Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние анти-CD4 мАТ на регуляцию пролиферации Т-клеток трансформированных вирусом H.saimiri

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние анти-CD4 мАТ на регуляцию пролиферации Т-клеток трансформированных вирусом H.saimiri"

о

РОССИЙСКАЯ АКАДЕГС1Я МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГЕЛАТОЛОГИЧЕС1Ш НАУЧНЫЙ ЦЕНТ?

па правея руксзисп

ЩИТАЕВ Николай Аркадьевич

ВЛИЯНИЕ AHiH-CD4 MAT НА РЕГУЛЯШП ПРОЛИФЕРАЦИИ Т-КЯЕГОК ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ВИРУСОМ я. saimirí .

03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата Отологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии и

ревматологии общества Макса Планка

(Ерланген, ФРГ), и

в гематологическом научном центре РАМН

(Москва, Россия).

Научные руководители: В.М. Broker, PhD.,

кандидат биол. наук А.Б. Судариков,

Официальные оппоненты:

доктор мед. наук, профессор Т.И. Булычева кандидат биол. каук С.Г. Егорова

Ведущая организация: ' Институт биохимии им. А.Н.Баха РАМ.

Защита диссертации состоится « »...........IS94 г.

в час. на заседании диссертационного совета Д 001.45.02 при Гематологическом научном центре РАМН (Москва, Новозыковский

пр.4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН (I25I67, Москва, Новозыкозский пр.4а). 1 »

Автореферат разослан с »..............'..■;____1994 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета .

кандидат биологических наук

А.Д.Реук

общая xipäkteracxkka работы Актуальность ур&отч. Среда исследований, посвга).енп»'г изучение гс-тмуногогическсгг. ответа клонированных Т-ли^оцктов человека, негатквкзя регуляция прож^ергцик Ч'-клеток звкимчст особое псхго-жэш:з. Досигаения в бтой oö.wra i'^ieor не только ак-дэмическиЯ интерес, но и ¡¡гчроко внедряются в клиническую практику. Зкачи-талснке усилия были направлены на изучение негативного елиянн:! ::а ироли'^зр^тжгзь.'Ч ответ Т-лим5оцитоз моноклональкчх антител (nVT), реаг>гртгд>ге с сги рецептором. Актуальность «^следования этого вопроса продиктована реавэдей ролъв см* т--ое-йоцитов в иммлюлогччзсюп реакциях отторзеяия трансплантанта, при первичном и вторичном гуморальном иммунологическом ответе, и при индукции специфической толерантности [Chariten, в. et »i. ioes]. Однако, несмотря на несомненно загнув регуляторнузэ функцию cm* Т-клеток в иммунологических реакция:, участае сем рецептора в регуляцм ответа Т-юютками до конц8 на Еыяскена [ Janeway.

с. а. jr. ics^l.

cd* рецептор взаимодействует со своим природам лигандом -мкс-и молекулой и способствует адгезии cew* 7-клетск на mhc-ii позитивные клетки. Ко-рецепторная активность см молекулы заключается в том, что в процессе взаимодействия Т-клеточяого рецептора для антигена (тек) с антигенным легпвдом, связанный с мне-и молекулой, CD4 рецзптор физически взаимодействует с тек и одновременно с мне-и. в результате такого межкшекулярного взаимодействия происходят следупцяе события: а) стабилизируется

Ich

TCR/Ag/KHC-Ii/сен хоилекс: б) протен-тирозкновая киназа р5в связанная с cm рецептором, вжшифицируст актазирупскй сигнал, енкгая концентрации антигена (лд) несбходо/уп для ахпувации Т-КЛвТКИ В 30-300 раз [Eichm&nn, К. . et al. 1387]. СЯрЭТОЙ СТОрОны имеются дгнные уквзывепцие, что на определенных этапах роста

з

Т-лим$оцитсю сигналы, генерируемые cd-i рецептором приводят к негативной регуляции их пролиферации в отсутстоии взаимодействия

TCRXAg^MHC-II [Schrezenmeier, Н. . et al. 1938; Fleisher. В., et

ai. 19Q8]. Шло показано, что анта-спм мдт способны ингибирозать пролиферации Т-лим$оцитоз на поздней стадии актавэции и/или при ИЛ-2 зависимой стадии роста. Однако, механизм действия анти-см, антител остется невыясненньи.

Сложность изучения физиологических свойств со4 рецептора затрудняется отсутствием адекватных моделей клонированных Т-лимфоцитов человека, позволяющих провести детальные исследования. Очевидно, что для более подробного изучения функции cd4 рецептора необходимо использовать модель клеток, в которой интерференция CD4 рецептора с его природными лигандами - антигенами мне класса и - будет минимальной, что позволит дискриминировать результат использования анта-сси антител от просто блокировки TCR^Ag^iHC взаимодействия.

В свсях исследованиях мы использовали клонированные cim* Т-люфощпы человека, трансформированные вирусом ы.saimirí, как модель активированных Т-клеток, свободных от контаминации арс

[Biesinger. В., et al. 1990]. В рвЗУЛЬТаТв Трансформации КЛЗТКИ

приобретали способность к пролиферации в присутствии экзогенного рИЛ-2, стабильно экспрессировали поверхностные рецепторы

[Biesinger. В., et al. 1992].

Цели и задачи исследования. Охарактеризовать функциональные свойства травзформированных вирусом «.saimirí клонированных Т-лимфошггов человека. Используя нvs-трансформааты, как модель активированных Т-лимфоцитов человека, изучить влияние антител, реагирупцих с cda рецептором на физиологическую егпгвность Т-лим£оцитов человека.

