Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние аппликационной сорбции на системы протеолиза и детоксикации при ожоговой болезни у крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние аппликационной сорбции на системы протеолиза и детоксикации при ожоговой болезни у крыс"

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

РГ6 од ..

ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГИ

1 8 ДВІ І-' -

На правах рукопису

ВОВЯНКО Світлана Ігорівна

ВПЛИВ АПЛІКАЦІЙНОЇ СОРБЦІЇ НА СИСТЕМИ ПРОТЕОЛІЗУ ТА ДЕТОКСИКАЦІЇ ПРИ ОПІКОВІЙ ХВОРОБІ У ЩУРІВ

03.00.04 - біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1995

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України

Наукові керівники: кандидат біологічних наук

Єрецька Олена Василівна

доктор медичних наук, професор Сидорик Євген Петрович

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Богацька Лідія Наумівна

доктор біологічних наук Коваленко Валентина Миколаївна

Провідна установа: Донецький медичний університет

імені М.Горького

Захист відбудеться "2<?. /$- " 1995 р. о______годині______хв

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 50.15.01 в Інституті геронтології АМН України (254114, м.Київ, вул.Вишгород-ська, 67)

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту геронтології АМН України

Автореферат розіслано “ % ^ ^ 1995 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради /•>

кандидат медичних наук /~ Р.І.Потапенко

Загальна характеристика роботи

Актуальність. Проблема опікової травми дотепер залишається актуальною. Більшість авторів погоджується, що опіки як лихо мирного часу є неминучими [Булай П.И., Крысько Л.Т., 1986; Демецкий А.М. и др., 1992; De Roche R. et al, 1994].

У розвитку опікової хвороби провідну роль відіграє синдром ендогенної інтоксикації, який багато в чому обумовлює перебіг хвороби [Лифшиц Р.И. и соавт., 1977, 1986; Федоров

H.A. и др., 1985]. У зв’язку з цим у комплексі лікувальних заходів при опіковій хворобі важливе місце посідають методи еферентної терапії, в тому числі сорбційні методи детоксикації [Повстяной Н.А 1990; Левин Г.Я., 1991]. Найважливішим джерелом інтоксикації є опікова поверхня. Тому триває пошук ефективних засобів запобігання або обмеження резорбції токсичних речовин із пошкоджених тканин при альтерації та запаленні. З цією метою було запропоновано використовувати вуглепеві сорбенти як аплікації на поверхню опіку або рани [Николаев В.Г. и др., 1983; Ерецкая Е.В. и др.,1984; Eretskaya E.V., 1987]. На сьогодні вже набутий певний досвід застосування аплікаційної сорбції (АС) в практиці комбустіології [Бижко И.П. и соавт., 1985-1988; Козинец Г.П. и сотр., 1990]. Вивчалися місцева дія сорбційної пов'язки [Харченко В.Г. и др., 1988; Циганков В.П.,1994] та загальноклінічний ефект АС [Синяпкина

Н.П., 1988]. Як відомо, опікова хвороба супроводжується суттєвими розладнаннями на всіх метаболічних шляхах. Відбуваються порушення метаболізму білків, вуглеводів, ліпідів, нуклеїнових кислот [Камилов Ф.Х., 1975; Симонова Л.И. и др., 1984; Goldstein S.A., 1989]. Важливими патогенетичними

механізмами розвитку опікової хвороби визнають порушення кисень-залежних процесів, енергетичного обміну [Рябинин В.E.,

Лифшиц Р.И., 1990]. Тому розробка сучасних методів лікування вимагає комплексного вивчення патохімії опікової хвороби. Проте, відомі лише окремі дослідження, спрямовані на установлення взаємозв'язку між станом ранового процесу та загальним дезінтоксикаційним ефектом АС [Слесаренко С.В., 1990, 1993]. Разом з тим, дослідження механізмів розвитку опікової хвороби та відповіді організму на лікувальний процес є необхідною умовою оптимізації схем лікування та підвищення його ефективності. Неможливість вивчення ряду суттєвих патогенетичних аспектів в умовах клінічного спостереження обумовлює необхідність проведення експериментальних досліджень. При цьому стан систем, які, за сучасними поглядами, є критичними при опіковій хворобі, в тому числі, білковий обмін і системи природної детоксикації [Лифшиц Р.И и соавт., 1977], повинен бути об’єктом найприскіплишової уваги.

В останні роки ведеться інтенсивна розробка специфічних матеріалів для аплікаційної сорбції, насамперед, вуглецевих. Результати клініко-експериментальних досліджень [Ульченко В.Ю., 1988] свідчать, що ефективність застосувння різних вуглецевих сорбентів для лікування травматичних ран залежить, головним чином, від їхньої сорбційної ємності та кінетичних характеристик, що дозволяє припустити загальний механізм біологічної дії. Вважають, що кращі сорбційні властивості порівняно з іншими аплікаційними сорбентами має АУВМ“Днєпр”МН [Кочергина Л.Д. и др., 1989]. Раніше дослідженнями О.О.Портного та ін, (1984) та нашими дослідженнями [Ерецкая Е.В. и соавт., 1986] було встановлено високу сорбційну активність цього матеріалу відносно ряду біологічних речовин. У зв’язку з вищевикладеним, ми вважали вибір АУВМ “Днепр” МН (далі по тексту - АУВМ)

з

для вивчення впливу аплікаційної сорбції на перебіг опікової хвороби найбільш доцільним.

