Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вiвчения властивостей iммобiлiзованоi уреази та створения на ii основi бiосенсора з метою визначення сечовини в сироватцi кровi

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Вiвчения властивостей iммобiлiзованоi уреази та створения на ii основi бiосенсора з метою визначення сечовини в сироватцi кровi"

РГ6 од

íi'1^ К;?1ШгаТУГ'ВЮХШ]1 hi. О.В.ПАЛЛАД1ЙД- • АКАДЩ IÏ *1 ¡ЛУК * УКРА ï HJ1 -

' IIa правах рукописи

БУЕРЯК Ольга ДидрШна

' ВИВЧЕШИ ВЛЛСТИВОСТЕЙ МИОБШЗОВАНО! УРЕАЗИ ТА-СТВОРИШЯ НА "ï ï OCüC8i"bJOCEHCOFA 3 МЕТОЮ В313НАЧЕННЯ СЕЧОШПШ В СЯРОВАТЦI КРОВI ~

03.00*04 - ÖioxiMisi.

,__Автореферат--

дисертацп на' здсбуття паукового ступени кандидата бЮлоПчннх туи

Ku'in - !933

»

Робота виконана в • 1нстит\'?1 молекулярно! 61олог11' 1 геяетики АН Укра1ни.

Науковий кер!вник: доктор 61гй!ог1чиих наук М.Ф.СтародуО

0ф1ц1йн1 опоненти: -доктор 61олог1чних наук М.П.Дштренко, ■ кандидат «1м1чних наук С.в.милаяовеькйй

Пров1дна установа: 1нститут б1оорган1чно! х1мП та нафтох1мП А)| Укра1ни - . ■ *

Захист в!дбуцеться " ^/¿-¿¿^У ^994 р. о 14 годин! на зас1данн1 спеЩал1зовшю1 вчепо! ради Д 016.07.01 в 1нсти--' тут! С1ох1Й1) !м.0.В.Паллад!на АН УкраЧни еа адресою: 252031, м. Кн1в-30, вул. Леонтовича, 9, ... . >

- - ~ (

N '

. 3 дисертац1ею можна ознайомитися у-б!бл1отец!' 1нсхгитуту 01ок1мП 1м.О.П.Паллад!на АН Укра'Пш.

Автореферат ров1сланик "^--¿.1993 р.

Вчеиий секретар

1 ' ' ' . х

••-пец1аЯ18овано1 радн," /?/

кяндидат (ИологШних наук /¿¿фъ^^^ О^ВЛарсекко

ЗАГАЛЬКА ХАРАКТЕРИСТИКА РОВОТИ

Актуальнасть проблеми. ишобШзован! ферыенти зкаходять шп-роке застосування в р^зних галузях Д1йльност; людшш, а саме в'медицин!, харчов!й промисловост!, CioTexeojiori I. Неможлиш говорили про узагальнений cnoci6 1ммоб1л!зац11 фермент!в: для кошюго з них необХ1Дно Шдбирати свай спецш.Мчний п!дх1д, виходячи з конкретннх задач та цьлей вмкорпстання ферменту. В!льш того, винкка<; потреба pi3no5i4noro досл1джеиня властивостей як в!льного так i ¡ммобШзо-ваного ферменту, вибору умов збережешш його активносп а ¡ммобШ-зованому стан! з метою оптшЛзацП фуш?ц!онування ферменту на протяз! певкого промШсу часу та в pi3imx 61олог1чних сс-редевивэх.

Одним з фермент1В, що наибиьш широко вивчаеться з метою практичного застосування е уреаза. Основшш напрш.псом II застосування е визначення сечовини у розчинах та б!олог!чнн.ч pi динах (зокрема в ttpoBi). Для цього фермент ¡ммобШ зують на рi заих нос'1ЯХ, або на ф!зичних поверхнях приетроЗв, що рееструигь Kinu.eui продукт ферментативно! реакцП. Такими пристроями являвгься, зокрема, б1осенсори.

Велшшй ¡нтерес, який проявляемся до 6ioceitcopiB протягом осташМх десяти pokib, 'зумовленим 1>; певшши переварами в поравняли 1 з традиц!йниш методами хН«!чного анализу: ьнсоксю чутливхс-т» та специф!чн1ста при в1дносн!й дешевизн! та npceroii еиксрвс* тання.

На початок наших дооШдмень рсботи по етЕореншз 6ioct-aropls на основ! уреази проводились рядом вченпх /Kuly.o et al. 19S5; Narlftesing et al., 1989; Cfcakai et al., 1038; Przybyt, S^ier, 1990/ алв вони акцентувалп увагу на пристроях, я» -базуйл с» из ви-користашй р!зних конструкШи макроелектрзд1в. Виходячи з нерс-иаг польових транзистор1в перед макроелектродамн кода uyuuit'Civri та технологi4H0CTi виготовленнл, ми зссередились на розроби! ур-с-азних сенсорiв саме на 1х основ! .

