Л-лизином (рис. 1). В эксперименте клеточная линия инкубировалась в течение 24 и 48 ч без эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением или без дб-цАМФ (2 мМ) и по окончании инкубации клетки собирались для биохимического анализа.

Для определения длины отростков нейральных клеток линии NB-1 нейробластомы человека измерение производили от начала отростка и до его окончания. Не менее 600 клеток на предмет исследования длины отростков были выбраны для анализа в поле фазово-контрастного микроскопа. Нейральные клетки с отростками были подразделены на 4 группы: 1) клетки с ультракороткими отростками (до 12 мкм); 2) клетки с короткими отростками (длина отростка 12-24 мкм); 3) клетки с отростками средней длины (длина отростка 25-36 мкм); 4) клети с длинными отростками (длина отростка более 36 мкм).

Высевание клеток NB-1 нейробластомы человека в чашки, покрытые поли-л-лизином _

24 ч

Трансфекция

(^m^J С^) (сап^

Истощение питательной среды"

24 ч

дб-цАМФ

(^m^j С^У^ (c^Mj (сапм|

24 ч

Исследование морфологии

Измерение уровня мРНК

Оценка биохимических маркеров

Рис. 1. Схема эксперимента по трансфекции вектором с геном САПМ клеток NB-1 нейробластомы человека. САПМ - вектор с геном сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной; ПВ - "пустой вектор"; дб-цАМФ - дибутирил-цАМФ.

Для трансфекции гена, кодирующего сиалидазу ассоциированную с плазматической мембраной (САПМ) была сконструирована плазмида рСЕР-hmSD посредством вставки открытой рамки считывания (1.200 п.н.) гена САПМ (Neu 3) в плазмиду рСЕР (Invitrogen). Биохимическая активность полученной конструкции была проанализирована на клеточной линии COS-1. Трансфекция клеточных линий была проведена с использованием набора

фирмы "BenderMedsystems" согласно рекомендации производителя: после инкубирования в течение суток клеточная линия NB-1 была обработана в течение 16 ч добавлением в среду деферриоксамина. По окончании инкубации клетки были подвергнуты трансфекции 5 мкг ДНК (pCEP-hmSD или рСЕР, для экспериментальной и контрольной клеточных культур, соответственно). Затем клетки были проинкубированы в течение 24 ч в среде с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (10%) и в зависимости от целей эксперимента проинкубированы в течение 24 ч в отсутствии эмбриональной телячьей сыворотки.

Для клонирования в условиях in vivo рабдомиосаркомы РА-23 крыс, которая была отселектирована в лаборатории генетики клеточных популяций Института цитологии РАН из высокодифференцированной рабдомиосаркомы крыс, индуцированной 20-метилхолантреном, путём массового отбора клеток натропность к легочной ткани (Степаньян, Бахтин, 1980), опухолевую ткань очищали от некротизированных участков, промывали в среде 199 с добавлением антибиотиков (пенициллин, стрептомицин) в стандартных концентрациях и измельчали с помощью ножниц в стерильном флаконе. Полученную взвесь фильтровали через стерильную нейлоновую ткань, осаждали клетки из суспензии с помощью центрифугирования (1000 об/мин, 10 мин). Осадок опухолевых клеток разводили в среде 199, концентрацию жизнеспособных клеток определяли с помощью камеры Горяева. Для получения легочных экспериментальных метастазов (клонов) рабдомиосаркомы приготовленные суспензии вводили в хвостовую вену крыс в объёме 0.2 мл. Животным прививали по 60 тыс. клеток. Через 20-25 сут после в/в прививки клеток рабдомиосаркомы РА-23 животных выводили из эксперимента, предварительно усыпив эфиром, вычленяли лёгкие и отпрепаровывали клоны размером 3-5 мм в диаметре.

Определение активности лизосомальной сиалидазы в клетках клонов рабдомиосаркомы РА-23 проводили по следующей схеме: опухолевые клоны (п=10) гомогенизировали в калий фосфатном буфере (10 мМ) при +4°С: 0.25 М сахароза, 1 мМ ЕДТА. Фенилметилсульфонилфлюорид в концентрации 0.2 мМ был добавлен непосредственно перед гомогенизацией. Гомогенат цетрифугировали при 3.000 об/мин в течение 10 мин. Далее супернатант отделяли (фракция I) и 1 мл полученной фракции I пипетировали и центрифугировали в течение часа при 40 т. об/мин при +4СС. Супернатант отбрасывали, а полученный осадок (фракция И) дополнительно пипетировали в небольшом объёме (220 мкл) в буфере для гомогенизации. Активность лизосомальной сиалидазы определяли против 4-метилумбеллиферил-Ы-ацетилнейраминовой кислоты (4-MY-N-AHK) в конечной концентрации 2 мМ. Реакционная смесь, конечный объём которой составлял 200 мкл, также содержала ацетат натрия (рН 4.6 или 5.5). После инкубации при 37°С в течение 1-2 ч реакцию останавливали добавлением 2.5 мл глицинового буфера (0.25 М глицин-NaOH, рН 10.4) и проводили флуорометрическое измерение продукта реакции 4-умбеллиферона (450 нм). Активность выражали в единицах на мг белка - ед./мг белка.

Определение активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной проводили в клетках линии NB-1. После удаления культуральной жидкости из чашек Петри клетки снимали резиновым шпателем, добавляли в чашку охлаждённый фосфатно-солевой буфер (рН 7.0), в который также был добавлен, непосредственно перед использованием, ЭДТА в конечной концентрации 0.5 М и фенилметилсульфонилфлюорид в конечной концентрации 0.2 М. Клеточную взвесь пипетировали и переносили в центрифужные пробирки (Sarsted) объёмом 15 мл. Клетки центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин, после чего удаляли надосадочную жидкость, а клеточный комок подвергали гомогенизации. Концентрацию белка определяли по Брэдфорду. Активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, определяли против смеси ганглиозидов (конечная конц. 0.5 мг /мл). Общий объём реакционной смеси составлял 100 мкл и состоял из следующих компонентов: Тритон Х-100 (0,1%), бычий сывороточный альбумин (1 мг/мл) и 0.025 М ацетат натрия (рН 4.6) и образца, содержащего фермент (50 мкл включительно). После инкубации при 37°С (при умеренном встряхивании) в пробирки добавляли 50 мкл метапериодата натрия (0.6%), энергично перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. После инкубации с метапериодатом натрия в пробирки добавляли арсенит натрия объёмом 0.5 мл (10%). Далее добавляли 1.5 мл ТБК, энергично перемешивали и немедленно переносили в кипящую воду на 15 мин, после чего немедленно охлаждали в воде, добавляли циклогексан объёмом 1.5 мл, энергично перемешивали с помощью встряхивателя и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. По окончании центрифугирования отбирали верхнюю фазу (70 мкл) и измеряли при длине волны 549 нм (Hitachi). Расчёт активности фермента производили по методу предложенному ранее (Hasegawa et al., 2001). Активность выражали в единицах на мг белка -ед./мг белка.

Для получения комплементарной ДНК (кДНК) образцы выравнивали, чтобы получить концентрацию РНК 5 мкг в 11 мкл воды высокой степени очистки, к каждой пробе добавляли I мкл олиго-Т праймера. Образцы инкубировались при следующих температурных и временных параметрах амплификатора до внесения обратной транскриптазы (Superscript II RT): 70°С в течение 10 мин, 3°С в течение 5 мин. Непосредственно перед повышением температуры до 42°С в пробирки вносили по 7 мкл буфера для обратной транскриптазы, включающий также смесь нуклеотидов (10 мМ) и 0.1 М дитиотрейтол, и 1 мкл обратной транскриптазы. Далее инкубацию образцов проводили при 42°С в течение 50 мин. По завершении инкубации образцов при 70°С в течение 15 мин в пробирки добавляли 0.2 мкл РНКазы Н (из расчёта 60 U/мкл) и продолжали инкубацию при 37°С в течение 20 мин. Реакцию останавливали, добавляя 480 мкл воды. Условия ПЦР в течение 45 циклов: 94°С - 1 мин, 60°С - 1 мин, 72СС - 2 мин. 72°С - 10 мин. Прямой праймер: 5'-GACAGAGGGATTACCTACCGGATC-3', нуклеотиды 55-78 от стартового кодона; обратный праймер: 5'-

САСССАТСАТТСТСАСССТОТТ-З', нуклеотиды 966-987.0бразцы нормализовали по уровню экспрессии |3-актина.

Для проведения вертикального электрофореза белков в полиакриламидном геле ("ВюгасГ) использовались следующие параметры: напряжение 70- 140 В, сила тока мА, мощность 1 - 2 Вт и время проведения - 90 мин. Для проведения полусухого переноса разделённых белков из геля на мембрану (НуЬопс1-С) приготавливали многослойную систему, состоящую из геля, двух слоев фильтровальной бумаги хроматографического класса и мембраны. При этом использовались следующие параметры: напряжение - 10 ~ 15 В; сила тока - 2 А. Перенос осуществляли в течение 1 ч. После переноса мембрану аккуратно освобождали и отмывали в ТБС-Т -буфере (10 мМ Трис-НС!, 100 мМ №С1, 0.1% Твин-20, рН 7.4) в течение 10 мин. Детекцию сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, проводили с использованием мышиных антител в разведении 1:10. Затем мембрану инкубировали со вторыми козьими антителами (направленными против первых мышиных антител), конъюгированными со щелочной фосфатазой. Разведение вторых антител составляло 1:5000. Параллельно ставили изотипический контроль. Для визуализации использовали следующие растворы: буфер для щелочной фосфатазы состоял из следующих компонентов (0.1 М Трис-НС1, 0.1 М ЫаС1, 5 мМ Р^СЬ, рН 9.5). Раствор для окрашивания приготавливался в следующем формате: буфер для щелочной фосфатазы - 2 мл; нитросиний тетразолий - 8 мкл; 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат - 6 мкл. После последней отмывки в ТБС-буфере мембрану размещали на гладкой поверхности, покрытой полиэтиленом, и наносили раствор для окрашивания. Образец инкубировали в течение 1 мин, после чего немедленно помещали в раствор (20 мМ Трис-НС1. 5мМ ЭДТА, рН 7.5) для остановки реакции на 5 мин. Далее мембрану отмывали в бидистиллированной воде, высушивали и анализировали молекулярную массу разделённых белков. Для флюоресцентного анализа нейральные клетки клетки N6-1 нейробластомы человека, выращенные в стерильных микроскопических камерах, отмывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, рН 7.4), препараты высушивали и фиксировали в 4%-м параформальдегиде в течение 5 мин при комнатной температуре. Отмывали в ФСБ (Зх по 5 мин) и проводили (строго в течение 2 мин) дополнительную фиксацию в 0.2%-м Тритоне Х-100, приготовленном на ФСБ. Далее препараты отмывали в ФСБ (Зх по 5 мин) и не высушивая, а только удалив избыток влаги фильтровальной бумагой наносили первые антитела -, моноклональные мышиные антитела (1:100), направленные против сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной. Препараты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной камере. По окончании инкубации препараты отмывали в ФСБ (Зх по 5 мин) и, удалив избыток влаги фильтровальной бумагой, наносили вторые козьи (Р(аЬ)'2) антитела, конъюгированные с ФИТЦ (флуоресцеинизотиоционат). Со вторыми антителами препараты инкубировали в течение 30 мин при комнатной

температуре в разведении 1:300. Отмывали в ФСБ (Зх по 5 мин) и, удалив избыток влаги, наносили пропидий иодида на 1 мин, после чего ещё раз отмывали, наносили раствор, препятствующий быстрому выгоранию флюорохромов, и накрывали покровным стеклом. Исследование проводили с использованием фильтров для анализа ФИТЦ (520 нм). В каждом препарате подсчитывали не менее 300 клеток.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Морфофункциональные изменения клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс при воздействии противоопухолевых

средств.

3.1.1. Метастатический потенциал клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс при воздействии противоопухолевых

средств.

Результаты опытов с рабдомиосаркомой РА-23 представленные на рис. 2-5 показывают, что введение циклофосфана оказывало значительный тормозящий эффект, выражавшийся в снижении всех показателей метастазирования. При этом среднее число метастазов у животных 2-й группы, получавших циклофосфан, снижалось по сравнению с контролем более чем в 30 раз. При анализе нарушений морфологии ядер в опухолевых клетках отмечено, что циклофосфан, вызывал нарушения в ядрах клеток рабдомиосаркомы РА-23, выражавшиеся, прежде всего, в увеличении частоты клеток с микроядрами и "хвостатыми" ядрами (рис. 6 -8).

Рис. 2. Число крыс с метастазами клонов рабдомиосаркомы РА-23 при введении циклофосфана (группа II). Группа I - контроль (изотонический раствор хлористого натрия). В каждой группе по 10 голов. По вертикали -число крыс.

Рис. 3. Количество метастазов клонов рабдомиосаркомы РА-23 при введение циклофосфана (группа II). Группа I - контроль( изотонический раствор хлористого натрия). В каждой группе по 10 голов (Ы - количество крыс с метастазами). По вертикали -количество метастазов.

Рис. 4. Среднее число метастазов клонов рабдомиосаркомы РА-23 на крысу при введении циклофосфана (группа II). Группа 1-контроль (изотонический раствор хлористого натрия). В каждой группе по 10 голов (К1 - количество крыс с метастазами). По вертикали - среднее число метастазов. Различие достоверно относительно группы 1 при р<0.05.

35.4 ±3.7

Рис. 5. Среднее масса метастаза (мг) клонов рабдомиосаркомы РА-23 при введении циклофосфана (группа II). Группа I - контроль (изотонический раствор хлористого натрия). В каждой группе по 10 голов ^ - количество крыс с метастазами). По вертикали - средняя масса метастаза. *Различие достоверно относительно группы I и II при р<0.05.

9 П

7.8± 0.54

(N=5000)

(N=2500)

Рис. 6. Частота клеток с микроядрами в клетках клонов метастазов рабдомиосаркомы РА-23 крыс при введении циклофосфана (группа II). Группа I - контроль (изотонический раствор хлористого натрия), ^количество проанализированных клеток. По вертикали - процент клеток с микроядрами. ^Различие достоверно относительно группы I при р<0.05.

0.15

0.20 ■

0.2±0.1

0.15

0.10

0.05

0.00

(N=5000) (N=2500)

Рис. 7. Частота клеток с интерфазными мостами в клетках клонов метастазов рабдомиосаркомы РА-23 крыс при введении циклофосфана (группа П). Группа I - контроль (изотонический раствор хлористого натрия). Ы=количество проанализированных клеток. По вертикали - процент клеток с интерфазными мостами.

I п

(N-5000) (N=2500)

Рис. 8. Частота клеток с «хвостатыми» ядрами в клетках клонов метастазов рабдомиосаркомы РА-23 крыс при введении циклофосфана (группа И). Группа I - контроль (изотонический раствор хлористого натрия), ^'-количество проанализированных клеток. По вертикали - процент клеток с «хвостатыми» ядрами. *Различие достоверно относительно группы 1 при р<0.05.

Анализируя результаты, можно отметить, что при дозировке 50 мг/кг циклофосфан тормозил образование и рост метастазов. Полученные данные подтверждают результаты предыдущих экспериментов, показавших противоопухолевые свойства циклофосфана, и позволяют предположить, что данный препарат оказывает генотоксическое действие как на первичные опухоли, так и на их метастазы.

3.1.2. Сиалидазная активность в клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс, контрастных по метастатическому

потенциалу.

В виду изменений способности к метастазированию (метастатического потенциала) клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 представлялось важным также ответить на вопрос: сопровождается ли изменение метастатического потенциала изменением биохимических характеристик опухолевых клеток. Лизосомальная сиалидаза и сиалидаза, ассоциированная с плазматической мембраной, являются ферментами, участвующими в гидролизе олигосахаридов и гликосфинголипидов (ганглиозидов), соответственно, модулируя состав гликопротеинов и гликосфинголипидов клеточной мембраны, и изменяя, таким образом, способность опухолевых клеток к метастазированию и инвазии. В связи с этим на активность лизосомальной сиалидазы и сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ), были проанализированы опухолевые клоны, контрастные по способности к метастазированию. На предмет выявления сиалидазной активности были протестированы три клона из контрольной выборки и три клона, извлечённых из лёгких животных, подвергшихся обработке цитостатиком циклофосфаном. Как видно из табл. 1, активность лизосомальной сиалидазы в клонах с низким метастатическим потенциалом варьировала в грубой фракции (фракция 1) от 0.903 до 1.297 ед. на мг белка и в среднем составляла 1.100±0.284 ед. на мг белка. Активность лизосомальной сиалидазы в клонах с высокой способностью к метастазированию в грубой фракции (фракция 1) варьировала от 0.602 до 0.950 ед. на мг белка и в среднем составила 0.818±0.271 ед. на мг белка, что достоверно не отличалось от среднего показателя, выявленного во фракции I, полученной из клонов с низким метастатическим потенциалом (р>0.05). Дальнейшее исследование обогащенной фракции (фракция II), выделенной из клонов с высоким метастатическим потенциалом, выявило, что средний показатель активности лизосомальной сиалидазы составил 1.48±0.12 ед. на мг белка, тогда как активность лизосомальной сиалидазы, зарегистрированная во фракции II, выделенной из клонов с высоким метастатическим потенциалом, в среднем составляла 2.70±0.29 ед. на мг белка, что значимо отличалось от среднего показателя (фракция II) среди клонов с пониженной способностью

Таблица 1

Активность лизосомальной сиалидазы в клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 с высоким и низким метастатическим потенциалом__

Клоны Активность лизосомальной сиалидазы (в единицах на мг белка)

фракция I фракция II

! 8 х 5 г о 1| 1 О I = 2 0 1 0.602 1.38

02 0.905 1.49

РЗ 0.950 1.57

Средние значения 0 818=0.271 1.48±0.12

С низким метастатическим потенциалом С 1 0.903 2.81

С 2 1.297 2.44

СЗ 1.101 2.86

Средние значения 1.Ю0±0.284 2.70±0.29"

*Различие достоверно относительно среднего показателя

для клонов с высоким и низким метастатическим потенциалом при р<0,01.