Мета роботи: вивчити вплив аплікаційної сорбції із застосуванням активованих вуглецевих волокнистих матеріалів на стан систем протеолізу та детоксикації при експериментальній опіковій хворобі.

Основні задачі роботи.

1. Вивчити стан протеолізу в тканинах опечених та інтактних м'язів у динаміці опікової хвороби та можливості корекції його порушень під впливом локальної дії АУВМ на пошкоджені тканини.

2. Визначити вплив АУВМ на фракційний склад білків опечених та інтактних м’язів у динаміці опікової хвороби .

3. Оцінити стан калікреїн-кінінової системи при опіках та при аплікаційно-сорбційній терапії опікової хвороби.

4. Методом ЕПР-спектроскопії оцінити вплив аплікаційної сорбції на вміст і активність молекулярних переносчиків електронів енергетичної та детоксикаційної систем клітини.

Наукова новизна. Вперше виконано дослідження впливу АС із застосуванням АУВМ на перебіг експериментальної опікової хвороби. Встановлено, що детоксикаційна дія цього методу грунтується як на ефекті прямого вилучення токсичних речовин із опікової рани, так і на відтворенні функціональної активності систем детоксикації організму. Показано, що одним із механізмів реалізації ефекту АС є пряма адсорбція протеолітичних ферментів із рани. Вперше проаналізовані зміни якісного та кількісного складу білків скелетних м'язів у залежності від їхньої віддаленості від зони екстремальної термічної дії в різні строки після травми. Встановлено, що зміна складу білкових фракцій може правити за показник відновлення пошкоджених тканин у процесі лікування. Встановлено високий рівень інформативності ЕПР-

спектроскопії як методу контролю за станом систем детоксикації організму при опіковій хворобі та оцінки ефективності лікування.

Практичне значення. Результати досліджень є підставою для включення АС у комплекс лікувальних заходів при опіковій хворобі, вибору тактики некректомії та аутодермопластики. На підставі вивчення динаміки місцевих та загальних змін при опіковій хворобі розроблені модифіковані перев'язочні матеріали з метою застосування на різних стадіях ранового процесу. Одержано рішення про видачу патенту України по заявці N 9305025 "Перев'язочний матеріал" (у співавторстві).

Апробація роботи. На тему дисертації опубліковано 24 роботи. Основні положення дисертації викладені та обговорені на таких наукових форумах: -VII Міжнародному симпозіумі з гемоперфузії (Київ, 1986), -IX Міжнародному симпозіумі з гемо-перфузії, адсорбентів та іммобілізованих реагентів (Токіо, 1989), XVII Європейському конгресі з штучних органів (Болонья,1990), -II Міжнародній конференції з проблем медицини катастроф (Київ, 1991), -II Білоруській конференції "Эфферентные методы в клинике" (Мінськ, 1993), -IX Міжнародному/XX Європейському конгресі з штучних органів (Амстердам, 1993), -Міжнародному симпозіумі "Эндогенные интоксикации"(Санкт-Петербург, 1994), -1 з'їзді Українського біофізичного товариства (Київ, 1994).

Декларація про особистий внесок. Автор дисертаційної роботи приймала участь у розробці програми та методології досліджень, провела патентно-інформаційний пошук, самостійно виконала всі біохімічні, біофізичні, фізико-хімічні методики, провела облік та аналіз одержаного первинного матеріалу, сформулювала положення та висновки роботи.

Положення, що виносяться на захист:

1. Опікова травма викликає метаболічні порушення місцевого та загального характеру, які розвиваються у певній послідовності.

2. Місцеве застосування АУВМ при опіках справляє суттєвий терапевтичний ефект на перебіг ранового процесу. Він виявляється в локалізації та мінімізації необоротних змін тканин та більш швидкому відновленні кількісного та якісного білкового складу пошкоджених та інтактних м'язів.

3. АС із застосуванням АУВМ є ефективним методом детоксикації при опіках. Детоксикаційна дія АС грунтується як на прямому видаленні токсичних речовин із опікової рани, так і на відтворенні функціональної активності систем детоксикації організму.

Структура та об’єм роботи. Дисертацію викладено на 166 сторінках. Вона складається з вступу, огляду літератури, методичної частини, трьох розділів власних досліджень та їх обговорення, підсумку, висновків та списку літератури, що містить 197 джерел. Роботу ілюстровано 5 таблицями та 27 рисунками.