На сьогоднИшМй день створено д~кШ,1:з rapiaHTiB yp&.znrai с бЮсеисору на сечовину на основi едек1род»в, пытироа Jrw-'-im транзистор!в та оптцчних волокон /Karub* et al. 1986; Апзл; 1685, 1SS3, 1987; Makaipoto et: al., 1985; Van dor Snocvl, H,83r GardHs et al1690/. Але Icirynxb т1хъки noojw'CKi nr"-r\r.< месдого розсоОвесих у!>егетш:< ccrfcopl« rms, '-•>«.•-.: ,i • - y;«

()»•«!?-Ill moi« (KJrbbi) *i pmMwcrepts;" ¡«и^м ! и • •••

- г -

ам!ачного електроду. Привертаз усагу таком те, що т!льки в дзох роботах /Зь1опо ео а!., 1986; Апга: еЬ а1., 1987/ пов!дсмлялося про проведения визначення концеитрацП сечовини в кров! за допомо-гою уреазних сенсор!в на основ! польсвих транзисторов. Це, мокли-во, зумовлено певшши труднощаыи проведения вюЛр!в в кроз!. Кр!м того, 1сиуе ряд проблем, пов'язаних як з конструкцию ПТ, так 1 з !ммоб!л!зац!ею б!олог!чного матер!алу на 1х поверхн!. Весь комплекс проблем набувае особливого значения, якщо ыати на уваз! не т1льки створення лабораторного прототипу б!осенсора як такого, але й багатоолаяове досл1длення .з метога оЩнкн можливосП та ефекти-вост! його застосування-у кл1н!чн!й практиц!.

Мета та задач}' досл!дж&ння. Головною метою роботи е ¡ммобЬт! -зад! я уреази р!зними методами на новерхн! нап1впров1дникових пристроЗв, досл!джеиня властивостей та умов збереження активност! ферменту 1 створення на його основ! лабораторного прототипу б!о-сенсора для визначення сечовини в сироватц! кровь

Виходячи з мети роботи, Оули сформульован!, сл!дуюч! задач!:

1. Зд1йснитц р!зшши методами !ымоб!л!зац!ю уреази на поверх-н! нап!впров¡дникових структур та п!д!брати наЯбДлыа оптиыальний метод для нанесения ферменту на рН-ПТ.

2. Вивчити особливост! зм!ни властивостей уреази при I! !ммо-

б,!л!з.ацП Еибраним методом.

3. Р!зноб!чно охарактеризувати в!дгук б1осенсору■при вим!рю-Еанн! концентрацП сечовини в моделышх розчинах та безпосередньо

в.сироватц! кров!.

4. Визначити р!веыь коредяцШю! залежност! м!к величинами, огр.шашши за до помогаю б|осеисору та фенол-Ипохлорнтнэго методу.

5. Вивчити ыолаивост! максимального збереження активност! уреази при')Ш0б!л!зацП та в НшобШзованоыу стан! з метоп ста-б1л!зац!1 роботи сенсору.

Наукова новизна роботи.

В робот! вперше.проведен! досл1даення по вибору оптимального способу формування фермзнтно! мембрани з 1шоб!л!зозано» уреазоя на поверхн! нап!впров¡дникових структур. Показано, ¡цо включения уреази в мембрану шляхом пол!ыеризац!I П з БСЛ за допомогою пар!В ГА б!льш технолог1чне, та надае можлив1сть у значно 0!льш!й м!р! уникати !нактивац!1 ферменту пор^внянно з мембраною на основ! ПАДГ, 1Нд1бран! оптимальв! умови формування мембрани на основ! РОА. Досл!джено властивост! 1ммоб!л1зопано; даним методом уреази.

Гозроблено лабораторный прототип уреазного б!осеясору на ос-

hobI рИ-чутливого польового транзистору та р!зноб1чно дослШжено його елевтрох1мичн1 властивост!. Вперое п!д!бран! оптимальн! умови визначешш за допомогога енэшосенсору концентрацИ сечовшш ¡в .модель них розчииах, наближених sa властивостями до сироватки кров!, та безпосередньо в п!й. Проведено пор1вняння результат!в тестуван-на вм1сту сечовшш в сирсваШ кров!, одержалнх за допсмогоа г1похлсритного методу та ензимосенсору, а такси внзначен! основа! переваги останпього в план! практичного використання.

Практична ц!нн1сть роботи.

Створена д!та модель (прототип) ензнмосенсору для експресно-го визначешш концентрацН сечовини в сироватц! .Kposi (SOX в!дгуку цього сенсору реал1зуея>ся на протяз! 2 хв). Строк роботи датчика ензимосенсора блязько 20 вим!рппань. [{введен! характеристики вка-зують на перспектиЕНхсть розроблеиого прототипу уреазного баосен-сора для практично! меднцгаш. Bin може бути основою при рэзрсбш та налагод:г.онн1 промыслового вппуасу в1ш1равалышх приладав такого типу для б1ох1м!чно1 дДагностшш.

Anpooauln роботи Результата дослхджень доповгдалися на V на-уков1й конфереиЩ! молодих вчепих (Ужгород, 1990), на PecnydJii-кансыйй ' яауког.о-ч*хи!чи1А >со;!£'-ег?еijцi"I '-Нош? возмглнссти corps-1ЙННОГО приборостроения" (Ворзель, 1993), на II Всесоозисыу скмио-зиум! "Ипхенерпая энзиыология" (Москва, 1991), иа Шлшпроднсму симпозиум! "Biosensor symposium" (Enschede, 1991), на И Свггог.сыу конгресх "Second World Congresson Biosensors" (Женева, 1992).

Лублжанп. Оо.човн! результата роботи. с.пу б л i} сов ai! i б 12 наугсо енх роботах.