Научная новизна работа. Была подучена панель Т-клонов человека,

иммортализob9иных вирусом н. saimirí. Сили проведеаы детальные срагкзния мекду трвнсЛормированньм! и "нормальный родительскими клонами. Ha ochoeshjd; вкспериментзлъных данных (Зато показвно, что трансформация вирусом л. saimirí не влияет на функдасиальнь>е свойства клонированных Т-лимфоцитов человека.

Були получены оригинальные данные по влиянию га продуферз-т-1вР1!Х ответ Т-г.яото;; мсноклональшг антител (мА.7). реэгзфунцих ^ cüí рецеш~^с.; но поверхности Т-лжйоцктов. Доказано, что обработка 'iTOH-ipoBXKHbK Т-лк-фодитов анта-с04 кешклоналыы'® ангаголь^гл грпнодат :с Сустра.у исчезнсЕскяэ «-цегпт (CD25) репеп-тсра и-2 с поверхности клеток, свойство не vzsevrdoe ранее. Было установленоv что нагибирущкй эфйект внти-см мАТ является специфическим негатазным регуля.торньм сигкзлсм п не связен с разобщением cd4/mkc-:t взаимодействия. Обнаружено, что у обработанных 2LTK-CD4 мАТ Т-л!>фоцитов значительно сикается секреция Ш1-2. Твким обрассм, показано участие cd-i рецептора в получении специфичесагс сигн&лоа, не связанных напрямуа о распознаванием антигена в контексте мнс-п/тст.

Пря.дтлесхчя сна^Аюстг- гэботы. Полученные результаты проливают свет на новые, до ci?: пор не исследованные, процессы негативной регуляции пролздерэцта т-люфоцптов. Данныз сгаэдэтвльствзгазга об участи«! coa рецептора в получении специфических сигналов, не связанных капрямуз с распознаванием антигена в контексте мне-ii/tcr имеют важное значение для разработал методов shth-cd4 терапии различных и?ф:унрпятолоп:Ч человека.

¿гргбзуря рзбетн. Результаты исследоЕЭний бьин догохены на Европейской конференции "Therapeutic Imuunomodulatiois. Theory and Practice" (Вас1 Windaheäm. 1992), HO 23 егеГОДНОЙ ЗСТреЧЬ

Общества :кму:юлогии Германки (mainz, feg. I9SC). Пуб.тпкя-^пи. По мэтелкалам диссертации опубликованы I статья к

тезисы 2-х сообщений. I статья в печати.

ШТЕИ1АЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клетки культивировали в среде rphi ís-io с добавками: L-глутамин (4 мМ). HEPEs-буфер (0.015 М), пенициллин (200 Ед/мл). стрептомицин (200 мкг/мл) и ira сыворотки теленка (fcs) или сыворотки человека, при 37°С, 5% С02, во влажной атмосфере. После инфекции клеток вирусом и. saimirí, в среду добавляли 5025 среды се и рИЛ-2 человека (50-100 Ед/мл).

Выделение Т-хлеток из крови человека. Периферические клетки человека (рвмс) были получены из крови здоровья доноров изократи-ческим центрифугированием в соответствии со стандартной процедурой [Beverley, p. 1988]. Цитометрический анализ с использованием мат (октз и Leu—из) показал, что в результате выделения >90% и <1% клеток давали полозительнув реакцию на спэ и coi4 маркеры, соответственно.

Клонирование Т-кдвток человека. Т-клетки позитивные на vpe.7 селективный элемент Т-клеточного рецептора были клонированы методом лимитаруидих разведений. Рост клонированных клеток стимулировали в присутствии 5 х 10* облученных 3000 Рад. рвмс и добавлением РНА (0.5 маг/мл) и рИЛ-2 человека (50 Ед^лл). Для псяуче--ния клонов с известной антагенной специфичностью, рвмс культивировали в присутствии антигена 10 мкг/мл. (столбнячного токсина -CT) 10 дней. После двухкратной стимуляции в присутствии антигена и облученных фидерных клеток антиген-специфичные Т-клетки были клонированы методом лимитарущих разведений. Два клона позитивных на v/зв. 7 селективный элемент с неизвестной антагенной специфичностью (39 и 48) и один СТ-специЕичный клон (68/5), были использованы ДЛЯ трансформации вирусом н. saimirí (HVS-КЛОИЫ). Трансформация Т-клетох человека вирусом н. saimirí. Трансформация

клеток вирусом н. sain.ífi штамм о 488-77 лрозодивась в соответствии С МвТОДККОЙ Предлогеноя ранее t Biosinger. 3., -ít Í.1. 1Э92). этот етап рэботы был проведен в сотрудничестве с группой

Dr. Ь. Fleckenstein, ИНСТИТУТ БИрУСОЛСГИИ (Erlangen, FRG).

