Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белоксорбционные свойства высокодисперсного кремнезема и экспериментальное обоснование его использования в биохимической практике

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Белоксорбционные свойства высокодисперсного кремнезема и экспериментальное обоснование его использования в биохимической практике"

Харшвський медичыий шститут

РГ5 ОД

На правах рукопису

ТЕРТИШНА Олена Володимир1впа

В1П(ЖСОР5Ш11И1 ВПАСТИВОСТ1 ВПСОКООПСПЕРСМОГО КРЕМНЕЗЕМУ ТА ЕКСПЁРПМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУМТУВАНИЯ ñoro

вгшоррвстаиня в шохямвчиш

ПРАКТИШ

03.00.04—6íoxímíh 02.00.04—4)Í3XÍmííi

Автореферат дисертацп па здобуття вченого ступепя кандидата бшлспччпих паук

Харкш 1994

Дисертащею е рукопис

Робота виконана в 1иституп х!мп поверхш АН Украши та Вшницькому медичному шститут1 ¡м. М.1.Пирогова

Науковий кер1вник: докт. мед. наук, проф. М.БЛуцюк

Науковий консультант: канд. Х1м. наук В.Г.Богомаз

Офщшш опопенти: докт. бюл. наук, проф. В.Й.Луговий

докт. х1м. наук О.О.Попомарьов

Ведуча установа: Крнмсышй медичний шститут

Захист дисертацп в1дбудеться " " ^оиОГУЬОъо_ 1994 р.

А С ^

о _год. ка заидаиш спещал1зозано! ради Д. 088.23.04 по захисту

дисертацш при Харгавсысому медичному шститут! (310002, м.Харгав, пр. Лешна, 4).

3 ¿-.исертащею можиа ознайомитись в б1блютец! Харгазськэго медич-ного шститута (м.Харгав, пр.Лешна, 4).

Автореферат роз!сланий " ^ " сс^^с^ 1994 року

Вчений секретар спещал!зовано! ради

канд. мед. наук Л.О.Жубршова

Загальна характеристика роботи

/-.ктулдьнгсть ггооблеми. В осташй роки значно п1двип;ився гн-терес до вясоходисперсялх кремнеземхз /ВД1У. Латерхаля, 50 створе-нг на основ1, знакши аироке застосування у ргзшк галузях про-Ж1СЛ030СТ1, с1льскоцу господарствх, аьдипинх та фармацхх /о.1.Богомаз та спгвав.,1989; У.Ы.;,стрэханоза, 1991; О.О.ЧуНко, Ю.1.Гор-лоз, 1992; М.Б.Луцдк та спхзав., 1933/.

Медик13 та б10Х1У1К1з ирязаблюз у ВДК комплекс таких властя-зоете;; як зисока ххм1чна чистота, ггдрофхльнгсть, Э1дсутн1сть тохсичкостх та, особливо, здатн1сть ацсорбувати речовини бхлково! природа.

Ёласт;ш1сть ЗДК швидао та мгцко приз.днувати до свое! лэверх-нх б1л:ся робять IX унхзальнимл серед сорбент13.

Б1локсорбеитн1 або протеоиэктичнх /л^х^гги - зв'язузати/ зластивост1 ВДК дозволяять вякорястозувати хх у виглядх певних лххарсысих форм як ыедикшенти «хсцевого та знутрхЕнього прязна-чення /0.1.Бондерчук та СП13£В., 19с6; Т.Л.Полеся, 1992; и.Б.Лу— цзх, 1993 та хнзг/. Уи ввазачи доцхльниы бхлья глибохо вивчити протеонектлчн1 властивост1 БДК, визначити моаливий возив медичного сорбента гсреинеземнох природа "Полхсорб на быковий обмхн в експеряыент1, а тако:л розробитя хпдхода до стзорення мзтодгв виз-начзння бглкхв та ентитхл за допомогоа реагентхз / колохдний роз-чин, ееросилогель/ - поххдних ВДК.

Мета роботи. Бибчити деякх механхзии вэаемо.цЛ ЗДК з б1лкамл, та вплив ЗДК на б:глковиП обыхн у експзрииентальних тварин, а такоп розробитя принцлпи визначення бглка та антит1л за допомогоо орепа-ратхз, цо створенг на баз1 ВДК.

Задач! роботи.

1. Вивчити деяя1 эсхоном1ряостх адсорбцы О'хлххз БДК, його фракцхями, колохдшш розчином ВДК, кремнакислото» та гранульован-ними формами крэмиезему.

2. Бстаковитя зв'язои техколог1чного процесу синтезу БДК та умоз зберхгання ЗДК з його протеонектичними властивостями.

3. Вивчити вплив створенного на баз1 ВДК ентеросорбента "Полхсорб Ж" на показники бокового обихну в експеримент1 на лабораториях тваринах.

4. Використати виязден1 законои1рност1 адсорбц1Х бгдкгв на ' ВДК дая створання реагента, придатяого для визначення бхлкхз та розройитм Бхдлоихдн! метода хндикащх бхлкхз.

Ь. На осноз! поххдногэ ЗД1-С - оероеилогелл - створити ¿цуио-сорбент, придатиий для кхлыасногс визначення антитгл.

Наукоап новизна. дзлк: поханхзьгл адсорбцхх бхлка

ВД1г та ¿швгил поххдними кремнезему, показана роль питомох поверх-Н1, к1Лы:ост1 силзнольних груп та ф1зико-х1ихчних властивостей бхлгсгв. Ьпераг доведено, ¡до стпарений на основI ¡ЗДК ентеросорбент "Лолхсорб Акя в терапезтичних дозах не змхнюз основн1 локззники б1лкозого оби1ну у експерииентальнпх тварин.