Структура та об'ем роботи._ДисертацХя ашщаеться з встуау,

огляду лггературп та екснериыенталыю!'час'пши, .яка В1«лчае опио матер!ал1в та метод!в дославши, викладу результат] в роботи. та 'ix обговорення (у 3 розд!лах), висноекхв, а такоя списку л!тергчу-ри, який вгадечас 04 публ11шц11.

Стощетт, до. вживаяться в робот!. ГА - глутароглш апьдеПд, БСА - бычачий сивороткоЕнн ольбумЗн, ЕДТА - етш!енд!ам!нтетраацетат, ИТ - польовий транзистор !1ЛАГ - пол!гкр!лз,м!дшш Гель

АТ> - актш?н!сть ')'°Г"йнту в1д мягадч/ально! в експер''г"-'->п i А - cHn-aiv (Моеркеср*

- 4 -

РЕЗУЛЬТАТ!'! ДОСЭДЖЕИЬ ТА IX ОБГОВОРЕИЯ

1Ь5МОБ1Л !3/Л1Я УРЕАЗИ ТА ВИВЧЕННЯ ВДАСТИВОСТЕЙ 1ШОБIЛ130ВАН0Г0 ФЕРМЕНТУ

Розробка н!дход1в зммобШзацП уреази у склад! б!омембран.

Для шыобШзацП уреази у склад1 ПААГ була ввпробувана мож-лив!сть ковалентного звязування 11 одиочасно з пол!мер!зац!ею гелю як х1м1чним, так 1 фотохИЛчним методами. Виявилось, що пол!мер!-зац1я геля досягаеться 'ильки при концентрат"! уреази не 0!лыле 30 мг/мл при позначному сп!вв1дношенн1 величин плоди поверхн!, яку займае гель, та його об'ему. Де не дае змоги отримувати тонк! мембрани в високою питомою активгистю ферменту, особливо внаслЬ док анактивуючого впливу вюидних компоненив 1 продукив реакП пол!мер!зац!! ПААГ на фермент. Таким чином, подальш досл!джешш були спрямованх на формувашш б1лково'! мембрани шляхом ковалентно-го зв'язування ферменту з БСА трьома способами: а) розчин ГА вносили у попередньо приготовану су).пш уреази та аиьбумхну (найб1льи поширений метод); б) попередньо висушену на поверка }среш!евих структур сумхш ферменту та альбуьину у вигляд! тонко! плавки оО-робляли розчином ГА; в) тонкий шар сумщ! альбумину та ферменту на поверхн! кремнДевих пластин п!ддавали дП пар1в ГА у волопй каме-р1 протягом р!эного часу , а пот1м отриману мембрану Шдсушували на гкштр!.

При вим1рюванн1 залишково? ферментативно! активност! виявилось, що в першому 1 другому виладках спостер1гаеться зиачие эки-ження активност! ферменту, 1, нав1ть, щлковита його хнактивацгя. У певн!й м1р! цей процес.в!дбуваеться 1 при формуваши ферментно'1 мембрани трет1м способом, але в останньому випадку все ж спостер!-гаеться збереження до 207. вих!дно! активност! ферменту. Тому нада-л! нами були И1д1бран1 оптимадьн1 умови имобШзацП уреази. ним способом. •' Крптер1ями - вадбору р1зних досл1дкуваних вар!ант!в були адгез1я мембрани до поверхш нан1впров1дширвш структур та величина зашпзково! ферментативно! активност!. Остановлено, що для ут-ворення б!лково'1 мембрани та збереження при Дммо&ШэацП максимального р!вня залишково! ферментативио! активност1, найб!льи при-датна сум!и, що вмащуе альбум1н та уреазу у стпввшюшенн! 3:1, а оптимачышй час експозшд'! кремн1евих пластин в парах ГА сгановигь 30 хв. За та]™ умов-зберп-аеться до £0 X вих1дно1 активност! ферменту в мембран!. 3 1ншого боку, при однаковому терм!н! етепозицП

в парах ГА питома активн!сть уреази максимальна при сгПвв! дискета БСА:уреаза 1:1. Гаку сумш, сб'емом не б!льшё 0,5 мгл, наносили на область затЕору польового транзистору Ктод! 30 хвилинно! 1пкуба-ц!1 в парах ГА було достатньо для пол1мер1зацП мембрани. Тому в подальшому перевага буяа надана сп1ввЧдноиенню компонентов 1:1, як такому, а.0 забезпечуе максимальне збере.чення питомо! активност! уреази, при п !ммоб!д!зац!1 в парах ГА на протяз! понад 30 хв.

Вивчення влзстивостей 1ммоб!л1зопаноГ уреази Наш булл охарактеризован! оптимально умови фупкц!окунания 1шоб!я1зовано1 уреази, включаючи залехн!сть активност! ферменту в!д рН, ¡юно! сили, буферно! емкост! середовища, а тако.ч II ст!й-кгсть до термо1Н&етивац1I.

