Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Альтернативные вариаты использования ферментов при создании полупроводниковых биосенсоров

ВАК РФ 03.00.20, Гельминтология

Автореферат диссертации по теме "Альтернативные вариаты использования ферментов при создании полупроводниковых биосенсоров"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОПЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

волотовський

Вячеслав Вячеславович

УДК 577.151.042:577.151.35

АЛЬТЕРНАТИВНІ ВАРІАНТИ ВИКОРИСТАННЯ ФЕРМЕНТІВ ПРИ СТВОРЕННІ НАПІВПРОВІДНИКОВИХ БІОСЕНСОРІВ

03. 00. 20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

КИЇВ - 1998

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Київському університеті імені Тараса Шевченка та Інститу молекулярної біології і генетики НАН України.

Наукові керівники:

доктор фізико-математичних наук, професор

СТРІХА Віталій Іларіонович

Київський університет імені Тараса Шевченка,

кафедра напівпровідникової електроніки,

завідувач проблемною лабораторією;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітни

СОЛДАТКІН Олексій Петрович

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, головний науковий співробітник відділу механізмів трансляції генетичної інформації.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник ВАРБАНЕЦЬ Людмила Дмитрівна

Інститут мікробіології і вірусологи імені Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділом біохімії мікроорганізмів; кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник НІГМАТУЛЛІН Рінат Равільович

Інститут колоїдної хімії і хімії води імені А.В. Думанського НАН України, головний науковий співробітник відділу фізико-хімії мембран.

Провідна установа

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України, м.Київ.

Захист дисертації відбудеться 16 вересня 1998 р. о 10 годині на засідан спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 в Інституті мікробіології і вірусології і Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 252143, м.Київ, вул. Заболотног 154.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту мікробіології вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 252143, м.Київ, ву Заболотного, 154.

Автореферат розісланий /б^1998р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук

Пуріш Л.М.

Актуальність теми. За минулі десятиліття було створено значну кількість аналітичних приладів, здатних більш чи менш селективно реєструвати концентрацію відповідних компонентів в рідкій фазі, але відносно недавно з’явився принципово новий тип сенсорних приладів - біосенсори [Turner, 1989]. Ці прилади одразу ж потрапили в фокус інтересів хіміків-аналітиків, біологів та медиків, що обумовлено рядом їх очевидних переваг, таких як висока селективність і чутливість при невисокій собівартості. Особливо слід підкреслиш можливість створення портативних аналізаторів для широкого кола споживачів, -наприклад, побутового глюкозиметра для людей, хворих на діабет [Hunter, 1987], чи сенсора для визначення концентрацій забруднювачів у питній воді [Tranh-Minh, 1985].

Напівпровідникові перетворювачі можна вважати найбільш перспективними в плані створення портативних біоаналізаторів, зважаючи на можливість їх мініатюрізації, створення в одному технологічному циклі чутливого елемента та схеми підсилення і обробки сигналу на єдиному кристалі та невисока собівартість при їх масовому виробництві.

Було розроблено ряд ензимосенсорів на основі потенціометричних та інших твердотільних перетворювачів, проте не завжди унікальні можливості ферментних систем використовувалися повністю. Зокрема, більшість ензимосенсорів було створено для визначення концентрацій відповідних субстратів, хоча ті ж самі ферменти можуть використовуватися для кількісного визначення їх інгібіторів та реакгиваторів. Для того щоб максимально реалізувати ті чи інші властивості іммобілізованого фермента і відповідно зкоректувати аналітичні характеристики біодатчика, необхідна певна модифікація біоселективної матриці. Одним з найпростіших і найзручніших методів такої модифікації, очевидно, є нанесення додаткових полімерних мембран різного типу на поверхню ферментного шару для контролю дифузії в об’єм біоматриці субстратів та продуктів ферментативної реакції, інгібіторів та реакгиваторів фермента, буферних компонентів розчину [Soldatkin, 1993].

відображена в дисертації, виконувалася при навчанні пошукача в аспірантурі Київського університету ім. Т. Шевченка в рамках державних науково-технічних програм “Біосенсори” та “Новітні метода біоінженерії”. Вона також включає дослідження, проведені в Інституті Молекулярної Біології і Генетики НАН України в рамках міжнародного лінкідас-гранту ENVIR.LG 950913.

Мста та завдання дослідження. Метою даної роботи була розроби

альтернативних варіантів використання іммобілізованих ферментів при створені

напівпровідникових біосенсорних систем для кількісного визначення і

субстратів, інгібіторів та реакгиваторів.