Показана прлнцнпова мо,тллв1сть використання ВДК для створен-ня рзагентхв, придатних для якхеного та кхлыасного визначення у водному езредови.цх б1л;из, у тоыу члел! антитхл.

Практична значения

I. Б результат! вивчення т.зхнолопх синтеза ЬДК, властизос-■гей кого фрекцх:; фхксувати бглок та хнаих властивостей показано ¿Ю найбгльа доцхльноэ для стБорення ентзросорбента ыедичного прязначення мо,-5на вважати так звану "середки фрекц1зэ". Наии су-М1сяо з хшиии розробниками направленг в 4ар:лком1тет ^крахни мате-р1али доклхнгчного випробування препарату "Пояхсорб як анти-д1аре£ного засоба та препарата для Л1кування в1русного гепатиту. Препарат дозволении для кл1И1чного застосузання /протокол !? I засх-даиня Фармокомхтету ГЛОЗ Украл" ни вгд 23 елчня 1993/, про,"лов успш-Н1 кл1нхчн1 випробування, затвердкзна вхдпозхдна Т£С.

Для довготривадего збзрзкання протеонектичних властивостей препарата "Полхсорб УПН необххдно Пого зберхгання у гериетичн1й упаховщ.

На приклад1 бЪпсового обмхцу наии показана В1дсутн1сть у препарата "Полхсорб иЬ" токсичност1 у терапевтичних дозах.

2. Розрсбдено метод одержання ст1/1кого колохдного розчицу ВДК, придатного для якхеного та нхльк1ского визначення б1лка.

3. Розроо'лено декхлька вариантов штода якгеного, напхвкгль-Х1сного та кхлысхсного визначення бмка у водних розчинах, у тому члел! в сечх, за допоыогош колохдного розчииу ВДК.

- з -

4. Показана мозлив1сть викорнстання гранульованного ВДМ -аерооилогеля- як хмуносорбента, на осиобт якогс розриблено метод .

к1лjitlchürü зпзнзчвннл йнгктхл.

0. ¿lo результатам роо'о^л одержано:

а/ авторське свхдотство на шшаххд /.'."• СГС?/

б/ хн^ормадтПник ляс? /Клгп, тЗЗС.з.2 по пробяекх "Зхрз'ош глфекцх;"

V акт эпрочадагння вгд 14 лхкзрень Украх'нл г/ II рацлропозицхй

Г1з.""зннл, ¡до зннос.яуься на лачу.ст

1. ЗДн та хил! досл1дкен1 препарата кремкезеанох привод»! /:;оло1дн7.;: розчин ЗДл, креннекислота, гракугьозан! форйги/ маять

2исо;г/ спорхдкзнгсть до бхлка. Сорбцхя бх.ткхз на B.TÍ залелить зхд таких злаотивостел сорбента як питома позерхня, хонцентрахпя си-лслольнлх труп, термхну та углов збереяення, а такогл зхд показника pH та фхзико-ххм1чних п'ластивостей сорбата-.

?.. Здптнхсть va зв'язуьати эелику кхлысхсть бхлха :¿cy.e бути илкорлстана для стзорення е^эктявнлх сорбентхз чедачного прлзначен-нл, a ? cucos для розробки Ы9?од13 кх;:ьк1СНОГО вкзначзння бглха та ант.чтхл до. 6í;:kobhz антигенхв.

3. Створгнкй на основх ЗДХ знтероссрбент "Пзлхсорб jSi" з тэ-рапезтичних дозах нэ порушув у експэрииентальних тварнн цсжазнихл

61лхового oómíhy.

4. ¿Ъзроблэнх метода вийначення 0'1лкхз та антптхл за досомо-гоз ряггзнтхэ, с/дер1г.£яжс з ЗДл - коло1дного розчину та азрэслло-

гэля.

/.иэобядтд робота. Матергали та положения дисертсдхх вихладз-hí з допов1дях на У Украхнському 6ioxiuí4homy з'хздх в м.хзако-ipaHxiacbKy / /, на П1дсумкових науково-лрактичних ьсонфзрен-цхях ¿йншщысого медшстлтутут / 1985, 1937, 1 , IOSü, ÍS'¿2 рр/, мхяобластному csMÍHapi длл лхкархз .IÏ2K та ЛКК м. Вхнииця / 1986/, конфоретдях молодих вчених м.Ейнниця / 1907/, X л'ечнхховськхй кон-çepsHijiï в и. Одесх / 1987/, Ш.хнародному симпозиум! " Роль öpoHxi-ального та легзневого кровооб!г.у ' в o6míhí рхдани та бхлка у леге-

нях", и.Леи1Нград; 1У ВсесоюзнгЛ конференцй* " Б1олог1чна ак-тивнхсть сполук креннгя, геруанхя, олова " м. 1ркутськ /1990/; на конгресг по захворюванняы органхв дихання, и.С.-Петербург /1992/; на засгданнях Вшницького В1дц:глення украхнського 610-Х1и1ЧН0Г0 товаринства /1987, 1990 /. Но теи1 дисертвщх надру-ковано 21 роботу, одержано I автсрське св1доца'во та II рацпро-позицхй.

Об'ем та структура роботн.