Матеріали і методи дослідження

Роботу виконано на 450 білих безпорідних щурах-самках масою 210-270г, які утримувлись в умовах віварію ІЕПОР НАН України. Після лабораторного обстеження тварин піддавали дозованому опіку шляхом накладання ватно-гасового факела на частину спини, з якої було заздалегідь вилучено волосяний покрив. Площа опіку становила 8 - 10% від загальної площі поверхні тіла щурів, яку розраховували за формулою Р.Бап-Яотап: Б = 10,65 * 3ЛУ2,

де 8 - загальна площа поверхні, см2, - маса тіла щура, г. Термометричний контроль за ступенем прогрівання тканин під

час опіку здійснювали за допомогою мідь-константанових термопар. Патогістологічне дослідження підтвердило, що такий спосіб відтворення опіку викликає пошкодження, яке відповідає ІІІБ - IV ступеню. Динаміку опікової хвороби вивчали на щурах, яких не піддавали ніяким операційним втручанням (група тварин без операційних втручань). Двом іншим групам на 3 добу після нанесення опіку під гексеналовим наркозом (20 мг/кг інтраперитонеально) в асептичних умовах виконували ексцизію опікового струпа. Рани закривали салфетками АУВМ (дослідна група) або марлі (контрольна група), які фіксували клейовою пов'язкою. Перев'язки виконували щоденно на протязі 3 діб і далі через день ще 7 діб. Обстеження проводили в певні строки до 45 доби після опіку. Досліджувані показники порівнювали з показниками у інтактних щурів (норма).

Активований вуглецевий волокнистий матеріал АУВМ “Днєпр”МН з певними характеристиками одержано в ДКТБ ІПМ НАН України за технологією, яка була розроблена сумісно в ІЕПОР ім.Р.Є.Кавецького та ІПМ ім.І.II.Францевича НАН України (ТУ 88 УРСР 147.046-91).

Загальний стан тварин оцінювали за їх зовнішнім виглядом, руховою активністю, кількістю споживаної за добу води та їжі, характером випорожнення. Площу ран визначали ваговим методом [Фенчин K.M., 1979]. Ступінь набряку тканин оцінювали за вмістом води.

Скелетні м'язи досліджували в залежності від їх віддаленості від фактора екстремальної термічної дії: м'язи, розташовані в центрі та на периферії опікової рани, а також інтактні м'язи спини та гомілки (литковий мускул). У водно-сольових екстрактах визначали: кількість білка - мікробіуретовим методом [Кочетов К.Н., 1980], активність трипсиноподібних протеїназ - за

швидкістю гідролізу протамінсульфату [Веремеенко K.H., 1988], антитриптичну активність - за гальмуванням казеїнолітичної активності трипсину [Веремеенко К.Н., 1988], активність кислих протеїназ. (катепсину Д) - за швидкістю гідролізу гемоглобіну [Веремеенко К.Н., 1980]. Диференціальне центрифугування проводили за методом C.DeDuve у модифікації А.В.Покров-ського і А.І.Арчакова (1976). Вільну, загальну (після солюбіліза-ції мембран тритоном Х-100) і зв’язану (різниця між загальною та вільною) активність катепсину Д у лізосомальній фракції та його активність у цитоплазматичній фракції визначали, як описано М.І.Камінським (1985). Диск-електрофорез проводили за методом U.K.Laemmli (1970) у 6% ПААГ у присутності 0,1% ДС-Na (“Multipor”- “LKB”, Швеція); для оцінки молекулярних мас поліпептидів використано суміш білків-стандартів (“LKB”); кількісний аналіз електрофореграм проводили за допомогою лазерного денситометра “UltroScan XL” (“LKB”, Швеція) при довжині хвилі 633 нм.

У плазмі крові, яку стабілізували цитратом натрію з метою виключення спонтанної активації прекалікреїну та інших попередників протеаз у процесі зсідання крові, визначали вміст прекалікреїну [Веремеенко К.Н., 1988], активність калікреїну [Крін-ська A.B., Пасхіна Т.С., 1977] та кінінази 1 [Folk J. et al, 1960], БАЕЕ-естеразну активність [Якубовська Р.І., Пасхіна Т.С., 1977]. Визначення oii-інгібітора протеїназ (сА-ІП) і ofe-макроглобуліну (dî-M) проводили за В.Ф.Нартиковою та Т.С.Пасхіною (1982). Виміри виконували за допомогою спектрофотометра DU-70 (“Beckman”, Австрія) з використанням термостатованої кювети.

Методом ЕПР (радіоспектрометр ЕПР РЭ 1307, 77°К) оцінювали вміст відновлених залізосірчаних центрів N-типу (ЗСЦ) електрон-транспортних ланцюгів енергетичної системи мітохон-

дрій (д=1,94) та окисленої форми цитохрому Р-450 детоксика-ційної системи мікросом ^=2,25) у печінці, нирках, селезінці, мозку, а також рівень Си(ІІ)-церулоплазміну ^=2,05) і транс-ферину (д=4,25) у плазмі крові; ЕПР-спектри тканин м’язів вивчали у діапазоні значень g-фaктopiв від 1,94 до 2,42.

Статистичний аналіз результатів проводили за допомогою прикладного пакету програм “БіаІ^арЬісв-У.г.б.” для ІВМ РС.