Виходячи з мети роботи, були сформульовані такі завдання:

1. На прикладі глюкозного потенціометричного сенсора дослідиш вііли заряджених додаткових мембран на аналітичні характеристики біосенсорни систем.

2. Проаналізувати можливі шляхи регулювання аналітичних характерне™ уреазного потенціометричного сенсора з метою підвищення його чутливос-до:

• субстрату (сечовини);

• інгібіторів (іонів важких металів);

• реакгиваторів (комшхексонів іонів важких металів).

На основі одержаних результатів створити лабораторні макети відповідай аналізаторів.

3. Розробити та дослідиш аналітичні характеристики перокендазнот потенціометричного сенсора та створити на його основі лабораторні прототип датчиків для кількісного визначення:

• аскорбінової кислоти;

• ціанідів;

• амигдаліну в продуктах харчування.

4. Розробити принципову схему портативною вимірювального приладе, яки дозволяє проводити дослідження в диференційному режимі і компенсуват зарядовий вплив додаткових мембран та неспецифічних домішок на відгу потенціометричних перетворювачів.

Наукова новизна роботи. В даній роботі:

• показана можливість багатофункціонального використання потенціометричні' ензимосенсорів на основі уреази та перокевдази.

• шляхом модифікації біоселективної матриці за допомогою заряджені полімерних мембран вперше отримано можливість регулювати дифузію іоні буфера, субстратів, інгібіторів та активаторів в об’ємі ферментного шару. А ц в свою чергу, призводить до змін аналітичних характеристик біосенсорів регулює чутливість іммобілізованих ферментів до вищезгаданих сполук;

з

> на основі потенціометричних уреазного та пероксидазного сенсорів створено лабораторні моделі аналізаторів для визначення концентрації сечовини, іонів важких металів, секвестрантів (комплексонів Іонів металів), аскорбінової кислота, ціаніду та амигдаліну;

> вперше створено портативний прилад для потенціометричних вимірювань за допомогою іоноселективних польових транзисторів. Робота в диференційному режимі при постійному струмі стоку забезпечує вимірювання зміни поверхневого потенціалу ІСПТ з високою точністю і компенсує зміщення робочої точки, спричинене зарядженими функціональними групами біоматриці.

Практична цінність роботи. Створено діючі лабораторні моделі ферментних зіосенсорів для експресного визначення концентрацій глюкози та сечовини в фізіологічних рідинах. Зокрема, розширений динамічний діапазон глюкозного потенціометричного сенсора дозволяє проведення досліджень в слабо розведених іразках, а це, в свою чергу, призводить до потенційної можливості in vivo зимірів. Створено лабораторні моделі ферментних сенсорів, що можуть бути основою промислових варіантів автоматизованих аналітичних систем для визначення концентрацій іонів важких металів та ціанідів при проведенні жологічного моніторингу. Розроблено лабораторні прототипи біосенсорних :истем, які можуть використовуватися в харчовій промисловості для вимірювань «онцентрацій вітаміна С, секвестрантів та ціаногенних глікозидів.

конференції “Еиговешоге XI”, (Варшава, Польща, 1997).

Публікації. Основні положення дисертації викладено у 6 наукових працях, / тому числі - 5 журнальних статтях

юшукача та за його безпосередньої участі в проведенні експериментів та аналізі утриманих результатів. Слід відзначити допомогу співробітника Київського дгіверситету ім. Т. Шевченка Пацковського С.В. при розробці вимірювальної іпаратури, використаної в дослідженнях.

іітератури, опису матеріалів та методів дослідження, експериментальної частини, пса включає виклад у трьох розділах результатів роботи та їх обговорення, зисновків, а також списку літератури, який охоплює 97 публікацій. Робота

Результати досліджень доповідались на міжнародній

а. Всі дослідження виконано з ініціативи

Дисертація складається з вступу, огляду

4 ■

викладена на 110 сторінках машинописного тексту. Фактичний матеріа

дисертації подано у вигляді 43 рисунків та 2 таблиць.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

В роботі були використані такі реактиви:

Ферменти (вказано активність одного міліграму сухого матеріалу):

• ^-глюкозооксидаза з РепісіШит vitale (КФ 1.1.3.4) з активністю 168 од.акт.Дп виробництва Косарського спиртзаводу Черкаського виробничого об'єднана спиртової промисловості;

• уреаза марки Б з бобів сої (КФ 3.5.1.5) з активністю 12 од.акг./м] виробництва Олайнського заводу хімреактивів (Литва);

• пероксидаза з хрону (КФ 1.11.1.7), 120 од.акт./мг та манделонітрил ліаза мигдалю (КФ 4.1.2.10), 160 од.акт./мг були отримані з фірми “Sigma” (США);

• р-глюкозидаза з мигдалю (КФ 3.2.1.21), 26 од.акт./мг були виробництво фірм “Fluka” (Швейцарія).