Дисертацгя викладена на 168 сторшках машинопису, сялада-еться з передмови, огляду ягтерагури, пята глав влясних дослгд-жень, обговореннл одержаних даних, внсновкхв та вказ1вника лг-тератури. Дисертавдя М1стлть 41 таблица та 7 малюшав. Список Л1тературн вклгачае посилання на 147 роб1т вхтчпаняних та 155 роб1Т закордонних авторхв.

ЗМ1СТ РОБОТИ Магер1али та методи Д0сл1Д-г.ення

Вивченнч copöqii бхлка на ВДК у процесг Пого виготовлення прсзодилось на 3 етапах : а/ П1сля коагуляцхх; б/ в кхнщ де-cop6qii; в/ в готовому продукт::. Визначали питому поЕерхнп методом газо—рхдиннох хроматограф! та концентрацг-о силанольних груп на nosepxHi методом Ш - спектроскопы.

Дослхджувалась б1Локеорбщпна активн1сть niporeHHoro ВДК з поверхней 300 и 'г ; його колохдного розчину; схлхкагелю марки / 5/40м /O^yxf^C, ЧСФР /; силохроиу КСК-2 з поверхнею 350 ы /г; коло1дно1 кремнекислоти, яку одержували кислотним ri-дрол1Эом силхката натр1я; ксерогелю, здобутого з piei кислоти висушуванняы при 200°С; аеросилогеля - гранульованого пох1дно-го ВДК з p03vcip0M пор 400 - 600 Д° та д1аметром сфер б1ля 2 им.

Використан1 сл1дуюч1 препарати б1лк1в: яечнии альбуыш /Ола-йе, Латв1Я, сироваточний альбум1Н людини / "¿«ал«^ Угор-дина/, к1нський гемоглоб1Н / " Я^/пад, США /, трипсин / Спофа, ЧСФР/, гама-ллобулхн та ¿нсулш / препарати фармакопе! СРСР /.

Сорбщю 61ЛК1В вивчали ¿л- исЬхо , будували та аналгзува-ли 1зотерми адсорбщх / Г.Парфгт, К.Рочестер, 1985 /. Цифрова-Н1 дан1 оброблялись статистично на ЕОУ по спец!альн1й програмх. Концэнтрацхх б1лка в розчинах визначали бхуретовим методом, а геиоглобша - гемоглоб1нциан1дниы методом /В.В.Меньшиков, 1987/.

Сорбц1а нуклеотид1в вивчали таким чином : до розчтив УЫФ, УДФ, УТФ, здФ, АТФ та / виробництза ф1рыи "¿ел^и -

Угорщина / добавляли по 50 иг ВДК, зм1сували на протяз1 I години при К1мнатн1й температур1 та центригували 30 хвилин при ЗС00 ? , у центрифугат1 визначали К1льн1сть нуклеотидгв по выхсту рибози орциновим методом. Адссрбц1ю нухлехнових кислот вивчали такии же чином, к1льк1сне досл1дденнл проводили за до-поыогою дифенхлгихнового методу / С.Е.Северин, Г.А.Соловьйова, 1989 /.

Гасля сорбцы вуглеводи визначали : глюкозу - орциновим методом, фруктозо-6-фосфат - антроновим методом,Ь - галактоз-амхн - по реркцы з реактивом Ерлхха, крохмаль - антроновим методом, М - ацетилгалактозамхн - з реактивом Ерл1ха / Е.Меддг, 1979 /. Ем1ст сечовох кислоти та амхнокислот визначали по по-глинанни св1тла в УФ частин1 спектра, сечовини - по б:гуретов1й ■ реакщх.

Вивчення впливу ентеросорбента иПол1сорб МП " на показники бокового обмхну проводили на 279 б:глих щурах. П1дцосл1,цним тва-ринам одноразово вводили за допомогою металхчного зонду 15% вод-ну суспенз1а препарату в дозах 0,1; 0,33; 1,С; 2,0; 3,0; 6,0 ; 8,0 та 10,0 г на кг ваги Т1ла. Контрольн1 тварини одерзували воду. Застосовували такоя довготривале введения сорбента у вигля-Д1 1Ь% суспензхх в дозах 0,1 / терапевтична доза /; 0,33 та 1,0 г/кг на протязх 10, 20, 30, 60 та 90 дч1в молодим тваринам / початкова вага - 95-115 г /.

Для досл1даення використовували центральну кров. Б1ох1М1ч-Н1 показники бокового та азотневого обмхну вивчались за допомо-гоп ун1ф1кованих метод1в: загальний б1лок - б1уретовую реамцею, креатинин - реамцею Яффе, з використення набору виробництва "Ла-хема" /ЧСФР/, лужну фостфатазу - з и—гл1цер1нфосфатом натр!Я по

Зоданському, ACT та АЛТ - дйфенхлгьцрззиновим методом, гемогло-6íh - гемоглобгнцианатним способом.

Методика виготовлення коло'-'дного роз чину ДДгС: порошок ДДК змгшували з бгдистильованою водою, або з ^хз10Л0Г1ЧНим розчином у спгвв1Дноаенн1 1:18 - 1:22, вносили у склянку подрхбнювача тканин PT-I. Компоненти змтшували при швидкостг обертгв 8000 на хви-лину. Суспензхю центри:угували на протязх 20 хвилин при 4000^. . У центри;!угат1 не^елометрично визначали концентрацхю кремнезему но змутненню /¿= 315 нм, 6= 0,5 см, ФЕК КФ - К2/ за допомогою калхбровочного гранка. Абсолютну кхлькхсть кремнезему в розчинх визначали шляхом висудувакня до nocTr'Ho'- ваги та зважуванням на аналхтичних терезах. Одержани"' розчин доводили до p06040v концент-paqi"' 0,bio.