Результати досліджень та їх обговорення

Характеристика вмісту й активності молекулярних переносників електронів у скелетних м’язах, нирках та печінні, активності протеолітичних Ферментів та їх інгібіторів у скелетних м’язах та плазмі крові, фракційного складу білків скелетних м’язів у період шоку та ранній постшоковий період.

На першому етапі досліджень ми вважали доцільним вивчити стан обраних нами параметрів на протязі перших 3 діб після нанесення опіку, оскільки метаболічні порушення в період шоку значною мірою обумовлюють подальший розвиток опікової хвороби. Виявлено,що в тканинах зони пошкодження в перші години після опіку збільшується рівень вільних радикалів флаво-та убісеміхінонного типу. Встановлено виникнення та послідовну екстремальну зміну вмісту парамагнітних нітрозильних комплексів негемового (ё=2.03) та гемового ^сереянє=2.007) заліза, наявність яких свідчить про розвиток гіпоксії та некробіотичних процесів у тканинах [Эмануэль Н.М., Сидорик Є.П., 1976]. Активація протеолізу проявляється послідовним підвищенням активності катепсину Д та трипсиноподібних протеїназ у зоні термічного пошкодження та у плазмі крові, яке супроводжується накопиченням о(і-ІП в тканинах. Зменшення вмісту сіг-М у плазмі крові в 1,6 рази через 3 години після опіку узгоджується з припущенням про його елімінацію з кровообігу внаслідок

вибіркового ендоцитозу моноцитами та макрофагами комплексів, які він утворює з активованими протеїназами [Дин Р., 1981]. На час виходу зі стану опікового шоку активність трипсинопо-дібних протеїназ у тканинах на периферії опікової рани перевищує норму в 1,3 рази, а кислих - у 26,5 рази. Ми вважаємо підвищення протеолітичної активності в тканинах і крові одним із факторів, що спричиняють і підтримують активацію калікреїн-кінінової системи, про яку свідчить зростання активності калік-реїну та зниження рівня його попередника при одночасному зменшенні активності кінінази та вмісту інгібіторів протеаз. Такий характер реагування калікреїн-кінінової системи в період шоку спостерігається і при інших видах тяжкої травми [Супрун Т.Ю., 1985] і свідчить про напруження внутрішньосистемних механізмів компенсації кініноутворення та, отже, безконтрольний гіперкініногенез.

Електрофоретичні дослідження дозволили виявити суттєві якісні та кількісні зміни білкового складу скелетних м’язів після опіку. Ми вважаємо, що вони обумовлені термічною денатурацією в зоні опіку, активацією протеолітичних процесів і підвищенням проникності судин. Тобто, відбувається певний перерозподіл білків внаслідок часткової або повної втрати опеченими тканинами деяких білків, з одного боку, та виходу в тканини білків плазми крові, з іншого. Про це свідчить, зокрема, підвищення відносного вмісту альбуміну в скелетних м’язах від 5,5% у нормі до 15-23% на 3 добу після опіку.

Серед системних проявів опікової хвороби особливу увагу привертає до себе зниження ефективності функціонування енергетичної системи мітохондрій і детоксикаційної системи мікро-сом в печінці та нирках: на 2 добу після опіку вміст відновлених

ЗСЦ зменшується в цих органах, відповідно, на 13,3% і 51,5%, а вміст відновленої форми цитохрому Р-450 - на 12,5% і 35,0%.

Запропонований метод аплікаційно-сорбційної терапії полягає в проведенні локальної сорбції шляхом накладання сорбційної пов’язки на опіковий струп або опікову рану після його ексцизії. В наших експериментах опіковий струп висікали на третю добу після опіку, трансформуючи опікову рану в операційну, що дозволяло таким чином усунути одне з найважливіших джерел інтоксикації при цій патології. Подальші дослідження були спрямовані на вивчення ефективності використання вуглецевого адсорбенту АУВМ ”Днєпр”МН, оцінку його впливу на найважливіші системи, відповідальні за розвиток опікової патології.

Вплив аплікаційної спрбиії із застосуванням АУВМ на перебіг опікової хвороби.

- Активність протеолітичних Ферментів та їх інгібіторів V скелетних м’язах. Як показано на рис. 1, після ексцизії опікового струпа двічі підвищується протеолітична активність у тканинах рани: на 5-7 і 21-30 добу після опіку. Збільшення протеолітичної активності на 5-7 добу відбувається при зниженні рівня інгібіторів протеаз. Вказані параметри корелюють за типом оберненої залежності; коефіцієнт кореляції досягає -0,91(о«0,01) у контролі, у дослідній групі він є значно нижчим (-0,59; о(>0,1). При цьому у тварин контрольної групи активність трипсиноподібних про-теїназ в 2,0 рази, а катепсину Д - в 1,5 рази перевищує відповідні показники у дослідних тварин. Підвищення протеолітичної активності на 21-30 добу після опіку супроводжується підвищенням активності інгібіторів. Ці показники корелюють за типом прямої залежності, однак у цьому випадку коефіцієнт кореляції значно вище у дослідній групі (+0,83; о«0,01, ніж у контрольній

Рис.1. Вплив аплікаційної сорбції із застосуванням АУВМ на систему протеїнази - інгібітори в скелетних м’язах опечених щурів

о - марля _ ценТр опікової рани ь ' маРля - неопечені м’язи спини

• - АУВМ * - АУВМ

□ - марля _ опікової рани * " маРля - неопечені м’язи гомілки

■-АУВМ •-АУВМ

По осі абсцис - час після опіку, доби.