Субстрати:

• глюкоза виробництва фірми “Merck” (Німеччина);

• сечовина, аскорбінова кислота, перекис водню, амигдалін виробництва фірм “Sigma” (США).

Матеріали для біочутливих та додаткових мембран:

• Альбумін сироватки бика (БСА) отримано з фірми “Boehiinger Mannheim (Німеччина);

• полі (4-вінілпіридин зі стиролом) - іоно-обмінний полімер (порошок, продук №19.207-4) та Nafion - іоно-обмінний полімер (5% в суміші низьке аліфатичних спиртів та 10 % води, продукт №27.470-4) виробництва фірм “Aldrich” (США).

Компоненти буферних розчинів:

• дигідрофосфат калію та цитрат натрію виробництва фірми "Мегсі (Німеччина);

• Тріс фірми "Reanal" (Угорщина).

Інші реактиви, використані в роботі, були вітчизняного та закордонної

виробництва і мали кваліфікацію "осл." та "х.ч.".

Дослідження проводилися на п-канальних іоноселективних польових ранзисторах, створених в науково-дослідницькому інституті "Мікроприлад” Київ, Україна).

Потенціометричні вимірювання проводились в буферних розчинах різного кладу при кімнатній температурі в комірці об’ємом 1,5 мл з інтенсивним геремішуванням. Концентрації субстратів, інгібіторів та реактиваторів в об’ємі міню вали шляхом додавання певних аліквот концентрованих розчинів. Завдяки иференційному режиму вимірювань було компенсовано неспецифічні зміни іхіднош сигналу, пов’язані з фоточутливістю перетворювачів та коливаннями емлератури і pH середовища.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

ДОСЛІДЖЕННЯ БАЗОВИХ ЕЛЕМЕНТІВ ФЕРМЕНТНИХ ПОТЕНЦІОМЕТРИЧНИХ СЕНСОРІВ

Вивчення аналітичних характеристик та оптимізаиія роботи потенціометричних

перетворювачів

Потенціометричні виміри базуються на принципі накопичення зарядів на юверхні електрода, яке призводить до виникнення поверхневого потенціалу. Цей іотенціал пропорційний до логарифму активності присутніх в розчині іонів юдню і вимірюється відносно інертного електрода порівняння, який також (находиться в контакті з досліджуваним розчином. В даному випадку рН-їутливий перетворювач (рис.1) створено на кремнієвій підкладинці р-пшу, в яку мплантовано дві ділянки п-тилу (витік та стік, відповідно), з’єднаних провідним саналом п-типу. Напруга в 1-2 вольта прикладається між кремнієвою тідкладинкою та електродом порівняння і створює електричне поле, яке мдштовхує електрони від поверхні підкдадинки. При вказаній полярності та зеличині затворної напруги зміна концентрації електронів провідного канала модулю є струм між витоком та стоком. Потенціометричний біосенсор формується з рН-ПТ при нанесенні шару іммобілізованого фермента на іоверхню іоноселекгивної мембрани. Каталізована ферментом біохімічна реакція :причиняє зміни pH в біоселективному шарі, які реєструються за допомогою теретворювача.

Рис. I. Схема напівпровідникового потенціометричного перетворювача.

Аналітичні характеристики ІСІГГ визначаються рядом фізичню параметрів, зокрема, рН-чутливістю (рис. 2) та інтенсивністю дрейфу вихідноп сигнала (рис. 3). На практиці всі ці параметри залежать, в основному, від тшг іоноселективного діелектрика, нанесеного на сенсорну область ІСПТ. Тому буде експериментально розглянуто вищезгадані залежності та рекомендоване оптимальний матеріал для іоноселекгавної мембрани, а саме БізН,.

pH буфера

Час, хв

Рис.2. рН-чутливість ІСПТ з різними іоноселекгивними

мембранами.

Рис. 3. Дрейфові характеристик, кремнієвих структур з різним, діелектричними шарами.