Проведено вимхрввання ponMípiB часток коло'Одного розчину ДцК методом лазерно'-'" доплеровсько" спектроскопх'-' /Е.Каммингс, Г.Па;~к,ГУ78/. Визначення проводили на експермментальному приладг в ВД1 племхнно'-' справи в тваринництзх:. Прилад складаеться з дже-рела когерентного випромхнювання, MÍKpo E0M та цифрово-друкарсь-кого пристосування. Використовувалась зацикленч програма падра-xyHKiB, як1 велися безперервно.

В конденсатх повхтря, що видихалось, визначалась концентра-Ц1я середах молекул /Н.И.Габриелян, В.И.Липатова, 1984/ та бхл-ка за Лоур1 та нашим методом/.

Кхлькхсть охлка в сироватцх кровх тзарин визначали методами гемолхза та гемаглвтинаци у полхстиролових платах /Фримель, I'Jb9/, Протипечхнкових аутоантитхл у хворих на вхрусний г«аатит визначали методом зустр1Чного ¿ыуноелектро^орезу та реакцхею пасивнот гемаглютинаЦ11 з використанням хыунодиагностикуму Горькхвськоги НД1 епхдемхолигхт та MÍKpúóiojiorix.

Лечгнковий антиген готували з печхнки практично здорових ко-лодих oció, _;о загикули В1Д травми, використовуочи при цьому метод водно-хлороформного екстрагування /Т.А.Алексеев*, 1»63/.

Результати дослхдаень були обробленх методом Bapiai;iPHOv статистики /Е. В. Гублер,197а; В.М.Носов, 1990/.

ADTop висловлюе особливу иодяку проф.О.О.иентюку за велику допоыогу в 3aCB0dHHi ряду методха дослхдження та оформленщ отри-манних даних, а також 1.Ф.Миронюку та 1.1.Геращенку за допомогу у виконанн! дослижень.

РЕЗУЛЬТАТ!! ДОСЙДЖЕНЬ ТА Тх ОБГОВОРЕНА I. Деяк1 3UK0H0MipHccTÍ сорбцГ-' бхлкхв на ВДК та тнших препаратах кремнеземхв

ЗнаГ-дено, до в межах середнгх концентрацг" бглкч /0,5-3,0 мг/мл / ¿зотерми адсорбц^ для ycix вивчених npenapaTÍB кремнезему можуть бути задовгльно описанг рхвнянням Ленгмюра та вхдобра--*ають високозибгриови''' процесс.на еквгпотенцгальнг"- noaepxHi. Розмгри грангчно'-' сорбцг'"' сироваточного зльбумгнл лядини та печного альбумгна наведенх у таблицг I.

'Габлиця I

Гранична сорбцгя б1ЛК1В на сорбентах кремнеземной

природи

Вид ___Гпадиц!« со£бц:гя,_ мг/г___

сорбента ,- Альбумхн людини ! Ясчни^ альбумхн

ВДК - аеросил А-300, пар- •

тхя 2Эб,виробництво 193 Э р. 720^23 480 + 75

Колотдни;1 розчин ВДК, 23 1150 + 264 544 + б1_

Коло'/дна кремнекислота, 2 Z 1154 + 33 622 + 47

С1ЛОхром D0 +8 118 + 15

Ксерогель 176 + II 107 + II

СШкагель L 5/40 М '¿4+4 20

Аеросилогель 270 + 15 167 + 17

3 таблиц1 I видно, до наГ-видою сорбц1~но» активнхстю болодд-ють кологдни!" розчин ВДК та кремнекислотч, що мояна пояснити вгд-сутн1стю у них крупних агрегатхв, що змеклують питому г.оверхню. Високоп також е сорбщя б1ЛК1В на ВДК - аерссил1 А-300. Характерно, що сорбцхя альбумхна лядини у ВС1Х виг.адкчх виде, нг* сорб-цхя яечного альбумхну.

Рсзмтрл сорбц!т бтлк1В на ВДК в мг/г / у протилежнтсть

моль/г / збхльйувтьоя в1дпов1дно збгльшенню Зк иадекулярно1 ма-си / таблиця 2/, а максимальне значения для кокного б1лка спос-тер1гаеться в зон1 ¿зоелектричнох точки.

Таблиця 2.

Сорбцхя 61лк1я з р1знов молекулярном касоп на ВДК

Бхлки Голекудярна Г|^кична_сорбц1я_ константа

маоа, дальтон мг/г моль/г'10"^ адоорбц11,

\А/

I 2 3 4 5

1ису.т1н 5 700 293+87 50,9+1,4 -

Трипсин 21 ООО 270+54 . ч12,9+20 -

Яечний альбумхн 45 ООО 489+71 10,7+1,6 1,2

Гемоглобш 68 ООО 623+15 9,1+0,2 4,6

Сироваточний альбумхн людини 69 ООО 723+14 10,5+0,2 11,5

2Г^глобул1н лх>-дини 160 ООО 895+25 5,6+0,3 13,3

Примака: и/. константа сорбц11, ио вказуе • на ступ1нь спор1Дн&-ност1 б1лка до сорбента.