* - різниця між контрольною (марля) та дослідною (АУВМ) групами є достовірною, р< 0.05.

(+0,52; о>0,1). На наш погляд, наведені дані свідчать про більш збалансований стан системи протеїнази - інгібітори в разі застосування АС як у період розвитку реакції запалення (5-7 доба), так і при розвитку регенеративно-репаративних процесів у

рані (21-30 доба). На 45 добу в обох групах тварин активність ферментів та інгібіторів виявляє виражену тенденцію до нормалізації у всіх тканинах, крім центру опікової рани. Слід, однак, зауважити, що у щурів контрольної групи активність катепсину Д на периферії опікової рани у цей термін залишається ще досить високою і становить 152,1+19,6 нмоль/(схг) порівняно з 23,1+1,2 нмоль/(схг) у дослідній.

Визначення активності катепсину Д у субклітинних фракціях у різні строки після опіку виявило, що деструкція мембран лізосом відбувається як в опечених, так і у віддалених від зони опіку м’язах. Але застосування АУВМ значно зменшує ступінь лабілізації та пошкодження лізосомальних мембран, про що свідчить зниження в цьому випадку не тільки загальної активності катепсину Д, а й частки його вільної активності та активності у цитоплазматичній фракції (Рис.2).

Все це викликає закономірний інтерес до механізмів впливу АС на процеси протеолізу в скелетних м’язах. Результати наших досліджень свідчать про існування ефекту прямої адсорбції ферментів із рани та високу сорбційну ємність АУВМ до протеолітичних ферментів і продуктів протеолізу. Після контакту пов’язок з поверхнею рани вони виявляють активність кислих протеїназ: марля - 125,2+51,6 нмоль/с на см2 пов’язки та АУВМ -396,9+35,0 нмоль/с на см2 пов’язки, і трипсиноподібних: марля -80,9+8,0 нмоль/с на см2 пов’язки та АУВМ - 171,3+14,7 нмоль/с на см2 пов’язки. Вивчення десорбції свідчить про більш міцне зв’язування ферментів АУВМ порівняно з марлею. Збереження активності ферментами в іммобілізованому стані забезпечує можливість здійснення локального протеолізу із подальшою адсорбцією продуктів на пов’язці АУВМ. Завдяки цьому

збільшення сухої ваги пов’язок за добу становить для АУВМ -87,1±2,7%, тоді як для марлі - лише 21,7+8,1%.

Рис.2.

Вплив аплікаційної сорбції із застосуванням АУВМ на активність катепсину Д в скелетних м’язах щурів на 7 і 21 добу після опіку Щ - вільну, в - зв’язану,| |- у цитоплазматичній фракції

а - центр опікової рани в - неопечені м’язи спини

б- периферія опікової рани г - неопечені м’язи гомілки

По осі ординат - % досліджуваної активності відносно загальної.

* - відміна від норми є достовірною, р< 0.05.

- Фракційний склад білків скелетних м’язів. Порівняльний аналіз водорозчинних білків скелетних м’язів спини і литкового м’язу інтактних щурів методом електрофорезу дозволяє виявити в їхньому складі біля 23 фракцій. В обох м’язах переважають фракції з Яг 0,78; 0,72; 0,69; 0,67 та 0,61 (приблизна молекулярна маса 37, 44, 48, 51-52 та 66 кДа). Білки з Яг 0,94; 0,93; 0,84; 0,58 та

0,50 (молекулярна маса 18, 24, 31, 69 та 86 кДа) присутні в

менших кількостях, інші білкові фракції мінорними. Термічна травма викликає істотні зміни білкового складу як опечених, так і не опечених м’язів: з’являються додаткові компоненти з низькою молекулярною масою (Яг 0,87; 0,82; 0,80; 0,74; 0,71), збільшується відносна кількість білка у фракціях, які відповідають білкам плазми крові (Яг 0,61 та 0,24). Розвиток некрозу в зоні пошкодження спричиняється до того, що білковий спектр цих тканин, навпаки, вичерпується з ряду фракцій, скорочуючись до 5 основних - з Яг 0,93; 0,69; 0,61; 0,58 та 0,24; при цьому домінує фракція альбуміну, частка якої в деяких випадках досягає 34,1%.

При застосуванні АУВМ білковий склад неопечених м’язів спини відновлюється на 7, а тканин на периферії опікової рани - на ЗО добу після опіку, тоді як у контролі до 45 доби нормалізації не спостерігається.

Рис.З.