Було вивчено вплив заряджених полімерів (полі-4-вінілпіридин зі стиролої та ЫаОоп) на функціонування зарядово-чутливих потенціометричних сенсорів показано, що нанесення іонообмінної мембрани на поверхні потенціометричного перетворювача призводить лише до незначних змін ємнісни характеристик структури "напівпровідншс-діелекірик-елекіроліт" та поверхневог

ютенціалу ІСПТ в результаті іонного обміну в полімері. Для проведення вимірів і диференційному режимі при постійному струмі стоку транзистора, що повністю сомпенсує зміщення робочої точки, спричинене зарядженими функціональними рупами біоматриці, було розроблено електронну схему та створено портативний зимірювальний прилад, який було успішно випробувано на практиці.

Дослідження властивостей додаткових заряджених мембран на прикладі глюкозного

біосенсора на основі ІСПТ

Практичне використання багатьох потенціометричних біосенсорних систем і імітовано рядом недоліків, серед яких варто виділити три основні:

* низька чутливість в середовищах з високою буферною ємністю;

* вузький діапазон концентрацій, що визначаються;

* поява неспецифічних сигналів при роботі в реальних зразках.

Показано, що заряджені полімери, використані при формуванні елективних мембран, можуть повністю або частково усунути вищевказані іедоліки. Дослідження роботи немодифікованого глюкозного потенціометричного біосенсора (рис. 4 а) в Тріс-буфері виявили досить вузький динамічний діапазон калібрувальної кривої (0,05-1,5 мМ глюкози) та її сигмоідну форму, що не дозволяє проводиш вимірювання в нерозведених зразках крові, оскільки нормальна концентрація глюкози в крові становить 3-5 мМ і за ггатологій сягає кількох десятків мМ. Сигмоідність калібрувальної кривої призводить до похибок у вимірюванні навіть при розведенні зразка. Дослідження робочих характеристик такого сенсора також показали, що він відзначається високою чутливістю до концентрації буферу в розчині. Так збільшення концентрації Тріс-буфера від 5 до 40 мМ призводить до 20-кратного зменшення відгуку сенсора. Проте нанесення додаткової полімерної мембрани призводить до значного (більш ніж на порядок) розширення динамічного діапазону сенсора (рис. 4 б), причому, лінійна частина калібрувальної кривої покриває навіть завищений (за патології) рівень глюкози в крові. Модифікація сенсора зарядженою полімерною мембраною також суттєво збільшує величину його відгуку в розчинах з високою концентрацією буфера і покращує точність вимірювань в реальних зразках (похибка для модифікованого датчика не перевищує 7%, для немодифікованого - 14%). Втрата каталітичної активності іммобілізованого фермента після одного місяця зберігання в буферному розчині при 4°С не перевищила 50%.

Глюкоза, мМ

(а) (б)

Рис. 4. Калібрувальні криві для глюкозного сенсора без додаткової мембрани (а) та з додатковою ПВП мембраною (б) в 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ та 40 мМ Тріс-НО буфері, pH 7,4.

ВИКОРИСТАННЯ УРЕАЗИ В БІОСЕНСОРНИХ СИСТЕМАХ

Датчик для кількісного аналізу сечовини Практичне застосування уреазних сенсорів для визначення концентрації сечовини в фізіологічних рідинах теж лімітується рядом недоліків, серед яких недостатній динамічний діапазон і сильна залежність сигналу від буферної ємності розчину, в якому проводяться вимірювання (рис. 5 а).

. (а) (б)

Рис. 5. Калібрувальні криві для урсазного сенсора без додаткової мембрани (а) та з додатковою ПВП мембраною (б) в 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ та 40 мМ Тріс-НСі буфері, pH 7,4.

Оскільки подібні проблеми були частково вирішені у випадку глюкозного потенціометричного біосенсора, то очікувалось, що використання додаткових заряджених мембран призведе до покращення вказаних параметрів

вищезгаданого сенсора для визначення концентрації сечовини. Очевидним фактом є підвищення чутливості сенсора з додатковою мембраною, порівняно із немодифікованим, проте продовження динамічного діапазону (як у випадку глюкозного датчика) помічено не було (рис. 5 б). Це обумовлене тим, що динамічний діапазон уреазного датчика визначається іншими факторами, ніж у випадку глюкозного сенсора, тому не може регулюватися за допомогою додаткової мембрани. Очевидно, що запропонований сенсор може бути

використано для визначення концентрації сечовини в фізіологічних рідинах, хоча при вимірах реальних зразків їх слід розводити буферним розчином в

оптимальних пропорціях. Похибка при вимірюванні сечовини за допомогою

немодифікованого та модифікованого датчиків не перевищила 7%. Втрата каталітичної активності іммобілізованої уреази після одного місяця зберігання в сухому вигляді при кімнатній температурі не перевищила 10%.