Выявлено, ио б1локсорбцх&и власткЕ0ст1 БДК змеишуються при його збер1ганн1, особливо у негерметичн1й упаковцх/ табл.3/. Це свхдчить про те, по сорбенти медкчнсго призкачення, вкготос-лен1 на осков1 ВДК / "Пол1сорбп та "Полхсорб !'Л" / потрхбно збе-р1гати в умевах герметичности

При ознайомленн1 з технолог1Чним процесом виготовлення БДК виявлено, шо протегнзз'язуша здатн1сть досягае максимума лише на останньому етал1 синтеза - коагуляц11. Промислов1 партхг ВДК значно вгдрхзняються М1Г собою по аррорбц1йшй здатностх шодо б1лк1в , :а-значить, I по фармацевтичн1й ефективност1. Викикла проблема стандартизацх1 ВДК медичного иризначення, для чого ст.наук. сп1вроб. 1ХП 1.5. ^'кро никои проведено фрагацонування сорбента на три фракцх! - "легку","лередню" та "тякку". Нами показано, ио

к£5б1льш придатиоп для з:::сорлстання 2 медицин г "серодга" фрак-цй, яка однородна по розмхру час то к /а/, по г.роте1нонектичн1й здатностх /б/ та по показнику негипног маси /в/.

Таблица 3

¡¡длив терм:ну та уиов зберхгання БДК на йог о проте!нсорбц1йну вм1стивн1еть

'-троки збвретання, ___„ ^упаковки......

и1СЯ1»1 Палерова Герметична

__________ пойетеленоЕа

Гранична сорбц!я б!лка, мг/г

0

1

2

б а

805 + 17 729 + 25 С54 * 4

434 + РА 368 + 28 297 + 23

605 + 17 7£8 + 14 777 + 10 720 + 23 654 + 24 592 + 22

1

Вивчення сорбц11 на 13ДК 1нших бхологхчно активних речовин показало, то нуклегновг кислоти та полхсахариди не ыадть спо-рхдненост1 до по верхи I ВДН, а хнш не сорбуються / моконуклоо-тиди, глакоза, сечова кислота та и./, або сорбуються в иалзЯ к1лькост! / фосфолш1ди, гл1колппди, аы1 но кис лота/. ЦхкаЕО, по деяк1 з них добре адсорбуються на комплексах б1Лок-ЗДК /II.Г. Рибак, 1993/.

2. Вплив ентеросорбента "1Ьл1сорб Ш" / препарата, одерганого з Эрогенного ВДК / на бхлковий обмхн в експери-мент1

Проведенх дос.'ядленкя показали, ао одноразово пгроральнс введеня препарата нав1ть в доз1 Ю г/кр не викликас зк1ни у ста-н1 61лкобого обмхку.

При багаторазовому з8стосуванн1 сорбенту в дозах 0,1 / те-ралевтична доза/; 0,33 чи 1,0 г/кг на протязх 10 - 90 дн1в по' ■ ! ... ' I

казники бокового обм1ну зм1нгавались незначно : лише дози I г/кг тимчасово зб1льшували р1веш сечовини. Шсля 9Э дн1в введения препарата вс1 показники нормал1зувались, по св1дчить про дуке ниэьку токсичность препарата. Частина з одержаних даних наведена в таблиц1 4.

Вказан1 та ши одержан! дан1 ув1йшли до складу документ&-Ц11, над1Слано1 у 5армком1тет ЮЗ Укра1ни на ентеросорбент "ГЬ-л1сорб Ш". Препарат дозволено для медичного застосування при Л1куванн1 гострих кишечних хнфегацй та в1русного гепатита.

3. Розробка методу визначення б1лка у б1олог1чних об'ектах з використанням ВДК

Здатшсть ВДК швидко I мщно зв'язувати велик! к1лькостх б1лка даютх можлив1сть використовувати цю властив1сть в анал>-тичних ц1лях. Так, залропоновано метод депроте1Н1за1Ц1 водних середовиш за допомогою ВДК / к.Б.Луцюк та сп1вав., 1964 /.

Ш вперше спостер1гали явише взаемно1 флокуляцй' часток кремнезему та б1лка у водному середовии1, яке лягло в основу нового метода визначення бхлка. При взаемод11 коло1дного розчину ВДК з б1лком спостер1гаються ф1зико-х1м1чн1 зм1ни у систем^,як1 легко рееструються в1зуально та Iнетрументально. Важливо, шо коло1дний розчин, виготовлений по розробленому нами способу Е1дпов1дае двом основним вимогам : висок1й власн1й ст1йкост1 при збер1ганн1 та здатнхетю коагулювати у присутност1 б1лка.

Одержалий по налпй методиц1 кологдний розчин мае в1дпов1д-Н1 зовншн1 ознаки / нап1Епрозор1сть, опалесцетця, дихроЗсзм т. х./ та характерн1 для колохдного розчину розмхри часток /1,34+0,02 нм/ вим1рянх за допомогою лазерной спектроскоп 11.

Биявлено, то колохдний розчин ВДК в присутност1 б1лка в кон-центрац11 нише 4 мкг/мл не зм1нюеться. Де евдаить про те, ио молекул б1лка недостатньо для злипання часток кремнезему у вели-К1 конгломерата. Де нижня межа ст1йкост1 коло1дного розчину I одночасно чутливос« метода визначення б1лка.