!1роА2ф5р;:гязк»р те ara. 10* кл. / чуш^ ресуспедагосвали ;:а 93-ллютньй с:оскодончке шанса; в присутствии изучявиьа стимулов (антатепз, рМ-2, и др.). Антиген-специфичные клоны активировали р присутствии облученных аутолопикых гвкс (2-3 х 10*) гчшэнкых Т-зигеток методом розеткообразозанкя с эритроцитами барана. Сек-реит'т лЯ-2 Hvs-клонеми, тестнровглась бкотестом, используя М-2-заЕЖхамуя жяио жни ст-м к 10* клеток cm нг лужу в 150 ккя. среды прибавляли 50 мкл. супернат"ята или 50 икл. титрованного стандарта рИЛ-2. Клетки переносили з инкубатор и 1сульткзировзли в течении 48 часов, культуры клеток линии ст44 культивировали В чгоов. После этого добавляли с ^н ] тямидик (í^o. ) и клетки культи-яирсвали еще 16-16 часов. Клетки пригасили ка стеклянный фильтр и .¡газировали. Высутаентю фильтры анализировали на /з-счетчике. Игд'таыйлуоресрекиаа гид:з. Окрашивание клеток для анализа проводили в ras, pH 7.2 с добавками fes (5%) и ззэда натрия (0.02%) кг льду. Клетки 2 х I03 кнкубтровали 60 млн в присутствии меченных fi тс мат. реагирустдимх с соотвэтстауп^им рецепторе«. Негела-телъное связывание антител с Fc-рзцепторами блокировалось 300-кратны-; избытком ige человека (фракция ix по Кону). Окрашенные клетки исследовались нэ клеточном сортере.

йз^зценна коицзктрацеи поноэ кальция внутри клаткя. Для измере-ш концентрации кокез кальция суспенаив клеток ипг-субировали с ^луороАргмом rura-2/АМ. Еидарения. прозодим при 505 нм с возбуз-ДЭГдЗЙ длинней ВОЛНЫ 340 ЕМ. К8К СПКСЭНО В работе tMvirphy. Е. , et al. 1в£0].

КодксблстгЕнг. Фосфорилированиз клеточньи белкоз по аминокме-

лотным остаткам тирозина изучалось иммуноблоттангом лизатов клеточных культур с анта-фосфотарозшовьми мАТ ртгго. Этот этап работы проводился В сотрудничестве С Dr. A. Yu. Tsygankov. Signal

Transduction Laboratory. Bristol-Mayers Squibb. HJ. USA. Процедуру иммувоблоттага клеточных лизатов проводили согласно методике описанной В работе [Tsygankov. A. Yu, et al. 1892]. Измерение концентрации ИДИ-r человека методом elisa. Супернатан-ты от кулыуры клеток (как отмечено в разделе "Пролиферативные тесты") отбирались через 36 чесов после инициации культуры. Для детекции ЮВ-r человека использовали сандвич-метод как описано в

работе (Broker • В. М. et al. 1833].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика сгм* т-клонов человека

ПОСЛе ИГ Трансформации ВИРУСОМ Н. sa.im.iri. Ивфехщш смешанной популяции т-клеток вирусом H.saimiri -онкогенньи вирусом обезьян - приводит к имморталлзации клеток

[Biesinger. В. . et al. 1092]. МЫ П0КЭ38ЛИ, ЧТО ВИРУСОМ H.saimiri

мохно иммортализовать и ухе клонированные Т-клетки человека (Broker, в.а , et ai. 1093). Несмотря на успешную ижортализацию а/р т-клеток как сы так и era позитивных, нам не удалось иммор-тализовать г/<5 Т-клетки. По-ввдимому, эта субпопуляция клеток значительно отличается от а/р субпопуляции и нэ может быть им-морталмзоваЕа с применением этого метода. Крою того, частота возникновения одной перманентно растущей клэтек из 20-100 т^кз. инфицировавших клеток показывает, что восприимчивость Т-клеток к трансфо^явп! вирусом зависит от огфеделеннпго функционального состояния клеток, а не от принадаезноста к какой-либо субпопуляции. После трансформации T-клоны не продуцируют и не секретируют зрельс вирусных частиц ухе на 2-ой месяц культивирования. Т-

клетки иммортализовакные Еирусом обычно содержат 30-80 копий генома Н. saimirí в форме КОЛЫЮЗОЙ ЗШСОМНОЙ ДНК [Bit-Linger. в.. et al. 1932]. ЙЗВеОТЮ, ЧТО ХП-фОТрОПШЙ BiipyC htl.v-j , так хв трансформирует Т-клетта человека in viiro [Miyoshi. i.. <?t »1.

1081; Yanta moto, V. . et al. 1982; Popovic, H. . et al. 1083; .4ut-

min, т. В. , 1Р91]. 0ДНГКО, для Трансформации вирусом ktlv-i необходимо совместное культагафсвание с инфицированной яи-v-i :сет-ксй, 'продуцирующей инфекционный вирус, а кз с суперзатантсм содержащем частицы вируса, как в случае с я.saimirí. К тсму-же, клзтки гммортализсЕанкые htlv-i вггрусом продуцирует* кцюкциснн^э част.зды вируса и не является стабильньми трансфориактами, -гзк к?к через определенный промежуток врзмеви менязгт сбоя морфологические и ростовые свойства [Pooovic, к. , et el. 1s33; Nut таг»,

т. в. . 1991 ] .

Проведенные нами прямые сравнения мезду "нормальными" Т-клонзми и кх транспор:йрованными аналогами показало, что '.фанс-формакта сохранили родительски? фенотип "активгфсззшыг" клеток (Таблица I). До трансформации все клоны экспрессирсвали ча своей поБзрхноста соз комплекс, v^s. 7 детерминанту Т-клеточного рецептора (tcr), см. lfa-i. coa рецепторы и были азе нзгятавны. Уровень экспрессии таких молекул как a-цепь рецептора к ¿Ш-2 (cdss) и мне класса и антигенов изменялся с момента стимуляции роста клеток достигая пика на 3-7 день (**) и постепенно снижался пэ-ралельно с возвращением ¡слеток « покоящееся состояние. Трансформированные клоны такие стабильно экспрессирсвали соз. саг. сол, LFA-i рзцесторы. Они m-прехнему оставались сюэ-вегатанными и сог^апяли Бкспроссию урз.г детермянснты тег. в отлгчие от родительских клеток вируо-трансформироьакные клоны акспрессировчли антигены ннс-и и сигз конститутивно. Тем кз менее, экспрессия рецептора cms увеличивалась если клетки дополнительно стамули-

ровать анти-TCR мАТ вмлоз! (*).