Рис. 6. Залежність чутливості уреазного сенсора до іонів інгібітора від методу іммобілізації фермента.

"І 10 100 1000 10000 Си (П), мкМ

Необхідно відзначити той факт, що позитивно заряджена додаткова мембрана призводить до зменшення впливу іонів важких металів на активність іммобілізованого під нею фермента, а сенсор з уреазою, іммобілізованою під негативно зарядженою полімерною плівкою, значно чутливіший до цих інгібіторів, аніж сенсор з ферментом, покритим позитивно зарядженим юлімером (рис. 6). Очевидно, цей ефект можна пояснити електростатичними їзаємодіями між зарядженими функціональними групами полімерів та іонами нгібітора. Для збільшення чутливості фермента до інгібіторів було ^пропоновано іммобілізувати уреазу під шаром негативно зарядженого полімеру

(№йоа), що, на нашу думку, призводить до накопичення іонів важких металів і біоматриці.

Сенсор для детектування іонів важких металів Слабка специфічність уреази до інгібіторів (всі іони важких металі! утворюють стійкі комлекси з БН-групами активного центру уреази, пригнічуючі її каталітичну активність) призводить до часткового перекриття калібрувальний ліній для різних іонів (рис. 7). Проте слід відмітити, що іони ртуті набагак шкідливіші для людського організму, аніж іони міді, хоча обидва типи інгібуюп уреазу, знаходячись майже в одному й тому ж діапазоні концентрацій (1-1( мкМ). Ці факти змушують шукати шляхи покращення селективності сенсора д< одного конкретного виду іонів, і, зважаючи на високу токсичність ртуті, її іоні було вибрано для аналізу.

Рис. 7. Калібрувальні ірафікь для визначення концентрації, іонів важких металів зі

допомогою біосенсора :

уреазою, іммобілізованою пії ЙаВоп плівкою.

' 0.1 1 10

Концентрація інгібіторів, мкМ

Для зменшення чутливості уреази до іонів срібла було запропоновані додавати в досліджуваний зразок аніони, які селективно утворюють нерозчинн солі з катіонами срібла, таким чином виводячи їх з реакційної суміші. Найбільїі ефективними в цьому відношенні є іони йоду: навіть незначна добавка йодид натрію в суміш інгібіторів значно зменшує концентрацію іонів срібла в розчин Хоча іони міді не можуть бути виведені з суміші аналогічним чином, показане що фермент, інгібований Си (II), відновлює свої каталітичні властивості після хв відмивки в 100 мМ розчині натрієвої солі ЕДТА. В той же час ЕДТА н відновлює активність уреази, інгібованої іонами ртуті, тому така селективн відмивка робить систему практично нечутливою до солей міді. Отже бул розроблено макет біосенсорної системи з покращеною (за допомого! іммобілізації фермента в зарядженому полімері) чутливістю та можливісп селективного визначення окремих типів іонів важких металів. Проте складніст процедури призводить до значної похибки вимірювання - до 15%.

Сенсор для визначення концентрації секвестрантів Секвестранти (комплексони металів) займають важливе місце серед харчових домішок, оскільки вони допомагають підтримувати якість багатьох продуктів при зберіганні. Найбільш вживані секвестранти - це етилен діамін тетраацетати (ЕДТА), цитрати та фосфати. їх використати чітко регулюється відповідними нормативними документами, тому концентрації секвестрантів в продуктах не повинні перевищувати встановлених рівнів. Для визначення їх вмісту в харчових зразках було запропоновано біосенсорну систему, в якій зв’язуючі властивості секвестрантів використовувались для відновлення каталітичної активності уреази, попередньо інгібованої іонами міді.

Якщо калібрувальний графік для визначення концентрації ЕДТА за допомогою біосенсора побудувати в напівлогарифмічних координатах (відновлена активність відносно десятинного логарифму концентрації), лінійна частина калібрувальної кривої покриває весь діапазон, який може нас цікавити (від 10 мкМ до 1 мМ), похибка вимірювання не перевищує 2%. Відновлення активності ферменту іншими комплексонами, потенційно присутніми в харчових продуктах, досягається при значно вищих концентраціях (рис. 8).

Рис. 8. Калібрувальні графіки для визначення концентрацій секвестрантів за допомогою потенціометричного біосенсора з іммобілізованою під ПВП плівкою уреазою.

0.01 0.1 1 10 100

Концентрація секвестрантів, мМ

Таким чином, досліджена біосенсорна система може стати необхідним аналітичним інструментом для контролю концентрацій секвестрантів в харчових продуктах, особливо, при необхідності визначення сукупної ефективності комплексонів.