к метастазированию (р<0.01). Следует отметить, что активность лизосомальной сиалидазы в мышечной ткани как у крыс, не подвергшихся воздействию цитостатиков, так и у крыс, которые подверглись воздействию циклофосфана, в среднем, не превышала 0.983±0.142 и 0.979+0.197 ед. на мг белка, соответственно.

Поскольку были выявлены различия по активности лизосомальной сиалидазы в контрастных по способности к метастазированию (метастатическому потенциалу) клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 (табл. 1), мы протестировали эти же клоны на предмет активности сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ). Результаты показывают (табл. 2), что в клонах с повышенной способностью к метастазированию (высоким метастатическим потенциалом) и в клонах с пониженной способностью к метастазированию активность САПМ различалась и среди выборки клонов 01, Э2 и ЭЗ была выше (1.040±0.187 ед. на мг белка) по сравнению со средним показателем, зарегистрированным для выборки клонов С1, С2 и СЗ (0.930±0.167 ед. на мг белка). Несмотря на тенденцию к повышению активности САПМ среди клонов 01, 02 и БЗ следует отметить, что достоверных различий между исследованными показателями активности

Таблица 2

Активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ), в клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 с высоким и низким метастатическим потенциалом

Клоны Активность САПМ (в единицах на мг белка)

С высоким метастатическим потенциалом э I 0.96

О 2 1.32

РЗ 0.84

Средние значения 1.040±0.187

С низким метастатическим потенциалом С 1 1.04

С 2 0.91

СЗ 0.84

Средние значения 0.930*0.167

САПМ выявить не удалось (р>0.05). Активность САПМ в мышечной ткани как у крыс, которые не подвергались воздействию цитостатиков, так и у крыс, которые подверглись воздействию циклофосфана, составила 0.901±0.282 и 0.911±0.165 ед. на мг белка, соответственно.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что генотоксические факторы приводят к существенному снижению способности опухолевых клеток к метастазированию (метастатическому потенциалу). Пониженная способность к метастазированию ассоциирована с изменением морфологических (повышение частоты опухолевых клеток с нарушением морфологии ядер) и биохимических (повышенная лизосомальная активность) характеристик опухолевых клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс.

3.2. Функциональные изменения клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23, связанные с отбором на повышение и понижение частоты опухолевых клеток с нарушением структуры ядер.

3.2.1. Отбор опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс на повышение и понижение частоты опухолевых клеток с нарушением

структуры ядер.

Для того чтобы исключить воздействие циклофосфана на сиалидазную активность был проведён эксперимент для получения клонов

рабдомиосаркомы РА-23 крыс с высоким и низким метастатическим потенциалом без воздействия каких-либо генотоксических факторов. Для этой цели клоны опухолевых клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс были подвергнуты отбору на понижение и повышение частоты встречаемости клеток с такими нарушениями морфологии ядер как интерфазные мосты (ЧКИМ). На повышение и понижение частоты встречаемости клеток с интерфазными мостами было проведено пять циклов отбора. Средняя частота клеток с интерфазными мостами в исходной выборке клонов

Рис. 9. Исходная выборка клонов (N=44, Хер® 1.0%) легочных метастазов (п=количество клонов) рабдомиосаркомы РА-23 крыс

составила 1.0%, а размах изменчивости от 0.0 до 2.4% (рис. 9). При этом доля клонов исходной выборки, в которой ЧКИМ была зарегистрирована на уровне менее 1-го процента составила 79%. К пятому циклу отбора на повышение ЧКИМ не удалось зарегистрировать ни один опухолевый клон, в котором частота интерфазных мостов составляла бы менее 1%. При этом средняя ЧКИМ в выборке 5-го цикла отбора составила 8.8% (рис. 10). Таким образом, частота клеток с интерфазными мостами в полученных популяциях клеток рабдомиосаркомы повысилась с 1.0 до 8.8%, т.е. в 8.8 раза. Различия между выборками исходных клонов и подвергнутых отбору на повышенную ЧКИМ были достоверны при Р<0.001 (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Отбор клонов рабдомиосаркомы РА-23 на понижение спонтанной частоты встречаемости в них клеток с мостами проводился одновре.менно и параллельно с отбором клонов РА-23 на повышение ЧКИМ. Из исходной популяции (рис. 9) отбирали 1 клон с минимальным показателем частоты

I - ЧКИМ от 2.0 до 2.9%

¡>-ЧКИМ от 3.0 до 5.9%

□ - ЧКИМ от

6.0 до 8.9%

□ - ЧКИМ от

9.0 до 19.0%

Рис. 10. Выборка клонов ("N=16, ^=8.8%) легочных метастазов (п=количество клонов) рабдомиосаркомы РА-23 крыс, полученная после 5-го (терминального) этапа отбора на повышение частоты клеток с интерфазными мостами (ЧКИМ).

Я - ЧКИМ от 0.0 до 0.9%

Ш - ЧКИМ от 1.0 до 2.0%

Рис. 1 1. Выборка клонов (N=48, Хср=0.5 %) легочных метастазов (п=количество клонов) рабдомиосаркомы РА-23 крыс, полученная после 5-го этапа отбора на понижение частоты клеток с интерфазными мостами (ЧКИМ).

интерфазных мостов, т.е. ЧКИМ в котором регистрировалась на уровне 0.0%. К пятому циклу отбора на понижение частоты клеток с интерфазными мостами средняя ЧКИМ в выборке из 48 клонов составила 0.5%. При этом более 94% клонов имели частоту мостов, не превышающую 0.9% (рис. 11). Таким образом, были проведены 5 циклов отбора популяций клеток рабдомиосаркомы на понижение частоты клеток с интерфазными мостами. Частота встречаемости клеток с интерфазными мостами в популяциях клеток рабдомиосаркомы снизилась с 1.0 до 0.5%, т.е. в два раза. Достоверность различий на каждом цикле отбора составила Р<0.001 по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.

3.2.2. Метастатический потенциал опухолевых клонов, контрастных по частоте клеток с нарушениями структуры ядер.

После проведения 5-ти циклов отбора на повышение и отбора на понижение ЧКИМ клеточные популяции РА-23 были специально протестированы на метастатический потенциал (табл. 3). Видно, что популяции клеток с повышенной ЧКИМ имели достоверно меньший метастатический потенциал, чем популяции клеток с пониженной ЧКИМ (Р<0.05, п=5). При этом, различия по величине метастатического потенциала между линиями с высокой и низкой ЧКИМ были более, чем пятикратными.

Среднее значение метастатического потенциала клеточной популяции с повышенной ЧКИМ в субштамме РА-23 составило 28.б±7.5, а значение метастатического потенциала клеточной популяции этого субштамма с пониженной ЧКИМ составило 107.1±23.9.

Таблица 3

Метастатический потенциал клеток клонов РА-23 после 5-ти циклов отбора

на повышение и 5-ти циклов отбора на снижение частоты встречаемости ___клеток с интерфазными мостами._

Характеристика клонов Средняя ЧКИМ, % Число сформировавшихся метастазов на крысу

Клоны после отбора на понижение частоты клеток с интерфазными мостами (А 1 - А 5) 0.5 107.1±23.9 »(N=15)

Клоны после отбора на повышение частоты клеток с интерфазными мостами (В 1 - В 5) 18.5 28.6±7.5 (N=15)

* Примечание: N - количество животных в каждой группе

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о снижении метастатического потенциала в ходе отбора клонов РА-23 на повышение частоты встречаемости в них клеток с интерфазными мостами.

3.2.3.Активность лизосомальной сиалидазы в клетках опухолевых клонов, различающихся по нарушениям структуры ядер.

Таким образом, полученные данные показывают, что клоны с повышенной и пониженной способностью к метастазированию различаются между собой по ряду морфофункциональных характеристик. При этом следует подчеркнуть, что контрастные по метастатическому

Таблица 4

Активность лизосомальной сиалидазы в клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 с высоким и низким метастатическим __потенциалом_

Клоны Активность лизосомальной сиалидазы (в единицах на мг белка)

фракция 1 фракция II

А 1 0 802 1.42

5 А2 1.000 1.50

о и АЗ 0.350 1.40

Й § « 8 Ь 5 ■¿из А 4 0.001 1.16

2 5 ё О 5 В А 5 0.620 1.80

Средние значения 0.555*0.183 1.46±0.10

В 1 1.330 2.95

2 В 2 0.850 2.60

о - = 1 ВЗ 0.700 1.84

г £ ^ г С 5 В 4 0.790 2.47

~ о Р и г г В 5 1.800 3.71

Средние значения 1,094±0.304 2.71±0.31 *

* Различие достоверно относительно среднего показателя фракции II для клонов с высоким метастатическим потенциалом при Р<0,01.

потенциалу клоны не подвергались каким-либо генотоксическим воздействиям. В связи с этим представлялось важным оценить активность различных типов сиалидаз в клонах с повышенной и пониженной способностью к метастазированию. Как показывают результаты (табл. 4) определения активности сиалидазы в грубой лизосомальной фракции (фракция I) более выраженная активность фермента была зарегистрирована в клонах с низким метастатическим потенциалом (1,094±0.304). В грубой лизосомальной фракции полученной из клонов с высоким показателем метастазирования активность сиалидазы была ниже, однако, достоверных различий между исследованными выборками клонов рабдомиосаркомы РА-23 выявить не удалось (Р>0.05). Как показывает проведённое исследование, более 60% активности сиалидазы было зарегистрировано во фракции П (как для выборки клонов с низким, так и для выборки клонов с высоким метастатическим потенциалом), полученной в результате ультрацентрифугирования и, следовательно, являющейся обогащенной лизосомами фракцией. При этом было выявлено, что активность лизосомальной сиалидазы была существенно (Р<0.01) ниже в клонах, характеризующихся высоким метастатическим потенциалом по сравнению с активностью фермента в клонах с низким метастатическим потенциалом, 1.46±0.10 и 2.71±0.31, соответственно. По-видимому, повышенное содержание молекул сиаловой кислоты на гликопротеинах клеточной мембраны способствует повышенному метастазированию опухолевых клеток, тогда как высокая активность лизосомальной сиалидазы может приводить к повышенному метаболизму сиалоконъюгатов в лизосомах клетки, снижая метастатический потенциал злокачественных опухолей.

3.2.4. Активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической

мембраной, в клетках опухолевых клонов, различающихся по нарушениям структуры ядер.

Наряду с определением активности лизосомальной сиалидазы представлялось важным исследовать активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, в клонах с высоким и низким метастатическим потенциалом. Как следует из табл. 5, активность САПМ в клонах с высоким метастатическим потенциалом варьировала от 0.42 до 1.24 ед./мг белка и в среднем по выборке составила 0.876±0.167 ед./мг белка. В выборке клонов с низким метастатическим потенциалом наименьшая активность СА{1М в клоне В2 составила 0.63 ед./мг белка, а самая высокая — 1.51 едУмг'белка (клон В5). При этом среднее значение составило 0.986±0.162 ед./мг белка, что не отличалось достоверно от среднего значения активности САПМ для выборки клонов с высоким метастатическим потенциалом (р>0.05).

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что наблюдается тенденция в повышении активности сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, в выборке клонов с высоким

метастатическим потенциалом, однако, достоверных различий при данных экспериментальных условиях не удалось зарегистрировать.

Таблица 5

Активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ), в клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 с _ высоким и низким метастатическим потенциалом

_ Клоны Активность САПМ (в единицах на мг белка)

А 1 1.20

3 ' ° А2 0.63

§ 5 | АЗ 0.84

3 ? г а А 4 0.75

и I н § А 5 1.51

Средине значения 0.986±0.162

В 1 1.24

В 2 1.06

ВЗ 0.42

2 § 2 | В 4 0.53

= Ь % ё и 3 5- о В 5 1.13

Средине значения 0.876±0.167

3.3. Морфофункциональные изменения нейральных клеток линии N8-1

нейробластомы человека. 3.3.1. Морфологические маркеры дифференцировкн клеток линии N6-1 нейробластомы человека при повышенной экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной Морфологическая дифференцировка нейральных клеток характеризуется образованием отростков. Поэтому был выбран этот маркер дифференцировкн нейральных клеток N6-1 нейробластомы человека в ответ на трансфекцию вектором с геном САПМ и/или воздействие дибутирил цАМФ (дб-цАМФ). Поскольку в эмбриональной телячьей сыворотке (ЭТС) содержатся самые разнообразные ростовые факторы, в том числе и те, которые влияют на образование и рост отростков опухолевых клеточных линий нейрального происхождения, то представлялось целесообразным придерживаться экспериментальных условий, чтобы исключить влияние подобных факторов в эксперименте: нейральные клетки инкубировались в истощённой среде без эмбриональной телячьей сыворотки.

Рис. 12. Длина отростков в нейральных клетках линии NB-1 нейробластомы человека: без трансфекции (а) и после трансфекции (б) вектором, содержащим вставку гена САПМ. Среда без ЭТС (1 сут). Классы клеток по длине развиваемых отростков: I - <12 мкм; II - 12-24 мкм; III - 25-36 мкм; IV - >36 мкм. По оси ординат - %. *р<0.001

50 45

35 30 25 20 15 10 5

I II III IV

Рис. 12,в. Длина отростков в нейральных клетках линии NB-1 нейробластомы человека. После трансфекции вектором, не содержащим вставку гена САПМ. Среда без ЭТС (1 сут). Классы клеток по длине развиваемых отростков: I - <12 мкм; II - 12-24 мкм; III - 25-36 мкм; IV ->36 мкм. По оси ординат - %. р<0.001.

Так, в культуре, которая не подверглась трансфекции (истощение по ЭТС в течение 1 сут), частота клеток с длиной отростков более 36 мкм не превышала 0.9±0.3% (рис. 12,а), тогда как в культуре, подвергшейся трансфекции вектором, содержащем САПМ, частота клеток, которые развили отростки более 36 мкм превысила 7% (7.4±0.4%) (рис. 12,6). Это значимо отличалось как от контроля (р<0,001), так и от клеток, которые были генетически модифицированы "пустым" вектором (1.0±0.2%, р<0.001) (рис. 12,в). Обработка клеток дб-цАМФ (среда без ЭТС) на фоне экспрессии САПМ вызывала ещё более значимое удлинение отростков. Так, в культуре клеток NB—1 нейробластомы человека, подвергшихся трансфекции вектором, содержащим вставку гена САПМ, частота клеток с длиной отростков более 24 мкм превысила 26% (рис. 13,6), что значимо отличалось от показателей (рис. 13,а и 13,в), выявленных для клеток контрольных культур (р<0.001). Интересно отметить, что в культуре, которая была подвергнута трансфекции геном САПМ, но не обработана дб-цАМФ (рис. 12,6) частота клеток с длиной отростков более 36 мкм (7.4±0.4%, класс IV) была даже выше, чем частота клеток как подвергнутых трансфекции, так и обработанных дб-цАМФ (3.5±0.3%) (рис. 13,6). По-видимому, "сольное" воздействие САПМ способно индуцировать в отдельной популяции

I II III IV

Рис. 13. Длина отростков в нейральных клетках линии NB-1 •нейробластомы человека: без трансфекции (а) после трансфекции (б) вектором, содержащим вставку гена САПМ. Среда без ЭТС, дб-цАМФ (2 мМ) (1 сут). Классы клеток по длине развиваемых отростков: I - <12 мкм; II - 12-24 мкм; III -25-36 мкм; IV - >36 мкм. По оси ординат - %. *р<0.001.

то ео

20 10

Рис. 13,в. Длина отростков в нейральных клетках линии N13-1 нейробластомы человека. После трансфекции вектором, не содержащим вставку гена САПМ. Среда без ЭТС, дб-цАМФ (2 мМ) (1 сут). Классы клеток по длине развиваемых отростков: I - <12 мкм; II - 12-24 мкм; III -25-36 мкм; IV - >36 мкм. По оси ординат - %. *р<0.001.