У присутност1 велико1 к1Лькост1 б1лка / 3 мг/мл та вше/ колозедний розчин також на коагулюе, шо пов'язано, на нашу думку,

Таблиця 4

Вплиз тривалого перорального введения ентеросорбента "Полхсорб МИ" на показники белкового обмгну сироватки кровт цуртв / М +г>и, П/= 5 /

Показники Контроль -Дози препаоата, мг/г-

0,1 0,33 1,0

Через 1С днхв

Пагальни:" бтлок, г/л 57,6+3,0 64,2+2,8 63,6+2,4 63,4+2,4

Сечовина, ммоль/л 8,6+1,3 8,1+_0,9 9,4+1,3 13,6+1,6х

Креатингн, нкмоль/л 72,4+11,8 80,6+6,4 70,2+11,6 31,2+3,7

Через 20 днгв

Загальни^ бглок, г/л 69.4+6,0 63,6+1,3 63,5+3,6 62,8+1,3

Сечовина, ммоль/л 7,2+0,5 7,0^0,8 6,5+0,9 4+0,5х

Креатинтн, мкмоль/л 79,2+10,3 73,6+9,2 89,2+8,8 93,0+3,1

Через 30 днгв

ЗагальниГ: б;глок, г/л 54,7+4,8 55,6+0,9 49,6+6,6 51,4+3,1

Сечовина, ммоль/л 7,2+0,8 8,9+0,6 3,1+1,4 12,6+1,6

Креатингн, мкмоль/л 85,0+6,9 36,8+7,3 83,4+3,7 33,3+5,4

Через 60 днхв

ЗагальниЯ бхлок, г/л 54,0+4,1 53,0+3,4 62,3+3,4 54,0+3,4

Сечовина, мкмоль/л 6,3+1,2 7,0+2,3 7,3+1,2 у,7+и,о

1\реатии1Н, мкмоль/л 73,4+«,8 «4,1)+/,*' оЗ,и+У,7 35,8+6,4

Через уи днгз

Загальник бтлок, г/л 5Ь,а+3,и 54,0+2,2 ио,0±1,6 62,7+о,2

Ссчшвина, ммоль/л 7,4+0,32 7,6+0,34 7;7+и,29 у,6+1,1

Креатинхн, мкмоль/л 74,3+Ъ,0 83,1+6,7 82,7+6,3 38,3^0,3

Примхтка: знаком "х" означена достовхрна ргзницл показник1В в пор1ВНяни1 з контролем Р / 0,и5

з в1домим явипем колохдного захисту. СТ1ПК0СТ1.

Це, так звана, верхня мека

/•л к никньою та верхньою меками ст1йкост1 лежить зона ко»-центрахцЯ бьлка, шо законом1рно викликае флокуляцхл коловдюго розчину ЗДК. Ми 11 зазначаемо як зону еквхвалентноеТ1 / малюнок1/. Кэгадаемо, яо таке саге явите спостерггаеться при реакц11 мг<х антигеном та антит1лсм, коли осад комплексу антиген-антат1ло утворю-йться лише в зонх екзхвалентност! / Р.С.Незлхн, 1966 /.

а. низька концентрацгя бглка /В1£сутн1сть фЛОКуЛЯЦ!! /

б. екв1валентна концентрация бхлка /рлокуля-шя /.

Утворення осаду

в. дуже висока концентрация б!лка - коло1д-. ний захист/в1д-сутнгсть флоку-

ляц11 /

Галиной I. Стан коло1дного розчину ВДК при взаемод11 з ргзними концентрац1ями б1лка

Прим1тка : СЭ - молекули б1лка

- частки кремнезему

Визнаний феномен' взаемод11 молекул б1лка та часток колоэдного розчину ЗДК дозволяя розробити Ц1лу низку конкретних методгв якхс-ног, нап1вяк1сяого та кгльшеного визначення" б1лка. Каведемо дая-К1 з них, розроблених нами б1льш детально.

Нал1вк1льк1сне визначення б1лка методом розведення. Дослхд-кувану р1дину у ряд1 проб1рок послхдовно розЕодать у 2,4,8 I т.д. разIз, у кокну з проб1рок вносять по 2 мл 0,5',ь колоЗсдного розчину ВДК. Знаходять останню проб!рку, де В1дбулася протягом 30 хвил.

флокуляцхя /це в1дпов1дае приблизно концентрац11 4 мкг/мл бхлка/. Jlasi проводить математичний розрахунок. Цей метод придатний для визначення б1лка в сеч1 хворих, бо пор1вняно з розпоЕСЮд:кеним методом Столы ti ковг. 61ЛЫ2 чутлизий, безлечний та екологхчно чис-тий, спостерхгаеться добре з!дтЕорюван1сть результат1в шкийза.

2:ипрес-метод визначення б1лка полягае у послхдсвному розве-денн1 досл1д!л71?шю1 рхдини у 10, 100 та 1000 разхз, внесен« у коя ну пробхрку кологдного розчину кремнезему та ф1ксуванн1 через 30 хзилин результат!в. По запропоновашй нами таблиц1 мояливе . приблизне визначення кхлькост1 б1лка в д1апазон1 В1д ICO мг/мл до 4 мкг/мл.

с!етод н1льк1снсго визначення б1лка полягае в тому, ио при гмшунанн! рсзчингв бхлка та кологдного розчину кремнезему в результат! взаемод1х часток б1лка та кремнезему спочатку cnocTepi-гаеться тимчасове Л1дзияення оптично1 ппльностх /змутнення/ про-nopqifojo концентрац!! бхлка з подальшим пад1нням до нуля. Вим1рю-вання оптично1 га1льност1 проведено на 3?ЕК при довжин1 хвил1 315нм, попередньо будують rpaíiK заленност1 екстинц11 вхд концентрац11" б1лка, який зизначазэть.

Показано, rao на перебхг реаицхх взаемод11 часток коло1дного розчину ВДК та молекул б1лка мають слабкий вплив такi фактор:*, як pH, температура, йонний слкад середовиша та речовини в концен-тргщях, як! часто присутн1 у досл1дкуваних об'ектах / глюкоза, гепарин, сульЬат амонга , ДНК, дезоксихолат натр1я, тритон Х-ЮО, ацетон, глщерин, етиловий спирт, кислоти т.i./.