ВИКОРИСТАННЯ ПЕРОКСИДАЗИ В БЮСЕНСОРНИХ СИСТЕМАХ

Датчик для кількісного аналізу вітаміна С Пероксидаза відновлює перекис водню в присутності ряду косубстратів, одним з яких є аскорбінова кислота, тому цю ферментну реакцію можна використати для визначення концентрації перекису водню або ж відповідних аналітів в розчині. Хоча фенольні компоненти та діаміни теж належать до потенційних косубстратів, аскорбінова кислота є єдиним субстратом пероксидазної реакції, який присутній у харчових зразках (фруктові напої) в значній (до декількох мМ) концентрації, що дає можливість сподіватися на високу селективність біосенсорної системи. Було проаналізовано декілька видів фруктових напоїв з різним вмістом аскорбінової кислоти. Результати вимірів концентрації вітаміну С біосенсорним методом, проведені в фосфатному буфері (рис. 9), добре корелювали з даними, отриманими за допомогою рідинної хроматографії (похибка не перевищила 4%). Втрата каталітичної активності іммобілізованого фермента після одного місяця зберігання в буферному розчині при 4°С не перевищила 40%. Тому можна зробити висновок про те, що зразки із значним вмістом вітаміна С (апельсиновий сік, наприклад) можуть аналізуватися пероксидазним біосенсором без жодної попередньої обробки, що робить запропоновану систему реальною альтернативою складним і дорогим аналітичним методам (таким як рідинна хроматографія).

Рис. 9. Калібрувальні криві для визначення концентрації

вітаміну С в фосфатному буфері (pH 6,0) різних конценірацій за допомогою пероксидазного

потенціометричного біосенсора.

Таблиця 1.

Дослідження вмісту вітаміна С в фруктових напоях

Напій Виміряна концентрація вітаміну С, мМ

Біосенсорний метод Хроматографія

Апельсиновий сік Del Monte 2,72 ± 0,10 2,57 ±0,08

Апельсиновий сік Lotte Samkang 2,34 ±0,07 2,42 ±0,05

Шипучий напій Haejo Мііп 1,60 ±0,06 1,91 ±0,04

Фруктовий напій Gerber 1,68 ±0,07 1,40 ±0,01

Фруктовий напій Safaiy 1,12 +0,02 0,89 ±0,02

Сенсор для визначення ціанідів

Оскільки ціаніди утворюють стійкі комлекси з атомами заліза активного центру пероксидази, пригнічуючи її каталітичну активність, цей фермент може бути використано для виготовлення біосенсора, чутливого до вшцеозначеної токсичної сполуки. Було запропоновано іммобілізувати фермент під позитивно зарядженою полімерною плівкою, що, на нашу думку, призводить до накопичення іонів ціаніду в біоматриці, а отже - до підвищення чутливості :енсора до ціанідів.

Експериментальні дані показали суттєву різницю в інгібіторній чутливості :енсорів з різним типом іммобілізованного матеріалу (рис. 10). Так, калібрувальна крива для визначення концентрації ціаніду за допомогою сенсора з біоселективною мембраною на основі БСА покриває широкий динамічний їіапазон від 3 мкМ до 1 мМ КСК Якщо ж аналогічний фермент іммобілізовано іід ПВП плівкою, сенсор вимірює концентрації ціаніду в межах 0,1-10 мкМ [похибка вимірювання не перевищує 2% при іммобілізації фермента в БСА, та 5% - при іммобілізації під ПВП плівкою). Оскільки константа інгібування ііанідом пероксидази в розчині становить близько 4 мкМ [Тацита & Оуата, 1996), таку різницю в чутливості слід прокоментувати. Вірогідно, негативно іаряджений при нейтральних значеннях pH БСА створює потенційний бар’єр рія іонів ціаніду та пригнічує їх дифузію в мембрану, що призводить до іаниженої чутливості фермента, іммобілізованого в БСА, по відношенню до нгібітора. Покращена чутливість сенсора до ціаніду у випадку позитивно арядженої мембрани може бути пояснена накопиченням іонів ціаніду в ііоматриці. Треба також відмітити той факт, що в останньому випадку молекули

фермента не є зв’язаними з матрицею, а отже їх активні центри можуть бути більш доступними для інгібітора.

Оскільки азиди теж можуть пригнічувати активність пероксидази, було досліджено селективність розробленого біосенсора. Дослідження показали, що навіть відносно висока концентрація азиду натрію (до 10 мМ) не пригнічує активності іммобілізованої пероксидази.