нейральных клеток более выраженное образование отростков. Вместе с тем частота клеток с длиной отростков более 24 мкм была значимо выше в культуре как подвергнутой трансфекции, так и обработанной дб-цАМФ (27%) (р<0.001), что указывает на синэргичный эффект дб-цАМФ на фоне повышенной экспрессии сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной.

Таким образом, высокая активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной вызывает морфологическую дифференцировку в опухолевых клетках нейрального происхождения.

3.3.2. Анализ активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии N8-1 нейробластомы человека.

Активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ), была осуществлена при тех же экспериментальных состояниях, что и анализ морфологии клеток ИВ-1 нейробластомы человека, т.е. на 2-е сут после трансфекции, 1-е сут после истощения среды по ЭТС (см. материалы и методы). Как следует из рис. 14, активность САПМ в контрольной клеточной линии \'В-1 (1) составила 4.2±1.6 ед./мг белка, а в

Рис. 14. Нейральная клеточная линия NB-1 нейробластомы человека: I -контроль без обработки дб-цАМФ; II - контроль с обработкой дб-цАМФ; III - трансфекция вектором, не содержащем ген САПМ; без обработки дб-цАМФ; IV - трансфекция вектором, не содержащем ген САПМ; обработка дб-цАМФ; V - трансфекция вектором, содержащем ген САПМ; без обработки дб-цАМФ; VI - трансфекция вектором, содержащем ген САПМ; обработка дб-цАМФ. Активность САПМ выражена в ед./мг белка. По оси ординат - активность САПМ (ед./мг белка). *р<0.001, **р<0.05 (см. пояснение в тексте).

клетках, обработанных дб-цАМФ (II) - 10.1±3.1 ед./мг белка, что, однако, не позволило выявить достоверных отличий по активности САПМ в исследуемых клеточных культурах. Активность САПМ в клетках, подвергнутых трансфекции вектором, содержащим ген анализируемого фермента (V), составила не менее 35 ед./мг белка, что достоверно отличалось от контрольных клеток, не подвергавшихся трансфекции (I и II) и подвергнутых трансфекции "пустым" вектором (III и IV) (р<0.001). Активность САПМ в клетках, подвергнутых трансфекции исследуемым геном и обработанных дб-цАМФ составила не менее 50 ед./мг белка (VI). Анализируемая сиалидазная активность значимо отличалась не только от активности зарегистрированной в контрольных клетках (р<0.001), но и от

сиалидазной активности, выявленной для клеток, подвергнутых трансфекшш с САПМ, но не обработанных дб-цАМФ (р<0.05).

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что активность САПМ и цАМФ-сопряжённых факторов может быть взаимно усилена.

3.3.3. Активность ацетилхолннэстеразы в клеточной линии N6-1 нейробластомы человека при воздействии факторов дифференцировки.

Ацетилхолинэстераза (АЭ) является функциональным маркером дифференцировки нейральных клеток, поэтому представлялось важным оценить влияние повышенной экспрессии сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, на активность ацетилхолннэстеразы в клеточной линии N¿-1 нейробластомы человека. Активность АЭ оценивалась в тех же культуральных условиях, что и оценка активности САПМ и морфологических маркеров дифференцировки. Чтобы исключить влияние вектора на индукцию в активности АЭ бьша осуществлена также трансфекция клеток вектором, не содержащим ген САПМ. В виду того, что до истощения (1 сут после трансфекции) культуральной среды по ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка) не были зарегистрированы достоверные различия между исследованными клеточными культурами приводятся данные по активности ацетилхолннэстеразы через 1 сут после истощения среды по ЭТС (2 сут после трансфекции). Как показывают результаты (рис. 15), наиболее высокая активность ацетилхолннэстеразы была зарегистрирована в клеточной культуре, которая не подвергалась трансфекции, но была обработана дб-цАМФ (136±3.2%). При этом активность АЭ в данной клеточной культуре значимо отличалась при р<0.001 не только от контроля (I), но и от клеточных культур (V и VI), подвергшихся трансфекции вектором, несущим ген САПМ

(р<0.001). Однако ацетилхолинэстеразная активность не отличалась достоверно между клеточной популяцией, которая не подвергалась трансфекции и была обработана дб-цАМФ (II), и клеточной популяцией, которая подвергалась трансфекции вектором с отсутствующим геном САПМ и обработанной дб-цАМФ (IV). Клеточные линии (V, VI), подвергшиеся трансфекции вектором, содержащим ген САПМ, также показали высокую активность ацетилхолинэстеразы (119±2.8 и 116.3±2.7%, соответственно), которая достоверно отличалась от контрольного показателя (р<0.001). Как следует из рис. 15, в клеточной линии, подвергшейся трансфекции вектором с геном САПМ, с последующей обработкой дб-цАМФ была зарегистрирована некоторая тенденция к снижению активности АЭ (VI). По-видимому, данный эффект можно объяснить активацией разнообразных молекулярных факторов, которые в некоторых случаях могут иметь по отношению друг к другу неспецифический тормозящий эффект. В связи с этим интересно отметить, что в клетках, которые были подвергнуты трансфекции вектором, не содержащим ген САПМ, и обработанные

160 140

120

100 ео во

40 20 О

Рис. 15. Нейральная клеточная линия N13-1: I - контроль без обработки дб-цАМФ; II - контроль с обработкой дб-цАМФ; III - трансфекция вектором, не содержащем ген САПМ; без обработки дб-цАМФ; IV - трансфекция вектором, не содержащем ген САПМ; обработка дб-цАМФ; V -трансфекция вектором, содержащем ген САПМ; без обработки дб-цАМФ; VI - трансфекция вектором, содержащем ген САПМ; обработка дб-цАМФ. Активность ацетилхолинэстеразы выражена в процентах от контроля. По оси ординат-%. *р<0.001, **р<0.05 (см. пояснение в тексте).

дб-цАМФ также регистрировалась высокая активность АЭ достоверно отличавшаяся от активности АЭ как в клетках, подвергнутых только трансфекции вектором с САПМ (V), так и в клетках и подвергнутых трансфекции вектором с САМП, и обработанных дб-цАМФ (VI).

Результаты проведённого исследования указывают, что высокая активность САПМ приводит к выраженной активности такого функционального маркера дифференцировки нейральных клеток как ацетилхолинэстераза. Более значимое повышение в активности АЭ в клетках без повышенной экспрессии САПМ, но обработанных дб-цАМФ, можно объяснить активацией нескольких цАМФ-сопряжённых молекулярных факторов, которые усиливают действие друг друга.

3.3.4. Активность лизосомальной сиалидазы в клеточной линии N5-1 нейробластомы человека.

В связи с полученными результатами при исследовании активности сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной,

Таблица б

Активность лизосомальной сиалидазы в клеточной линии ЫВ-1

Клетки при различных экспериментальных условиях*. Активность фермента в ед./мг белка.

Контрольная клеточная культура 0.884±0.139

Контрольная клеточная культура, с последующей обработкой д-цАМФ 1.114±0.215

Клетки, подвергнутые трансфекции "пустым вектором" 1.45Ш.370

Клетки, подвергнутые трансфекции "пустым" вектором, с последующей обработкой дб-цАМФ 0.935±0.421

Клетки, подвергнутые трансфекции вектором, содержащим ген САПМ 1.510±0.353

Клетки, подвергнутые трансфекции вектором, содержащим ген САПМ, с последующей обработкой дб-цАМФ 1.640±0.491

*См. материалы и методы. Средние представлены результатом трёх экспериментов.

представляло несомненный интерес изучить активность лизосомальной сиалидазы (ЛС) в клеточной линии N8-1 нейробластомы человека при различных экспериментальных условиях, включая обработку клеток синтетическим аналогом циклического аденозинмонофосфата. Результаты, представленные в табл. 6, показывают, что в нейрональных клетках ЫВ-1 выявляется спонтанная активность лизосомальной сиалидазы, которая в контрольной клеточной культуре составляет 0.884±0.139 ед./мг белка. В клетках, подвергшихся трансфекции, активность ЛС варьировала и была зарегистрирована на уровне 0.935±0.421 ед./мг белка для клеток после трансфекции "пустым" вектором с последующей обработкой д-цАМФ и максимальной для клеток, модифицированных вектором с САПМ и

обработанных дб-цАМФ, в которых ЛС активность составила 1.640±0.491 ед./мг белка. Вместе с тем следует отметить, что при анализе средних показателей активности ЛС в исследованных клеточных культурах достоверных различий не было зарегистрировано.

3.4. Анализ молекулярно-генетических маркеров экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии 1\В-1 нейробластомы человека. 3.4.1. Верификация продукта транскрипции гена сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клетках N13-1

нейробластомы человека. Исследование количества матричной РНК, экспрессируемого геном САПК, было проведено в клеточных культурах при условиях согласно стандартному протоколу (см. материалы и методы). При этом исследование количества матричной РНК в культурах, подвергшихся трансфекции вектором, содержащим ген САПМ, не проводилось. Количество мРНК (рис. 16), измеренное в контрольной клеточной культуре, подвергшейся

500 450

400

350

300

250 200 150

100

50 0

I II III IV

Рис. 16. Количество матричной РНК (% от контроля), выявленной в нейральных клетках NB-1 нейробластомы человека, культивировавшихся при разных экспериментальных условиях (среда без ЭТС): I - контроль; И -контрольные клетки, обработанные дб-цАМФ; III - клетки, подвергшиеся трансфекции вектором, не содержащим ген САПМ; IV - клетки, подвергшиеся трансфекции, вектором, не содержащим ген САПМ. Обработаны дб-цАМФ. По оси ординат - %. *р<0.001 (см. пояснение в тексте).

обработке дб-цАМФ, превысило контрольное значение (клетки, не подвергавшиеся трансфекдии и обработке дб-цАМФ) более чем в 4 раза (р<0.001). Измерение количества мРНК в клеточной культуре, подвергшейся трансфекдии "пустым" вектором, выявило тенденцию в повышении уровня мРНК гена САПМ, однако, различия по сравнению с контролем оказались недостоверны, что позволяет говорить об отсутствии неспецифической индукции "пустым" вектором в повышении транскрипционной активности гена, кодирующего мРНК для САПМ.

3.4.2. Иммуноцитохимическая верификация клеток N8-1,

положительных по экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной.

Исследование методом иммуноцитохимического анализа показало, что в клеточных линиях N13-1 нейробластомы человека, не модифицированных трансфекцией для получения клеток с повышенной экспрессии гена САПМ, представляется затруднительным локализовать антиген, даже при использовании усиления сигнала с помощью иммуноцитохимических систем визуализации. По-видимому, это связано с тем, что САПМ - это фермент, который в количественном отношении незначительно представлен в клетке и не образует скоплений в клеточной мембране. В связи с этим представляет несомненный интерес возможность локализовать САПМ: находится ли фермент предпочтительно в теле нейральной клетки или её отростках. Результаты иммуноцитохимического анализа показали, что клетки ЫВ-1 нейробластомы человека после трансфекции вектором, содержащим ген САПМ, значимо экспрессируют фермент, который выявляется с помощью моноклональных антител. При этом флюоресцентный сигнал выявляется не только в теле нейральной клетки, но и её отростке. По-видимому, синтезируясь и созревая в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме фермент, в дальнейшем, поступает из тела нейральной клетки в её отросток.

ВЫВОДЫ

1. Клоны клеток перевиваемой рабдомиосаркомы РА-23 крыс с высоким метастатическим потенциалом характеризуются низкой активностью лизосомальной сиалидазы, тогда как клоны клеток с низким метастатическим потенциалом характеризуются высокой активностью лизосомальной сиалидазы, что свидетельствует о важности этого фермента для метастазирования опухолевых клеток мышечного происхождения.

2. Клоны клеток перевиваемой рабдомиосаркомы РА-23 крыс с высоким и низким метастатическим потенциалом характеризуются, соответственно, более выраженными и менее выраженными изменениями структуры ядер в форме интерфазных мостов.

3. Морфологическая дифференцировка нейральной клеточной линии NB-] нейробластомы человека сопровождается высокой активностью сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной, что свидетельствует о супрессивном значении этого фермента для опухолей нейрального происхождения.

4. Циклический аденозинмонофосфат повышает количество матричной РНК гена сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной и её активность в нейральной клеточной линии NB-1 нейробластомы человека, что свидетельствует о зависимости этих изменений от цАМФ-сопряжённой сигнальной системы.

5. Циклический аденозинмонофосфат не вызывает повышения количества матричной РНК гена лизосомальной сиалидазы и её активности в клетках NB-1 нейробластомы человека, что указывает на отличные от цАМФ-сопряжённой сигнальной системы механизмы геномной и протеомной регуляции этого фермента в нейральных клетках.

6. В нейральных клетках NB-1 нейробластомы человека с высокой активностью сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной регистрируется достоверное повышение активности ацетилхолинэстеразы, что доказывает возможность использования сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, как функционального маркера дифференцировки опухолевых клеток нейрального происхождения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рекомендуется использование перевиваемой рабдомиосаркомы РА-23 крыс в качестве экспериментальной модели для тестирования противоопухолевых препаратов. При этом предлагается измерять активность лизосомальной сиалидазы, как маркера снижения метастатического потенциала опухолевых клеток.

2. Предлагается регистрировать активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной при тестировании антибластомных средств, разрабатываемых для супрессии опухолей нейрального происхождения.

3. В экспериментах по регенерации аксонов необходимо учитывать значения активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной как прогностического маркера.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Кравцов В.Ю., Прошин С.Н., Федорцева Р.Ф., Треус в!в., Никифоров A.M., Яковлев А.Ф., Каминская E.B., Бахтин Ю.Б. Частота клеток с полумостами в клеточных популяциях in vivo // Доклады Академии Наук. -1996. - Т.350. - N.6. - С.831-833.

2. Vakhtin Yu.B., Kaminskaya E.V., Kravtsov V.Yu., Proshin S.N., Fedorova E.V., Yakovlev A.F. Genomic stability of tumour cells of rat rhabdomyosarcoma with different levels of tumorogenicity. In: 'Molecular determinants of cancer

metastasis' // 50th Annual Symposium on Fundamental Cancer Research / Houston, Texas, USA. - 1997. - P.122.

3. Кравцов В.Ю., Прошин C.H., Яковлев А.Ф., Каминская Е.В., Бахтин Ю.Б. Мосты и многополюсные митозы в популяциях клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс // Б юл. Эксп. Биол. Мед.- 1997.- T.123.-N.5.-C.569-572.

4. Proshin S, Kaminskaya Е, Vakhtin Yu, Kravtsov V, Yakovlev A. Cells with "trailed nuclei" as markers of the breakages of the chromosome bridges // XVIII Internafional Congress of Genetics / Beijing, China. - 1998. - P.32.

5. Kaminskaya E.V., Vakhtin Yu.B., Fedorova E.V., Kravtsov V.Yu., Proshin

5.N., Yakovlev A.F. Mutagenecity and tumorigenecity in cells of lung metastases of rat rhabdomyosarcomas // 17th International Cancer Congress / Rio de Janeiro -Brazil. - 1998,-P.216.

6. Прошин C.H., Кравцов В.Ю., Ольнев М.Г., Яковлев А.Ф., Бахтин Ю.Б. Хромосомные мосты и "хвостатые" ядра в популяциях злокачественных клеток // Генетика. - 1998. - Т.34. - №.1. - С.61-64.

7. Патент на изобретение N 2111249 от 20 мая 1998 года. Способ селекции популяций клеток in vivo. Прошин С.Н., Кравцов В.Ю., Яковлев А.Ф., Федорцева Р.Ф., Бычкова Н.В., Бахтин Ю.Б., Никифоров A.M. 8.3абежинский М.А., Коваленко А.Л., Кветной И.М., Южаков В.В., Попучиев В.В., Бахтин Ю.Б., Каминская Е.В., Прошин С.Н., Попович И.Г., Зарипова Е.А., Анисимов В.Н. Влияние циклоферона на метастазирование карциномы лёгких Льюис у мышей и рабдомиосаркомы РА-23 у крыс // Вопросы онкологии. - 1999. - Т.45. - N.6. - С.650-654.

9. Proshin S., Yamaguchi К., Wada Т., Miyagi Т. Modulation of neuritogenesis by ganglioside-specific sialidase in human neuroblastoma NB-1 cells // The 23rd Japanese Carbohydrate Research Meeting / Yokohama, Japan. 2002. - P.237.

10.Proshin S., Yamaguchi K., Wada Т.. Miyagi T. Modulation of neuritogenesis by ganglioside-specific sialidase (Neu 3) in human neuroblastoma NB-1 cells // Neurochemical Research. - 2002. - Vol.27. - N7/8. - P.841-846.

11.Прошин C.H. Физиологические эффекты сиалидаз в формировании пластичности нервной ткани // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Том.7. - N.1. - С. 1414-1418.