Вплив аплікаційної сорбції із застосуванням АУВМ на вміст альбуміну в скелетних м’язах опечених щурів

О - марля центр опі-

О - АУВМ" кової рани

□ - марля периферія ■ - АУВМ опікової рани

д- марля _ неопечені д - АУВМ м’язи спини

ф - марля неопечені ф - АУВМ м'язи гомілки

* - різниця між контрольною (марля) та дослідною (АУВМ) групами є вірогідною, р< 0.05.

Як демонструє рис.З, зміна відносного вмісту альбуміну в тканинах усіх досліджуваних м’язів має у динаміці опікової хвороби більш-менш виражений біфазний характер. Але максимальних значень цей показник досягає в різні терміни опікової хворо-

би, в залежності од віддаленості досліджуваної тканини від зони екстремальні термічної дії. При застосуванні пов’язок АУВМ відносний вміст альбуміну вірогідно зменшується порівняно з контролем у тканинах усіх м’язів, а в литковому м’язі вже на 4 добу не відрізняється від норми. Це свідчить про зниження підвищеної проникності судин під впливом АС, що може бути доказом зв’язку між адсорбцією біологічно активних речовин із рани пов’язками АУВМ та активацією калікреїн-кінінової системи, відповідаль-ної за стан судинної проникності.

- Стан калікреїн-кінінової системи. Операція ексцизії опікового струпа, яка є додатковою травмою, призводить до повторного збільшення активності калікреїну й загальної протеолітичної активності плазми крові та зниження вмісту прекалік-реїну, активності кінінази й оЬ-М, тобто до розвитку змін, які сприяють накопиченню кінінів у плазмі крові. АС, розпочата відразу після ексцизії струпа, значною мірою запобігає негативним ефектам операційного втручання, забезпечуючи більш збалансований стан калікреїн-кінінової системи в процесі розвитку реакції-відповіді на опікову та операційну травму. Активність калікреїну зростає після операції в дослідній групі не так істотно, як у контрольній, і становить 588,0+62,0 нмоль/(схл) та 1064,0+98,0 нмоль/(схл), відповідно. Зниження рівня прекалікреї-ну також не є таким значним, і через добу після операції його вміст відносно норми становить 82,9% у дослідній групі порівняно з 64,1% у контрольній.

У період гострої опікової токсемії збільшення активності протеолітичних ферментів супроводжується підвищенням рівня інгібіторів незалежно від виду пов’язки. Активність кінінази також зростає, але у контрольних тварин залишається на 19,2% нижчою, ніж при застосуванні пов’язок АУВМ.

Зміни загальної активності трипсиноподібних протеїназ плазми крові мають фазний характер. Наші спостереження узгод-жуються з даними К.М.Веремієнко і співавт. (1984), якими було показано, що така “хвилеподібна” зміна протеолітичної актив-ності у динаміці опікової хвороби є характерною для хворих із сприятливим її результатом. Слід зауважити, що максимальне значення активності трипсиноподібних протеїназ під час другого підвищення, яке відповідає процесу нагноєння та очищення ран із формувнням повноцінного грануляційного валу, реєструється в групі тварин із пов’язками АУВМ на 7 добу після опіку, тобто на 6-8 діб раніше, ніж у контролі.

- Детоксикаційний ефект аплікаційної сорбції. Раніше було показано [Корчева Л.М., Бурлака А.П., Сидорик Є.П., 1990], що оцінка вмісту й активності молекулярних переносчиків електронів детоксикаційної системи мікросом і енергетичної системи мі-тохондрій печінки та нирок за допомогою ЕПР-спектроскопії може бути ефективним методом контролю токсичності лікар-

Рис.4.

Вплив аплікаційної сорбції із застосуванням АУВМ на вміст відновлених ЗСЦ у нирках та печінці опечених щурів:

1 - без операційного втручання

2-з марлевими пов’язками (контроль)

З - з пов’язками АУВМ (дослід)

По осі ординат - інтенсивність

сигналу ЕПР &=1,94), відн.од.

Штрихами позначено область

значень для інтактних тварин.

Ми вважали доцільним використати ці показники для оцінки рівня ендогенної інтоксикації в динаміці опікової хвороби. Виявлено, що більш ранні зміни відбуваються в нирках (Рис. 4). У печінці вміст відновлених ЗСЦ вірогідно знижується в період токсемії. Наявність позитивної кореляції високого ступеня між вмістом відновлених ЗСЦ і окисленої форми цитохрому Р-450 на протязі опікової хвороби (коефіцієнт кореляції +0,91) свідчить про недостатність енергозабезпечення гідроксилюючої системи мікросом енергетичною системою мітохондрій.

Операція ексцизії опікового струпа призводить до повторного істотного зменшення вмісту відновлених ЗСЦ нирок у контролі через добу після неї. Застосування АС дозволяє певною мірою запобігти післяопераційному пригніченню функціональної активності нирок і прискорює відновлення активності цього органу. Аналіз спектрів ЕПР печінки теж свідчить, що ексцизія опікового струпа сприяє менш вираженому прояву опікової інтоксикації. У період септикотоксемії (21 доба) вміст відновлених ЗСЦ печінки становить порівняно з нормою: у опечених щурів без операційного втручання - 66,1%, у щурів контрольної групи - 85,8%, а при застосуванні АС цей показник вірогідно не відрізняється від норми.