На рис.1 наведена залежи1сть активное?! в1льного (крива 1) та оммобШзованого.(крив! 2.3) ферменту в^д рН 1 нкубац!иного .середо-вияд. Оптимум рН для нативно! уреази у 100 мН фосфатному буфер! знаходиться в межах 7-7,5. Для ¡ммобШзованого ферменту в!!! б!льп вузьккй, 1 у випадку визкачення активност! уреази у 1КЗ !лМ буфер! становись 7,5. При внкористята 1 иН буфера оглимум рй !м?.юб! .газовало! уреази зсувгетьсл в кислий дЮпазон на 1-1,Б единиц5. Так;:;; ефект пов'язаиш, мозагао, з тки, ко у розтеньх з ни?ых» Лу-г-ижсй емклетю в результат! вакогог-геияя йен! в амо'Пк до!с«ь.'{-.> ?аку?копня не кошенсуеться, тому фермент Флктично функцЮну«-: при ош« в.!го-ких значениях рН, н!гс рЯ буферного розчииу, цо викорисговув?1.ся.

На рис. 2 изведена зал«л1сть активност! в!льчзго (к» я с» Г, та ¡ммобШзованого (крива 2) ферменту в!д буфэрно! емкос.т! сере-довпца 1икубац!! при рН фосфатного буферу 7,5. При л 1 коалп-рацП буферу в1д 0 до 5 и\1 актиЕЯ1сть ферменту депо эрдетав, по, певно, пов'язаро !з гтаб!л1зп»исп структур!! Фор>.'"-н'гу п-;!-":^-зростання молярност! оуферу виклшеае зникышл роты актив:-.сст1 уреази, до може бути зумовлене зм!ною проникност! мембрани для субстрату за рахунок зэ!льшення Лоно! силн.

3 ыетоо перрц 1рки цього припущення, нами була вмвч':-!<-л золс-л-!асть активност! в1льно1 (рис. 3, ксива 1) та ь».!0б'1л!5ов:»:ю! (рис. 3, крива г/3) уреази. в!д йоно! сил» !икубац!йного середовища. Вияеилося, що активность уреази знш-г/еться !з зроста.чням йен-центрацП N301- Цэ, мояливо, е насл1дком екрануваиня ззрядхьних труп активного центру Ферменту та зменЬення проникност! •«омбрани для субстрату. Останне лршзуиення частксго п!дтвер^гу-льс;: результатами експег-имент1в по винчени?: нпбрякшш нс-мбр^ни л г'.-;-ношНн сил]. СтуШьъ набрзгашш г»л*<5ум111с1>с1 н??с. .. а, •.•:••:•»•

5 5.5 0 6.5 7 7.5 0 0.5 9 '

рИ

Рис. 1. Заяехцпсть активност! е!лыю! (крива 1) та 1шоС1д!-вовано! уреази (крив! 2,3) в!д рН Шсубац! иного середовшаа: крива 1 - 100 мМ кал!й-фосфатшш буфер, крив! 2,3 - 1 кМ та 100 мМ калий- фосфатний буфер в!дпов!дно.

АФ. %

Концентрац1я буферу, ММ

Рис. 2. ЗагеяшЮть активност1 вольно! (крива 1) та !ммоб1л1-.»овшкч (крива Г") уреази ь!д кспцентрацП кал!й-фосфатного буферу.

ббйо5 за дспомогда ГА, запенить вхд величини кош! сипи: чим Саль-ше йона сила розчииу» им меише ступ!нь набрякання мембрани. Необидно в1дм1тити, ¡ар стушнь набрякання тако! мембрани не леревищуе

35 в1дс0тк1в.

Стабыыпсть ¿¡.«мобШзовано! уреави характеризували по к1не-ткц1 термо1нактивачП ферменту уа цшм1чвост1 кого робота. 1ммоб1-л!зована уреаза СПльв тершстаб1льна, пор!вняно з розчинншл ферментом при ВС1Х доолхдхених значениях рН буферного розчику. Причо-му найб!лыиу р1зниц;о аареестровано при значения рН 7,0, коли гпсля прогрхвашга мембрани на потяз! 30 кв при 65°С зберхгаетьсд до 80% вгайдно! активное« ферменту (на а!дм!ну В1Д вьчьного ферменту, активШсть якого при тих самих умовак збер!гаеться липе на ".О X). 1ммобы5зований фермент витримуе до 8 цикл1в роботи (но 10 >;в кож-пай) без втрати активное?!. Велике практична значения при ство-ренн! ферментного сенсору мае вианачеиня Км для Н'мобиааованих фермент!в, оск!льки цэ дозволяв оц!нювати ыожлив! меж! визначешш концентраци субстрат1в цих фермент1в. Для уреази, йшсбШзовано! в альбум!нов1й мембран!, величина за сечовпною сталсвить 2,0 мМ при 20°С та рИ 7,0. Визначенал при тих же умовах величина !(,„ для розчииного ферменту становила 3,3 мМ.

, СГВОРЕИНЯ УРЕАЗН0Г0 СЕНСОРУ НА ОСНОВ 1 рН~1ГЛДЖ!1Х ШЛЬОВИХ ТРАНЗИСТОРШ

Вявчення електрохппчнпх влас.тквостен у^^азного бюсенсо^;!

Типовий еигляд в!дгуку б1осенсору на пеину концентрат» с-чо-вини в залежност1 в!д часу представлении на рис. 4. Базова лШя отримана за в1дсутноеп субстрату. Шелл внесения сечовинн нл;>;с1т-ыальна величина в!дгуку досягалась впродовк 1-3 хв. Комвання часу, протягом яетго досягазтьсл максимальна величина в1дгу»ту, &у-новлеи!, очевидно, р1знсю товщшюю мембран.