12.Прошин С.Н. Физиологическая роль ганглиозидов и сиалидаз при воздействии факторов ионизирующей радиации // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. - 2007. - N. 2. - С.28-32.

13.Proshin S.N. Sialidase activity and metastatic characteristics of tumor cell clones in vivo of rat rhabdomyosarcoma RA-23 // J. Glycobiology. - 2007. -Vol.17. -N.l 1. — P.1228.

М.Прошин C.H., Каминская E.B., Лебедев A.A., Кравцов В.Ю., Шабанов П.Д. Активность лизосомальной сиалидазы в опухолевых клетках клонов рабдомиосаркомы РА-23 / III Съезд Фармакологов России: спец. вып. (сентябрь). С. 1909 // Психофармакология и биологическая наркология. -2007.-Т.7.-4.2.-2084 с.

15.Прошин С.Н., Каминская Е.В., Лебедев A.A., Шабанов П.Д. Опухолевые клетки клонов рабдомиосаркомы РА-23 с высоким и низким метастатическим потенциалом отличаются по активности лизосомальной сиалидазы // Бюл. Эксп. Биол. Мед.-2008.-Том. 145.-N.3.-С.330-333.

16.Прошин С.Н., Каминская Е.В., Лебедев A.A., Байрамов A.A., Яковлев А.Ф., Шабанов П.Д. Метастатический потенциал и сиалидазная активность клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА - 23 крыс // Мед. Акад. Жур. - 2008. - Том.2. - С.26-29.

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Прошин, Сергей Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Протеомные и геномные факторы в морфологических изменениях опухолевых клеток.

1.1.1. Нарушение эпигенетического контроля и опухолевый рост.

1.1.2. Морфологические изменения нейральных клеток при воздействии факторов дифференцировки.

1.2. Значение сиалидаз и ганглиозидов в морфологических изменениях опухолевых клеток.

1.2.1. Сиалидазная активность в структурных изменениях клеточного ядра.

1.2.2. Значение ганглиозидов для морфологических изменений клеток.

1.2.3. Значение сиалидаз и ганглиозидов в морфофункциональной пластичности нейральных клеток.

1.3. Ферменты, участвующие в метаболизме ганглиозидов.

1.3.1. Методические особенности исследования активности ферментов, регулирующих состав ганглиозидов.

1.3.2. Метаболизм ганглиозидов.

1.3.3. Субстратная специфичность разных типов сиалидаз.

1.3.4. Липидные микродомены и сиалидаза ассоциированная с плазматической мембраной.

1.4. Циклический аденозинмонофосфат как фактор дифференцировки нейральных клеток.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Перевиваемые клеточные линии in vivo.

2.2. Поддержание клонов перевиваемой in vivo рабдомиосаркомы РА-23 крыс.

2.3. Клеточные культуры и генетическая трансфекция.

2.4. Анализ активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной.

2.5. Анализ активности лизосомальной сиалидазы.

2.6. Анализ активности ацетилхолинэстеразы.

2.7. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ-электрофорез).

2.8. Количественная полимеразная цепная реакция.

2.9. Иммуноцитохимический анализ.

2.10.Импрегнация клеток нитратом серебра.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Морфофункциональные изменения клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс при воздействии противоопухолевых факторов.

3.1.1. Метастатический потенциал клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс при воздействии противоопухолевых факторов.

3.1.2. Сиалидазная активность в клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс, контрастных по метастатическому потенциалу.

3.2.1. Отбор опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс на повышение и понижение частоты опухолевых клеток с нарушением структуры ядер.

3.2.2. Метастатический потенциал опухолевых клонов, контрастных по частоте клеток с нарушениями структуры ядер.123'

3.2.4. Активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клетках опухолевых клонов, различающихся по нарушениям структуры ядер.

3.3. Морфофункциональные изменения нейральных клеток линии NB-1 нейробластомы человека.

3.3.1. Морфологические маркеры дифференцировки клеток линии NB-1 нейробластомы человека при повышенной экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной.

3.3.2. Анализ активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии

NB-1 нейробластомы человека.

3.3.3. Активность ацетилхолинэстеразы в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека при воздействии факторов дифференцировки.

3.3.4. Активность лизосомальной сиалидазы в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека.

3.4. Анализ молекулярно-генетических маркеров экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека.

3.4.1. Верификация продукта транскрипции гена сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клетках NB—1.

3.4.2. Иммуноцитохимическая верификация клеток NB-1, положительных по экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной.

3.4.3. Верификация методом протеомного анализа антигена, соответствующего сиалидазе ассоциированной с плазматической мембраной.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сиалидазная активность и морфологические изменения опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения"

Актуальность проблемы.

Изменение морфологических свойств клетки в ответ на воздействие внешних и/или внутренних факторов характеризует её состояние. В связи с этим необходимо исследование механизмов; регулирующих эти изменения. Возможность клеточного- ответа на определённый стимул — будь то трофический фактор (синтез факторов роста, или дифференцировки) или физико-химическое воздействие, — обеспечивается- комплексным взаимодействием сопряжённых молекулярных систем, которые расположены как на мембранах, так и в ядре клетки. Плазматическая мембрана является динамичной структурой со сложной организацией. Гликосфинголипиды и ферменты, модулирующие их, способны образовывать надмолекулярные системы плазматической» мембраны, которые особенно насыщены ганглиозидами. Ганглиозиды, являясь неотъемлемой составной частью плазматической мембраны любой эукариотической клетки, подвергаются* гидролизу ферментом сиалидазой, элиминирующим молекулы сиаловой кислоты из их структуры. Изменение количества молекул сиаловой кислоты, приводит к качественным изменениям ганглиозидов, что активирует или тормозит ряд протеинкиназ. Протеинкиназы, в свою очередь, осуществляют фосфорилирование ряда белков; что стимулирует или снижает транскрипцию определённых генов. Несмотря на значительные достижения в исследовании клеточного генома, нет полной ясности о том, как реализуют своё действие уникальные гены в клетках эукариот.

К настоящему времени уже не вызывает сомнения, что сиалидазы. играют важную роль в изменении морфологических свойств клеток. Показано, что накопление сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в области окончания одного из отростков способствует его росту (Rodriguez et al., 2001). Ассиметричное перераспределение сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ) локально повышает активность тирозинкиназы А, которая, в свою очередь, стимулирует активность фосфатидил-инозитол-3-киназы (ФИ-З-К) и следующую за этим деполимеризацию актина в отростке и его развитие в виде аксона (Da Silva et al., 2005). Матричная рибонуклеиновая кислота, с которой происходит трансляция фермента сиалидазы- ассоциированной с плазматической мембраной, выявляется в коре головного мозга, мозжечке и гиппокампе у мышей. Экспериментально вызванная- с помощью трансфекции высокая активность данного типа сиалидазы инициировала феномен дифференцировки в клеточных линиях нейрального происхождения. При этом дифференцировка клеток сопровождалась морфологическими изменениями, что регистрировалось как образование отростков (Hasegawa et al., 2000). При аксонотомии регенерация аксонов происходила в тех нейронах, в которых выявлялась высокая* активность САПМ. В нейронах с низкой активностью САПМ аксонотомия, как правило, не сопровождалась восстановлением аксонов, что было показано- на клеточной культуре нейральных клеток, полученных из гиппокампа крыс (Rodriguez et al., 2001). Предполагается, что данный* эффект сиалидазы сопровождается изменением в плазматической мембране содержания высших ганглиозидов и накоплением содержания ганглиозидов с одной молекулой сиаловой кислоты (Kato et al., 2006).

Нарушение экспрессии сиалидаз имеет значение для развития патофизиологических процессов в организме. При сиалидозах, например, болезни Тэя-Сакса происходит нарушение деградации олигосахаридов и их избыточное накопление в лизосомах. Такие характеристики опухолевых клеток, как способность к метастазированию и инвазивность, непосредственно связаны с состоянием плазматической мембраны клетки, в состав которой входят соединения, содержащие молекулы сиаловых кислот, включая гликосфинголипиды. При этом изменение активности сиалидаз может существенно влиять на злокачественность опухолевых клеток не только вследствие изменения состава гликосфинголипидов, но, главным образом, влияния на активность определённых типов тирозинкиназ, которые могут инициировать перестройку цитоскелета. Как известно, функциональное состояние клеточного цитоскелета оказывает влияние на подвижность и инвазивность опухолевых клеток. Повышенная экспрессия сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии карциномы почки RCC приводила к истощению моносиалоганглиозида GM3 и делала опухолевые клетки карциномы менее чувствительными к факторам, индуцирующим апоптоз (Ueno et al., 2006). Снижение концентрации GM3 также приводило к повышению подвижности опухолевых клеток. Метастатический потенциал опухолевых клеток меланомы В16 мыши также существенно зависит от моносиалоганглиозида GM3 (Kato et al., 2001). Высокая экспрессия сиалидазы сопровождает процесс дифференцировки клеток мышечной ткани. Значительное повышение уровня матричной рибонуклеиновой кислоты для гена сиалидазы.регистрировалось в крысиных миобластах уже на 3-й сут после индукции дифференцировки. В то же время; миогенная дифференцировка могла быть блокирована при экспозиции крысиных миобластов к антисенс-олигодезоксирибонуклеиновой кислоте, комплиментарной ДНК, кодирующей сиалидазу (Sato and Miyagi, 1996).

В задачи исследования входило:

4. Охарактеризовать структуру ядер в клетках клонов с высоким и низким метастатическим потенциалом, в том числе в клетках клонов рабдомиосаркомы РА—23 крыс при воздействии химиотерапевтических агентов;

5. Определить уровень матричной РНК гена сиалидазы, ассоциированной? с плазматической мембраной, в клеточной линии NB-1 нейробластомы. человека в ответ на воздействие веществ, способствующих клеточной дифференцировке;

6. Оценить эффект высокой активности сиалидазы ассоциированной, с плазматической мембраной на морфологическую дифференцировку клеток линии NB-1 нейробластомы человека в том числе при воздействии веществ, способствующих клеточной дифференцировке;

Научная новизна.

Впервые в мире обосновано использование показателей сиалидазной активности для оценки морфологических изменений опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения. Выявлена отрицательная взаимосвязь между повышенной активностью лизосомальной сиалидазы и метастатическим потенциалом. На основе гетерогенности клонов перевиваемых опухолевых клеток in vivo показано, что существует положительная взаимосвязь между метастатическими характеристиками опухолевых клеток и изменением структуры ядер опухолевых клеток в виде интерфазных мостов. Установлено, что высокая активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной сопровождает морфологическую дифференцировку нейральных клеток in vitro. При этом доказано, что циклический аденозинмонофосфат индуцирует морфологическую дифференцировку и повышенную активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной. Работа имеет приоритетное значение для изучения молекулярных механизмов регенерации нервной ткани и поиска фармакологических веществ антибластомной направленности.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Клоны перевиваемой рабдомиосаркомы РА—23 крыс с высоким и низким метастатическим потенциалом! отличаются по активности лизосомальной сиалидазы и по частоте клеток со структурными изменениями ядер в форме интерфазных мостов, этот эффект модулируется цитостатиком циклофосфаном.

Теоретическая и, практическая значимость работы. Теоретическая значимость полученных результатов заключается в доказательстве значения двух типов- сиалидаз (ассоциированной с плазматической мембраной и лизосомальной) в морфологических изменениях опухолевых клеток нейрального (образование отростков) и мышечного происхождения (изменение структуры ядер в форме интерфазных мостов). Высокая активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной вызывает глубокие морфофункциональные перестройки нейральных клеток, выражающиеся в их морфологической и биохимической дифференцировке. Циклический аденозинмонофосфат повышает активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, но не лизосомальной сиалидазы, что, по-видимому, связано с активацией разных молекулярных сигналов- (сигнальных систем) в нейральных клетках. Кроме того, полученьъ данные, указывающие на то, что различные- типы сиалидазной. активности имеют разное значение- в формировании метастатических характеристик злокачественных клеток мышечного происхождения.

Практическая, значимость работы состоит в том, что предложен и апробирован оригинальный способ выявления активности разных типов сиалидаз, который может быть использован в экспериментальных и клинических исследованиях для оценки влияния различных стимулов на клеточную дифференцировку. Комплексный подход в оценке молекулярных и морфологических изменений, которые сопровождаются высокой сиалидазной активностью, может быть использован для тестирования пептидных, синаптотропных, метаботропных, гормональных и антибластомных фармакологических средств.

Реализация результатов работы. Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедр нормальной физиологии и фармакологии Военно-медицинской академии имени С.М'.Кирова, кафедры нервных болезней и психиатрии и кафедры специализированной терапии Института медицинского образования Новгородского государственного университета имени Ярослава Мудрого. Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины им. А.М.Никифорова МЧС России. Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований при РАН (РФФИ №04-04-49672).

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертационной работы доложены на 18-м международном конгрессе генетиков (Пекин, 1998), 17-м международном конгрессе по исследованию рака (Рио-де-Жанейро, 1998), 14-й объединённой встрече европейского и американского нейрохимических обществ» (Вёрлиц, Берлин, 1999), 11-м международном конгрессе по гистохимии и иммуноцитохимии,(Йорк, Великобритания; 2000), 23-й конференции по исследованию полисахаридов4 (Токио, Япония, 2002), 27-й конференции по гликолипидам (Бостон, США, 2007), 3-м съезд фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007).

Публикации.1 По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 10 журнальных статей, один патент на изобретение и 5 тезисов. Работы опубликованы^ материалах международных конференций и в журналах: «Доклады Академии наук», «Вопросы онкологии», «Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии», • «Медико- , биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях», «Neurochemical Research», «Генетика», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», «Glycobiology», «Медицинский Академический Журнал».

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы из 446 источников, среди которых 411 на иностранном языке. Диссертация изложена'на 236 страницах, содержит 7 таблиц, 61' рисунок.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Прошин, Сергей Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Клоны клеток перевиваемой рабдомиосаркомы РА—23 крыс с высоким метастатическим потенциалом характеризуются низкой активностью лизосомальной сиалидазы, тогда как клоны клеток с низким метастатическим потенциалом характеризуются высокой активностью лизосомальной сиалидазы, что свидетельствует о важности этого фермента для метастазирования. опухолевых клеток мышечного происхождения.

2. Клоны клеток перевиваемой рабдомиосаркомы РА—23 крыс с высоким и низким метастатическим потенциалом характеризуются, соответственно, более выраженными и менее выраженными изменениями структуры ядер в форме интерфазных мостов.

3. Морфологическая дифференцировка нейральной клеточной линии NB—1 нейробластомы человека сопровождается высокой активностью сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной, что свидетельствует о супрессивном значении этого фермента для опухолей нейрального происхождения.

4. Циклический аденозинмонофосфат повышает количество матричной РНК гена сиалидазы ассоциированной с плазматической- мембраной и её активность в нейральной клеточной линии NB-1 нейробластомы человека, что свидетельствует о зависимости этих изменений от цАМФ-сопряжённой сигнальной системы.

5. Циклический аденозинмонофосфат не вызывает повышения» количества матричной РНК гена лизосомальной сиалидазы и её активности в клетках NB-1 нейробластомы человека, что указывает на отличные от цАМФ-сопряжённой сигнальной системы механизмы геномной и протеомной регуляции этого фермента в нейральных клетках.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

3. В экспериментах с регенерацией аксонов при аксонотомии нейронов необходимо учитывать показатели активности сиалидазы ассоциированной с плазматической, так как высокая активность фермента сопровождает восстановление аксонов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Прошин, Сергей Николаевич, Санкт-Петербург

1. Алов И.Б. Цитофизиология и патология митоза // М.: Медицина, 1972 с. 45-78.

2. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Основные генетические механизмы // Молекулярная биология клетки, М: Мир, 1994.-Т.2, с.7-51.

3. Беляев К.Р., Счастный С.А., Щукин С.И., Рослый И.М., Зубенко В.Г., Семикин Г.И., Морозов А.А. Механизм действия электромагнитных полей на организм человека // Вестник РАМН. 1996. - Т.5. - С.51-54.

4. Березин М.В., Ляпин P.P., Салецкий Ф.М. Влияние слабых переменных магнитных полей на рассеяние света водными структурами (препринт / МГУ. Фик. Фак., № 21). М., 1988. 41 с.

5. Беркутов А.Я., Жулев В.И., Кураев Г.А., Прошин Е.М. // Системы комплексной электромагнитной терапии. — М: Лаборатория базовых знаний. 2000. С.13-34.

6. Бурба Л.Г., Валихоф А.Ф., Горбатов В.А., Симонян Г.А., Нахмансон В.М., Шишков В.П., Дун Е.А., Коромыслов Г.Ф., Гулюкин М.И., Кудрявцева Т.П. Лейкозы и злокачественные опухоли животных / Под ред. В.П.Шишкова, Л.Г.Бурбы.-М.:Агропромиздат, 1988.-400 с.

7. Гаряев П.П. Волновой геном.- М.: Общественная польза. 1994 с.23-36.