Тгбтауа_1. Фенотип родительских и трансформированных кленов.

рецепторы % позитивных клеток (интенсивность)

(антитела) КЛОН так-61/39 КЛОН 39-HVS

CD3 (OKT3) 99 8 СЮ,323 99 7 С 9.323

СМ, (Мах.18НЗ) 98 9 СВ.153 99 9 С 38.943

CD2S (тивэ) 69 9 С3.13** 93 1 СЗ'.7еЗ

93 1 C2S.023*

МНС-IX (L243) 72 9 С7.073** 92 8 С20,753

CD14A (CLB-LFA-1 /2) 99 1 С5.91Э 99 в С12.883

CDS (711) 99 8 C10.2S3 88 0 С 5 , 763

сое (OKT8) - -

Vfie. 7 (0Т145) 99 8 СЮ.013 99 8 СЮ. 03

Т-клош трансформированные вирусом H.saimin сохранили антигенную специфичность. Это демонстрируется как увеличением включения ишидина, так и усилением секреции ИHS-r в ответ на добавление антигена (Ркс.1). однако, трансформированные клоны проявляют высокую чувствительность к фидерным клеткам и в отсутствии антигена, что затрудняет оценку антигенной специфичности и к постороннему антигену (Рис.ГВ, колонка 2, 4). Эту трудность преодолел ег.н. R.weber [личное сообщение] используя L-клетки в качестве фидерных клеток при "презентации" антигена. Эти данные подтверждают более ранние наблвдения, что Hvs-трансформироваккые клетки чувствительны к сог-зависимому альтернативному пути активации {Hittrucker, Н. V/. . ot al. 1032]. СОХрЭНЭНИе аНТИГвННОЙ специфичности показано и в случае импортализеши Т-клеток вируг

COM HTLV-I (Mitsuya, Н. . et al. 1984; Faller, D. V. . et al.

lese]. Однако, у Т-клеток ижортализованных вирусом htlv-i наб-лвдается исчезновение соз/тск комплекса с поверхности клетки после 2-3 месяцев культивирования [yss«?i. н., . et ai. 1евэ;

Inatsuki. А., 1Э89].

Рис. I. Антигенная специфичность Т-клонов до

и после трансформации вирусом н. sai^n.

©

Л

«АЗ

«5*

.5—

©

If

Ж»

*К0»

Л1

IpJ.

ш

заа:

(D

2

.«гГ^з? «ta£>

ш i.X

'¿¿УМ: «¿S-V*-

ш Ггй*1

"Г-О1!-' lit

I - ТОЛЬКО Т-клоны .

2 - Т-клоны + фидерные клетки

3 - Ад (СТ. 10 МКГ/МЛ) фвдерте клетки

4 - посторонний ag (ppd,

10 мкг/мд) + фидерные клетаи

5 - MAT октэ, в растворе (I мет/к!) + фидерные клетки

s - ршнг, (тоо Ед/мл) + Фидерные клетки

А - клон TAR-63/5; Б - HVG-клон; В - сскрецня IFH-y HVS-клоном (±) стандартное отклонение в одном кэ б экспериментов (к) СП2~эовискное обогащение пролиферации 1сн. вьию. стр. 101

Одним из самых первых событай в Т-клеткэ после связывания рецепторами соответствующих лигандов является фосфорилирование ряда клеточных субстратов по аминокислотным остаткам тирозина

[Mlist-elin. Т. , el al. 1990; June, С. H. , et il. 109О]. ПряМОв

сравнение тирозин-кинззгюй активности индуцируемое через соэ и/или cm рецепторы показало идентичность между "нормальньми" родитеяьгажми Т-:аю:;ау,и и кг трансфор:®рсввпныж аналогами (Piic.2). В оСо'.к случаях ньблэдаетзя незначительная тирозин-кинася&я активность в отсутстгаш стимуляции. В лизатах трансформированных клеток не только количество белхсзьа субстратов, но и

4

спектр их фосфорилированния при стимуляции совпадали с аналогичными у "нормальных" клонов. Анти-см мдт махЛбНо сами по себе стимулирован незначительную тарозин-киназную активность, но значительно усиливали активность тарозиновых киназ индуцируемую анти-соз ентателами при сшивке соз и cd4 рецептора вторичной ан-

ТИСЬВОрОТКС* [Broker. В. М. , et al. 1003].

Рис. 2. Тирозин-юшазная активность Т-клонов до и после трансформации вирусом Н. saimirí.

* дорожки - стимулы

1 - без стимуляции

2 - + рИЛ-2 (50 Ед/мл)

3 - + «HTH-CD4 МАТ

(Max. 16Н5, 1МКГ/МЛ)

4 - сшивка ПНТИ-С04

антисыворотеой

5 - + анти-СОЗ MAT

(октэ, I мкг/мл)

G - сшивака анти-СПЗ ангисьЕОротаой

7 - + анти—CD4

■+ IHTH-CD3

8 - СИИБКа а н т н-CD3 И

онти-сс-; антасызо-ротксй

А - клон TAR-61 УЗЯ; Б - клон 3S-HVS_

Вторичкьм событием после связывания лиганда Т-клеточнкм рецептором для антигена и/или соз комлекса является увеличение концентращи ИОНОВ кальция в клетке [Gardner. P. 1S80].