Гонлива розробка 1нших BapiaHTÍB метода кхлькиного визначення б1лха за допомогоп розробленого нами принципа.

4. Використання гранульованого ВДК аеросилогеля як 1муносорбента

ВДК вияеляг. писоку сп0рх.днен1сть до б1ЛК13, у ТОМ}' числ1,

прлродно, i до бхлкхв-антигенхв. Тому ВДК i íx пох1днх е, на наш погляд, п

ерепектизним хмуносорбентом. Нами використано як ÍMyHO-сорбент" гранульований ВДК - аеросилогель, синтезозаний з íhcth-тут1 xímíí norepxHi АН Укра1ни / АС №9983392 , 1983 /. Аеросилогель яеляс собо-о нерозчинш у бодх крупнопорист! гранули д1амет-ром б!ля 2 мм. Протехнэв'язувча здатн!сть аеросилогеля значно

нижча, Н1к у ВДК / 270+ 15 мг/г /, але цоком достатьня для фук-Ц11 1муносорбента.

Сорбцгя антиген1в на аеросилогел1 в1дбу.заеться семовз:льно I швидко, не потребуе додаткових операщй по х1м1чному модгрх-куваннп поверхнг та кон'югування антигена. ВияЕлено, ао сорбцхю антиген1в на аеросилогел1 треба пр0Е0дити на протяз1.10-30 хзи-лин при ммнатшй температур! у д1апозон1 рН 4,5-7,0. Необх1дна кхлыасть антигена встановлюеться шляхом вимхрювання граничноI сорбцх1, характерног для кокного конкретного антигену.

Принцип методу полягая у визначеннх к1лькост1 бока на 1мунссорбент1 до контакту з алтисироваткою та пхсля нього. Грану ли аеросилогелю, ао М1стяться на дн: проб1рки легко в!дмивають-ся 31Д надлишк1в бхлка за допомогога ф1зрозчина та звичайно1 пас-тер0ЕСЬК01 Л1петки.

В процес1 розробки метода використовувалась сироватка кров1 иур1з, 1мун130ваних ер1тоцитами барана та 35 хворих на В1русний гепатит, в кроз1 яких циркулюпть антитела до антигенхз печ1нки. НаяЕН1Сть антиил у сирозатках кров1,чи Ёс 31дсутн1сть П1сля 1му-носорбЦ11, контролювалесь класичними методами 1!.<унох1М11. 1муно-сорбцхя антител супроводкуеться деякою неспецшцчною сорбц1ею, але II розм1ри мокно значно зменшити розбавленням досл1довано1 сироватки. Ка запропонований метод одергкано азторське сз1доцтзо / АС )? 1513403, 1969 /.

На приклад1 визначення антито у сироватц1 кроз1 хсорих на В1русний гепатит виявлено ем1ст аутоантикл до печ1нкозого антигену, який був максимальним / 129,1+4,6 мкг/мл / у хворих з тяжкою стад1ею захворювання.

В И С Н О В К И

I. Зисокодисперсний кремнезем / ВДК/ та виготовлен1 з нього реагенти /колоздний розчин та аеросилогель /, а такок 1нш1 матер1али кремнеземно1 природа / кремнекислота, схлохрон, ксеро-гель т. I./ здатн1 швидко та мщно приеднувати до себе значн! ыль-костх б1лка - в1д 270 до 1150 мг/г. Протетаозз'язуюта актизшсть ВДК моке бути використана для створення на його основх сорбент!з

медичного призначення та лабораторних методхз визначення бхлк1в та анткт1л.

2. Здатнють до сорбц1Х б1ЛК1в ВДК, його фрагацями, промхг,-ними продуктами синтезу, поххдними ВДК та 1ншими кремнеземами згг-лешть В1д питомох поверхнх, концентрац1х силанольних груп на по~ верхнх, вида кремнезема, показнимв рН, ф1зико-ххмхчних властивос-тей сорбата та умов збер1гання сорбента. Кхнетика сорбц11 бхлк1в на ВДК задов1льно описуеться рхзнянням Ленгмюра.

3. В доклпичних досл1дкеннях нами показано, со ентеросорбент медичного призначення "Полхсорб МГ - кремкеземно'х природа - в те-раповтичних дозах не порушуе б1лковий обмш.

4. Розроблено cnoei6 виготовлення колоЗЁдного розчину ВДК та принцип визначення за його допомогою бьчка у б10гогхчних об'ектах. Гетод специрчний, визначае лише речовини 61лкоео1 природа з fliar-позон1 концентрац1й 4,0 мкг/мл - 3,0 мг/мл б1лка.

5. Розроблена методика використання гранульованого ВДК /аеро-силогеля / у якост1 1муносорбента, то в1др1зняеться в1д в1домих високим р1внем пор1дненост1 до антигенхв 61лкоеох природа та не потребуй додатково1 xïmî4hoï обробки поверхн1. 1муносорбент при-датний для кхлькйного визначення у сироватц1 кров1 антитхл бхл-koboï природа.

СПИСОК POBiT, 0ПУЕЯ1К03АШХ ЗА TLVQD ДКСЕПАЦП

1. М.Б.Луцвк, О.З.Тертишна, Г.В.Брянцева . Новий метод К1ЛЬК1СН0-го визначення б1лка / твердофазний, адсорбцхйно-коагудяц1йкий / // У Укр.бхох. з'хзд: Тез. доп.- 1в.-£ранк1ЕСЬК.-1987.-ч.2.-С.64.