8. Григорьев Ю.Г. Отдаленные последствия биологического действия электромагнитных полей // Радиац. биология. Радиоэкология. 2000. - Т.40 -№.2. - С.217-225.

9. Гриняев С.Н., Родионов Б.Н. Возможные последствия воздействия низкоэнергетического электромагнитного излучения на генетический аппарат живой клетки // Вестн. нов. мед. технол. 1999.- Т.6 - N 1. - С.40-42.

10. Гужова И.В., Бахтин Ю.Б. Отбор на снижение метастатического потенциала в популяциях клеток перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс // Цитология. 1988. Т.30. №.12. С.1482-1487.

11. Гужова И.В. Поверхностные антигены клеток рабдомиосаркомы крыс с органотропным метастазированием. Автореферат канд. дисс., JL, 1989, 21 с.

12. Зыбина Е.В., Зыбина Т.Г., Исаков Г.К., Кикнадзе И.И. Полиплоидные митозы в клетках трофобласта норки // Цитология. 1994. Т.36. №.8. С.321-328.

13. Ильинских И.Н., Новицкий В.Ю., Ильинских Е.Н., Ильинских Н.Н., Ткаченко G.E. Инфекционная кариопатология / Под ред.Н.Н.Ильинских.-Томск: Изд-во Том.ун-та, 2005.-168 с.

14. Ильинских Н.Н., Новицкий В.В., Ванчугова Н.Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность. Томск, 1992. с.45-97.

15. Ильинских Н.Н., Новицкий В.В., Ванчугова Н.Н., Ильинских И.Н. // Томск: Изд. Томского Университета, 1992. 271 с.

16. Ильинских Н.Н., Ильинских И.Н., Бочаров Е.Ф: Цитогенетический гомеостаз и иммунитет. Новосибирск: Наука, 1986. 115 с.

17. Ильинских Н.Н. Влияние энтеровируса Коксаки А13 на хромосомный аппарат соматических и< генеративных клеток мышей. Регуляция морфогенеза и регенерация пищеварительных желез. JI., 19746. С.118.

18. Казанцева И.А. Патология митоза в опухолях человека. Новосибирск: Наука, 1981. 144 с.

19. Калашникова JI.A. ДНК-технологии сельскохозяйственных животных / Л.А.Калашникова, И.М.Дунин, В.И.Глазко и др.; М.: ВНИИплем, 1999:-148с.

20. Каминская Е.В., Гужова И.В., Фёдорова Е.В., Бахтин Ю.Б.

21. Штамм клеток рабдомиосаркомы крысы РА-23, используемый в качестве модели для изучения процессов органотропного метастазирования и скрининга противоопухолевых препаратов: Патент РФ № 2026344, сентябрь, 1995.

22. Каминская Е.В., Ярцева Н.М., Федорцева Р.Ф., Бахтин Ю.Б. // Бюл. эксп. биол. мед. 1990. Т.310. №.1. С.207-210.»

23. Кравцов В.Ю., Гужова И.В., Каминская Е.В., Ильинских Н.Н., Бахтин Ю.Б. Нестабильность генома и метастатический потенциал клетокрабдомиосаркомы РА-23 крыс.// Доклады АН СССР.-1990.-310(5> с. 12391241.

24. Крокер Д. // Районы ядрышкового организатора и фибриллярные центры / Молекулярная клиническая диагностика: Методы. Под ред. С.Херрингтон и Дж.Макги. М: Мир 1999, С.261-279.

25. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: «Высшая школа». 1973. - 343 с.

26. Мамаев Н.Н. Использование метода серебрения цистронов рибосомной РНК интерфазных клеток для количественной оценки гемопоэза при заболеваниях крови./ СПГМУ, С.-П. 1998 11 с.

27. Монахова М.А. Цитогенетические аспекты пространственной организации интерфазного ядра // Успехи соврем. Биологии. 1990. - Т.110. -№.2. - С.163-179.

28. Мосолов А.Н. Новые подходы к решению проблемы пространственного расположения хромосом в интерфазном ядре // Цитология. 1972. - Т. 14. -С.541-552.

29. Прокофьева-Бельговская А.А. Радиационные поражения хромосом на ранних стадиях развития лосося // Цитология. 1961. - Т.З. - №.4. - С.437-45.

30. Стобецкий В.И. Индукция специфических дицентрических хромосом в клетках яичника китайского хомячка СНО-6 // Цитология. 1990. - Т.32. -№.1. - С.92-93.

31. Стобецкий В.И., Чеботарёв А.Н., Миронова Л.Л. Анализ сочетаний хромосом в дицентриках при индуцированном теломерном слиянии // Цитология. 1994. - Т.36. - №.1. - С.60-63.

32. Стобецкий В.И. Феномен теломерного слияния хромосом в клетках с микроядрами и его возможное объяснение. / Хромосомы человека в норме и патологии.-мат-лы конф., М. 1989. с. 95-100.

33. Шишло М.А. О биотропных параметрах магнитных полей. // Вопросы курортологии и физиотерапии. 1981.-№3. - с.61-63.

34. Эйди У.Р. Частотные и энергетические окна при воздействии слабых электромагнитных полей на живую ткань.// Труды инженеров ин-та по электротехнике и радиоэлектронике.- 1980.-Т.68 -№1 с.140-48.

35. Abate L.E., Mukherjee P., Seyfried T.N. Gene-linked shift in ganglioside distribution influences growth and vascularity in a mouse astrocytoma // J. Neurochem. 2006. - Vol.98. - N.6. - P.1973-1984.

36. AgapovaX.S., Ilyinskaya G.V., Turovets N.A., Ivanov A.V., Chumakov P.M., Kopnin B.P. Chromosome changes caused' by alterations, of p53 expression // Mutat Res. 1996. - Vol.354. - P.129-138.

37. Akbar M., Baick J., Calderon F., Wen Z., Kim H:Y. Ethanol promotes neuronal apoptosis by inhibiting phosphatidylserine accumulation' // J: Neurosci. Res. 2006. - Vol.83. - N.3. - P:432-440.

38. Andersen S.S.L., Bi G. Axon formation: a molecular model for the generation of neuronal polarity // BioEssays. 2000. - Vol.22. - P.172-179.

39. Anderson L.E. Biological effects of extremely low-frequency electromagnetic fields: in vivo studies // Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 1993. - Vol.54. - N.4. - P.186-196.

40. Anderson, R.G. The Caveolae membrane system // Annu. Rev. Biochem. -1998. Vol.67. - P.199-225.

41. Andrisani O.M. CREB-mediated transcriptional control // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1999. - Vol.9. - N.l. - P.19-32.

42. Arimura N., Kaibuchi K. Key regulators in neuronal polarity // Neuron. 2005.- Vol.48. P.881-884.

43. Atkinson S.P., Keith W.N. Epigenetic control of cellular senescence in disease: opportunities for therapeutic intervention // Expert. Rev. Mol. Med.2007. Vol.9. - N.7. - P.l-26.

44. Balaban-Malenbaum G., Gilbert F. Double minute chromosomes and the homogeneously staining regions in chromosomes of a human neuroblastoma cell line // Science. -1977. Volil98. - P.739-741.

45. Bjersing J.L., Brorsson A., Heby O. Increased expression of c-jun, but not retinoic acid receptor beta, is associated with F9 teratocarcinoma stem cell differentiation induced by polyamine depletion // J. Biol. Chem. 1997. - Vol.67.- P.378-385.

46. Bibbo M. (1997) Comprehensive Cytopathology, 2 edn. W. B. Saunders Company, Philadelphia.

47. Bradke F., Dotti C.G. The role of local actin instability in axon formation // Science. 1999. - Vol.283. - P.1931-1934.

48. Bradke F., Dotti C.G. Establishment of neuronal polarity: lessons from cultured hippocampal,neurons // Curr. Opin. Neurobiol. 2000. - Vol.10. - P.574-581.

49. Bremer E.G., Hakomori S. GM3 ganglioside induces hamster fibroblast growth inhibition in chemically-defined medium: ganglioside may regulate growth factor receptor function // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. - Vol.106. - N.3. -P.711-718.

50. Brohier H.T., Kuzin A., Zu Y., Odenwald W., Skeath J.B. Drosophila homeodomain protein Nkx6 coordinates-motoneuron subtype identity and axonogenesis // Development. 2004. - Vol.131. - P.5233-5244.

51. Brown M.S., Goldstein J.L. Lipoprotein receptors in the liver. Control for plasma cholesterol traffic // J. Clin. Invest. 1983. - Vol.72. - N.3. - P.743-747.

52. Bunz F., Dutriaux A., Lengauer C., Waldman Т., Zhou S., Brown JP., Sedivy JM., Kinzler KW., Vogelstain B. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage // Science. 1998. - Vol.282. P.1497-1501.

53. Carpenter G. Receptors for epidermal growth factor and other polypeptide mitogens // Annu. Rev. Biocheim 1987. - Vol.56. - P.881-914.

54. Chang A.C.M., Janosi>J:, Hulsbeek Mi, De Jong D!, Jeffrey K.L, Noble J.R., Reddel R.R. A novel?human;cDNA highly homologous to the fish hormone stanniocalcin // Mol. Cell. Endocr. 1995. - Vol.112. - P.241-247.

55. Chang A.C.M: and Reddel R.R. Identification;of a second stanniocalcin cDNA. in mouse and human: stanniocalcin 2 // Mol. Cell. Endocr. 1998. - Vol.141. -P.95-99.

56. Chien C.H;, Shann Y.J., SheuS.Y. Site-directed mutations of the catalytic and conserved amino acids of the neuraminidase gene, nanH, of Clostridium perfringens ATCC 10543 // Enzyme Microb. Technol. -1996. Vol.19. - P.267-276.,

57. Cho S.Y.,.Lee S.H:, Park S.S. Differential expression of mouse Disable gene in retinoic acid-treated. F9 embryonal carcinoma cells and early mouse embryos // Mol. Cells. 1999. - Vol.9. - P.179-184.

58. Chung E.S:, Jin B.K. Disialogangliosides induce neurodegeneration in rat mesencephalic cultures // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - Vol. 346. -N.2. - P.572—577.

59. Cohen J. The immunopathogenesis of sepsis // Nature. 2002. - Vol.420. -P.885-891.

60. Coles E.G., Taneyhill L.A., Bronner-Fraser M. A critical role for Gadherin6B in regulating avian neural crest emigration // Dev. Biol. 2007. - Vol.312. - N.2. -P.533-544.

61. Connell-Crowley L., Le Gall M., Vo D.J., Giniger E. The cyclin-dependent kinase, Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo // Curr. Biol. -2000. Vol.10. - N.10. - P.599-602:

62. Cooper W. Hypothesis on a casual link between EMF and an evolutionary class of cancer and spontaneous abortion // Cancer Biochem. Biophys. 1996. - Vol.15. — N.3. - P.151-170.

63. Coquelle A., Toledo F., Stern S., Bieth A., Debatisse M. 1988. A new role for hypoxia in tumor progression: induction of fragile site triggering genomic rearrangements and formation of complex DMs and HSRs // Mol. Cell. 1988. -Vol.2: - P.259-265.

64. Coyle J.T., Puttfarcken P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders // Science. 1993. - Vol.262. - P.689-695.85'. Craig A.M., Banker G. Neuronal polarity // Annu. Rev. Neurosci. 1994. -Vol.17. - P.267-310:

65. Cuatrecasas P.5 Interaction of Vibrio cholerae enterotoxin with cell membrane // ■Biochemistry. 1973. - Vol.12, N 18. - P.3547-3558.

66. Da Silva J.S., Hasegawa Т., Miyagi T. Asymmetric membrane ganglioside sialidase activity specifies axonal fate // Nat. Neurosci. 2005. - Vol.8. - N.5. -P.606-615.

67. Davis R.J. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases // Cell. -2000. Vol.103. - P.239-252.

68. Dawson H.N., Ferreira A., Eyster M.V., Ghoshal N., Binder L.I., Vitek M.P. Inhibition of neuronal maturation in primary hippocampal neurons from tau deficient mice // J. Cell Sci. 2001. - Vol.114. - P.1179-1187.

69. Den H., Malinzak D.A., Rosenberg A. Lack of evidence for the involvement of a beta-D-galactosyl-specific lectin in the fusion of chick myoblast // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. - Vol.69. - P.621-627.

70. Dendorfer U. Molecular biology of cytokines // Artif. Organs. — 1996. -Vol.20. N.5. - P.437-444.

71. Dennis J.W., Waller C., Timpl R., Schirrmacher V. Surface sialic acid reduces attachment of metastatic tumor cell to collagen type IV and fibronectin // Nature (Lond.). -1982. Vol.300. - P.274-276.

72. Dennis J.W., Lafarte S., Waghorne C., Breitman M.L., Kerbel R.S; (31-6 branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis // Science. -1987. Vol.236. - P.582-585.

73. Dijkhuzen Т., Vandenberg E., Molenaar W.M'., Menzelaar J.J., Dejong B. Rearrangements involving 12pl2 in two cases-of cardiac myxoma // Cancer Genet. Cytogenet. 1995. - Vol.82. - N.2. - P.161-62.

74. Dotti C.G., Sullivan C.A., Banker G.A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture // J. Neurosci. 1988. - Vol.8. - P.1454—1468.

75. Dujardin» D.L., Barnhart L.E., Stehman S.A., Gomes E.R., Gundersen G.G., Vallee R.Bi A role for cytoplasmic dynein and'LISl in directed cell movement // J. Biol. Chem. 2003. - Vol.163. - P.1205-1211\

76. Duprey P., Morello D., Vasseur M., Babinet C., Condamine H., Brulet P.', Jacob F. Expression of the cytokeratin endo A gene during early mouse embryogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. 1985. - Vol.82. - P.8535-8539.

77. Etienne-Manneville S., Hall A. Integrin-mediated activation of Cdc42 controls cell polarity in migrating astrocytes through PKO-^ // Cell. 2001. - Vol.106. -P.489-498.

78. Ferrari G., Anderson B.L., Stephens R.M., Kaplan D.R., Greene L.A. Prevention of apoptotic neuronal death by GM1 ganglioside. Involvement of Trk neurotrophin receptors // J. Biol. Chem. 1995. - Vol.270. - P.3074-3080.

79. Fielding C.J. Lecithin-cholesterol acyltransferase and cholesterol transport // Methods Enzymol. 1985. - Vol.111. - P.267-274.

80. Fogel M., Altevogt P., Schirrmacher V. Metastatic potential severely altered by changes in tumor cell adhesiveness and cell-surface sialylation // J. Exp. Med. -1983. Vol.157. - P.371-376.

81. Folch J., Arsove S., Meath J.F. Isolation of brain strandin, a new type of large molecule tissue component // J. Biol. Chem. 1951. - Vol.191. - N.2. - P.819-831.

82. Foster R.R., Satchell S.C., Seckley J., Emmett M.S., Joory K., Xing C.Y., Saleem M.A., Mathieson P.W., Bates D.O., Harper SJ(. VEGF-C promotes survival in podocytes // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. Vol.291. - N.l. - P.196-207.

83. Freire E., Gomes F.C., Jotha-Mattos T. Sialic acid residuse on astrocytes regulate neuritogenesis by controlling the assembly of laminin matrices // J. Cell. Sci. 2004. - Vol.117. - N.18. - P.4067-4076.

84. French P.W., Penny R., Laurence J.A., McKenzie D.R. Mobile phones, heat shock proteins and cancer // Differentiation. 2001. - Vol.67. - N.4/5. - P.93-97.

85. Fujii I., Iwabuchi Y., Teshima Т., Shiba Т., Kikuchi M. X-Neu5Ac: a novel substrate for chromogenic assay of neuraminidase activity in bacterial expression systems // Bioorg. Med. Ghem. 1993. - Vol.1. - N.2. - P.147-149.

86. Furukawa K., Hamamura K., Aixinjuelo W., Furukawa K. Biosignals modulated by tumor-associated carbohydrate antigens: novel targets for cancer therapy // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006. - Vol.1086. - P.185-198.

87. Garige M., Azuine M.A., Lakshman M.R. Chronic ethanol consumption upregulates the cytosolic and plasma membrane sialidase genes, but down regulates lysosomal membrane sialidase gene in rat liver // Metabolism. 2006. -Vol.55.-N.6.-P.803-810.

88. Gartner Т.К., Podleski T.R. Evidence that a membrane bound lectin mediates fusion of L6 myoblasts // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. - Vol.67. -P.972-978.

89. Gascoyne N., Van Heyningen W.E. Binding of cholera toxin by various tissues // Infect. Immun. 1974. - Vol.12. - N 3. - P.466-469.

90. Gilbert J., DahW1., Riney C., You J., Cui C., Holmes R., Lencer W., Benjamin T. Ganglioside GDla restores infectibility to mouse cell lacking functional receptors for polyomavirus // J. Virol. 2005. - Vol.79. - N.l. - P.615-618.

91. Gillard B.K., Thurmon L.T., Marcus D.M. Variable subcellular localization of glycosphingolipids // Glycobiology. 1993. - Vol.3. - P.57-67.