Порівняння зміни вмісту металоферментів у плазмі крові зі зміною вмісту в опечених м’язах парамагнітних нітрозильних комплексів гемового та негемового заліза виявляє, що зростання гіпоксії в тканинах супроводжується зниженням рівня трансфе-рину. Ексцизія опікового струпа і подальше ведення рани під пов’язками не впливає якісно на характер розвитку спектрів ЕПР м’язів. Загоєння опікової рани характеризується послідовним зникненням сигналів нітрозильних комплексів у спектрі ЕПР м’язів. На 45 добу у 50% контрольних тварин зберігається

інтенсивний сигнал ЕПР, обумовлений вільними радикалами (§=2,00), тоді як при проведенні АС спектр ЕПР нормалізується у цей термін повністю.

- Вплив аплікаційної сорбнії на загоєння опікової рани. Спостереження за перебігом ранового процесу показало, що ексцизія опікового струпа суттєво зменшує набряк пошкоджених тканин. Про це свідчить зниження в них вмісту води: в контрольній групі - на 16,0%, а під по-в’язками АУВМ - на 22,0%. Через 2-3 доби після цієї операції під пов’язками АУВМ формується сухий сгруп, у той час як у контрольних тварин рани залишаються вологими, з набряклими краями.

Загоєння ран у тварин обох груп відбувається без нагноєння і розплавлення суміжних тканин, переважно за рахунок крайової епітелізації. При цьому у дослідній групі ми спостерігали завершення епітелізації на 39-41 добу, тобто на 5-7 діб раніше, ніж у контрольній.

Таким чином, аналіз і співставлення одержаних даних свідчить, що АС із застосуванням АУВМ забезпечує синхронну корекцію порушень метаболічних процесів у зоні опіку та поза нею. Дія АС спрямована на найважливіші патогенетичні ланки синдрому ендогенної інтоксикації. Пряме вилучення токсичних речовин із опікової рани певною мірою дозволяє зупинити розвиток токсемії. Відновлення мікроциркуляції запобігає прогресуючому розвитку гіпоксії та вторинного некрозу. Особливо слід підкреслити відновлення під впливом АС функціональної активності власних систем детоксикації організму. Все це дозволяє визнавати АС із застосуванням АУВМ ефективним методом сорбційної детоксикації при опіках.

Висновки

1. При розвитку опікової хвороби у щурів відбувається активація протеолізу в скелетних м’язах і плазмі крові. Аплікаційна сорбція із застосуванням АУВМ зменшує рівень патологічної активації протеїназ та їх інгібіторів у тканинах опечених та віддалених від зони опіку скелетних м’язів, а також знижує ступінь лабілізації та деструкції лізосомальних мембран. При цьому має місце адсорбція пов’язками протеолітичних ферментів і продуктів протеолізу з опікової рани.

2. Реакція калікреїн-кінінової системи на опікову травму характеризується значним відставанням активації інгібіторів та інактиваторів системи від зростання активності кініногеназ. Аплікаційна сорбція сприяє збалансованості реакції системи на опікову травму та операцію ексцизії опікового струпа, зменшуючи проникність судин для білків плазми крові.

3. Термічна травма викликає істотні зміни кількісного та якісного складу водорозчинних білків опечених та віддалених від зони опіку скелетних м’язів. Аплікаційна сорбція обмежує розвиток вторинного некрозу, сприяє відновленню білкового складу неопечених м’язів на 7, а тканин на периферії опікової рани - на ЗО добу після опіку.

4. Аплікаційна сорбція підвищує вміст відновлених залізо-сірчаних центрів И-типу енергетичної системи мітохондрій та окисленої форми цитохрому Р-450, який знижується в тканинах печінки та нирок внаслідок термічної травми та після операції ексцизії опікового струпа. Це є показником відновлення ефективності функціонування електротранспортних ланцюгів енергетичної системи мітохондрій та детоксикаційної системи мікро-сом печінки та нирок.

5. Аплікаційна сорбція справляє суттєвий терапевтичний ефект на перебіг ранового процесу, про що свідчить скорочення строку загоєння опікової рани на 6+1 день.

6. Результати досліджень дозволяють рекомендувати аплікаційну сорбцію як метод, що забезпечує можливість здійснення тактики ранньої некректомії, запобігаючи розвитку метаболічних порушень та синдрому ендогенної інтоксикації.

. Основні публікації за профілем дисертації

1. Исследование сорбции белков плазмы крови активированными углеродными волокнистыми материалами /Співавтори: Е.В.Ерецкая, В.Г.Николаев, В.П.Сергеев, А.В.Стефанов; Хим.- фарм. журнал, 1986, N 3., С.360-365/.

2. Влияние аппликационно-сорбционной терапии на активность некоторых ферментов и ингибиторов в динамике травматической болезни /Співавтори: Е.В.Ерецкая, Л.А.Сахно, В.Ю.Ульченко; Клин.хирургия, 1989, N 4, С.32-34/.