2. О.В.Тертишна, В.В.Гавура, 1.'5.Киронюк та in. k-ляхи використання кремкеземхв / аеросилхз, силохромхв / у 1мунолог1чн1й практк-ц1. // там же С. 256-257.

3. Н.Б.Луцвк, ¿.В.Тертьшная. Использование пирогенных кремнеземов в лабораторной практике .// У научн. кон|>.: Тез.докл. .- Винница, 1987.» С.77-78.

4.Н.Б.Луцюк, Е.З.Тертетная. Способ адсорбции антигенов на микросферах и.их количественное определение.// Х1У Обьед. конф.изабр. и рац. : Тез. докл..- Винница, 1987 .- С.126.

3. 2.13. Тертшн&я, Н.Б.Луцвк, 53. В. Однорогое. Применение аз рос ила в иммунологических исследованиях // 1У науч.конр..: Тез докл.-Винница, 1968 С.20-21.

S. А.А.Чуйко, В.И.Еогомаз, Н.Б.Луцюк, А.А.Пентюк, Е.В.Тертывкая и др. К обоснованиюприменения аэросила /оксилл/ в лечебно-профилактических целях.// Республ. кон5. : "Сорбенты мед. назначения и мех-мы их лечебного действ." : Тез. док. - Донецк, I988.-C.39-40.

7. Е.В.Тертыннял, В.В.Гавура, Н.Б.Луцвк. Иммуносорбзнтный метод количественного определения протизопеченочних аутоантитэл у больных вирусным гепатитом // Л13И .- 1988, PIQ .- С.64-66.

8. А.В.Ильченко, ¿.З.Тертшная . Сорбция органических вешестз на пироганном кремнеземе / ЬЪнр.'Тез. НИР в практ. здравоохр.", Тез. докл.: Винница, 1989.- С.19-20.

9. В.В.Гавура, Е.В.Терткшная. Изучение аутоиммунных процессов у больных вирусы™ гепатитом путем определения протизопеченочных аутоантител// í-iEü.- 19897- в.б, разд.З.- С.86.

10.C.D. Ладутько, Е.В.Тертыпная. К характеристике сорбционных ceoíícti некоторых энтеросорбентов // Там ке , где работа 8.- С.2¿-26.

11. О.А.Яковлева, Н.Б.Луцюк, Е.Б.Терткшная. Диагностический комплекс конденсата зьгдькаемого ЕОздуха// XXXI 1..екд.симп. "Роль бронх, и легочн. кронообр. в обмене гйидк. в легком": Тез. докл.- Ленинград, 1989 .-С.107.

12. АС V' I5I3403, Способ количественного опредзленкя антител к эритроцитам барана. / Н.Б.Луцюк, А. Л. Чу «ко, Е.З.Тертышая и др.// БИ,- I969.-P37*С.203-204.

13.А.А.¿ролов, В.В.Гавура, Н.Б.Луцюк, Е.В.Тертьзингя, В.И.Еогомаз. Иммуносорбентный метод исследования аутоиммунных процессов у больных вирусным гепатитом. // йнф. писвмо ¡.3 УССР.- по проблеме "Вирусные инфекц. заболев."- 1989 В.2.- 3 с.

14. Н.Б.Луцюк, В.И.Еогомаз, А. А.Пентнзк, Е.В.Тертшная и др. // Сор-бируемость биологически активных веществ на высокодисперсном кре!*-неземе как предварительный критерий выбора направлений медико-биологических исследований // 1У Всесоюзн. хок$. "Биолог. активн. соед. кремния, олова, германия": Тез. докл. - Иркутск, 1999.-С.12"

L5. И.И.Геращенко, Е.В.Тертшная. Изменение сорбируемости сывороточного альбумина на кремнеземе в присутствии протеолитических ферментов // Деп.' в Укр.НИИ НГИ » 1564,УК. 90 от 09.10.90.

16. 0. А.Яковлева, Е.В.Тертыпная . Влияние эндогенных факторов и физической нагрузки на формирование влаговыделения и детоксакации легкими // Терал. архив.- 1991 т.63, Я2 С. 11-14.

17.И.И.Геращенко, Е.В.Тертыпная, Н.Б.Луцюк, В.И.Богомаз. Сравнительное изучение сорбционной способности кремнезвмеодержадих фаз различной природы по отношения к белку.// Укр. хим. курн. 1992,-

С. 236-258.

18.0.В.Тертишна, №. Б.Луцкж, П. К.Загниборода. Виготовлення та власти-вост1 коло1дного розчину аеросилу // X Об'едн. конф.: Тез. доп. -В1нниця, 1992 С.84-85.

19. Е.В.Тертыпная, 0.А.Якозлевя.. Оценка выделительной функции легкими // 3 Нац. конгр. по болезням органов дыхан.: Л. Пульмонология.- 1992.-№4.- С.426.

ГО. Е.В.Тертышная, Н.Б.Луцюк, О.А.Яковлева, Б.А.Борисенко. Применение полисорба для определения белка. // Сб. научн. трудов под ред. акад. А. А.Чуйко "Кремнеземы в медицине и биологии "/ Киев-Ставрополь.- 1993.- С. 175-180.

21.И.И.Герашенко, А.А.Пентмк, Т.Л.Полеся, Е.В.Тертшная. Избирательная адсорбция вьсокодизперснш кремнеземом липидсодвркашнх ком-понентоз крови./ Кэллоидн. жури. ,1993, т.55, #4.- С. 132-134.