Данные наших экспериментов показали, что трансформированные клетки реагируют идентачно при добавлении анти-соз и анта- CD4. антител по сравнению с аналогичные "нормальным" клоном (Рис.3, колонки Б I С). Абсолютная концентрация ионов кальция (389 ± 49

Рис. 3. Мобилизация ионов кальция в клетках разных типов.

А - Т-ЛИМфСЕЩТЫ переферичезкой хрози

Б - КЛОН ТАЙ-61 /43

С - КЛОН «3-НУ2 Д - ЛИНИЯ -)игка1.

нМ.) подученная з покоящихся Т-лкк±юцитах пзрефергкеской крови в ответ на сшивку соз рецептора была принята нэм за 100%. Стимуляции только анта-аэз ?#АТ было достаточно для гвдукции потока кальция у клонированных Т-лимфоцитов и у тте-клсиов. Тем не менее, сшивка соз рецепторов приводила к увеличению игобилизации ионов кальция у обоих груш клеток (379 ± 69 нМ и 267 ± 49 нМ ) соответственно. Сшивка соз/ам рецепторов значительно усиливала мобилизации ионов кальция (Рис.3, колонки Б и С). В отличие от покоящихся и клонированных Т-лимфоцитов мы показали , что в яуг-трансформированных клетках происходит .значительное изменение концентрации ионов кальция при стимуляции см рецептора знти-ам мАТ кахлвиэ добавленными в раствор, с последующей сливкой сам рецептора (Рис.4В). Как видно из Рис.4Б, мобилизваия кальция кле-пгямк при полимеризации ам рецешора не гнэчгггехько отличается по величие ст ггонцектреции ионов кальция, ^¿--зетпцзйся з метках сри по;имориеац,1и сиз рецептора. (Рис.4А). Эта данные горссэ коррелирует с ик5ормацяей, полученной по результатам

■ 10000

анти-фосфотирозиновых иммуноблотов, демонстрирующих повьсеннуг тирозин-киназнуп активность рэв1ск после полимеризации со4.

Рис. 4. Измерение с**' в нУБ-клонах.

)эгт*

_

© I ^

Стимуляция анти-соз мАТ, (ОКТЗ, I мкг/мл)

Стимуляция анта-сгм мАТ,

(Мах. 16Н5, I МКГ/МЛ)

1-14 о г.о 4.» «.г [2

Таким образом трансформация клонированных сеч Т-люфоцятов человека вирусом и. saim.trI привела к получению ижортализовакых Т-клоков, реакция которых на рззлзгеные воздействия практически н< отличается от реакции нормальных клеток. По тестируемьы параметрам (тарозин-киназная активность, мобилизация са1*, набору зке-прессируешх рецепторов. ад - специфичности) нуб- клоны соответствуют активированном Т-лимфоцитам человека. Существэнньм мэю-дическим преимуществом такой модели является возможность охарактеризовать результат целенаправленного воздействия на егм рецептор, так как трансформированные клоны свободны от контаминации арс, гомогенны по своему составу и не нуждаются в периоди-

ческой рестимуляции. Пролиферация трансформированных клеток целиком зависит ОТ экзогенного ИЛ-2 [Broker, В.M.. et al. 1993].

2.Угнетение роста трансформированных клонов анти-со* мАТ.

ом функционирует как ко-рецептор во время активации cd4* т-клетск, опосредованной тог [Flelsher. В. . er al. 198S; Ет-

iiirich. F.. et al. 1997; Janeway. С.A. Jr.. 1989]. АНТИГеН-

узнащий комплекс, состоящий из антигена, презентированного в контексте мнс-и, таг и ам ко-рецептора, взаимодействующего с инвариабельньм доменом мнс-и, подвергается влиянию анти-со* мАТ, что приводит к разрушению комплекса и препятствует активации Т-клеток. Помимо этого, анти-ом мАТ ингибировали пролиферацию и активацию Т-клеток в процессах, не зависящих от взаимодействия MKC-H/CD4, а именно, при.стимуляции клеток фармакологическими агентами РКА И ИОНОМИЦИНСМ [Carrera, A.C., et al. 1987; Schreienmeier, H., et al. 1988].

Как указывалось выше, по отношению к ранним событиям после связывания соэ/тск и ом рецепторов (анти-фосфотирсзиновый им-муноблотинг, мобилизация ионов кальция), трансформанты не отличимы от "нормальных" родительских Т-клонов. Однако, ИЛ-2 зависимая црсшйерацкя трансформированных клонов эффективно угнеталась акта-см ;.*ЛТ. Зфектазнымя в ингабироБздаи пролиферации клеток были как целая молекула антитела, так и ее FCab^ фрагменты, что исшшчает возможность вовлечения Fer рецепторов в ингибиро-вание (Рис.5). Несмотря на то, что взаимодействие сем. рецептора

СО СВОЕМ ЛИГЗНДОМ МНС-II ПреДСТаВЛЯеТСЯ НИЗКОаффИННЫМ [Doyle, с.. et ai. 1989], в своих исследованиях mi считали важным ИСКЛЮЧИТЬ объяснение механизма набждаемого ингибирования простъм блокированием этих взаимодействий.

Необходимость такого исследоЕэнзд дзаауется несколькими факторами. Во-первьгс, нАТ мах. 16Н5 узнают тот ze эпитоп на молекуле CD4, что И 9Р 120, к яаототся айвктаккчи ингибиторами MLC [Davis, S. J et al. 1992]. В0-ВТ0рЫХ,

несмотря на то, что Т-кло-ны трансформированные вирусом H.sairriiri СВОбОДНЫ от контаминации арс, тем не менее экспрессия молекул kiic-ii сохраняется и взаимодействие схи рецептора с »mc-ii мссет иметь место на поверхности соседних клеток.