Максимальна величина в1дгуку бЮсенсора та озвдкэст! йоге на-росташга спосгер1гаегься при рИ 7,0-7,5 , цо узгоа^уетьел а ионе-редн1ми данями по кодоркметричкему кигначена» зале?.поот1' ахтиьнос-т! Ш-юбШзоваво! уреази в!д рН буферу. Причому,' необх1дг:о гагы-чити, ир жива максимально! пвидкост1 наростанна в1дгуку в язле-ж-НОСТ1 в!д рИ повя1сто в1дповгдаз так1й саигй эадезокхя! для пат ив-но! уреази. Ердо галежяост1 максимально] величина в1лгуку г И, спостерхгаеться б^льа широкий оптиуум, гмшенкй в я-тч с'.-лль. Цс-и маша псясшггй там. ко, з одного еску, и.-.у

ЛФ, %

КошдентраЦ1Я НаС1, %

Рис. 3. Залеаш1сть активност! в1льно'1 (крива 1) та 1ммобШзова-но'1 (крив! 2,3) уреазн в!д концентрацП Ь'аС!: крив! 1,2 - 20 мМ ка-?1.й-фосфатний буфер, крива 3 - 1 мМ калЫ-фосфатний буфер.

Рис. 4. Вигляд в!дгуку б!осеисору на сечовину (0,4) мМ у 1 ¡.г.! Ъо ратному буфер!, рН 7,5. Момент внесения субстрату позначен стр!л-

актшИсть при рН 8,0, 'аз другого беку, буферна с,мк1сть ка "д1й-фосфатного буферу при такому значены! рН вхе незначна (для ка-л!й-фосфатного буферу рК - 7,2). Тобто, якцо при рН 8,0 власна актива! сть уреази депо знизуеться в пор1внянн1 з активнЮтю при рН 7.0-7,5, все р!вно ми межемо мати аналог1чну чи нав!ть б1льсу величину в!дгуку оЮсенсору за рахунок эменоення буферно"! емкост1 розчину. Кр1М того, такий широки;) рН-оптимум мохе бути зумозлекий наявн!сто иадлишку фермента на. позерхн! польового транзистору.

3 метой перев!рки цього припущення вивчали зачетаЮгь зелпчи-нн в1дгу!«у б!осенсора в!д температури. 0м1ла температуря дослют-заяого розчину з!д 15° до 30°С практично не впливала на величину в!дгуку б!осенсора, тод! як активдЛсть натизного фермент,' за таких умов суттево аростаяа. Щ результат« св!дчать про 1снуваиня ' надлишку ферменту на поверхн1 польового транзистору, тому величина в!дгуку бЮсенсора виэначаеться пльки концентрации субстрату в досл1ддуваному зразку.

Зэ зрсстаталм буферной емхсст! розчину величина э1дгуку бю-сенсору значко знижуеться (Рис. 5). При цьому мех! вим1рюваних концентрац!й сечоэини зсуваоться в б!к 1х збалььення. Та»«, у 1 мМ фосфатному буфер! область пропори! йно! эалехност1 величини сигналу б!осенсору в!д копцеитраш5 сечовшш складала в!д 0,05 до 0,5 мМ, а в 5 та 10 Ш буфер! - в1д 0,1 до 1,0 мМ та з!д 0,25 до 1.5 мМ в!дпов1дно. Тобто, чутливЮть сенсору ззлед1ть в!д буферно'! емкос-т! досл!джуваного зразку. цо необх1дно враховувати при зиМрюванн! концентрацН сечовини в 0!олог1чннх р!дннах.

Для б1олог1чних р!дин харачтершми е висок! концеитрац! 1 р1з-них солей, тому ваяливо з'ясувати, чи залечить х!д »:эл!бровочно1 кр:шо! в!д начвност1 в досл!джуваному зраз»су эначно! концентрацН КаС1 (основна с1ль,!хнцентргц1я в сироватц! кров! близько 150 мМ). Внявилось, що п1двиаення концентрацН сол1 в!д 0 до 200 мМ приводить до зшиення величин«.сигналу приблизко на 507. (Рис. 6). При подальшему зростачн! концентрацН сол1 до 400 мМ величина в1дгуку практично не змИететься. Таадм чином.' при визначенн! р!вно сечовини в ОЮлоПчнга р!динах необх!дно у вих!дний буфер додавати !!аС1 в концентрацН не нгаме 200 >И. Враховухзчи те.цо в сироватц1 кров1 концентрац!я КаС1 становить 150 мМ, при внесеин1 зразку у вим1ря-вальну ко:.(!рку ко;щентрац!я розчину буде визначатися коицентрац!ея сол1 буферу. Таким чином, мсзшга1 коливання цього параметру для зразку сироватки не будуть впливати на величину сигналу б!осенсЬра

л; ив

33 £5

го а ю

5 о

Концентрата сечовшш, иМ

Рис. 5. Залеипсть величина в!дгуку б!осенсора на сечовину в1д концентрат 1 буферу: 1, 2, 3 - 1 мМ, 5 ым. 10 мМ кал!й-фосфатиий буфер вгдпсвШю.

Концентрац1я сечовшш, иМ

А. и В

Концентрации На И. иН

Рис. 6. ЗалекнЮть ампл!туди в!дгуку сенсора на 1 ыМ сечовину б!д конца атрацП МаС1.