Отже було досліджено та розроблено біосенсорну систему на основі пероксцдази, яка дозволяє селективно вимірювати ціаніди в нано- та мікромолярних концентраціях. Зважаючи на високу чутливість сенсора та значну ціну традиційних скляних С№ електродів, використання таких датчиків при контролі забруднення навколишнього середовища ціанідами може бути високо перспективним.

Рис. 10. Калібрувальні криві для визначення іонів ціаніду за допомогою потенціометричного біосенсора з пероксидазою, іммобілізованою під ПВП плівкою та в БСА матриці.

КСК, мкМ

Сенсор для визначення концентрації амигдаліну Серед вищих рослин, що продукують НСИ, є декілька видів, які інтенсивно споживаються людиною. Кількість ціанистого водню, який можуть виділяти такі культури, іноді сягає 300-400 мг/100 г. Оскільки смертельна доза ціаніду для дорослої людини знаходиться в межах 30-250 мг, споживання навіть декількох десятків грам таких рослин може спричинити серйозне, а то навіть і фатальне, отруєння.

Ціанід в цих рослинах існує в формі глікозиду, який розкладається на цукор та нітрил під дією р-глюкозидази, а нітрил розщеплюється ліазою на альдегід та ціанистий водень. Оскільки останній пригнічує активність пероксидази, його концентрація може бути виміряна методом, раніше запропонованим нами для детектування ціанідів. Іммобілізація р-глюкозидази, манделонітрил ліази та пероксидази на рН-чутливій поверхні ІСПТ може бути

використана при створенні біосенсора для визначення концентрації ціаногенних глікозидів в харчових продуктах рослинного походження. Було запропоновано проводити вимірювання в буфері з pH 6,0, оскільки при такому значенні pH активність вищевказаних ферментів, а отже і чутливість сенсора до амигдаліну, -максимальна. Лінійна частина калібрувальної кривої, побудована в нагавлогарифмічних координатах, покриває концентрацію амигдаліну від 10 до 300 мкМ (рис. 11), похибка вимірювання не перевищує 3%.

За міжнародними санітарними нормами з харчових продуктів не повинно виділятися ціаніду більше ніж 20 мг зі 100 г продукта, тобто концентрація амигдаліну в ньому має бути меншою ніж 7,4 мМ. Запропонована нами біосенсорна система вимірює низькі (до 10 мкМ) концентрації амигдаліну і може бути використана для поточних вимірювань вищевказаної токсичної сполуки в харчових продуктах навіть після гомогенізації та багатократного розведення зразка.

Рис. 11. Калібрувальна крива для визначення концентрації амигдаліну за допомогою триферменгного потенціометричного біосенсора.

Амигдалін, мкМ

ВИСНОВКИ

1. Створено макет ферментного потенціометричного сенсора з поліпшеними аналітичними характеристиками для визначення концентрацій глюкози в фізіологічних рідинах та досліджено його параметри. Показано, що додаткова ПВП мембрана не тільки зменшує залежність відгуку сенсора від концетрації буфера, але й суттєво збільшує динамічний діапазон глюкозного датчика (до 2-Ю'2 М).

2. Розроблено лабораторні прототипи та досліджено аналітичні характеристики уреаз них потенціометричних сенсорів з регульованими параметрами. Зокрема показано, що:

• іммобілізація фермента в позитивно зарядженому полімері суттєво поліпшує стабільність роботи сенсора, захищаючи фермент від інгібування іонами важких металів;

• при іммобілізації фермента під негативно зарядженою полімерною плівкою суттєво збільшується чутливість датчика до інгібіторів (мінімальна визначувана концентрація солей ртуті в розчині становить близько 1 мкМ);

• Відновлення каталітичної активності уреази, попередньо інгібованої іонами міді, відповідними комплексонами (ЕДТА, цитрати, фосфати) запропоноване для кількісного визначення останніх в продуктах харчування (в концентраціях МО'МЮ"3 М в еквіваленті ЕДТА).

3. Розроблено макет пероксидазного потенціометричного сенсора для:

• визначення концентрації аскорбінової кислоти (в діапазоні 2,510‘‘|-310 3 М) в фруктових напоях;

• кількісного визначення ціаніду з мінімальною визначуваною концентрацією МО'7 М;

• При коіммобілізації в пероксидазній мембрані ферментів, які каталізують розклад ціаногенних глікозидів, зокрема амигдаліну, було створено сенсор для кількісного визначення останнього в діапазоні 1-Ю'5 -3-Ю'4 М.