В наших экспериментах мАТ lt*, которые связываются с дис-тальным доменом сем, рецептора и не нарушают взаимодействия cd4-mhc-ii [Doyle, е., et. ai.ioög], оказывает" такой же ингибирущий эффект как и махдбнз мАТ. Кроме тоге, мы показали, что анта-мне-п >>АТ (l243), которые блокируют мнс-пазм взаимодействие не обладают ингабиругщим эффектом (Рис. 5).

Икмунокомпетентаые cd4 позитивные Т-лкм$оц:ггы регулируггг иммунный ответ через секрецию ряда медиаторов (лгафш:ноб). 1Ды изучали в какой степени физиологический ответ hvs-ioiohob подвержен воздействию анти-civ. ентхтел. Нам не удалось обнаружить спонтанной секреции ИЛ-2 у hvs-клонов, используя ИЛ-2 зависимую линию мыли CT44, хотя ¡.¡РНК ИЛ-2 сбнгру^-'иа^ся в ¡слэъсах. Анта-CD4 мАТ в растворе или иммобилизованные на пластике не стикули-

Рис. 5. Влияние анта-ссх мдт

и их фрагментов на пролиферацию нуз- клонов.

шиниравэ отпал и и фрашшов«иг Au. а (иствсре ■

Рис. 6. Влияние анти-мнс-ii МАТ на пролиферацию

HVS-KTOHOB.

ругт секреции /Л-2. Напотив, индукция ИЛ-2 легко достигается воздействием на соз и/или тек комплекс антите-

лами OKT3, ВМА031, uchti. Типичный эксперимент, демон-стрирупций физиологический ответ hvs-клонов, представлен на Рис. 7А. Клетки были актавированны иммобилизованными на пластаке анта-cd3 мАТ uchti или анти-тск мАТ ВМА031. в качестве кон-

1 •

.01 .03 .1 .3 1 } 10 X 100

шшлршя жэогешого ИЛ-2. е ЕдЛа

трольных использовались ке-- митогенные анта-сш мАТ ти

и анти-со4 мАТ мах.1бН5. в этом хе эксперименте мы контролировали восприимчивость клеток к ингибированию анти-со4 мАТ в растворе в присуствии 50 Ед/мл рИЛ-2. Через 7 часов после активации 50 мкл. культуральной среды отбиралось для измерения ИЛ-2, а спустя 48 часов измерялась, пролиферация. Нэ Рис. 7Б показана зависимость пролиферации линии клеток мыши от концентрации ИЛ-2 в супернатантах. Только анти-соз и анти-тсй мАТ индуцирует пролиферацию и продукцию ИЛ-2 нуз-клонами. Несмотря на то, что пролиферация нуэ-клонов угнеталась анта-сгм мАТ, добавленными в раствор (Рис. 7А, кривая I), присутствие антител не сказывается на пролиферации линии клеток мьши стч4 (Рис. 7Б, кривая I).

В контрольных экспериментах клетаи предварительно инкубировали в течении 24-48 часов с анти-сгм мАТ. После тщательной отмывки избытка антател, обработанные таким образе»« клетаи, подвергали активации анти-соз и анти-тск мАТ и исседовали последу»-

Рис. 7. Физиологический шуа секрецию ИЛ-2. Еиотесты

ответ н^-клонов.

на содержание КЛ-2 в среде от интактаых к обработанных клонов демонстрирухгг, что предварительная обработка клеток анти-сс* антителами значительно снимет продукцию УЛ-2 (Рис. 8).

В совокупности с результатами. демонстрирупдк-ми специфичность ингибирзв-щего эффекта в отсутствии сгм/ннс-и взаимодействия, эта результаты свидетельствует о прямом 5 частик сем. рецептора в процессе регуляции Т-клеточного ответа на поздней КЛ-2 зависимой стадии роста.

После порвичных событий, происходящих во время активации, Т-лим£оциты экс-прессируктг не своей поверхности вьюокоаффинкый рецептор ИЛ-2 и пролиферирувт в ответ на КЛ-2. Биологический эффект ИЛ-2 опосредуется его взаимодействием с зысоко-афинным рецептором. Рецептор к ИЛ-2 состоит, из двух пшшпетвдных цепей: ззкоа ь-цьпь(ссез) к 7Э:Эа /?-цспь [waj.dma.nn, т. а. , 1ееб]. Показано, что ^-цепь рецептора к КЛ-2 непосредственно участвует в проведении сигнал" при азаимодейст-ки рецептора с ИЛ-2, активируя несколько различных тарозиновых

О Л] .1 .3 I 5 10

ышентрадоя уАТ шк&ишевамя на пласта» в шхАм.

Рис. 8. Влияние преинкубадаи нуэ-клонсв с анта-ст мАТ на последупда секреции ИЛ-2.

мАТ исНТ, мАТ ВМА021 мАТ ОКТЗ

Клетки преиикубировались 45 часов с мАТ Мах. 16Н5 С1 икг/мл>. отмывались от избытка мАТ и стимулировались анти—ТСР или -СОЗ мАТ.