- 11 -

та вносити похиб)су у визначеиня концентрацП, сечовини.

Нами буза визначена операцшга стаб!льн1сть робота б1осенсо-ру. Ввелилина в!дгуку на 1,5 мМ сечовину эменшувалася поступово, 1 за два т!йш1 роботи сенсору становла 702 вихшю1 величини. Щодо-бово проЕодилося 10 - 12 BKMiplB. Роэб!лн1сть м!л вим1рамй пе пе-ревищувала 10 %. Один датчик витримуе до 20 вим1р!в без паШння величина сигналу 1 до 120 вим1р1в при пад1нп1 сигналу не б1льпе 30 в1дсотгЛв.

Визначення р!вню сечовини в сироватц! кров!

Виявлено. со внесения розведекно! в 25 раз!в сироватки в роз-чин, що аяал!зуетъся. зм!нюе нахил кал1бровочно1 кривоТ (рис.7). При такому розведенн! копцентраШя сечовини не вкходить за меж! чутливост! сенсору (0,1 ыМ сечовини). За врахуванням цього ефекту була одержана'кая1бровочна ¡срива та визначено концентрацП сечовини у сироватц^кров! лабораториях тварин (табл. 1). Паралелыю концентрата сечовини визначалась фенол-Ппохлоритним методом. Розб1лн1сть у значениях пе перевищувача 10 в!дсотк!в.

Таблица 1. Пор!вняшш результат!в визначення концентрацП сечовини в сироватц1 кров! лабораториях тварин, - отриманих Фепол-г1похлоритнкм методом та з допомогш уреазного бЮсеисору.

Ко1щентрац1я сечовини,мМ КопцентраШя сечовинн.Ж ШдхилепняД

(фенол-гiпоялоритлпй м-д) (сенсор) (A-B)XlOO

А В . А

Скроватка кров! пацюк!в

6,75 6,25 7.4

9,00 8,75 2,8 ,

Сировагка кролик!в

13,75 14,40 4.7

16,25 16.00 1.5 -

13,25 14,40 8.7

13,75 14,40 4,7

А, мВ

Концентрация сечовини, мМ

Рис. 7. КалЮровочШ крив! уреазного б1осенсора у 10 мМ Ка-лМ-фосфатиому буфер! для вигначеийя сечовшш еа впдсутсст! сирс-ватки (крива 1) та при наявнозт! сироватки 25~кратного роэьэяення (крива Z).

ЛОШУК ШЛЯХ1В СТАБШЭАЦП РОБОТИ УРЕАЗНОГО СЕНСОРА СтабШзащя активност! уреази при 1ммеб!л!?ааП 3 метою -оцЗнки шлях!в стабШзацП активнее?! ферменту в прочее! аммобШзацП вивчали мо»ишв!сть захисту активного центру ферменту Шд час фор'мування мембрани в присутност! субстрат 1 в (се-човини та формам1ду) та стеричного аналога субстрату - т1сог;оншн.

Ус1 сполуки вносили у середовип;е для ¡ммобШзацГ! в 4-х крат-пому молярному надлишку по в1дношенню до ферменту. Х1нцева кон-цэнтрац!я субстрата становила 1 мМ. Виявилось, ио при наявност! сечовини в середовини !ммобШзацП, нав1ть при эб1лыпенн1 часу експозицН мембрани в парах ГА до 1 год виникають проблемп о 11 поламеризаЩею. Можливо, це являеться результатом локального 3a.iv-хешга середовища баля молекул ферменту в процесс розщеплення сечовини уреазою. Така зм1на рН маме негативно впливати на процес пол1меризацП. В той яе час, при наявност! в середовия! 1ммоб!л1-зацП формам!ду ,що розщеплюеться уреазоа з набагато мешпога швидк!стю (Км - 1,06 мШ, активШсть 1ммоб!л!зовано1 уреази на 253 вида, н!ж у вариантах без формам!ду. Мсшиво, зв'язуючись з аетив-ним центром, формам1д захищае функц!опально ваашв! групи активного центру в1д взаемодП з ГА, оск1льки субстрат-ферментний комплекс в даному випадку розпадаеться набагато пов!лы1!ие, н!я в ви-падку з сечовинсю. Хоча, в той хе час, т!осечовина не виявляе протекторно! дП на акттзн!сть уреази, а навпаки 1нг!буе II. Ц! зачоном!рност! збер!гаються при зсИлыленн! часу обробки мембрани парами ТА до 2 годин .

Щоб скоротити час прсцесу 1м.чоб1л1зацП уреази, ! тим самим змзниити мояливий вплив продукт!в реакцИ та'зм!ни рН на процес тшмеризацП, була проведена спроба "¡1 формувашш з використзнням 2,52 резчипу ГА. Одна1!, хоча в такому випадку час под!меризац!1 скорочуеться до .кальках хвзшш, були отримаи! результат!!, под!бн! до попереднах, Присутн!сть формачаду в середовиа;! !ммо5Шэаи!1 БбЬтъгауе ектившеть уреази, присутШсть Иосечовияи та сечовшш пригн!чують активШсть Ферменту в процес! ¡ммобШзацП.