4. Розроблено принципову схему і створено портативний вимірювальний прилад, який дозволяє проводити виміри поверхневого потенціалу ІСПТ в диференційному режимі і компенсувати вплив зовнішніх факторів на фізичні характеристики потенціометричного перетворювача; похибка вимірювання поверхневого потенціала ІСПТ не перевищує 0,5%.

СПИСОК РОБГГ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Болотовский В.В., Пацковский С.В. Прибор для измерения затворного потенциала ионоселективных полевых транзисторов // Приборы и техника эксперимента. - 1996. - №3. - С. 168.

2. Volotovsky V., Soldatkin А.Р., Shulga А.А., Rossokhaty V.K., Strikha V.I., El’skaya A.V. Glucose-sensitive ISFET-based biosensor with additional positively chargec

membrane. Dynamic range extension and reduction of buffer concentration influence on the sensor response // Anal. Chim. Acta. - 1996. - 322. - P. 77-81.

3. Volotovsky V., Nam Y.J., Kim N. Urease-based biosensor for mercuric ions determination // Sensors & Actuators. - 1997. - В 42. - P. 233-237.

4. Volotovsky V., Kim N. Ascorbic acid determination with an ion-sensitive field effect transistor-based peroxidase biosensor // Anal. Chim. Acta. - 1998. - 359. - P. 143148.

5. Volotovsky V., Kim N. EDTA Determination by Urease-Based Inhibition Biosensor // Electroanalysis. - 1997. - 10. - P. 61-63.

6. Volotovsky V., Jaflrezic-Renault N., Martelet C., Soldatkin A.P. Improvement of sensitivity of urease-based biosensor for heavy metal ions determination // Proc. Eurosensors XI. - Warsaw (Poland). - 1997. - P. 1201-1204.

Волотовський B.B. Альтернативні варіанти використання ферментів при створенні напівпровідникових біосснсорів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біогехншогія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 1998.

В дисертаційній роботі представлено результати розробки лабораторних макетів ферментних біосенсорів на основі іоноселективних польових транзисторів для їх використання в медицинській діагностиці, визначення шкідливих речовин в навколишньому середовищі та контролю складу і якості харчових продуктів. Досліджено вплив заряджених полімерних мембран на аналітичні характеристики потенціометричних біосенсорів. Встановлено, що використання додаткових мембран призводить до зниження впливу буфера на відгук сенсора, а у випадку глюкозного датчика - до суттєвого розширення динамічного діапазону. Також було відмічено покращення чутливості біосенсора до інгібіторів та реакгиваторів іммобілізованих ферментів за рахунок накопичення цих аналітів у відповідно заряджених біомембранах.

Ключові слова: ферментний біосенсор, іоноселективний польовий транзистор, зарядженная полімерна мембрана.

Болотовский В.В. Альтернативные варианты использования ферментов при создании полупроводниковых биосенсоров. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 1998.

В диссертационной работе представлены результаты по разработке лабораторных макетов ферментных биосенсоров на основе ионоселективных полевых транзисторов для использования в медицинской диагностике, определения вредных веществ в окружающей среде и контроля состава и качества пищевых продуктов. Исследовано влияние заряженых полимерных мембран на аналитические характеристики потенциометрических биосенсоров. Установлено, что использование дополнительных мембран приводит к снижению влияния буфера на отклик сенсора, а в случае глюкозного датчика - к существенному увеличению динамического диапазона. Также отмечалось улучшение чувствительности биосенсора к ингибиторам и реакгиваторам иммобилизированных ферментов за счет накопления этих аналитов в соответственно заряженых биомембранах.

Ключевые слова: ферментный биосенсор, ионоселективный полевой транзистор, заряженая полимерная мембрана.

Volotovsky V.Y. Alternative variants to use enzymes when making semiconductor biosensors. - Manuscript.

Thesis for a Doctor of Philosophy (PhD) degree by speciality 03.00.20 -biotechnology. - D.K. Zabolotny Institute of Microbiology and Virusology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1998.

The thesis contains the results on elaboration of laboratory prototypes of enzyme biosensors based on ion-selective field effect transistors to use in medical diagnosis, environmental control and food quality control. Influence of charged polymeric membranes on analytical characteristics of potentiometric biosensors has been investigated. It was found that additional membrane application results in a reduction of buffer influence on the sensor response, and in the case of glucose detector - in essential increase of dynamic range. Also an improvement of a sensitivity of the biosensors towards inhibitors and reactivators as a result of analyte accumulation in the properly charged biomembnmes has been noted.

Key words: enzyme biosensor, ion-selective field effect transistor, charged polymeric membrane.