протеинкиназ [Тог1дое, т.. еь а1. 1993]. Однако сама по себе она обладает промежуточной аффикностыэ к ИЛ-2. Единичная а-цепь рецептора обладает низкой аффинностью. При ассоциации а-цепи с /5-цепьп на поверхности клетки формируется функциональный высоко-аффинный гетеродимер, который сообщает клеткам чустви-тельность к низким концз1прациям ИЛ-2. На поверхности интактаого покоящегося Т-лшлфоцита зкспрессируется только Л-цоиь и интенсивность ее экспресси не меняется после активации клетки (НаЬакеуата, М. , еЬ а1. 19Э9]. НвПрОТИВ, 8КТИВаЦИЯ Т-ЛИМфОЦИТа приводит к экспрессии а-цзш и формированию высоко-аффинного рецептора на поверхности активированного люфоцита (воЬп!е1п.

е.. еъ а1 198Э].

Наши данные показывает1, что в присутствии анти-сгм, дат про исходят десятикратное снихеше чувствительности ¡слеток к рИЛ-2 (Рис.9). Изменение' чувствительности нуз-клонов к рИЛ-2 мохет бьпъ опосредовано скняенк&ч экспрессии о-цеои рецептора ИЛ-2. Другим механизмом мозет являться модуляция активности тярозин-

Рис. 9. Зависимость ингибируххцего аффекта от концентрации экзогенного Ю1-2.

юнцзитргция экзогенного К Л-2. в Ед^.г

Рис. 10. Анализ экспрессии а-цепи Ю1-2 рецептора.

®

©

¡5,14'

¿отег'Сиш^эстъ

киназы р5б1сЯ т.к. ео участие было продемонстрировано как для передачи сигнала с со4 рецептора, так и с р-цзпи ИЧ-2 рецептора [шм-

тЛ. У. 1893)

Иммунохигмческоэ окра-шво'тие нуэ-клонов обнару-гзаго бысчроа, доснхггждоо мс,кс1;.;уада через 1 часа и специфическое :гсчезнозе'-,:е а-цепи Ш1-2 рзцепторэ (сиезэ с поверхности клеток после обработай анти-сЕм мА.Т (Рис. 10 и Табл. 2). Клокы 39- и 43-нуз кШчУбиросЕЛ'сь в присутспгки расшор;&ых анти-сгм антител в тэченчч 96 часов. Через опрод&тан-ные промежутта! времени порция клзток (около 10®) от*

биралась ца анализ. В контрольном образце окравшзалч клетки, культлвгфозанныэ параллельно с экспер.«иэн-талъньм образцом, но без анта-егх! »¡АТ. Данньзз прод-стезленныз на Табл. 3 полизывает, что за зреет сведения эксперимента экспрес-

го

сия era, со4, cdiia и мнс-ii рецепторов не претерпевает значительных изменения.

Ранее было показано, что добавление анти-ам мАТ приводило к снижению экспрессии ИЛ-2 рецептора [Rosoff. p.m. . et ai. 1987]. Однако, этот эффект наблюдался при активации Т-клеток в присутствии арс или- при сшивке сш/тсй комплекса анта-соз-тсй мАТ. В этом случае,- более слабая экспрессия высокоаффинного ИЛ-2 рецептора в присутствии анти-coi мАТ может быть объяснена не достаточно полной активацией клеток. Однако, hvs-клоиы не нуждаются в предварительной активации, т.к. их спонтанная прсипфера-

Таблща_2. Влияние анти-ом мАТ мах.1бН5 на экспрессию a-цепи рецептора ИЛ-2 (coas) н'/з-клонами.

время инкубации с

cd2s антии-со4 мАТ max.i6h5 (часы).

0 4 6 12 24 48 95

% позитивных клеток (интенсивность)

контроль 69. 9 С3. 13 66. 2 СЗ. £33 63.5 СЗ. 913

опыт ... 14.1 1з.о 13. е ю.о СЗ. 363 С3.223 СЭ. 653 С3. 783 6.9 С4.663 7. 9 СЗ. 523

ция регулируется якзогенным ИЛ-2 и coas конститутивно экспрес-сируется на поверхности трансформантов..

Снижение поверхностной экспрессии coas (а-цепи ИЛ-2 рецептора) и снижение активности тирсзин-киназы psslck, по-видимому, яелявтся наиболее вероятаьм! объяснениями ингабчрупцего эффекта анти-ам мАТ. Эффект угнетения роста трансформантов наиболее отчетливо проявляется при низких концентрациях экзогенного рИЛ-2. Как упоминалось ранее, в отсутствии экзогенного рИЛ-2 н. saimirí трансформированные клоны непродолжительное время (1-2 дня) про-

Таблкца_Зл Влияние анта-ссм мА'Г Мах. юнб на экспрессию рецепторов трансформированными клонен.

время инкубации с

Рецепторл анти-егм мАТ Ках.13Н5 (чосм).

0 48 96

СБЭ % позитивных клетс:: (¡ЙПСЖКВНОСТЬ)