В1домо. що як стабШзатори фермент!в вююрштовуютъ такса сахарозу та глацерин. Тому ми ввакали доц1льиим перев!ритн вплив цих сполук па збереленкя активкост! уреази при !ммоб!л!зац!1. Максимальна активн1сть !?Амоб!л1зовано! уреази спостер1галасп при наявност! 5% гл!цернну в середовщ! ! часу експозицП в порах ГЛ 30

хй. Необх1дко в!дм!тити, цо еб1льсзшш часу обробки парами ГА до 1 години практично не впливаз на шггишпсть 1ммоб1л!8ованого ферменту. Зб!льшення концентрац11 глщерипу э 10 до 20% негативно впливаз на процес формування мембран. Мембрана Прше пол1меризуеться i в насл!док ць'ого в неЗ виыиваеться фермент. Одпак поэитивнпм' моментом е те, що глШерин sano6irae п!дсихашш роачину-, нанесеного на поверхню, sao необх!дно для проникнення в не! пар!в ГА та самого процесу пол!мер1эацП.

Досл1иення ачтивност! уреази при 1ммоб!л!8ац11 в присутност! сахарови показали, що П паявШсть в середовищ! 1мкобШзацП таком Шдвидуе аалкшкозу активность уреази в мембран! Оптималышми концентрации сахарози е 2.БХ при 30 хв експозицГ! в парах ГА та Б% , ягацр терм1н ешюзицП стаковитм год.

Стаб!л!зац1я активное?! уреази при 8бе-р1ганн1

Ще одним напрямкем нааих досл!дкень був пошук оптшалыии умов вбер1гання Ферментяих мембран. При збер1ганн1 !ммобШ8Сшщю-го ферменту в буферних роачииах одн1ею б основиих причин над1ння активност! ферменту може бути бактер1альиз деградац!я мембрани. Для пригн!чешт бактер1ально1 флори при збер1ганн1 б1ошмбрани в буФор! в и; со р и с т о в у в 'г s и азид 1шр!ю, Як показа»» ггхШдкешга, &зга натр!» иригШчуе активнють уреази на 30 Z при концентрацП 0,1 z, ase в процес! в!дыньа!шя мембразш в1д консерванта актишйсть 1ммоб!л!зоваиого ферменту практично в!дновлйзться до вик1дного р!вня. Тому в подалыпих довгострокових експервментах ми використо-вували азид натрш як консервант 1 в1дмивали иого при Еккориоташп сенсорного датчика.

В табл. 2 представлен! результат« досл1дкень активност! !ммо-бШзовано! уреази за р1зпш умовах збер!гацня. Макспмзльшш ефект досягаеться при эбер!ганн! ímmq6í л i вованого. ферменту в буфер! в приоутност! 1 мМ ЕДТА при 4°С. Уреаза эбер1гала 100% rktkbhíctÍ на протяв! одного мЮяця. При 8бер1гани! в !нших умовах втрачазться в!д 30 до 75 % активносг! ферменту.

\

Таблица 2. Залежн1сть залишково! уреази (у радсотках в!д вих1дно1 активност!) при р1зних умовах зберхгачня

Умови збер1гання шмобШзсвано! Терм!н збер!гання. доба

уреази 0 9 И 17 29

20 мМ калш-фосфатний буфер, рН 7,4, 4°С 100 107 116 - 71

20 кал!й-фосфатний буфер, 1 мМ ЭДТА, 4°С, рН 7,4 100 115 105 104 107

У сухому стан!, 4°С 100 99 91 83 67

У сухому стач1, 20°С 100 76 71 32 27

ВИСНОБКИ

. 1. Проведен! досл!дження по зибору оптимального способу фор-мувакня ферментно! мембраии б1осенссру на основ! 1ммоб1л1зоваио1 уреази. Показано, до включения уреази в мем'брачу шляхом полшери-эац11 11 з БСА за допоыогои пар1в ГА бьтья технолоПчне, та надае мгаклив!сть У значно б!льш1й м!р! уникати !нактивац!1 фементу по-ргвняно з мембране» на ссноз1 ПААГ. П!д!бран1 оптимальн! умови формуваяяя мембраяи на основ! БСА.

2. Досл!дяено властивосИ шчоби'пвовано1 уреази. Встзловле-но, що 1<л1 для в1льно! та п/мобШзовало! уреази близь к! за значениям. 1ммоб!л!зована уреазз б^льз термоста5!льна в лор!внягап з в1льним ферментом.

3; Створено лзборатерний прототип уреазнсго б1ссенсору на основ! р11-ПТ, та вивчеко кого електрох1мичн1 властивост!: зале*н1сть ерличини сигналу в1д рН. йоно! сили та-¡концентратI буферу. П!

дЮран! оггпшалън! умови визначення сечовини в модельних розчинах, наближених за властивостями до сироватки кров1.

4. Визначено, ко чутлив!сть уреазного сенсору достатня для визначешш концентрацП сечовини в сироватц1 кров!. Коеф!Щент ко-реляцП м1ж показннками сечовини в сироватц! кров!, щр були визна-чен! за допоыогою уреазного бЮсенсора та г!похлоритшш методом, складас 0,98.

5. Показано, що один датчик витримуе до 20 BiiMipiB без пад!н-ня величини сигналу. Ро&б1;«н1сть Mi« вшлрам при в!дтворенн1 сигналу но перевицуе 10 Z.