3. Экспериментальное обоснование раннего применения аппликационной сорбции в лечении ран /Співавтори: Е.В.Ерецкая, Л.А.Сахно, В.Ю.Ульченко; Клин.хирургия, 1989, N

1, С. 15-17/.

4. Local adsorption with fibrous activated carbon materials (ACFM) as a correction method of some biochemical bum failures /Співавтори: E.V.Eretskaya, I.A.Lozinskaya, A.V.Verbinenko; Int.J. Art.Org., 1990, 13, N 9, Р.631/.

5. Basic studies of local adsorption in bum treatment/ Співавтори: L.A.Sakhno, V.G.Nikolaev, I.A.Lozinskaya, V.M.Yudin; Biomat., Art.Cells . Immob.Biotech, 1991, 19, 1, Р.111-128/.

6. Изменение содержания и активности молекулярных переносчиков электронов и металлоферментов при локальных термических ожогах /Співавтори: Е.В.Ерецкая, Л.М.Корчевая, Е.П.Сидорик; Доповіді АН України, 1992, N.3, С.110-112/.

7. Détoxification efîect of local adsorption in the management of bums: ESR research /Співавтори: E.V.Eretskaya, L.M.Kor-chevaya, E.P.Sidorik; Int.J.Art.Org., 1993, Ц, 6, Р.486/.

8. Детоксикационный эффект аппликационно-сорбционной терапии при термических ожогах и его оценка методом ЭПР /Співавтори: Е.В.Ерецкая, Л.М.Корчевая, Е.П.Сидорик; Доповіді АН України, 1994, N11, С. 157-160/.

9. Влияние аппликационно-сорбционной терапии на динамику активности молекулярных переносчиков электронов энергетической и детоксицирующей систем клетки при экспериментальной ожоговой болезни /Співавтори: Е.В.Ерецкая, Л.М.Корчевая; Вопросы медицинской химии, 1995, 4J_, N 2, С. 15-19/.

10. Рішення про видачу патенту України по заявці N 9305025 "Перев'язочний матеріал" (пріоритет від 30.12.1992) /Співавтори: О.В.Єрецька, В.О.Жуковський, В.М.Заболотний та ін./

11. Новые материалы и метод активного хирургического лечения гнойных ран /Співавтори: К.С.Терновой, А.ЛЛюбинец-кий, А.В.Кусков; Сорбционные методы детоксикации и иммунокоррекции в хирургии. - Ташкент: Медицина, 1984, С. 17- 18/.

12. Case of 90 % surface bum treatment with carbon dressing material AUVM DNEPR MN /Співавтори: V.P.Kostenko, H.Sh.Shukurov, V.G.Korotich; Abstr. of the VII Int. Symp. on hemoperfusion, September 10-14 1986, Kiev, P. 121/.

13. Влияние аппликационно-сорбционной терапии на динамику протеолиза при термическом ожоге в эксперименте /Співавтор: Е.В.Ерецкая; Тезисы 2й Белорусской конференции “Эфферентные методы в клинике” 6-8 мая 1993г, Минск, С.27-28/.

14. Изучение механизмов лечебного действия аппликационной сорбции при экспериментальной ожоговой болезни /Співав-тор.Е.В.Ерецкая; Эндогенные интоксикации, С.-Пб,, 1994, С.115/,

Вовянко С.И. Влияние аппликационной сорбции на системы протеолиза и детоксикации при ожоговой болезни у крыс.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04-биохимия, Ин-т геронтол., Киев, 1995.

Защищается 24 научные работы и I патент, содержащие результаты экспериментального исследования механизмов аппликационной сорбции (АС) с применением активированных углеродных волокнистых материалов при ожоговой болезни. Установлено, что модулирующее действие на течение раневого процесса и системный эффект АС обусловлены прямым удалением токсических веществ из ожоговой раны, снижением патологической активации протеолиза, коррекцией нарушений микроциркуляции, восстановлением функциональной активности систем детоксикации организма.

Vovianko S.I. Effect of local adsorption on proteolytic and detoxifying systems in burned rats.

Thesis in fulfilment of the requirements of the Candidat of biological sciences in the speciality of biochemistry. Inst. Gerontol., Kiev, 1995.

24 scientific papers and 1 patent are presented for defence, which contain the results of experimental study of mechanisms of local adsorption (LA) method with the use of activated carbon fibrous material in the dynamics of bum disease in rats. Therapeutic effect of LA on the wound healing and systemic effect of LA are proved to be based on the direct elimination of toxic substances from the bum wound, attenuation of pathologic activation of proteolysis, correction of microvascular permeability alterations as well as normalisation of the native detoxification systems functional activity. Ключові слова:

опік, аплікаційна сорбція, детоксикація, протеоліз, щури.

Підписано до друку 24.11.95. Формат 60*84/16 Умов. друк, л 1.03. Тираж 100 прим. Заказ 474/Ш50

Надруковано на Ризографі АТ “ДиалогКиів”