опьт . . .98. 0 С5. 7 Ьз 81. 5 С!..33

контроль 9я. е С9.г7> 99. 1 сз. 83. 7 сз. еео

СВ4

опыт . . 93. 6 С4. 03 93. 1 СО. ьЗЭ

контроль 09. 3 С7. 033 98. 9 со. 1ЙЗ ¿В. С, СЮ. П43

СМ 1А

опыт . . . 07. 5 сз. 113 97. 3 |'13. 043

контроль 99. 5 СИ. 713 90. 0 С5. 733 90. 1 се. о!3

ИКС-11

опыт ... 64.е С4. 4ЕЗ 03. 1 СЗ. 753

контроль 95. 0 С 5. 343 94. 6 С5. 033 63. 6 сл. саз

лкфорйрувт возможно за счет остаточного ИЛ-2 или его медовых количеств продуцируемых и немедленно утилизируема аутокринным путем [ж^гискег, н. V. е! а1. 199г]. это, по-ввдкюму, объясняет высокую чустзктельность нуэ-клонов к угнетение пролиферации. С другой стороны, в свете наших данных становится очевидной "сложность" демонстрации кнгкбирущего эффекта анги-см внтител у "нормальных" клонированных Т-лимфоцитов. При неспецифической рестимуляцш т-клонов рна и рИЛ-2 в присутствии аутологичных фидерных клеток концентрация секретаруемого ИЛ-2 достигает 300 Ед/.чл. к вьие. Очевидно, что при таких высоких концентрациях ИЛ-2 экспрессия пыссхо-аффинного рецептора становится не сущоствен-ной. Позднее, после снижения концентрации КЛ-2 до фкзкалогичес-кой происходит претэтествекный рост клоков, несурда г^коуо-аффшшьй рецептор, однако, к тому времени в I слетках блокируется экспрессия гена рЕв'с,\ Таким образец, ьрисутствкз онти-ом ан-

тител ке может проявиться угнетением пролиферзции, если они не были добавлены^ самом начале культивированния. Однако в последнем случае наблюдаемое ингибирование (которое всегда имеет место), мохно интерпретировать как ослабление активации за счет блокировки cd4^mhc-ii взаимодействий, а не кэк специфический негативный сигнал.

С дугой стороны у популяции Т-лимфоцитов находящихся в ИЛ-2 зависимой стадии роста блокировка экспрессии высокоаффинного рецептора ИЛ-2 за счет пролонгированного ом/кнс-п взаимодействия мохет привести к индукции клональной анергии (периферической толерантности), как было описано для клонированных ты лимфоцитов мыши применением антител блокирующих взаимодействие ИЛ-2 со своим рецептором [De Sllva, d. R. . et al. 1091].

Заключение. Нами были получены Т-клоны человека иммортали-зованкые вирусом ><■ satmri, которые являются моделью активированных Т-клеток человека с неизменной функциональной активностью и не содержащих примеси антаген-презентирущих клеток. Используя эту модель, впервые показано, что обработка hvs-клоиов а:пи-сэ4 мАТ приводит к быстрому исчезновению высоко-аффинного рецептора ИЛ-2 с поверхности клеток. Тщательным анализом установлено, что ингибирушций эффект анти-со4 мАТ является специфическим негативным регуляторным сигналом, и не связан с разобщением см./мнс-и взаимодействия. Так хе обнаружено, что у обработанных анти-со4 мАТ Т-лимфоцитов значительно снижается секреция ИЛ-2. Таким образом, впервые показано участие со4 рецептора в получении специфических сигналов, не связанных напрямую с распознаванием антигена в контексте mhc-ii/tcr.

ВЫВОДЫ

I.Путем трансформации клонированных cd4* Т-лимфоцитов

человека вирусом к.эныполучены клоны которые по антигенной специфичности, набору экцпрессирусмьа рецепторов функционально на отличаются от родительских Т-хлснов.

2.Обработка трансвюрмир&заккых к тонов анти-см мЛТ пшводкт к угнетению ИЛ-2 зависимой пролк^эргше: не связсньому с разобщением со4^мнс-и взаимодействия.

3.Специфический знта-аз4 ьзгатавньЯ "агьал связг! с исчез-козенкем высоко-эффшного рецептора Кя-2 с и-ве^гжоста обработанных клеток.

4. На основании ссбстЕЭЕ-лк и огтер'пурыд д^акыу сформулирована гипотеза о ради с^/мнс-и взаимодействии з процессе иммунологического распознавания ангагеаов и иегулялда ттроляфератш-чоге ответа.

Ojhcok paöoi, cuyöJiEKOBSHHJ'^. no tgkh ÄKccepvauEa:

1.Broic-, D.M., A. Yu. T-ygankov, I.Mulle;—Fleckensiein, A. H. Gus--, », /..cm.aav. B. Biusinger , B. Fleckervstein. F.Erjra-ich. 1 m-

jnortalizat'ion of hvti*an T celt clows b'J Herpesvirus sairiiri: Signal transduction analysis rev&als fxerjet iorjzl CD3, CD4» and IL-? receptors. J. Xnununol. , 1893, vol. 1S1, pp. 1184-11*53.

2. Broker, B. M. , A. Yu. Tsygankov. H. Flckenscher . H. A. Cltaev.

I. Mull er -Fl eckenstein, B. Fleck&tstein. J.B.Bolen, F.Emmrich. Engagement of the CD4 rcceptor inhibits the IL—2 dependent pro~ liferation of human T cells transformed by Herpesvirus saimiri. Eur. J. Iron'jnoi . in press.

3.Broker, B. M. . N. A. Chltaev, A. Yu. Tsygankov, B. Fleckenstein, I. Muller -Fleckenstein, J.B.Bolen. H. Fickenscher, F.Em-rich. Anti-CD4 inhibits proliferation of hvjnan T cell clones transformed by Herpesvirus saitniri. "Therapeutic Inununoniodula-tion. Theory and Practice". European Research Conference. Bad Windseim, FRG, June 14-18, 1992.

4.Broker, B. M. . H.A. Chitaev. A. Yu. Tsygankov, A.H.Gu=e, I.

Mull er-Fl eck enstein. H. Fickenscher , B. Flockenstein. J.B.Bolen, P. E.Tjnrich. Human Tcells immortalized by Herpesvirus saii;Uri: Inhibition by anti-CD4. 23rd Annual Meeting of the Gesellschaft, fur Inoiunolugie, Main-., FRG. October 20-31, 1092.