6. Визначено вилив ЩА, глщерину, сахарози, субстрат1в уреази '(сечовини, формам!ду) та 'ix аналога т1осечозинн на вбер1ганнл ajiTiiBHOCTl уреази при ишсОШзацГ) в мембран! та при a6epiramii Ферментно! мембрани за р!зних умов. Встановлено, що наявн!сть в розчг.111 сахарози, та особливо гл!церину, при формуванн! фермеитно! мембрани б1льш ефективно запоб1гае !нактиващ1 уреази, iuk приоут-HicTL вказаних виае субстратов.

OciiQBiii положения дисертацп опубликован! в роботах:

1. Стародуб il.fi>., Сандровсш1й Д.К., Солдаткин А.П., Бубряк O.A. .Ельская A.B., Самиба O.E., СтрихаВ.И., Хусточка Л.Н., Шуль-га A.A. Мультибиосенсор на основе полевых транзисторов для определения глхжози н мочевшш//Всесо:о&нал конференция "Химические сенсоры": Тез.докл. - Ленинград,1S89.-4.3.- С,259

- 2. Стародуб И.Ф., Зайцев В.Н., Хусточка Д.И,, Лагоренко A.B., Коломиец Л. 1!., Бубряк O.A., 'Гурковска.ч Г.В., Ельская A.B. Интеграция биологического материала в электрохимические бносенсорше устройства // Всесоюзная конференция "Химические сенсоры": Тез,докл.

- Ленинград,1989.-Ч.З.- С.213

3. Бубряк O.A., Лазаренко A.B., Хусточка Л Л!. Эксп^римдаагь-1ше подходы формирования на поверхности кремниевых структур матрицы, Сиоселективной к мочевине// У научная конференция молоды;; ученых: Тез. докл. - Ужгород, 1930. - С. 165.

4. Стародуб Н.Ф., Хусточка Л.П., Лазаренко A.B., Бубряк O.A., Теренгьев Ф,г., Ельская A.B. Интеграция биологического материала в электрохимические биесенсорнш ус1ройоа-ва//й. апалит. химии -1590,- 45, UV.- п. 1 »122-1410.

5. Бубряк О,Л., Xyciочка Л.П., CCWBTKJ'S A.IL, Пдьскзя /¡.В.

Формирование биоыембраиы для зпзн?юсенсоров,.на оспове полупровсд-тпсоЕНХ сгрукгур//Материалы 11 Всес.симп. "Инженерная знзимоло-гия". - Москва. 1991.- С. 211-212. ' .

6. Солдаткин Л.П., Бубряк O.A., .Стародуб Н.Ф.. Ельская A.B. Использование ферментных биосенсоров на основе pH-чувствительных полевых транзисторов для анализа нйзкомолекулярных веществ// Рес-

• лубликанасая наунно-технйческая конференция. "Новые возможности ■ современного медицинского-приборостроения": Тез. докл.- Ворзель, 1991. - С! 85.

7, Бубряк О.^., Солдаткин А.П., Стародуб Н.Ф., Ельская A.B. Биосенсор^для определения мочевины на основе pH-чувствительных по-легых транзисторов//Республиканская научно-техническая конференция "Новые возможности современного медицинского приборостроения": Тез. докл.- Ворзель, 1991. - С, 86.

8'. Starcdub li.F., Bubryak O.A., Pavlenko Ul/f. Soldatkln .Д.P., Rachkov' A.E., El*skaya\ A.V.; Biomembrane formation for enzyme- and inwunosensors: approaches and achievements // Biosensor syirposlum, Enschede, 1991 , Abstr., P.48.

9. Бубряк О.'АГ, Хусточка Л.Н., Солдаткин А.П., Стародуб Н.Ф. Исследование иммобилизации и свойств у^еазы с цель» создания био-с.епсора на оспове полупроводниковых структур//Укр. биохим. ■ жур-v нал -1992.-6J, К1.-С. 66-71. "

_ -10. Shul'ea A.A.. Strlkha V.l., Patskovsky S.V., Dzydevicb S.V.. El'skaya A.V., Soldatkln A.P., Bubryak O.A. 'Thln-fllnt Conductometrlc Biosensors^ for Glucose and Urea Determination// Proc. of the Second World Coneresson Biosensors. -Geneva. Switzerland, 1992..- P. 45-48. '

11. Бубряк O.A.; Солдаткин А.П.. Стародуб Н.Ф., Ельская A.B., Пульга A.A., Стриха. В.И. Изучение оптимальных условий работы биосенсора на основе уреаэы и pH-чувствительных полевых транзисторов. Определение мочевины в растворе// Укр., Сиохим. журнал.- 1993.- 65, N 1. - С.110-113. - ,

% 12. Бубряк O.A., 'Солдаткин А.П..' Стародуб Н.Ф., ельская A.B., Пандровский А. К., Шульга А. А., Стриха В-И. - Уреазный биосенсор на полевом транзисторе. Особенности конструкции и характеристики ра- _ bo ты в модельных условия^ // аяектрохимия.- 1993. - 29, И 3. С. 315-320. Ч'

' • . ... / — V

Пгдп. до друку93 . Формат 60xS4/Iô." Ilanip друк/Gïc. друк. • Уц. ,1фук. арк. Р. в* . Ун. фароо-вгдб. . Обл.-вид. ab:.

Tupaü iÜÖ пр. Баы. Еезксштошо."

Вхдцруковано в Îiîowïïvt! маг шашки All Укра1ни 2526GI Iîuïb 4, ГСП., вуя. Терецзшйвська, £