92. Gisselsson D. Chromosomal instability and genomic amplification in bone and soft tissue tumours / Lund University, 2000. pp.73.

93. Gonzalez-Billault С., Owen R., Gordon-Weeks P.R., Avila.J. Microtubule-associated protein IB is involved in the initial stages of axonogenesis in peripheral nervous system cultured neurons // Brain. Res. 2002. - Vol.943. - N.l. - P.56-67.

94. Goodman R., Bumann J., Wei L-X., Shirley-Henderson A'. The sensitivity of the myc-promoter in mice? Irradiated with EMF // Electro and Magnetobiology. -1992.-Vol.11.-P.19-28.

95. Goodman R., Blank M. Magnetic field stress induces expression of hsp 70 // Cell Stress Chaperones. 1998. Vol.3. - P.79-88.

96. Goslin K., Banker G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture // J. Cell Biol. 1989. - Vol.108. -1507-1516.

97. Grabham P.W., Seale G.E., Bennecib M., Goldberg D.J., Vallee R.B. Cytoplasmic dynein and LIS1 are required for microtubule advance during growth cone remodeling' and fast axonal outgrowth // J. Neurosci. 2007. - Vol.27. -N.21. - P.5823-5834.

98. Gu J1., Fujibayashi. A., Yamada K.M., Sekiguchi K. Disruption of the endothelial cell protein G receptor gene in mice causes placental thrombosis and early embryonic lethality // J. Biol. Chem. 2002. - Vol.277. - P.19922-19928.

99. Gupta S., Campbell D., Derijard В., Davis R.J. Transcriptional factor ATF2 regulation by the JNK signal,transduction pathway // Science. 1995. - Vol.267. -P.389-393.

100. Gupta D., KirklandT.N., Viriyakosol S., Dziarski R. CD14 is a cell-activating receptor for bacterial peptidoglycan // J. Biol. Chem. 1996. - Vol.271. -P.23310-23316.

101. Gupta S., Barret Т., Whitmarsh A.J., Cavanagh J., Sluss H.K., Derijard В., Davis R J. Selective interaction of JNK protein kinase isoforms with transcription factors // EMBO J. 1996. - Vol.15. - P.2760-2770.

102. Hakomori S. Glycosphingolipids // Sci. Amer. 1986. Vol.245. - N.5. - P.44-53.

103. Hakomori S., Igarashi Y. Functional role of glycosphingolipids in cell recognition and signaling // J. Biochem. 1995. - Vol.118. - P.1091-1103.

104. Hakomori S. Glycosynapses: microdomains controlling carbohydrate-dependent cell adhesion and signaling // Ann. Braz. Acad. Sci. 2004. - Vol.76. -N.3. - P.553-572.

105. Hansemann D. Ueber patologische Mitosen. 1891. Arch Pathol Anat Phys Klin Med 119:299-326.

106. Hara S., Takemori Y., Yamaguchi M., Nakamura M., Ohkura Y. Determination of alpha-keto acids in serum and urine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection // J. Chromatogr. 1985. - Vol.344. -P.33-39.

107. Harder Т., Simons K. Caveolae, DIGs, and the dynamics of sphingolipid-cholesterol microdomains // Curr. Opin. Cell Biol. 1997. - Vol.9. - N.4. - P.534-542.

108. Harel R., Futerman A.H. Inhibition of sphingolipid synthesis affects axonal outgrowth in cultured hippocampal neurons // J. Biol. Chem. 1993. - Vol.268. -P.14476-14481.

109. Harper S.J., LoGrasso P. Signalling for survival and death in neurons: the role of stress-activated kinases, JNK and p38 // Cell Signal. 2001. - Vol.13. - P.299-310.

110. Hasegawa Т., Yamaguchi W., Wada T. Takeda A., Itoyama Y., Miyagi T. Molecular cloning of mouse ganglioside sialidase and its increased expression in Neuro2a cell differentiation // J. Biol. Chem. 2000. - Vol.275. - P.8007-8015.

111. Hasegawa Т., Sugeno N., Takeda A. Role of Neu4L sialidase and its substrate ganglioside GD3 in neuronal apoptosis induced by catechol metabolites // FEBS Lett. 2007. - Vol.581. - N.3. - P.406-412.

112. Hata K., Wada Т., Hasegawa A., Kiso M., Miyagi T. Purification and characterization of a membrane-associated ganglioside sialidase from bovine brain // J. Biochem. 1998. - Vol.123. - P.899-905.

113. Hata K., Sasaki A., Sawada M., Wada Т., Tateno Т., Miyagi T. Overexpression of ganglioside sialidase in transgenic mice leads to non-insulin dependent diadetes mellitus // Glycoconj. J. 2001. - Vol.18. - P.90-98.

114. Herdegen Т., Leah J.D: Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins // Brain Res. Brain Res. Rev. 1998. - Vol.28. - P.370-490.

115. Hermann C., Spreitzer I., Scroder N.W., Morath S., Lehner M.Di, Fischer W., Schutt C., Schumann R.R., Hartung T. // Eur. J. Immunol. 2002. - Vol.32.-P.541-551.

116. Hess E.L., Coburn A.F., Bates R.C., Murphy P. A new methodifor measuring sialic acid levels in serum and its application to rheumatic fever // J. Clin. Invest. -1957. Vol.36. - N.3. - P.449-455.

117. Hiraiwa M., Nishizawa M., Uda Y., Nakajima Т., Miyatake T. Human placental sialidases: further purification and characterization // J. Biochem. 1988. - Vol.103. - P.86-90.

118. Hoyer L.L., Hamilton A.C., Steenbergen S.M., Vimir E.R. Cloning, sequencing and distribution of the Salmonella typhimurhim LT2 sialidase gene,nanH, provides evidence for interspecies gene transfer // Mol. Microbiol. — 1992. -Vol.6. P.873-884.

119. Hu D., Tan X., Sato Т., Yamagata S., Yamagata T. Apparent suppression of MMP-9 activity by GDla as determined by gelatin zymography // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - Vol.349. - N.l. - P.426-431.

120. Jiang Hi, Rao Y. Axon formation: fate versus growth // Nat. Neurosci. 2005.- Vol.8.-P.544-546.

121. Kabayama K., Sato Т., Kitamura F., Uemura S., Kang B.W., Igarashi; Y., InokuchiJ.I. TNFalpha-induced insulin resistance in, adipocytes as a membrane microdomain disorder: involvement of ganglioside GM3 // Glycobiology. 2005.- Vol.15. -N.1.-P.21-29.

122. Kalka D., von Reitzenstein C., Kopitz J-., Cantz M. The plasma membrane ganglioside sialidase cofractionates with markers of lipid' rafts // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - Vol.283. - P.989-993.

123. Kamakura К., Kaida К., Kusunoki S., Miyamoto N., Masaki Т., Nakamura R., Motoyoshi K., Fukuda J. Harmful effects of anti-GalNAc-GDla antibodies and TNF-alpha on rat dorsal root ganglia // J. Peripher. Nerv Syst. 2005. - Vol.10. -N.2. - P.190-201.

124. Kato K., Shiga K., Yamaguchi K. Plasma-membrane-associated sialidase (NEU3) differentially regulates integrin-mediatedf cell proliferation through laminin- and fibronectin-derived signaling // Biochem J. 2006. Vol.394. - N.3. -P.647-656.

125. Kastan* M.B., Onyekwere O., Sydransky D., Vogelstein В., Craig RW. Participation of of p53 protein in-the cellular responce to DNA damage // Cancer Res. 1991. - Vol.51. - Р.6304-631Г.

126. Kavet R., Stuchly MiA., Bailey W.H., Bracken T.D. Evaluation of biological effects, dosimetric models, and exposure assessment related to ELF electric- and magnetic-field.guidelines // Appl. Occup. Environ. Hyg. 2001'. - Vol.16: - N.12. — P.1118-38.

127. Kawai H., Allende M. L., Wada R., Kono M., Sango K., Deng C., Miyakawa Т., Crawley J. N., Werth N., Bierfreund U. // J: Biol. Chem. 2001. - Vol.276. -P.6885-6888.

128. Kawai A., Onimura H., Homma I. Mechanism of C02/H+ chemoreception by respiratory rhythm generator neurons in the medulla from newborn rats in vitro // J. Physiol. 2006. - Vol.572. - N.2. - P.525-537.

129. Kawakami Y., Kawakami K., Steelant W.F.A., Ono M., Baek R.C., Handa K., Withers D.A., Hakomori S. // J. Biol. Chem. 2002. - Vol.277. - P.34349-34358.

130. Kholmanskikh S.S., Dobrin J.S., Wynshaw-Boris A., Letourneau P.C., Ross M.E. Disregulated RhoGTPases and actin cytoskeleton contributed to the migration defect in Lisl-deficient neurons // J. Neurosci. 2003. - Vol.23. -P.8673-8681.

131. Kim C.H. Ganglioside-GM3 modulates tumor supressor PTEN-mediated cell cycle progression-transcriptional induction of p21(WAFl) and p27(kipl) byinhibition of PI-3K/AKT pathway // Glycobiology. 2006. - Vol.16. - N.7. -P.573-583.

132. Kimura K., Markowski M., Bowen C., Gelmann E.P. Androgen blocks apoptosis of hormone-dependent prostate cancer cells // Cancer Res. 2001. Vol.61. - N.14. - P.5611-5618.

133. King D.S., Costill D.L., Fink W.J., Hargreaves M., Fielding R.A. Muscle metabolism during exercise in the heat in unacclimatized and acclimatized humans // J. Appl. Physiol. 1985.- Vol.59. - N.5. - P.1350-1354.

134. Kishi M., Pan Y.A., Crump J.G., Sanes J.R. Mammalian SAD kinases are required*for neuronal polarization // Science. 2005. - Vol.307. - P.929-932.

135. Klenk E., Lauenstain K. Carbohydrate containing lipids of the formed elements of the human blood. // Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 1951. -Vol.288. - N.4/5/6. - P.220-228.

136. Kniep B:, Kniep E., Ozkucur N., Barz S., Bachmann M., Malisan F., Testi R., Rieber E.P. 9-O-acetyl GD3 protects tumor cells from apoptosis // Int. J. Cancer. -2006. Vol.119. - N.l. - P.67-73.

137. Kobayashi M. Differential regulation of synaptic transmission by adrenergic agonists via protein kinase A and protein kinase С in layer V pyramidal neurons of rat cerebral cortex // Neuroscience. 2007. - Vol.1 - P.234-241.

138. Kojima N., Hakomori S. Cell adhesion, spreading, and motility of GM3-expressing cells based on glycolipid-glycolipid interaction // J. Biol. Chem. -1991. Vol.266. - N.26. - P.17552-17558.

139. Kopitz J., Sinz K., Brossmer R., Cantz M. Partial characterization and enrichment of a membrane-bound sialidase specific for gangliosides from human brain tissue // Eur. J. Biochem. 1997. - Vol.248. - P.527-534.

140. Kopitz J., Muhl C., EhemannV., Lehmann C., Cantz M. Effects of cell surface ganglioside sialidase inhibition on growth control differentiation of human neuroblastoma cells // Eur. J. Cell Biol. 1997. - Vol.73. - P.l-9.

141. Kotani M., Kawashima I., Ozawa H., Terashima Т., Tai T. Differential, distribution of major gangliosides- in rat central nervous system detected by specific monoclonal antibodies // Glycobiology. 1993. - Vol.3. - P.137-146.

142. Kotani M., Kawashima I., Ozawa H., Ishizuka I., Tareshima Т., Tai T. Immunohistochemical localization of minor gangliosides in the rat central nervous system // Glycobiology. Vol.4. - P.855-865.

143. Kozireski-Chuback D., Wu G., Ledeen R.W. Up-regulation of nuclear GM1 accompanies axon-like, but not dendrite-like, outgrowth in NG108-15 cells // J. Neurosci. Res. 1999a. - Vol.55. - P.107-118.

144. Kozireski—Chuback D., Wu G., Ledeen'R.W. Axonogenesis in neuro-2a cells correlates with GM1 upregulation in the nuclear and plasma membranes // J. Neurosci. Res. 1999b. - Vol.57. - N.4. - P.541-550.

145. Kruse S., Pommerencke J., Kleineidam R.G., Roggentin P., Schauer R. Effects of cysteine modifications on the activity of the 'small' Clostridium perfringens sialidase // Glycoconjugate J. 1998. - Vol.15. - P.769-775.

146. Kurzchalia T.V., Parton R.G. Membrane microdomains and caveolae // Curr. Opin. Cell Biol. -1999. Vol.11. - P.424-431.

147. Kuzman J.A., Gerdes A.M., Kobayashi S., Liang Q. Thyroid hormone activates Akt and prevents serum starvation-induced cell death in neonatal rat cardiomyocytes // J. Mol. Cell Cardiol. 2005. - Vol.39. - N.5. - P.841-844.

148. Lanier L.M., Gertler F.B. From Abl to actin: Abl tyrosine kinase and associated proteins in growth cone motility // Curr. Opin. Neurobiol. 2000. -Vol.10.-N.l. -P.80-87.

149. Ledeen R.W. Biosynthesis metabolism and biological effects of gangliosides / In: Neurobiology of glycoconjugates (Margolis R.U., Margolis R.K., eds) / New York: Plenum. -1989. pp.43-69.

150. Ledeen R W., Wu G., Vaswani К К., Cannella M S. Trophic Factors and the Nervous System / Horrocks L A, Neff N H, Yates A J, Hadjiconstantinou M., editors / NY: Raven. 1990. - pp.17-34.

151. Ledeen R.W., Wu G. Nuclear lipids: key signaling effectors in the nervous system and other tissues // J. Lipid. Res. 2004. - Vol.45. - N.l. - P.l-8.

152. Ledeen R.W., Wu G. Gangliosides of the nuclear membrane: a crucial locus of cytoprotective modulation // J. Biol. Chem. 2006. - Vol.97. - N.5. - P.893-903.

153. Ledeen R.W., Wu G. GMI ganglioside: another nuclear lipid that modulates nuclear calcium. GMI potentiates the nuclear sodium-calcium exchanger // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2006. - Vol.84. - N.3/4. - P.393-402.

154. Ledeen R.W., Wu G. Sphingolipids of the nucleus and their role in nuclear signaling // Biocheim Biophys. Acta. 2006. - Vol.1761. - N.5/6. - P.588-598.

155. Lein P.J., Banker G.A., Higgins Dr Laminin selectively enhances axonal. growth and accelerates the development of polarity by hippocampal, neurons in. culture // Brain Res. Dev. Brain Res. 1992. - Vol.69. - Р.19Г-197.

156. Li Y., Maher Pi, Schubert D. A, role for 12-lipoxygenase in nerve cell death caused by glutathione depletion // Neuron. 1997. - Vol.19. - P.453-463.

157. Li Y., Maher P., Schubert D. Requirement for cGMP in nerve cell death caused by glutathione depletion // J. Cell Biol. 1997. - Vol.139. - P.1317-1324.

158. Li C.X., Jing Y.L., Xie Y.K. Glycosylation-induced depolarization facilitates subthreshold membrane oscillation in injured primery sensory neurons // Brain. Res. 2007. - Vol.1139. - P.201-209.

159. Liedtke Т., Schwamborn J.C., Schroer U., Thanos S. Elongation of axons during regeneration involves retinal crystallin beta b2 (crybb2) // Mol. Cell Proteomics. 2007. - Vol.6. - N.5. - P.895-907.

160. Lincoln J.E., Boling M., Parikh A.N., Yeh Y., Gilchrist D.G., Morse L.S. Fas signaling induces raft coalescence that is blocked by cholesterol depletion in human RPE cells undergoing apoptosis // Invest. Ophtalmol. 2006. - Vol.47. -N.5. - P.2172—2178.

161. Lingle W.L., Lutz W.H., Ingle J.N., Maihle N.J., Salisbury J.L. Centrosome hypertrophy in human breast tumors: implications for genomic instability and cell polarity. 1998. Proc Natl Acad.SciUSA 95:2950-2955.

162. Liotta L.A., Kohn E.C. The microenvironment of the tumor-host interface // Nature. 2001. - Vol.411*. - P.375-379.

163. Liu Z., Ruan Y., Yue W., Zhu Z., HartmannT., Beyreuther K., Zhang D. GM! up-regulates Ubiquilin 1 expression 1 in human neuroblastoma cells and rat cortical neurons // Neurosci. Lett. 2006. - Vol.407. - N.l1. - P.59-63.

164. Liu Z.P., Wen F.Q., Chen Y.X., Wang S.Y., Zhou- K.Y., Xia Q. Effect of endogenous gangliosides on. integrin alpha2betal-mediated adhesion of neuroblastoma1 cells to collagen // Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2007. -Vol.9.-N.l. -P.42-46.

165. Lukinoviz-Skudar V., Matkovic K., Banfic H., Visnjic D. Two waves of the nuclear, phospholipase С activity in serum-stimulated HL-60 cells during G(l) phase of the cell cycle // Biochim. Biophys. Acta. -2007. Vol.1771. - N.4. -P.514-521.

166. Luo J., Zhang L., Tu H., Hu J., Li X., Li D., Lei T. Experimental study on treatment of glioma by embryonic neural stem cell transplantation- in rats // J. Huazhong Univ. Sci. Technolog. Med. Sci. 2007. - Vol.27. - N.5. - P.571-575.

167. Ma С., Martin S., Trask В., Hamlin J.L. Sister chromatid fusion initiates amplification of the dihydrofolate reductase gene in Chinese hamster cells // Genes Dev. 1993. - Vol.7. - P.605-620.

168. Macso D:, Van de Walle M., Spiegel S. Interaction ganglioside GMI with the В subunit of cholera toxin modulates growth and differentiation of neuroblastoma N18 cells // J. Neuroscience. 1991. - Vol.11. - P.2443-2452.

169. Mandell' J.W., Banker G.A. Microtubule-associated proteins, phosphorylation gradients, and'the establishment of-neuronal polarity // Perspect. Dev. Neurobiol. -1996. Vol.4. - N.2/3: - P.125-135.

170. Manning A.M., Davis R.J. Targeting JNK for therapeutic benefit: form junk to gold? // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. - Voh2. - P.554-565.

171. Manthorpe M., Engvall E., Ruoslahti. E., Longo G.E., Davis G.E., Varon S. Laminin promotes neuritic regeneration from cultured peripheral and central neurons // J. CellBiol. 1983. - Vol.97. - P.1882-1890.

172. Mao L., Wang J.Q. Interaction between ionotropic and metabotropic glutamate receptors regulate cAMP response element-binding protein phosphorylation in cultured striatal neurons // Neuroscience. 2002. - Vol.115. - N.2. - P.395-402.

173. Mao L., Wang J.Q. Phosphorylation of cAMP response element-binding protein in cultured striatal neurons by metabotropic glutamate receptor subtype 5 // J. Neurochem. 2003. Vol.84. - N.2. - P.233-243.

174. Mao L.M., Tang Q., Wang J.Q. Protein kinase C-regulated cAMP response element-binding protein phosphorylation in cultured rat striatal neurons // Brain Res. Bull. 2007. - Vol.72. - N.4/5/6. - P.302-308.

175. Malisan- F., Testi R. GD3 ganglioside and apoptosis // Biochem. Biophys. Acta. 2002. - Vol.1585. - P.179-187.

176. Martinet W., De Meyer G.R., Herman A.G., Kockx M.M. Amino acid deprivation induces both apoptosis and autophagy in marine C2C12 muscle cells // Biotechnol. Lett. 2005. - Vol.27. - N.16. - P.1157-1163.

177. Matsuo Т., Heller M., Petti L., CTShiro E., Kieff E. Persistence of the Epstein-Barr vims genome integrated into human lymphocyte DNA // Science. 1984. -Vol.226.-P:1322-1325.

178. Matsuura K., Kobayashi^K. Analysis of GM3-Gg34nteraction using clustered-gycoconjugate models constructed from glycolipid monolayers and artificial glycoconjugate polymers // Glycoconuj. J. 2004. - Vol>21'. - N.3/4. - P.139-148.

179. Maurer B.J., Lai E., Hamkalo B.A., Hood L., Attardi G. Novel submicroscopic extrachromosomal elements containing amplified genes in human cells // Nature. -1987. Vol.327. - P.434-437.

180. McBride O.W., Peterson J.L. Chromosome-mediated gene transfer in mammalian cells // Annu. Rev. Genet. 1980. - Vol.14. - P.321-345.

181. McClintock B. The production of homozygous deficient tissues with mutant characteristics by means of the aberrant behavior of ring-shaped chromosomes // Genetics. 1938. - Vol.23. - P.315-376.

182. McKerracher L., Chamoux M., Arregui C.O. Role of laminin and integrin interactions in growth cone guidance // Mol. Neurobiol. 1996. - Vol.12. - P.95-116.

183. Meyn M.S. Chromosome instability, syndromes: lessons for carcinogenesis. // Curr. Top. Microbiol. Immunol: 1997. - Vol.221. - P.71-148.

184. Milner R.J., Salute M., Crawford C., Abbot J.R., Farese J. The immune response to disialoganglioside GD3 vaccination in normal dogs:, a melanoma surface antigen vaccine // Vet. Immunol. Immunopathol. 2006. - Vol.114. -N.3/4. - P.273—284.

185. Minden A., Karin M. Regulation and'<function of the JNK subgroup of MAP kinases // Biochem. Biophys. Acta. 1997. - Vol.1333. - P.F85-F104.

186. Min K.J., Yang M.S., Jou I., Joe E.H: Protein kinase A mediates microglial. activation induced by plasminogen.and gangliosides // Exp. Mol. Med. - 2004a. -Vol.36. - N.5. - P.461- 467.

187. Min K.J., Pyo HK., Yang M.Si, Ji K.A., Joe E.H. Gangliosides activate micriglia via protein kionase С and NADPH oxidase // Glia. 2004b. - Vol.48. — N.3. - P.197—206.

188. Miyagi Т., Tsuiki S. Rat-liver lysosomal sialidase. Solubilization, substrate specificity and comparison with the cytosolic sialidase // Eur. J. Biochem. 1984. - Vol.141. -P.75-81.

189. Miyagi Т., Tsuiki S. Purification and characterization of cytosolic sialidase from rat liver // J. Biol. Chem. 1985. - Vol.260. - P.6710-6716.

190. Miyagi Т., Sagawa J., Konno K., Handa S., Tsuiki S. Biochemical and immunological studies on two distinct ganglioside-hydrolyzing sialidases from the particulate fraction of rat brain // J. Biochem. 1990. - Vol.107. - P.787-793.

191. Miyagi Т., Konno K., Emori Y., Kawasaki H., Suzuki K., Yasui A., Tsuiki S. Molecular, cloning and expression of cDNA encoding rat skeletal muscle cytosolic sialidase // J. Biol. Chem. 1993. - Vol.268. - P:26435-26440.

192. Miyagi Т., Wada Т., Iwamatsu A. Molecular cloning and characterization of a plasma membrane-associated sialidase specific for gangliosides // J; Biol. Chem. -1999. Vol.274. - Р:5004-501Г.

193. Miyakoshi L.M., Mendez-Otero R., Hedin-Pereira C. The 9-O-acetyl GD3 gangliosides are expressed by migrating chains of subventricular zone neurons in vitro // Braz. J. Med. Biol. Res. 2001. - Vol.34. - P.669-673.

194. Monti E., Preti A., Rossi E., Ballabio A., Borsani G. Cloning and characterization of NEU2, a human gene homologous to rodent soluble sialidases // Genomics. 1999. - Vol.57. - P.137-143.

195. Monti E., Bassi M.T., Papini N. Identification and expression of NEU3, a novel human sialidase associated to the plasma membrane // Biochem. J. 2000. -Vol.349.-P.343-351.

196. Murozuka Y., Watanabe N., Hatanaka K., Hakomori S.I. Lyso-GM3, its dimer, and^multimer: their, synthesis, and their effect on epidermal growth factor-induced receptor tyrosine kinase // Glycoconj. J. 2007. - Vol.32. - P.112-117.

197. Nabi I.R., Raz A. Cell shape modulation alters glycosylation of a, metastatic, melanoma cell-surface antigen // Int. J. Cancer. 1987. - Vol.40. - P.396-402.

198. Nabi I.R., Raz A. Loss of metastatic responsivenees to cell' shape modulation in a newly characterized B16 melanoma adhesive cell variants // Cancer Res. — 1988. Vol.48. - P.1258-1264.

199. Nabi I.R., Watanabe H., Raz A. Identification of B16 F1 melanoma autocrine motility-like factor receptor // Cancer Res. - 1990. - Vol.50. — P.409-414.

200. Nakagami Y., Abe K., Nishiyama N., Matsuki N. Laminin degradation by plasmin regulates long-term potentiation // J. Neurosci. 2000: — Vol.20. -P.2003-2010.

201. Nakayama A.Y., Harms M.B., Luo L. Small GTPases Rac and Rho in the maintenance of dendritic spines and braches in hippocampal pyramidal neurons // J. Neurosci. 2005. - Vol.20. - P.5329-5338.

202. Naslund I., RubioG.A., Auer G.U. Nuclear DNA changes during pathogenesis of squamous carcinoma, of the cervix in 3,4-benzopyrene-treated mice // Anal. Quant. Cytol. Histol. 1987. - Vol.9. - P.411-418.

203. Ning Y., Buranda Т., Hudson L.G. Activated epidermal growth factor receptor induces integrin alpha2 internalization via caveolae/raft-dependent endocytic pathway // J. Biol. Chem. 2007. - Vol.282. - N.9. - P.6380-6387.

204. Norkin L.C., Anderson H.A., Wolfrom S.A., Oppenheim A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 is followed by brefeldin A-sensitive transport to the endoplasmic reticulum, where the virus disassembles // J. Virol. 2002. - Vol.76.- P.5156-5166.

205. Ou L.C., Gean P.W. Transcriptional regulation of brain-derived neurotrophic factor in the amygdala during consolidation of fear memory // Mol. Pharmacol. -2007. Vol.24. - P.23-29.

206. Owen R., Gordon-Weeks P.R. Inhibition of glycogen synthase kinase 3beta in sensory neurons in culture alters filopodia dynamics and microtubule distribution in growth cones // Mol. Cell Neurosci. 2003. - Vol.23. - N.4. - P.626-637.

207. Pajalunga D., Mazzola A., Salzano A.M., Biferi M.G., De Luca G., Crescenzi M. Critical requirement for cell cycle inhibitors in sustaining nonproliferative states // J. Cell Biol. 2007. - Vol.176. - N.6. - P.807-818.

208. Palestini P., Pitto M., Ferraretto A., Tettamanti G., Masserini M. Change of ganglioside accessibility at the plasma- membrane surface of cultured neurons, following protein kinase С activation // Biochemistry. 1998. - Vol.37. - P.3143-3148.

209. Panni M.K., Cooper J.D., Sofroniew M:V. Ganglioside GMI potentiates NGF action on axotomised medial septal cholinergic neurons // Brain. Res. 1998. -Vol.812.-P.76-80.

210. Peguet-Navarro J., Sportouch M., Popa I., Berthier O., Schmitt D., Portoukalian J. Gangliosides from-human melanoma tumors impair dendritic cell differentiation from monocytes and induce their apoptosis // J. Immunol. 2003. -Vol.170. - P.3488-3494.

211. Pelkmans L., Kartenbeck J., Helenius A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER // Nat. Cell Biol. 2001. - Vol.3. - P.473-483.

212. Peng X.Q., Zhang X.L., Fang Y. Sialic acid contributes to hyperexcitability of dorsal root ganglion neurons in rats with peripheral nerve injury // Brain Res. -2004. Vol.1026. - N 2. - P.185-193.

213. Petro K.A., Dyer M.A., Yowler B.C., Schengrund C.L. Disruption of lipid rafts enhances activity of botulinum neurotoxin serotype A // Toxicon. 2006. -Vol.48. - N.8. - P.1035-1045.

214. Eur. J. Immunol. 2001. - Vol.31. - P.3153-3164.

215. Phillips J.L., Haggren W., Thomas W.J., Ishida-Jones Т., Adey W.R. Magnetic field-induced changes in specific gene transcription // Biochim. Biophys. Acta. 1992. - Vol.1132. - N.2. - P.140-144.

216. Pigman P., Hawkins W.L., Blair M.G., Holley H.L. Sialic acid in normaLand* arthritis human synovial fluids // Arthritis Rheum. 1958. - Vol.1. - N.2. - P.151-166.

217. Pinkstaff J.K., Detterich J., Lynch G., Gall C. Integrin subunit gene expression is regionally differentiated in adult brain // J. Neurosci. 1999. - Vol.19. -P.1541-1556.

218. Pinthus J.H., Bryskin I., Trachtenberg J., Lu J.P., Singh G., Fridman E., Wilson B.C. Androgen induces adaptation to oxidative stress in prostate cancer: implications for treatment with radiation therapy // Neoplasia. 2007. - Vol.9. -N.l. - P.68-80.

219. Pitto Ml, Mutoh Т., Kuriyama M., Ferraretto A'., Palestini P., Masserini M. Influence of endogenous GMI ganglioside on TrkB activity in cultured neurons // FEBS Let. 1998. - Vol.439. - P.93-96.

220. Porte Y., Buhot M.C., Mons N. Alteration of CREB phosphorylation and spatial memory deficits in aged 129T2/Sv mice // Neurobiol. Aging. 2007. -Vol.5. - P.124-127.

221. Prinetti A., Iwabuchi K., Hakomori S. Glycosphingolipid-enriched signaling domain in mouse neuroblastoma Neuro2a cells. Mechanism of ganglioside-dependent neurogenesis // J. Biol. Chem. 1999. - Vol.274. - N.30. - P.20916-20924.

222. Quinn C.C., Gray G.E., Hockfield S. A family of proteins implicated in axon, guidance and outgrowth // J. Neurobiol. 1999. - Vol.41. - P.158-164.

223. Raff M.C. Social controls on cell survival and cell death // Nature. 1992: -Vol'.356. - N.6368. - P.397-400.

224. Razani В., Rubin C.S., Lisanti M:P. Regulation of cAMP-mediated signal transduction via interaction of caveolins with the catalytic subunit of protein kinase A // J. Biol. Chem.- 1999. Vol.274. - P.26353-26360.

225. Razani В., Lisanti M.P. Two distinct caveolin-1 domains mediate the functional interaction of caveolin-1 with protein kinase A // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2001. - Vol.281. - P.1241-1250:

226. Razani В., Woodman S.E., Lisanti M.P. Caveolae: from cell biology to animal physiology // Mol. Pharm. 2002. - Vol.54. - N.3. - P.431-468.

227. Reiner О., Carrozzo R., Shen.Y., Wehnert M., Faustinella F., Dobyns W.B., Caskey C.T., Ledbetter D.H. Isolation of a Miller-Dieker lissencephaly gene containing G-protein (3-subunit-like repeats // Nature. -1993. Vol.364. - P.717-721.

228. Rickles R.J., Darrow A.L., Strickland S. Molecular cloning of complementary DNA to mouse tissue plasminogen activator mRNA and its expression during F9 teratocarcinoma1 cell differentiation // J. Biol. Chem. 1988. - Vol.263. - P.1563-1569.

229. Ripple M.O., Henry W.F., Rago R.P., Wilding G. Prooxidant-antioxidant shift induced by androgen treatment of human prostate carcinoma cells // J. Natl. Cancer Inst. 1997. - Vol.89. - N.l. - P.40-48.

230. Rodriguez J.A., PiddinL E., Hasegawa T. Plasma membrane ganglioside sialidase regulates axonal growth and regeneration in hippocampal neurons in culture // J. Neurosci. 2001. - Vol.21. - P.8387-8395.

231. Roggentin P., Rothe В., Kaper J.B., Galen J., Lawrisuk L., Vimir E.R., Schauer R. Conserved sequences in bacterial and.viral sialidases // Glycoconjugate J. 1989. - Vol.6. - P.349-353.

232. Roggentin, Т., Kleineidam R.G., Schauer R., Roggentin P. Effects of site-specific mutations on the enzymatic properties of a sialidase from Clostridium perfringens // Glycoconjugate J. 1992. - Vol.9. - P.235-240.

233. Rogue L., Clode A.L., Gomes P., Rosasantos J., Soares J., Castedo S. Cytogenetic findings in «31 papillary thyroid carcinomas // Genes Chromosomes Cancer. 1995. - Vol.13. - N.3. - P.157-162.

234. Rojo J., Diaz V., de la Fuente J.M., Segura I., Barrientos A.G., Riese H.H., Bernad- A., Penades S. Gold glyconanoparticles as new tools in antiadhesive therapy // Chembiochem. 2004'. - Vol.5. - N.3. - P.291-297.

235. Royle M. The proterminal regions and telomere of human chromosomes // Adv. Genetics. 1995. - Vol.32. - P.273-315.

236. Saha S., Mohanty K.C., Mallick Pi Gangliosides enhance migration of mouse B16-melanoma cells through artificial basement membrane alone or in presence of laminin or fibronectin // Indian. J. Exp. Biol. 2005. - Vol.43. - N.12. - P.1130-118.

237. Saito M., Sugiyama K. Characterization of nuclear gangliosides in-.rat brain: concentration, composition, and developmental changes // Arch. Biochem. Biophys. 2002. - Vol.398. - N.2. - P.153-159.

238. Saltman D., Ross F.M., Fantes J.A., Allshier R., Turner G.E., Evans H.J. Telomeric associations in a lymphoblastoid cell line from a patient with B-cell follicular lymphoma // Cytogenet. Cell Genet. 1989. - Vol.50. - N.4>. - P.230 233.

239. Santacroce P.V., Basu A. Studies of the carbohydrate-carbohydrate interaction between lactose and GM(3) using Langmuir monolayers and glycolipid micelles // J. Glycoconj. 2004. - Vol.21. - N.3/4. - P.89-95.

240. Santiago M.F., Berredo-Pinho M., Costa M.R., Gandra M.G., Cavalcante L.A., Mendez-Otero R. Expression and function of ganglioside 9-O-acetyl GD3 in postmitotic granule cell development // Mol. Cell. Neurosci. 2001. - Vol.17. -P.488-499.

241. Saqr H.E., Omran O., Dasgupta S., Yu R.K., Oblinger J.L., Yates A. Endogenous GD3 ganglioside induces apoptosis in U-1242 MG glioma cells // J. Neurochem. 2006. - Vol.96. - N.5. - P.1301-1314.

242. Schander J., Kutoh E., Margot J. Cell-density (cycle) dependent silencer of the rat insulin-like growth factor binding protein-2 (IGFBP-2) gene // Growth Factors.- 1999. Vol.16. - N.3. - P.217—223.

243. Schwamborn J.C., Ptischel A.W. The sequential activity of GTPases RaplB and Cdc42 determines neuronal polarity // Nat. Neurosci. 2004. - Vol.7. -P.923-929.

244. Shaywitz A.J., Greenberg M.E. GREB: a stimulus-induced transcriptional factor activated by a diverse array of extracellular signals // Annu. Rev. Biochem. -1999. Vol.68. - P:821-861.

245. Shi S.H., Jan L.Y., Jan Y.N. Hippocampal neuronal polarity specified? by spatially localized. mPar3/mPar6 and PI-3-kinase activity // Cell. 2003. -Vol.112.-P.63-75.

246. Simons K., Toomre D. Lipid rafts and signal transduction // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2000. - Vol.1. - P.31-39.

247. Shen W., Ladisch S. Ganglioside GDla impedes lipopolysacharide-induced maturation of human,dendritic cells // Cell Immunol. 2002. - Vol.220. - P.125-133.

248. Shu L., Lee L., Shayman J.A. Regulation of phospholipase C-gamma activity by glycosphingolipids // J. Biol. Chem. 2002. - Vol.277. - N.21. - P.18447-18453.

249. Shu L., Shayman J.A. Src kinase mediates the regulation of phospholipase C-gamma activity by glycosphingolipids // J. Biol. Chem. 2003. - Vol.278. -P.31419-311425.

250. Skaper S.D., Katoh-Semba L., Varon S. GM1 ganglioside accelerates neurite outgrowth from primary peripheral and central neurons under selected culture conditions // Brain. Res. -1985. Vol.355. - P.19-26.

251. Sottocornola. E., Colombo I., Vergani В., Taraboletti G., Berra B. Increased tumorigenicity and' invasiveness of C6 rat glioma cells transfected with the human a—2,8 sialyltransferase cDNA,// Invasion Metastasis. 1999. - Vol.18. - P.142-154.

252. Spirman« N., Sela B.A., Schwartz M. Antiganglioside antibodies inhibit neuritic outgrowth from regenerating goldfish retinal explants // J. Neurochem. -1982: Vol.39. - N.3. - P.874-877.

253. Stark G.R., Debatisse M., Giulotto. E., Wahb GM. Recent progress in understanding mechanisms of mammalian DNA amplification // Cell. 1989. -Vol.57. - P.901-908.

254. Steinbeck R.G. Chromosome division figures reveal genomic instability in tumorigenesis of human colon mucosa // Br. J. Cancer. 1998. - Vol.77. -P.1027-1033.

255. Suzuki' Y., Fukuoka K. Neuraminidase in mucolipidoses: normal activity in frozen autopsy tissues- from1 three patients with I-cell. disease and adult, beta-galactosidase deficiency // Clin. Chim: Acta. 1979. - Vol.99. - N.2. - P.107-112.

256. Svennerholm L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method // Biochim. Biophys. Acta. 1957. - Vol.24. - N.3. — P.604-611.

257. Svennerholm L. Quantitative estimation of gangliosides in senile humanbrains // Acta Soc. Med. Ups. 1957. - Vol.62. - N.l/2. - P.l-16.

258. Szabo G., Dolganiuc A., Dai Q., Pruett S.B. TRL4, ethanol, and lipid rafts: anew. mechanism- of ethanol action with implications for other receptor-mediatedeffects // J. Immunol.- 2007. Vol.178. - N.3. - P.1243-1249.

259. Szostak J.W., Blackburn E.H. Cloning- yeast telomeres on linear plasmidvectors // Cell! 1982: - Vol.29. - P.245-255:

260. Takamiya, K., Yamamoto, A., Furukawa, K., Yamashiro, S., Shin, M., Okada, M., Fukumoto, S., Haraguchi, M., Takeda, N.,. Fujimura, K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol.93. - P.10662-10667.

261. Тап S., Wood M., Maher P. Oxidative stress induces a form of programmed cell death with characteristics of both apoptosis and necrosis in neuronal cells // J. Neurochem. 1998. - Vol.71. - P.95-105.

262. Tan S., Sagara Y., Liu Y., Maher P., Schubert D. The regulation of reactive oxygen species production during programmed cell death // J. Cell Biol. 1998. -Vol.141,-P.1423-1432.

263. Tao Q., Henderson A. EMF induces differentiation in HL-60 cells // J. Cell Biochem. 1999. Vol.73. - N.2: - P.212-7.

264. Tao T.-W., Burger M.M. Lectin-resistant variants of mouse melanoma cells. I. Altered metastasizing capacity and tumorigenicity // Int. J. Cancer. 1982. -Vol.29. - P.425-430.

265. Tessier-Lavigne M., Goodman C.S. The molecular biology of axon guidance // Science. 1996. - Vol.274. - P.1123-1133.

266. Tokuda N., Zhang Q., Yoshida S., Kusunoki S., Urano Т., Furukawa K. Genetic mechanisms for the synthesis of fucosyl GM1 in small cell lung cancer cell lines // Glycobiology. 2006. - Vol.16. - N.10. - P.916-925.

267. Tokuyama S., Moriya S., Taniguchi S.-I., Yasui A., Miyazaki J.-I., Orikasa S., Miyagi T. Suppression of pulmonary metastasis in murine B16 melanoma cells by transfection of a sialidase cDNA // Int. J. Cancer. 1997. - Vol.73. - P.410-415.

268. Toledo M.S., Suzuki E., Handa K., Hakomori S. Effect of ganglioside and tetraspanins in microdomains on interaction of integrins with fibroblast growth factor receptor // J. Biol. Chem. 2005. - Vol.280. - N.16. - P.16227-16234.

269. Trudel G.C., Holland P.C. Inhibitors of glycoprotein processing act at an early stage of myogenesis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - Vol.184. -P.125-130.

270. Tsai В., Gilbert J.M., Stehle Т., Lencer W., Benjamin T.L., Rapoport T. Gangliosides are receptors for marine polyoma virus and SV40 // EMBO J. 2003.- Vol.22.-P.4346-4355.

271. Tsia J-W., Chen Y., Kriegstein A.R., Vallee R.B. LIS1 RNA interference blocks neural stem cell division, morphogenesis, and motility at multiple stages // J. Biol. Chem. 2005. - Vol.170. - P.935-945.

272. Uchida Y., Tsukada Y., Sugimori T. Enzymatic properties of neuraminidases from Arthrobacter ureafaciens // J. Biochem. (Tokyo). 1979. - Vol.86. - N.5. -P.1573—1585.

273. Uemura K., Sugiyama E., Taketomi T. Effects of an inhibitor of glucosylceramide synthase on glycosphingolipid synthesis and neurite outgrowthin murine neuroblastoma cell lines // J. Biochem. 1991. - Vol.110. - N.l. -P.96-102.

274. Valaperta R., Valsecchi M., Rocchetta F. Induction of axonal differentiation by silencing plasma membrane-associated sialidase Neu3 in neuroblastoma cells // J. Neurochem. 2007. - Vol'.lOO.' - N.3. - P.708-719.

275. Van Dam Hi, Wilhelm D., Herr I., Steffen A., Herrlich P., Angel P. ATF-2 is preferentially activated by stress-activated protein kinases to mediate c-jun induction in response to genotoxic agents // EMBO-J. 1995. - Vol.14. - P.1798-1811.

276. Von Aulock S., Morath S., Hareng L., Knapp S., van Kessel K.P., van Strijp J.A., Hartung T. // Immunobiology. 2003. - Vol.208. - P.413-422.

277. Wada Т., Yoshikawa Y., Tokuyama S. Cloning, expression, and chromosomal mapping of a human ganglioside sialidase // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1999. Vol.261. - P.21-27.

278. Wagner G.F. The molecular biology of the corpuscles of stannous and regulation of stanniocalcin gene expression. In Fish Physiology, Vol.13: Chapt.9. - pp.273-306. Eds. N. Sherwood and,C. Hew. New Yrok: 1995. Academic Press.

279. Wagner G.F., Vozzolo B.L., Jaworski E., Haddad M., Kline R.L., Olsen H.S., Rosen. G.A., Davidson- M.B:, Renfro J.L. Human stanniocalcin inhibits renal phosphate excretion in the rat // J. Bone Min. Res. 1997. - Vol.12. - P.165-171.

280. Wahl G.M. The importance of circular DNA in mammalian gene amplification// Cancer Res. 1989. - Vol.49. - P.1333-1340.

281. Wang L.J., Colella R., Roisen F.J. Ganglioside GMI alters neuronal morphology by modulating the association of MAP2 with microtubules and actin filaments // Brain. Res. Dev. Brain. Res. 1998. - Vol.105. - P.227-239.

282. Wang Y.E., Esbensen P., Bentley D. Arginine kinase expression and localization in. growth cone migration // J. Neurosci. 1998. - Vol.18. - N.3. -P.987-998.

283. Wang Y., Yamaguchi K., Wada Т., Hata K., Zhao X., Fujimoto Т., Miyagi T. A close association of the ganglioside-specific sialidase Neu3 with caveolin inmembrane microdomains // J. Biol. Chem. 2002. - Vol.277. - N.29. - P.26252-26259.

284. Wang P., Wu P., Zhang J., Sato Т., Yamagata, S., Yamagata- T. Positive regulation of tumor necrosis factor-alpha by ganglioside GM3 through Akt in mouse melanoma В16 cells // Biochem: Biophys. Res. Commun. 2007. -Vol.356. - N.2. - Р.438-Ч43.

285. Warner L. The thiobarbituric acid assay of sialic acid // J. Biol. Chem. — 1959. Vol.234. - N.8. - P.1971-1975.

286. Warner T.G., Chang J., Ferrari J., Harris R., McNerney Т., Bennett G., Burnier J., Sliwkowski M.B. Isolation and properties of a soluble sialidase from the culture fluid of Chinese hamster ovary cells // Glycobiology. 1993. - Vol.3. - P.455-463.

287. Weinstein D.E., Dobrenis К., Birge R.B. Targeted expression of an oncogenic adaptor protein v-Crk potentiates axonal growth in dorsal root ganglia and, motor neurons in vivo // Brain Res. Dev. Brain Res. 1999. - Vol.116. - N.l. - P.29-39.

288. Wiggin G.R., Fawcett J.P., Pawson T. Polarity proteins in axon specification and synaptogenesis // Dev. Cell. 2005. - Vol.8. - P.803-816:

289. Willoughby D., Gooper D.M.F. Organization and Ca2+ regulation of adenylyl cyclases in cAMP microdomains // Physiol. Rev. 2007. - Vol.87. - N.3. - P.965-1010.

290. Wright. S.D., Ramos R.A., Tobias P.S., Ulevitch Mathison J:C. CD 14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding.protein // Science. 1990.- Vol.249. - №4975: - P: 1431^1433: .

291. Wolfl M;, Batten W:Y., Posovszky G., Bernhard H., Berthold F. Gangliosides inhibit the development from monocytes to dendritic cells // Clin. Exp. Immunol. -2002. Vol.130. - P.441-448.

292. Wong C.K.C., Yeung H.Y., Мак N.K., DiMattia G.E., Chan D.K.Or, Wagner G.F. Effects of dibutyryl cAMP on stanniocalcin and stanniocalcin-related protein mRNA expression in^neuroblastoma cells // J. Endocr. 2002. - Vol.173: - P:199-209.

293. Woronovicz A., Amith S.R., De Vusser K. Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase // Glycobiology. -2007. Vol.17. - N.l. - P.l0-24.

294. Wu G., Ledeen R.W. Stimulation of neurite outgrowth in neuroblastoma cells by neuraminidase: putative role of GMI ganglioside in differentiations // J. Neurochcm. •- 1991. Vol.56. - P.95-104.

295. Wu G., Ledeen R.W. Gangliosides as modulators of neuronal Ca2+ // Prog. Brain Res. 1994. - Vol.101. - P.101-112.

296. Xie X., Wu G., Lu Z.H:, Ledeen R.W. Potentiation of a sodium-calcium exchanger in the nuclear envelope by nuclear GM1 ganglioside // J. Neurochem. -2002. Vol.81. - N.6. - P.1185-1195.

297. Xie X., Wu G., Ledeen R.W. C6 cells express a sodium-calcium exchanger/GMl complex in the nuclear envelope but have no exchanger in the plasma membrane: comparison to astrocytes // J. Neurosci. Res. 2004. - Vol.76.- N.3. P.363-375.

298. Xu W., Yoon S.-I., Huang P., Wang Y., Chen C., Chong P. L.-G., Liu-Chen L.-Y. Localization of the {kappa} opioid receptor in lipid rafts // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2006. - Vol.317. - N.3. - P.1295-1306.

299. Yamaguchi K., Hata K., Koseki K. Evidence for mitochondrial localization of a novel human sialidase (NEW) // Biochem. J. 2005. - Vol.390. - N.l. - P.85-93.

300. Yamaguchi К., Hata К., Wada Т. Epidermal growth factor-induced mobilization of a ganglioside-specific sialidase (NEU3) to membrane ruffles // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - Vol.346. - N.2. - P.484-^90.

301. Yamasaki Т., Kawaji К., Ono K., Bito H., Hirano Т., Osumi N., Kengaku M. Рахб regulates granule cell polarization during parallel fiber formation in the developing cerebellum // Develoopment. 2001. - Vol.128. - P.3133-3144.

302. Yang R.B., Mark M.R., Gray A., Huang A., Xie M.H:, Zhang M., Goddard A., Wood W.I., Gurney A.L., Godowski P.J. Toll-like receptor-2 mediates lipopolysaccharide-induced cellular signalling // Nature. 1998. - Vol.395. -N.6699. - P.284-288.

303. Yang R.B., Mark M.R., Gurney A.L., Godowski PJ. Signaling events induced' by lipopolysaccharide-activated toll-like receptor 2 // J. Immunol. 1999. -Vol.163. - N.2. - P.639-643.

304. Yang L.J.S., Lorenzini I., Vajn K. Sialidase enhances spinal axon outgrowth in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - Vol.103. N.29. - P.11057-11062.

305. Yin X.J., Lee H.S., Kim L.H., Shin H.D., Kim N.H., Kong I.K. Effect of serum starvation on the efficiency of nuclear transfer using odd-eyed white cat fibroblasts // Theriogenology. 2007. - Vol.67. - N.4. - P.816-823.

306. Yogeeswaran G., Salk P. Metastatic potential is positively correlated with cell surface sialiulation of cultured marine tumor cell lines // Science. 1981. - Vol. 212. - P.1541-1516.

307. Yoo J., Lee H.K., Kang C.S., Park W.S., Lee J.Y., Shim S.I. P53 gene mutations and p53 protein expression in human soft tissue sarcomas // Arch. Pathol. Lab: Med. 1997. - Vol.121. - P.395-399.

308. Yoshimura Т., Kawano Y\, Arimura N., Kawabata S., Kikuchi A., Kaibuchi K. GSK-3p>regulates phosphorylation of CRMP-2 andi neuronal polarity // Cell. -2005. Vol.120. - P.137-149.

309. Yoshimura Т., Arimura N., Kawano Y., Kawabata S., Wang S., Kaibuchi K. Ras regulates neuronal polarity via the PI3-kinase/Akt/GSK-3p/CRMP-2 pathway // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - Vol.340. - P.62-68.

310. Zakeri Z.F., Quaglino D., Latham Т., Lockshin R.A. Delayed internucleosomal DNA fragmentation in programmed cell death // FASEB J. -1993. Vol.7. - N.5. - P.470-478.

311. Zhou H., Kuang J., Zhong L., Kuo W.L., Gray J.W., Sahin A., Brinkly B.R., Sen S. Tumour amplified kinase STK15/BTAK induced centrosome amplification, aneuploidy and transformation // Nat. Genet. 1998. - Vol.20. - P.189-193.

312. Zuo J.X., Liu Y., Liu J.F., Xue W.P., Yang X.L., Liang J. The study on freezing intercostals nerves for the relief of postoperative chest pain // Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 2007. - Vol.45. - N.14. - P.982-985.

Информация о работе

Прошин, Сергей Николаевич
доктора медицинских наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.25

Диссертация

Сиалидазная активность и морфологические изменения опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы