Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химический анализ высокодисперсных белоксодержащих систем на основе микроэлектрофореза и поточной ультрамикроскопии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Физико-химический анализ высокодисперсных белоксодержащих систем на основе микроэлектрофореза и поточной ультрамикроскопии"

На правах рукописи

РГБ ОД - - * ДЕК 2ЭСЗ \

МОЛОДКИНА ЛЮДМИЛА МИХАЙЛОВНА

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЫСОКОДИСПЕРСНЫХ БЕЛОКСОДЕРЖАЩИХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ МИКРОЭЛЕКТРОФОРЕЗА И ПОТОЧНОЙ УЛЬТАМИКРОСКОПИИ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Санкт - Петербург 2000 г.

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном техническом университете

Научный консультант: доктор технических наук, профессор КОЛИКОВ Всеволод Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор СЕДЫХ Николай Васильевич

доктор физико-математических наук, профессор ТРУСОВ Анатолий Анатольевич

доктор биологических наук, профессор ЗАХАРЧЕНКО Виктор Николаевич

Ведущая организация: Институт высокомолекулярных соединений РАН

на заседании Диссертационного совета Д 063.38.23

при Санкт-Петербургском государственном техническом университете

по адресу: 195 251 Санкт-Петербург, ул. Политехническая, д.29

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПбГТУ Автореферат разослан « ¿X » ноября 2000 года

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат физико-математических наук О.Л. ВЛАСОВА

Защита диссертации состоится «25» декабря 2000 года в 1Ц

часов

г-л-д -/Г Г)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ :

Актуальность темы

Диссертационная работа посвящена разработке и реализации подхода к изучению водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем (ВВССБС), необходимому для понимания физико-химической природы и механизмов процессов структурных изменений, происходящих на разных уровнях их организации.

Такие системы широко распространены в природе и в техносфере. Их отличает характерный размер взвешенных частиц, не превышающий 200 им, полидисперсность, многокомпонептность, присутствие белковых соединений в растворенном состоянии,, в виде ассоциатов и входящих в состав биоминеральных частиц. К ВВССБС ¡относятся системы, чрезвычайно важные для биотехнологии, экологии, медицины - Згто, например, сырье и продукты вакцинного производства, питьевая вода, биологические жидкости человека и животных. Под влиянием внешних воздействий в таких системах происходят копформационные изменения белковых молекул, взаимодействия между различными компонентами. Эти \ процессы ведут к структурным изменениям на молекулярном;: • надмолекулярном, межчастичном уровне. Понимание их природы и механизмов важно не только в познавательном, причинном и прогностическом плане. Оно необходимо и в : практической работе с высокодисперсными белоксодержащими системами '¡при производстве биологически активных препаратов, получении чистой питьевой-воды,;в медицинской диагностике и т.п. Все это определяет актуальность тематики исследования.

Обычно при практическом изучении ВВССБС проводят компонентный анализ с последующей постановкой ' модельных экспериментов над индивидуальными компонентами при варьировании отдельных факторов, - либо с организацией многофакторных исследований. В представленной работе предлагается иной подход. Он основан на экспериментальном определении функциональных характеристик состояния и поведения компонентов, несущих обобщенную информацию о системе на выбранном уровне ее структурной организации, на установлении, физико-химической природы-определяющих их причин. Возможность выбора таких «носителей информации» связана с тем, что электроповерхностные свойства взвешенных частиц отображают состав и свойства поверхностно активных (в том числе белковых) молекулярно растворенных соединений, а также веществ, диссоциированных на ионы; в свою очередь, электроповерхностные свойства определяют силы взаимодействия между частицами, т.е. возможность и характер их агрегации. ■

2 1

Цель и задачи работы

Цель настоящей работы состояла в разработке, аппаратурно-методическом оформлении и реализации подхода к изучению водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем экологического и медицинского назначения.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

1. сформулировать принципы и разработать концепцию подхода к изучению ВВССБС;

2. создать аппаратурно-методический комплекс для регистрации высокодисперсных белоксодержащих частиц с возможностью определения их концентрации, размера, электрокинегических свойств, распределения частиц по этим показателям,

3. выбрать методы и материалы для фракционирования и концентрирования компонентов ВВССБС, не повреждающие их структуру, и разработать на их основе методики целевой трансформации систем для их перевода на определенный уровень структурной организации;

4. обосновать выбор информативного набора физико-химических характеристик ВВССБС, которые следует определять для разных уровней их структурной организации;

5. на примере ВВССБС, значимых для медицинской биотехнологии и экологии, продемонстрировать научно-практические возможности разработанного подхода и созданного аппаратурно-методического комплекса.

На защиту выносятся основные положения и результаты:

1. обоснование и содержание комплексного подхода к изучению ВВССБС экологического и медицинского назначения, включающего, а) трансформацию (структурное упрощение) исследуемой системы, проводимую для получения информативного уровня ее структурной организации; б) формирование на новом уровне структурной организации одной или нескольких систем сравнения, различающихся по заданному признаку; в) экспериментальное определение функциональных характеристик взвешенных частиц, отражающих их электрокинетические свойства и поведение при агрегации; г) анализ суммарного содержания полученных характеристик с учетом уровня организации трансформированной системы;

2. аппаратурно-методическое обеспечение разработанного подхода к изучению ВВССБС в виде созданных высокочувствительных установок на основе методов микроэлекгрофореза и поточной ультрамикроскопии;

3. информационное содержание определяемых функциональных характеристик для разных уровней структурной организации ВВССБС (на примере конкретных дисперсии),

4. практическое приложение аппаратурно-методических разработок и результатов исследования ВВССБС.

Научная новизна работы

1. Впервые предложен и осуществлен комплексный подход к изучению водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем. Он включает:

• целевую трансформацию исследуемой системы, для получения информативных уровней ее структурной организации;

• формирование на новом уровне структурной организации одной или нескольких систем сравнения, различающихся по заданному признаку;

• определение методами микроэлектрофореза и поточной ультрамикроскопии . фунщионачьных характеристик взвешенных частиц, отражающих их электрокинетические свойства и поведение при агрегации,

• анализ суммарного содержания определенных физико-химических характеристик в соответствии с уровнем организации трансформированной системы, выявляющий молекулярные и надмолекулярные механизмы процессов, происходящих с участием белковых (или производных от них) соединений ; ■ '

2.Впёрвые экологически и медицински значимые ВВССБС охарактеризованы через наборы функциональных физико-химических показателей: С,- рН|,, ¿¡-С',л |(, 1 |рн, с , с-ТЛ'р,' Су-иср,1/Чч |рн. с, относящихся к разным уровням их структурной организации.

3. Впервые для ВВССБС экологического и медицинского назначения получены следующие научно-значимые результаты:

• показано, что к вирионам гриппа с микромозаичной структурой поверхности и способностью поверхностных гликопротеидов к конформационным превращениям, применима модель жесткой коллоидной частицы;

• поведение вируса гриппа в разных конформационных состояниях описано с позиций теории двойного электрического слоя и теории взаимодействия гидрофобных коллоидов ДЛФО (с учетом или без учета представления о граничных слоях);

• показано, что генетически обусловленные конформационные изменения поверхностных гликопротеидов вирусных частиц проявляются электрокинетически;

• определены времена процессов структурных превращений, происходящих в вирусных системах, которые вызваны конформационными изменения поверхностных гликопротеидов, а также изменением растворимости белковых компонентов;

• доказана принадлежность Санкт-Петербургской водопроводной воды к определенному типу высокодисперсной структурно сложной белоксодержащей системы;

• установлено, что высокодисперсные примеси водопроводной воды Санкт-Петербурга содержат белковые соединения и гуминовые вещества, определяющие их электроповерхностные свойства и устойчивость системы к агрегации;

• установлены отличия элекгрокинетических свойств и поведения при агрегации взвешенных частиц мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью;

Практическая значимость.

Разработанный и аппаратурно оформленный подход позволяет получать информацию о строении, свойствах и поведении водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем, на таком уровне и в таком комплексе, которые ранее были практически недостижимы Не требующий прецизионного оборудования, сложной машинной обработки, он делает «видимыми» коллоидные компоненты высокодисперсных систем и позволяет определять индивидуальные, а не интегральные, характеристики частиц дисперсной фазы, но вместе с тем даст сведения о состоянии всей дисперсной системы и о роли отдельных молекулярно растворенных компонентов в ее поведении .

Результаты, полученные при разработке и реализации подхода, нашли применение в технологиях производства чистых вирусных препаратов и препаратов белков плазмы крови. Даны рекомендации по физико-химическому определению штаммовых отличий вируса гриппа, выбору вакцинного штамма и предпочтительной технологии очистки и концентрирования вирусов в вакцинном производстве, определению срока годности очищенного вирусного препарата. Получена практически важная информация о коллоидных компонентах питьевой (водопроводной) Санкт-Петербурга в связи с их потенциальной аллергенной и канцерогенной опасностью, о причинах устойчивости коллоидной системы водопроводной воды, об источнике попадания высокодисперсных примесей в водопроводную сеть. Выданы обоснованные экспериментально проверенные рекомендации по мембранному и адсорбционному вариантам удаления коллоидных компонентов. Показана негативная роль коллоидных и молекулярно-растворенных компонентов водопроводной воды в технологиях ее обеззараживания путем озонирования или ионообменной фильтрации через ПГС-фильтры, а также в использовании мембранной и ионообменной фильтрации в мониторинге воды по санитарно-бактериологическим показателям. Получены результаты, позволяющие рекомендовать использование предложенного подхода для разработки методики диагностики мочекаменной болезни.

I î

Результаты работы также используются в научно-педагогической практике автора при чтении курсов лекций, ведении лабораторных занятий и НИР по дисциплинам «Физико-химические методы анализа», «Мониторинг окружающей среды», «Инженерные основы защиты природы», «Коллоидная химия», «Физическая биохимия» (для студентов кафедры экологических основ природопользования инженерно-строительного факультета, факультета медицинской физики и биоинженерии, каф. биофизики физико-механического факультета), а также при руководстве курсовыми проектами, дипломными работами и магистерскими диссертациями.

Апробация работы

Материалы работы докладывались на конференциях, проводимых на базе СПбГТУ («Инновационные наукоемкие технологии для России»,1995, Международная конференция «Интернационализация высшего образования и научных исследований в XXI веке: Роль технических университетов», 1999, III Всероссийская научно-техническая конференция «Фундаментальные исследования в технических университетах», 1999, Международный Бизнес-Форум IBT-XXI «Информационные и бизнес-технологии XXI века, 1999); а также на 1-ом Всесоюзном симпозиуме по молекулярной и жидкостной хроматографии (Дзержинск, 1979,1-ой Всесоюзной конференции «Хроматография в биологии и медицине» (Москва, 1983); Всесоюзной конференции «Коагулянты и флокулянты в очистке природных и сточных вод» (Одесса, 1988); Всесоюзной конференции «Коллоидио-химические проблемы экологии» (Минск, 1990); Путинском совещании «Культивирование клегок животных и человека. Проблемы цитологии» (Пущино, 1994); Российской конференции по мембранам и мембранным технологиям «Мембраны-95» (Владимир, 1995); П-ом съезде биофизиков России (Москва, 1999); Международных конференциях по поверхностным силам (Москва, 1985, 1990); Международной конференции «Коллоидная химия в решении проблем охраны окружающей среды» (Минск, 1994), Международных конгрессах «Вода: экология и технология» (Москва, 1994, 1996); Международной конференции «Биоколлоид 95» . (Киев, 1995); Международной научно-практической конференции «Измерительные информационные технологии и приборы в охране здоровья (МЕТРОМЕД-99)», (Санкт-Петербург, 1999); 32-nd IUPAC Congress (Stokholnv 1989); 11-th European Conference «Chemistry of interfaces» (Berline, 1990); IUPAC Congress (Budapesht,1991); 11-th International conference «Surface Forces» (Moscow, 1996); 9-th Intern, conference on Surface and Colloid Science (Sofia,1997), 10-th Intern. Conference on Colloid and Interface Science (Briston, 2000), Intern. Sympos. on Electrokinetic Phenomena (Dresden, 2000).

6 I

Публикации и личный вклад автора. Основные результаты диссертации отражены в 57 печатных работах, в том числе 5 авторских свидетельствах и 9 патентах.

Материалы, включенные в диссертацию, выполнены либо непосредственно автором, либо под руководством (или при соруководстве). Концепция разработанного подхода также принадлежит автору работы. Поименно состав руководителей, соисполнителей и дипломников, работавших по различным направлениям, имеющим отношение к теме диссертации, достаточно полно отражен в списке соавторов публикаций.

Исследования, связанные с анализом дисперсий вируса гриппа, выполнены в рамках госбюджетной тематики: «Разработка методик анализа дисперсных систем биологического происхождения». Изучение таких объектов как водопроводная вода г. Санкт-Петербурга, а также моча здоровых людей и больных мочекаменной болезнью, проводилось в порядке творческой инициативы автора.

Структура работы

Диссертация состоит из введения, 7 глав (разделов), заключения, библиографии и приложений. Работа изложена на страницах, включая рисунков и таблиц в основной части, а также рисунков и таблиц в Приложении.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность темы, поставлена цель и задачи работы, сформулированы основные положения, выносимые на защиту.

Глава 1 Обзор литературы включает: информацию о методах изучения и фракционирования дисперсных белоксодержащих систем, об электроповерхностных свойствах и агрегативной устойчивости биоколлоидов, сведения об объектах исследования.

Глава 2 Объекты и методы исследования

Объекты исследования, на которых продемонстрированы возможности разработанного подхода, были выбраны с позиций адекватности их свойств изученным уровням организации ВВССБС. Так возможности изучения уровня предельно упрощенной системы с однотипными коллоидными частицами, поверхностные свойства которых генетически предопределены, раскрывались на примере вируса гриппа разных штаммов (система -вируссодержащая аллантоисная жидкость), для другого уровня, на котором поверхность взвешенных частиц формируется при участии растворенных белковых (или производных) компонентов, в качестве объекта выбрана питьевая (водопроводная) вода г. Санкт-Петербурга. Для уровня, соответствующего полидисперсным системам с обновляющейся

дисперсной фазой - моча здоровых людей и больных мочекаменной болезнью. Помимо сказанного, все три системы связывает физиологическая общность.

Методы исследования. ■ Для регистрации биоколлоидов размерами менее 200нм с возможностью изучения их распределения по размеру и по электрокинетическим свойствам были выбраны методы поточной ультрамнкроскопии (ПУМ) и микроэлектрофореза (МЭФ), основанные на наблюдении светорассеяния от индивидуальных коллоидных частиц с помощью оптического микроскопа. Поскольку биоколлоиды имеют невысокий относительный показатель преломления, требовалось обеспечить высокую интенсивность падающего света и низкие потери рассеянного света. Эти условия были достигнуты в создапных установках (Молодкина и др., 1986, 1987), где в качестве источника света применили лазер мощностью 2 мВт, с длиной волны 0,6328 мкм, причем луч диаметром 2,5 мм фокусировали до диаметра 30 мкм.

Созданные установки позволяют регистрировать частицы размером более 65 нм (при относительном показателе преломления, равном 1,20); различать агрегаты из двух, трех частиц и образования в виде «гроздьев»; определять распределение по размерам и по электрофоретической подвижности, получать первое показание через 5 минут (ПУМ) и через 10 минут (МЭФ) после приготовления дисперсии. Пределы определяемых концентраций составляют 5*104-5*108 см"3 (без разбавления), относительная погрешность измерения - 5-10%.

В каждом МЭФ-эксперименте определяли электрофоретическую подвижность 50-80 частпц. Результаты использовали для расчета среднего значения электрофоретической подвижности (Ucp.), стандартного отклонения (аи) и коэффициента вариации (C\=au/U4,.).

Электрокинетический (Q потенциал рассчитывали по значениям электрофоретической подвижности с учетом поправки на поляризацию двойного электрического слоя (ДЭС) по методу Wirsema (Wirsema et all, 1966) и по методу O.Brien and White (O.Brien, White, 1978). Значения ¿¡-потенциала принимали равными штерновскому потенциалу и использовали в расчетах энергии взаимодействия коллоидов.

Энергию парного взаимодействия частиц определяли по классической теории ДДФО (Дерягин, 1937; Дерягин, Ландау, 1941; Verwey, Overbeek, 1948), При этом энергию ионно-электростатического' отталкивания рассчитывали для случая постоянства потенциала поверхности и равенства радиусов взаимодействующих частиц (Hogg et all, 1966), энергию молекулярного притяжения - по формуле, выведенной из микроскопической теории с

учетом электромагнитного запаздывания дисперсионных сил (Weisse, Ilealy, 1970). Значение фактора устойчивости при коагуляции в первичном минимуме определяли по формуле Дерягина-Муллера (1967г.), во вторичном минимуме - по формуле Хогта и Янга (Hogg, Yang, 1976).

В работе также использовали другие физико-химические методы анализа, такие как: молекулярная спектрофотометрия, спекгротурбидимстрия, потенциометрия, кондуктометрия, жидкостная хроматография (молекулярно-ситовая, ионообменная, адсорбционная), мембранная микро- и ультрафильтрация (на трековых мембранах).

Для определения титра вируса гриппа применяли реакцию гемагглютинации. Концентрацию белкового компонента в вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), в очищенных вирусных препаратах, в пробах мочи определяли методами Лоури, Лоури-Хартри и Лоури-Петерсона; на поверхности макропористых сорбентов или трековых мембран после выделения из белковых растворов или водопроводной воды -модифицированным методом Лоури-Хартри .

Глава 3. Трансформация структуры высокодисперсных бслоксодержащих систем

В первом подразделе третьей главы изложено содержание комплексного подхода к изучению ВВССБС. Во втором - приведены результаты разработки методик получения трансформированных состояний систем.

Концепция комплексного подхода к изучению водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем построена на принципах, которые являются обобщением литературных данных, либо вытекают из опыта нашей работы:

1. К ВВССБС применима классификация примесей воды по их фазово-дисперсному состоянию (Кульский, 1980), согласно которой компоненты ВВССБС относятся к группе гидрофобных и гидрофильных коллоидов (II гр.), молекулярно растворенных соединений (Шгр.) и веществ, диссоциирующих на ионы (TVrp.). Каждой группе отвечает характерный набор методов анализа и методов физико-химического воздействия;

2. Электроповерхностные свойства компонентов П-ой гр. отображают состав и свойства поверхностно активных (в т.ч. белковых) соединений Ш-ей гр., а также ионов, IV гр., (способных к специфической адсорбции и формирующих внешнюю обкладку ДЭС);

3. Агрегативная устойчивость дисперсных систем является своеобразным отображением элекгроповерхностных явлений (Измайлова и др., 1988);

4. Согласно п.п.2 и 3, в качестве основных характеристик ВВССБС можно использовать электрокинетический потенциал и агрегативную устойчивость,

. 9

5. Для ВВССБС информационную ценность имеют только функциональные показатели -зависимости показателей от различных переменных, а также функции распределения;

6. Функциональным физико-химическим характеристикам ВВССБС на каждом уровне организации системы соответствует свое смысловое содержание.

Сущность разработанного подхода к изучению ВВССБС заключается в следующем:

а) выбирается информативный уровень структурной организации системы - такой, на котором смысловое содержание. определяемых функциональных физико-химических характеристик коллоидов системы даст Информацию для решения поставленной научно-практической задачи, - • •

б) производится трансформация (структурное упрощение) системы до информативного уровня через комбинацию методов фракционирования или концентрирования, для ограничения состава, концентрации, размеров компонентов системы,

в) на новом уровне организации формируется индивидуальная система или две (и более) системы сравнения, различающихся по заданному признаку;

г) методами МЭФ и ПУМ определяются функциональные характеристики - зависимости электрокинетического потенциала и изменения во времени счетной концентрации' взвешенных частиц от состава, концентрации модельных электролитов, от их способности к специфической адсорбции, от времени с момента приготовления системы, а также-функции распределения и производные от них характеристики неоднородности системы;

д) производится анализ физико-химического содержания полученных характеристик с учетом уровня организации системы для выявления молекулярных и надмолекулярных механизмов процессов, происходящих в системе и прогнозирования се поведения в будущем. 1 -

Возможности подхода продемонстрированы для трех уровней организации систем или трех вариантов структурной сложности.

Первый уровень соответствует предельно упрощенным системам с однотипными коллоидами. Структурно сложная биосистема трансформируется до дисперсии одинаковых' биоколлоидов, помещенных в модельную дисперсионную среду. Получаемая'информация позволяет а) установить применимость теории ДЭС и теории ДЛФО к высокодисперсным системам биологического происхождения и выявить особенности структурных перестроек в поверхностном слое, строение которого генетически предопределено;

Второй уровень структурной организации представлен системой коллоидов определенного диапазона размеров, помещенных в дисперсионную среду поверхностно •

активных веществ (белкового происхождения). Вариация соотношения их состава и концентраций даст возможность выявить роль молекулярных биокомпонентов в формировании поверхностной структуры коллоидов.

Третий уровень характеризует полидисперсную систему, содержащую частицы высокодисперсного и ультрадисперсного диапазона, а также белковые соединения, растворенные или входящие в состав коллоидов. В системе организуется (или происходит самопроизвольно) агрегация частиц разного размера (системы с обновляющейся дисперсной фазой) Подход позволяет получать информацию о различии или сходстве их физико-химических свойств.

Методы получения трансформированных состояний ВВССБС При любом варианте структурного упрощения дисперсной системы - извлечении компонентов дисперсной фазы и помещении их в заданную среду, либо последовательном удалении (замене) растворенных компонентов, используется разделение по размеру или по физико-химическому сродству. Часто в одном процессе совмещаются оба механизма. Для разделения компонентов преимущественно по размеру в работе использованы методы хроматографии (молекулярно-ситовой, адсорбционной на пористом адсорбенте) и мембранной фильтрации (микро-, ультра-, нанофильтрации). Для разделения компонентов преимущественно по физико-химическому сродству - адсорбция в статике, адсорбционная и ионообменная хроматография. Особенности реализации методов заключались в создании «щадящих» (не разрушающих) условий по отношению к белоксодержащим компонентам, а также не провоцирующих необратимую агрегацию коллоидов.

Исследования по молекулярно-ситовой хроматографии на макропористых кремнеземах проводились на модельных и реальных объектах. Решали вопросы влияния на эффективность гель-хроматографии геометрических и физико-химических параметров. Исключение адсорбционного взаимодействия осуществляли за счет выбора элюента, либо модифицирования поверхности макропористых кремнеземов. Изучали варианты физического и химического модифицирования (Мчедлишвили и др., 1976, 1984; Коликов и др., 1977, Макарова и др., 1978; Бреслер и др., 1979; Борисова и др., 1979, 1983). Разработана методика модифицирования макропористых кремнеземов поливинилпирролидоном (Молодкина и Мчедлишвили, 1983).

Мембранная фильтрация. Для работы выбраны трековые мембраны, выгодно отличающиеся от других по селективности. Исследования проводили на модельных и реальных объектах, в тупиковом и тангенциальном режиме фильтрации. Определяли

кинетические и адсорбционные показатели процесса с учетом возможной коагуляции и ассоциации белковых компонентов. Материалы, представленные в подразделе, отражены в отчетах о ПИР и в публикациях (Власова, Молодкина и др. 1994, 1995; Молодкина и др. 1995).

Адсорбция, адсорбционная хроматография. Принципиальные и практические вопросы адсорбции и адсорбционной хроматографии вирусов гриппа на макропористых кремнеземах решались группой сотрудников проблемной лаборатории каф биофизики (включая автора) при создании технологии получения хроматографической гриппозной вакцины (Бреслер и др. 1973, 1974, 1976, 1977, 1978, 1980, 1981).

Изучены также адсорбционные свойства (емкостные и кинетические характеристики) мезо- и макропористых активированных углей на основе ультраднсперсных порошков (ЛУГ) по отношению" к-- молекулярно растворенным и коллоидным примесям водопроводной коды (Молодкина, и др., 1996).

Изучены сзлектрокинетические и адсорбционные свойства ионообменных полимерных фильтрующих элементов (ПФЭЛ) пространственно-глобулярной структуры (ПГС).

Глава 4. Выявление особенностей поверхностной структуры однотипных биоколлоидов на предельно упрощенных дисперсных системах

Предельно упрощенными здесь названы дисперсные системы, преобразованное из ВВССБС, состоящие из коллоидных частиц одинакового происхождения и одинаковых размеров, помещенных в раствор минерального электролита. Информативные возможности предлагаемого подхода для первого уровня рассмотрены на примере вируса гриппа разных штаммов, относящихся к подтипу А1.

Выбор информативного уровня структурной организации системы ••:■)>.

Исходная ВВССБС представляла собой вируссодержащую аллантоисную жидкость (ВАЖ) куриных эмбрионов, в состав которой кроме вирионов гриппа (размером порядка 100 нм) входят белковые соединения, липиды, углеводы, органические и минеральные соли. Понимание процессов межмолекулярных изменений, надмолекулярного и межчастичного взаимодействия, которые определяют поведение вирионов разных штаммов в инфекционном и в технологическом процессе, представляет самостоятельный научный и большой практический интерес, в частности для организации вакцинного производства. Такие технологические задачи как выбор физико-химических методов воздействия на отдельный компоненты, учет взаимодействия между коллоидными компонентами, выбор вакцшшого штамма, определение условий хранения очищенного

препарата, срока его годности и т.п., можно решить на основе изучения предельно . упрощенной дисперсии вирусных частиц. Поэтому при работе с ВАЖ исходную систему трансформировали до предельно упрошенного уровня и на этом уровне структурной организации выявляли особенностей поверхностной структуры вирионов разных штаммов, т.е. однотипных коллоидов.

Структурное упрощение вируссодержащей системы сводилось к получению системы неповрежденных неагрегированных, неассоциированных с другими компонентами вирусных частиц. В качестве основы преобразования ВВССБС была выбрана технология получения вакцины гриппозной хроматографической инактивированной жидкой (Молодкин, 1989, Регламент производства ... № 124-79, «Способ получения вакцины» - A.c. и патенты, 1973,1974, 1976). Она включает адсорбцию примесных белков на макропористом силохроме, адсорбционно-хроматографическое концентрирование и очистку вируса на макропористом стекле (МПС) и молекулярно-ситовую хроматографию на МПС, модифицированном поливинилпирролидоном (Молодкина и Мчедлишвили, 1983). На заключительной стадии вирусный материал переводили в условия физиологического раствора или дистиллированной воды путем повторной молскулярно-ситовой хроматографии на модифицированном и немодифицированном МПС.

Структурно упрощенные системы получены из ВВССБС трех штаммов подтипа AI.

Выбор информативного набора физико-химических характеристик был основан на разработках теории строения ДЭС и теории взаимодействия гидрофобных коллоидов ДЛФО (на классическом и современном варианте). Использовали известные из теории зависимости электрокинетического потенциала от концентрации индифферентного электролита, зарядного числа, концентрации потенциалопределяющего электролита, от присутствия специфически адсорбирующихся анионов и катионов. Также рассчитывали параметры, связь между которыми позволяет оценить степень неоднородности системы по электрокинетическим свойствам. Экспериментально определяя перечисленные зависимости, и проводя сравнение с теоретически ожидаемыми для индивидуальных систем, выявляли специфические особенности объекта, которые сопровождаются изменением электрокинетического потенциала.

Электрокинетические характеристики вирионов гриппа определяются структурой вирусных частиц и свойствами поверхностных компонентов. Поверхность вирионов представляет собой двойной липидный слой, в который гидрофобными концами погружены гликопротеидные субъединицы - гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA).

I Гликопротеидные шипы радиально ориентированы наружу, их число достигает 550-600, длина составляет 10-14 нм, толщина 4-8 нм, расстояние между ними 6-7 нм. Среди всех компонентов оболочки вируса наибольшей штаммовой изменчивости подвержены антигенные детерминанты гемагглютинина и нейраминидазы. Преобладание кислых группировок в поверхностных компонентах обеспечивает положение изоэлекгрической точки для вируса гриппа типа Л в интервале рН 4,8-5,4. Макромолекулярная структура НА и NA стабильна в широком диапазоне рН. Однако после инкубации в кислых условиях (рН<5), происходят структурные изменения в гликопротеиде НА. Это является важным этапом в инфекционном процессе ряда вирусов животных, в том числе вируса гриппа (Ruigrok et al, 1982; Skehel et a], 1982; Deniels et al, 1983; Sate et al.; Webster et all, 1983). Вирусные частицы, проникшие внутрь клетки, подходят к кислотным везикулам и, реагируя на понижение рН среды, сливаются с мембраной везикулы, давая возможность вирусной РНК выйти в цитоплазму. Разные штаммы вируса гриппа по-разному реагируют на понижение рН. Различную реакцию вирионов одного штамма объясняют генетической гетерогенностью вирусных частиц (Ruigrok et al, 1982).

Таким образом, в условиях стабильности конформации поверхностных компонентов можно ожидать небольших различий в электрокинетических свойствах разных штаммов вируса гриппа, относящихся к одному подтипу. Основные отличия должны проявляться за пределами интервалов стабильности, причем они должны касаться как . средних характеристик, так и распределения .частиц по заданному свойству.

Для трех штаммов вируса гриппа подтипа А1, далее сокращенно именуемых А1 Ленинград, А1Киев и А1 Чили, определены перечисленные функциональные зависимости. Специфику объекта должны отражать: зависимость ^-потенциала от концентрации иона водорода (рН среды), определяющей диссоциацию поверхностных групп и конформационные изменения поверхностных гликопротеидов; от концентрации биофильных элементов, например, иона Са2', влияющего на ферментативную активность нейраминидазы (Букер, Палейзи, 1978; Chividshyan, 1984); от времени хранения (t,p.) очищенного и концентрированного вирусного препарата и время контакта (t,orr.) вирионов с заданной дисперсионной средой; зависимости a-Urp., Cv-Ucp, отражающие штаммовую неоднородность. В результате выбраны аргументы: концентрация ионов Na', Са2\ В а2* (в паре с анионами, различающимися способностью к специфической адсорбции - СГ и МОГ), tsp., W (Молодкина и др. 1986, 2000, Molodkina et al. 1995).

На рис.1,2 приведены зависимости, полученные для разных штаммов, от рН, концентрации №С1 и СаСЬ. Из рис. 1а видно классическое поведение штамма А1Ленинград, т.е. отражение теоретической зависимости от рН, концентрации индифферентного электролита, концентрации специфически адсорбирующегося иона СГ. Для штаммов А1Киев и А1Чили это проявляется только в нейтральной и слабокислой области. При меньших значениях рН для штамма А1Кисв изоэлекгрическое состояние достигалось либо в широком диапазоне рН, либо неоднократно (при С^аа-Ю"2 М); для штамма А1Чили оно вообще не достигалось в интервале рН 3-7 и концентраций №С1 Ю-3 - 3*1 (Г2 М, но при этом в поле зрения присутствовало до 15% положительно заряженных или неподвижных в электрическом поле частиц даже при рН 5,5.

Рис.1 Зависимость ^-потенциала частиц вируса гриппа штаммов А1 Ленинград (а), А1Киев (б), А1Чили (в) от рН среды в растворах КаС1 (1-1,5*10"*; 2 - 4,0*10^; 3 - 1,0*10"3; 4-1,5* Ю-3; 5 - 1,0* 10'2; 6 - 3,0* 10"2 М)

Полученные различия проанализированы с учетом уровня структурной организации систем. На предельно упрощенном уровне такое поведение однотипных коллоидов свидетельствует об изменении состояния поверхностных компонентов (а не, например, о десорбции или адсорбции поверхностно активных компонентов, которых в дисперсионной среде не оставлено). Это может быть связано с различной реакцией штаммов на понижение рН среды, т.е. с разными пороговыми значениями рН, при которых происходят

конформационные изменения (приводящие к демаскированию отрицательно заряженных групп) и с разной степенью внутрнштаммовой неоднородности по этому свойству.

Из рисунков, приведенных на рис.2, виден сложный ход кривых зависимости иср-рН при изменении концентрации СаС12 для штамма А1 Ленинград, показывающий сдвиг изоэлектрической области в разных направлениях за счет специфической адсорбции аниона хлора и катиона кальция. Сделан вывод о многофункциональной роли катиона Саг+, который одновременно играет роль противоиона в структуре ДЭС и катиона, способного к специфической адсорбции, например, к образованию координационных соединений. Известно, что в белках донорами электронных пар являются конечные карбоксильные и аминогруппы, а также атомы азота у пептидной связи (Карнаухов, Безнис, 1992). Для штамма А1Киев, по-видимому преобладает вклад конформационных изменений с понижением рН, поэтому эффект специфической адсорбции трудно установить.

Рис 2 Зависимость электрофоретической подвижности вирионов гриппа штаммов А1 Ленинград (а) и А1Киев (б) от рН среды в растворах СаСЬ (1-3*10"5;2-1<Г',3-3*1(Г';4-1(Г! М)

Результаты изучения влияния срока хранения очищенного препарата на электрофоретические свойства показали, что штамм А1 Чили, способный отвечать конформациошшши изменениями на понижение рН среды практически сразу и в полной мере, уже не изменяет своих свойств при длительном хранении. Штамм А1Киев обладает некоторым «запасом устойчивости» поверхностных компонентов; при хранении эта устойчивость снижается, что проявляется по-разному при разных концентрациях электролита. Штамм АШенинград, самый устойчивый, реагирует только после долгого хранения препарата (12 месяцев) небольшим сдвигом всей кривой Сер - рН.

Зависимость электрокинетического потенциала от времени контакта коллоидных частиц с дисперсиошюй средой подтвердила высокую устойчивость штамма АШенинград. Одновременно показано, что к минимально возможному времени начала измерения

электрофоретической подвижности (к 10-15-ой минуте) ДЭС можно считать сформировавшимся.

Информативность данных, полученных на созданной микроэлектрофоретической установке возрастает, если полученные зависимости дополняются расчетом степени неоднородности систем по электрокинетическим свойствам, а также анализом яркости и формы «светящихся» объектов («двойники» «тройники», «гроздья»).

Степень неоднородности систем охарактеризована зависимостью среднеквадратичного отклонения электрофоретической подвижности (с) и коэффициента ее вариации (Су=а/1 иср |) от модуля среднего значения подвижности (I Ucp I).

Для всех изученных штаммов вируса гриппа и всех электролитов показано, что рост | Ucp | сопровождается ростом а (за исключением узкой области, прилегающей к оси ординат). Значения а укладываются в полосу с определенным! шириной и наклоном, которые в общем виде зависят от штамма, зарядного числа и концентрации электролита. Зависимости С, -Ucp. ограничиваются нижней прямой, параллельной оси абсцисс, и верхней огибающей, показывающей уменьшение Су с ростом | Uq,, |. По уровню нижних прямых и ширине полосы охвата значений Cv изученные штаммы можно расположить по возрастанию степени неоднородности в следующий ряд: А1Ленинград <А1Киев <А1Чили (Molodkina et al, 1997). Полученный результат является отражением разной степени генетически обусловленной неоднородности штаммов в ответ на понижение pH среды. Функциональные характеристики агрегативной устойчивости вириопов гриппа Результаты изучения агрегативной устойчивости анализировали с позиций классической теории ДЛФО с учетом только электростатической и дисперсионной составляющих (Дерягин, Ландау, 1941). Кривые коагуляции (1/v - t) определяли в зависимости от тех же параметров, что и при изучении электрокинетических свойств. Полученные значения С,-потенциала приравнивали штерновскому потенциалу и использовали для расчета электростатической составляющей энергии взаимодействия вирусных частиц. Полную энергию определяли по двум составляющим - электростатической и молекулярной, для расчета которой использовали константу Гамакера А=3*10~21 Дж, характерную для широкого ряда биологических объектов (Nir, 1972). Полученные значения высоты потенциального барьера и глубины вторичного минимума использовали либо напрямую для анализа кривых коагуляции вирусных частиц, либо в расчетах фактора устойчивости при коагуляции в первичном (Дерягин, Муллер, 1967) или вторичном (Hogg, Yang, 1976)

минимумах. Кроме того привлекали данные о неоднородности систем по элекгрокинетическим свойствам, и показатели наличия дополнительной, структурной составляющей, энергии взаимодействия. Степень несоответствия экспериментальных данных комплексу расчетных и дополнительно привлекаемых к рассмотрению служила мерой отклонения поведения биообъекта от принятой модели и позволяла обнаружить его специфику. .. .

Изучение агрегативной устойчивости штамма А1 Ленинград в широком диапазоне рН (3,4-7,0) и концетрации NaCl (6*10~6 -3*10~2М) показало, что при рН7 система устойчива в по крайней мере в течение 24 часов; при уменьшении рН - агрегирует, быстро приходя в состояние динамического равновесия. Максимальная степень агрегации наблюдается в изозлектрических точках, определенных методом микроэлектрофореза, причем она тем выше, чем выше концентрация электролита. Полученную зависимость в отсутствие ионно-электростатической составляющей энергии взаимодействия частиц можно объяснить, предполагая наличие граничных слоев (связанной воды), протяженность которых зависит от концентрации электролита. Следовательно для штамма А1 Ленинград необходимо учитывать по крайней мере три составляющие энергии взаимодействия частиц (Молодкина и др., 1988,2000; Molodkina et al, 1995).

Простота созданной конструкции и методическая оперативность, обеспечивающие возможность наблюдения за системой с первых минут приготовления, позволила выявить сверхбыстрый характер процесса агрегации вируса гриппа штамма А1 Ленинград (Молодкина и др, 1988, Molodkina et al, 1995). Расчетные значения периода агрегации (по Смолуховскому) близки к 10 часам, а экспериментальные варьируют от 10 минут до двух часов. По-видимому, кроме броуновского движения следует учитывать действие внешних сил, таких как сдвиг,, колебание и течение (Islam et al,1995). Такие относительные перемещения могли произойти в момент приготовления дисперсии, т.е. при введении вирусного концентрата, в раствор электролита с последующим мягким, но быстрым перемешиванием.

Повышение концентрации NaCl до,физиологического уровня (1,5*10"' М) приводит к усилению агрегацию (рН5,5, рисЗ,кр.6), однако при дальнейшем росте концентрации NaCl до 3*10"' М в первые минуты происходит коагуляция, а после двадцатой минуты -плавный, в течение 20 часов, распад агрегатов (рис.3, кр.7). Полученный эффект согласуется с отмеченным в литературе ингибированием агрегации вирусов в присутствии

высоких (но не достаточных для высаливания) концентраций электролитов (Тихоненко, 1973; Р1о1с1,&8Ьагр, 1978). Это может быть следствием повышения растворимости белков. Полученный результат позволяет установить очередность процессов после введения концентрата вирионов в раствор 3*10"' М КаС1 и оценить времена, связанные с изменением межмолекулярных взаимодействий (с участием молекул воды) и последующими перестройками в системе на межчастичном уровне.

Рис.3 Зависимости обратной счетной Рис.4 Зависимости обратной счетной

концентрации 1/v частиц вируса гриппа концентрации 1/v частиц вируса гриппа

штамма АШснинград от времени t при рН5,5 штамма А1Ленинград от времени t при

в растворах NaCl (1-6* 10"6, 2-1,5* 10"4; 3- рНЗ,4; 10"2 М NaCl. 1-4 - повторы

1,5*10'3; 4-Ю*2; 5-10"2; 6-1,5*10"'; 7-3*10"' М) эксперимента с интервалом 1-7 дней

Динамику структурных перестроек удалось также зарегистрировать для случая агрегации вирионов штамма А1 Ленинград в растворе 10~2 М NaCl, рН 3,4 (рис.4). Эффект, состоящий в агрегации (со степенью 1,5-2) в течение 0,5-1 часа, дезагрегации до исходного (или близкого к нему) уровня в течение получаса и нового этапа агрегации разной длительности и степени, повторялся при неоднократной проверке с интервалом 1-7 дней. Приведенный пример отражает специфику агрегации высокодисперсных биообъектов и демонстрирует чувствительность предлагаемого подхода (в совокупности с приборным и методическим обеспечением) к процессам структурных перестроек систем.

Кривые агрегации вируса гриппа штамма А1 Ленинград в растворах СаСЬ и ВаСЬ имеют такой же вид как и в случае NaCl. Степень агрегации (т) растет с увеличением концентрации электролитов, при этом в растворах СаСЬ максимум зависимостей т-рН смещается от рН4,5 до рН4,3; в растворах ВаСЬ смещения не наблюдается (рН 4,5). Из этого следует вывод о несколько большей специфической адсорбции иона Ва2+, хотя он и не относится к биофильным элементам. Полученные зависимости не соответствуют электрокинетическим данным. Но при этом надо учитывать, что электрокинетические

характеристики определялись при временах свыше 15-20 минут с момента приготовления систем, а за это время в системах уже происходила агрегация. Кроме того было отмечено, что в момент определения электрофоретической подвижности наиболее яркие конусы рассеянного света (при минимальном их количестве в поле зрения) наблюдались не в изоэлектрических точках, а при рН, соответствующих максимумальной степени агрегации. Т.о., согласно проведенному анализу, агрегация вирионов штамма А1Ленинград в присутствии СаС12 и ВаС12 либо определяется положением изоэлектрических точек, соответствующих нативной поверхности (причем как и для электролита КаС1, определенную роль играют слои грашиной воды, протяженность которых зависит от концентрации электролита), либо она происходит через мостикообразование с помощью двухзарядных катионов. В любом случае впоследствии (после 10-20 минут) электроповерхностные свойства вирионов заметно отличаются от нативных, но уже не определяют агрегацию частиц, по крайней мере в течение суток.

Поведение предельно упрощенной системы вируса гриппа штамма А1Киев в растворах №С1 существенно отличалось от поведения штамма А1Ленинград. Для нее была характерна медленная и, в основном, необратимая коагуляция, скорость которой росла с увеличением концентрации электролита и уменьшением рН. Сравнение расчетных и экспериментальных значений факторов устойчивости показало, что в агрегативной устойчивости вируса гриппа штамма А1Киев определяющую роль играет ионно-электростатический фактор (Мо1ос1кта й а1, 1995). Ряд экспериментальных значений фактора устойчивости даже количественно совпадал с расчетными значениями для агрегации в первичном и вторичном минимумах, при этом не требовалось привлечение представлений о структурной составляющей. Исключение составляло поведение системы при рН 3,9, т.е. наблюдалась более быстрая коагуляция, чем при рН 3,3 и 3,6 (но более медленная, чем при рН 2,9 или 3,0). Согласно электрокинетическим данным, область вблизи рН4 является пограничной, отделяющей «классическое» и особенное поведение вирионов штамма А1Киев. По-видимому, это область связана с заметными структурными перестройками поверхностных гликопротеидов, и это отражается в особенности характера кривых коагуляции при рН 3,9.

В децимолярных растворах №С1 происходило замедление коагуляции в интервале рН 3,0-3,9, т.е. проявлялось ингибирующее действие больших концентраций электролита в области нестабильности структуры гликопротеидов.

Изучение агрегации штамма А1Киев в растворах СаСЬ и ВаС12 показало: зависимость кинетики агрегации раннего периода от срока-'хранения трансформированной системы; несоответствие поведения при агрегации - электрокинетачсским данным; разную степень специфического связывания катионов Са2 и Ва , зависящую от рН среды.

Для штамма А1Чили в растворах 1ЧаС1 происходила 'агрегация, близкая по кинетике к поведению штамма А1Киев. При концентрациях КаС1, равных Ю~3 и 10~2 М уменьшение рН среды (от 6,5. доч3,0) вызывало переход системы от- состояния агрегативной устойчивости к медленной коагуляции с возрастанием ■ ¡в целом скорости агрегации. Аномальные (с учетом электрокинетических данных)7случаи ускорения коагуляции при рНЗ,4 (10 1 М) и рН6,5 (10"гМ)'объяс1иются значительной "неоднородностью системы по электрокинетическим свойствам, отмеченной при изучении элёктрокинетических свойств.

При концентрации N80, равной 3*10~2- М, поведение вирусной системы идеально соответствовало электрокинетике (рис.1 в). Кривые, полученные для 0,1М растворов КаС1 (рис.5) отражали последовательность процессов, связанных: а) со сверхбыстрой агрегацией в соответствии со структурой нативной поверхности; б) с конформационными изменениями поверхностных гликопротеидов (демаскированием отрицательного заряда) и влиянием больших концентраций КаС1 на растворимость белка, приводящими к распаду агрегатов,, в) с медленной агрегацией в соответствии с измененной поверхностью. (Молодкина и др.,1989) Полученные данные, как и в случае штамма А1 Ленинград, позволяют оценить суммарные времена процессов структурной перестройки системы.

;■ .. м

Рис.5 Зависимости обратной счетной концентрации 1/у частиц вируса гриппа штамма А1Чили от времени в растворах 10"' М ЫаС1. рН:1 - 6,5; 2 - 5,5, '3'- 4,1; 4 -3,4, 5 - 3,0. а) -начальный период, б) - основное время наблюдения за системой: < : ■••!•.■

Таким образом, на примере дисперсий вируса гриппа продемонстрирован^ .возможности

разработанного подхода по выявлению особенностей поверхностной структуры

однотипных биоколлоидов. ВВССБС, принадлежащие к трем штаммам вируса гриппа

одного подтипа, были трансформированы до предельно упрощенного уровня и для простых систем получен одинаковый набор функциональных элекгрокинетических и агрегативных характеристик. Сравнение электрокинетических зависимостей (С-рН|, ,C-CM.|t, C-t |рн, с) с ожидаемым поведением согласно теории ДЭС (зависимостью от концентрации и зарядного числа индифферентных и потенциалопределяюих электролитов, проявлением специфической адсорбции ионов), а также анализ неоднородности систем по электрокинетическим свойствам (a-Ucp., Cv-Ucp), позволили выявить особенности каждого штамма, проявить генетически предопределенное изменение структуры поверхностных гликопротеидов, происходящее на молекулярном уровне. Изучение агрегации систем (1/v-t|PRc) и проведенный анализ в соответствии с теорией ДЛФО выявили вклад не только молекулярной и электростатической составляющей, но и структурной, которая проявилась для одного из трех штаммов.

Глава 5 Роль компонентов дисперсионной среды в формировании структуры биомнперальных коллоидов

В пятой главе рассмотрен подход к изучению таких ВВССБС, в которых формирование поверхностной структуры биоминеральных коллоидов происходит при активном участии компонентов дисперсионной среды.

Применение разработанного подхода к решешпо таких задач состоит в трансформации системы, при которой можно осуществить разные варианты количественного и компонентного соотношения коллоидов и молекулярно растворенных веществ.

Исследования проводили на питьевой (водопроводной) воде, которая является типичным представителем ВВССБМС. Она содержит в заметном количестве коллоидные примеси, в состав которых входят белковые соединения (см. табл.1), а также (как будет показано ниже) гуминовые вещества (ГВ), которые являются продуктами разрушения белков. ГВ относят к биогеополимерам (Tomaic, Zutic, 1988). Показано, что по составу функциональных групп и ряду свойств ГВ близки к белковым, от которых они унаследовали, в частности, биполярные аминокислотные группировки (Маляренко, 1994).

Проблема чистой питьевой воды является одной из важнейших экологических проблем большого города и представляет особую актуальность для региона Санкт-Петербурга, бассейн водосбора которого включает торфяники и болота, определяющие повышенное содержание в поверхностных водах ГВ. Как известно, при хлорирование такой воды в процессе водоподготовки образуются канцерогенные вещества (Singer et al 1981).

I■ •-■ Таблица 1

Обобщенные характеристики образцов водопроводной воды г: Санкт-11стербурга

№ п/п ' ■ Определяемый показатель, размерность * ■ Интервал значений

1 рН ' <5;75-7,15

2 , Оптическая плотность (Х.=364 нм,/=5см)*' 0,16-0,23

3 Сухой вес примесей, мг/л, задержанных в тупиковом режиме фильтрации трековой мембраной с и ,.„„' =60 нм 1,9-4,7

4. Содержание белка, мг/л, в компонентах, обозначенных в пункте. 3 0,3-0,65

■ 5 • Счетная концентрация, см"3, коллоидных примесей размером порядка 0,1-0,2 мкм .,/■'■ (1,1-4,1)*108

6 Средние значения электрофоретической подвижности , м2/Вс, коллоидных примесей в исходной воде (1,0-1,4)* 10"8

.Примечание: - длина врлны, при которой определяется цветность вод . ,

Предварительно доказана принадлежность водопроводной воды (в/в) С.-Петербурга к определенному типу ВВССБС. На 30 образцах, отобранных в разное время1года,(;пЬказана близость нефункциональных характеристик (табл.1), продемонстрировано ,!ёдйГгоЬбразие функциональных характеристик (цср -рН|ь а-и^ , Су-и^., 1/у4|рн) (МолодкиЬа и др., 1994). ' На основании анализа литературы и результатов предварительных исследований сделано предположение о присутствии в водопроводной воде гуминовых веществ в растворенном виде и в составе поверхностных компонентов примесных коллоидов. Известно, что ГВ обладают ярко выраженными ионообменными свойствами по отношению к катионам щелочных и щелочноземельных металлов (Трстинник и др., 1969) и что их адсорбция на поверхности минеральных (глинистых) частиц может быть обратимой (Кадошников, 73). Поэтому задача Выявления роли гуминовых веществ в формировании поверхностной структуры коллоидов в/в была разделена на две подчиненные задачи доказательства: 1) ионообменных свойств поверхностных компонентов коллоидов в/в, 2) изменения поверхностных свойств коллоидов в условиях возможной десорбции ГВ. . Для их решения проводили трансформацию дисперсной системы и формировали пары систем сравнения, каждая из которых различалась концентрацией молекулярно растворенных компонентов одного или нескольких типов. Для каждой пары систем определяли и сравнивали функциональные электрокинетические характеристики и -динамику изменения счетной концентрации частиц в зависимости от тех же параметров.

Трансформация дисперсной системы (водопроводной воды) включала'предварительное концентрирование коллоидных компонентов и последующее введение концентрата в

дисперсионную среду с заданными свойствам!. Стадию концентрирования проводили в тангенциальном режиме фильтрации на кассетных модулях с трековыми мембранами (производитель - Б.М.Зеликсон) при определенном соотношении давлений в камерах фильтрата и концентрата. Степень концентрирования воды по объему составляла 25 раз. Проконтролировано отсутствие необратимой агрегации.

«Фоновую» концентрацию электролита в исходной в/в, считали равной концентрации 1:1,2:1 -зарядных электролитов, обеспечивающих такое же значение электропроводности.

Первая пара систем отличалась соотношением концентраций коллоидов и растворенных веществ, входящих в состав в/в. В системе I сохраняли соотношение, характерное для исходной воды; модельные электролиты добавляли к в/в. Систему II создавали путем разбавления в 25 раз концентрата коллоидов в растворах Гч'аС1 или СаСЬ с заданным рН.

Ожидалось зафиксировать: а)проявление ионообменных свойств поверхностных компонентов коллоидных частиц воды при замене электролита дисперсионной среды в/в на ионы или Саг'; б)различие молекулярных составляющих энергии взаимодействия коллоидов для систем I и II за счет возможной десорбции ГВ при резком снижении их равновесной концентрации в дисперсионной среде.

Для сформированных систем определяли функциональные зависимости СсР - рН СсР.-Сэл.|рн, с-Ь'ср , СуЦр., 1Лч1Г11х ■ На рис.6 представлены полученные кривые Сср-рН.

Сравнение полученных данных выявило общие и отличительные свойства систем I и II. Общим является: недостижение изоэлектрнческого состояния, рост модуля (^-потенциала с ростом рН в кислой и нейтральной области (НГ-потенциалопределяюющий ион) и его уменьшение с ростом концентрации обоих электролитов (сжатие ДЭС).

Различия проявлялись: в существенном отклонении от теории ДЭС (для индифферентных электролитов) зависимости £ от зарядного числа (г) для системы П; в резком повышением уровня кривых £-рН для системы II в присутствии электролита №С1.

Результаты объяснимы, если катионом, определяющим электропроводность в/в, является двухзарядный ион. При введении концентрата коллоидов в модельный раствор КаС1 происходит обмен двухзарядных ионов, связанных с поверхностными функциональными группами, на ионы !\та" (за счет концентрационного эффекта), и усиление степени диссоциации этих групп (особенно в нейтральной и щелочной области).

Анализ функциональных характеристик СД^, показывает, что для системы П обнаруживается дополнительная по сравнению с системой I область высоких значений Чср

(отвечающая электролиту КаС1), и что во всем диапазоне 1)ср, от 0,8* 10"8 до 2,7* 10"8 м2/Вс наблюдается рост С». Это отражает увеличение степени неоднородности коллоидов.

Система I (в/в + N801) Добавлено:

ср.мВ

40 30 20 10 О

- чп— 10»(-3)М

—&-2"|0»(-3)М

—е—9-ю«(-3)М

1 Т- ■

-Щг 1

-Е — 1

10 рН

Система I (в/а + СаСЦ Добавлено:

-i.cp.MB Система Ц (конц.'+ЫаС1) 70

р—■

У

/

Г""" —*-10"(-3)М » 2*10"(-3)М 'Г-А-— 3*10Ч-3)М —в-10»(-2)М -•*-•- в/в

ЮрН

Система II (конц.+ СаО}

4*10"(-4)М

Рис.6 Зависимости С«р. - рН для коллоидов систем I и II в присутствии электролитов №С1 и СаС12 (одинаковыми маркерами обозначены равные суммарные концентрации электролига с.учетом эквивалента фоновой концентрации).

Отличие молекулярных составляющих энергии взаимодействвд коллоидов систем I и II, доказано при сравнении функциональных характеристик 1Лм]рцс, (пример на рис.7)

Сравнение поведения систем I и II при агрегации с электрокинетическими данными выявило качественное соответствие для системы I (ЫаС1) и системы II (СаСЬ), частичное соответствие для системы I (СаС12), полное несоответствие для системы П (КаС1). Для количественной оценки рассчитывали энергии парного взаимодействия частиц по теории ДЛФО и значения факторов устойчивости. Поскольку константа Гамакера (А) для коллоидов в/в неизвестна, в расчетах испбльзовали набор значений Л от Ю-21 до 10~" Дж.

На основании сравнения расчетных и экспериментальных данных составлена сводная табл.2. Видно, что при каждом А экспериментальные результаты для системы I (№С1) объяснимы только при наличии граничных слоев связанной воды. Это согласуется с предположением о присутствии в поверхностном слое коллоидов в/в гуминовых веществ, известных высокой гидрофильностью, либо белковых компонентов.

Рис.7 Зависимость обратной счетной концентрации коллоидов систем I и П от времени.

Таблица 2

Сравнение систем I и П на соответствие экспериментальных и расчетных показателей

агрегации при разных константах Гамакера

Система / электролит А=10~2' Дж А=3*10~21 Дж А=Ю"20 Дж А=5*Ю"20 Дж

1/№С! В целом соотв. ГС~0,4-0,б нм в отдельных случ. В целом соотв. ГС-1 и Юнмв отдельных случ. ГС >7нм (в.к.) ГС>25 нм (н к.) ГС протяж. (б/б -в.к., н.к. и ср.к. - кисл.)

1/СаСЬ В целом соотв. Значение А занижено (н.к.) В целом соотв. ГС~1 и Юнм в отдельных случ. ГС>15нм (в.к.) ГС>20нм(ср.к.) ГС>25нм (н.к.) ГС протяж. (б/б-в.к., н.к. и ср.к. - кисл.)

П / №С1 Значение А занижено (1 исключение) Значение А занижено(н.,ср.к) ГС~0,7 и Юнм (в.к.) Полуколичеств. соответствие (ср.к.) ГС~10-15нм (в.к.) ГС>10-20нм (в.к., б/б -кисл) ГС>20нм(ср.к.) ГС>25нм (н.к.)

II / СаС12 Значение А занижено (н.к., ср.к.); совпадение (в.к.) Знач. А занижено (н.к, ср.к.-нейпгр); соответств. (ср.к. и в.к. - кисл) ГС~1нм (в.к-нейтр) Значение А занижено (н.к.) Полуколичеств соответствие (ср.к.) ГС (в.к.) Соотв.(н.к. -кисл); б/б (ср.к.,в.к. -ГС>20-25нм)

Примечания: 1) н.к.- низкие концентрации электролита, ср.к. - средние концентрации, в.к. -высокие концентрации; 2) б/б - безбарьерная коагуляция; 3) кисл. - область низких значений рН, нейтр. - нейтральная среда, 4) ГС - граничные слои связанной воды

Из табл.2 следует, что для системы I наиболее вероятно значение А=3*10~21 Дж. Для

системы Б использование любого значения А требует объяснения противоречивых

ситуаций. Тем не менее заметен сдвиг вправо «условий соответствия» для системы II по сравнению с системой I. Т.е. константа Гамакера, характеризующая систему II, должна быть выше. Поскольку, согласно микроскопической теории, сложные константы Аш тем выше, чем больше различаются вещества дисперсной фазы Аи и дисперсионной среды Л22 [А]21=(^Ац - УАп)2 ] (Яминский и др.,1982), то можно считать, что поверхность системы П является менее гадрофильной, чем поверхность системы I.

Таким образом, сравнительный анализ функциональных характеристик систем I и П показал, что: а) поверхностный слой коллоидов в/в содержит компоненты, обладающие катионообменными свойствами; б) адсорбция компонентов поверхностного слоя коллоидов в/в обратима; в) природа поверхности коллоидов в/в - (поляризуемость и потенциалы ионизации поверхностных молекул, определяющие констшггу Гамакера) изменяется после часгичной десорбции поверхностных компонентов, обнажившаяся поверхность становится менее гидрофильной.

Вторую пару систем сравнения формировали с различием только по одному типу компонентов. Из фильтрата (ФТ), получаемого во время приготовления концентрата коллоидных частиц, извлекали компоненты, проявляющие свойства органических анионов (характерно для ГВ (Славянская и др. .1981, 1982)), с помощью анионообмешюй целлюлозы. Концентрат вводили либо в фильтрат (система «ФТ+конц.»), либо в фильтрат, прошедший через ионообменный материал (ФТИО) (система «ФТИО+конц.»).

Адсорбированные целлюлозой вещества буро-коричневого цвета извлекали 0,3 М раствором КОН, освобождали от. ионов К*. ,и нейтрализовали, пропуская через . катионообменную смолу. Спектрофотометрический гш&Ьи в ультрафиолетовой и видимой области (Грановская,1969) показал ; близости спектров к спектрам, фульвокислот (Грановская, 1969). Гель-хроматографией 'на сефадексе в50 в щелочных условиях определили молекулярную массу двух фракций - 1,1 * 104 и 5 * 103.

По разности спектров дисперсионных сред. «ФТИО» и «ФТ» контролировали качественное различие' сравниваемых систем в содержании ГВ Количественное -определяли при ?.~250 нм (Славинская и др. 1982). Разностное содержание ГВ в системах «ФТ+конц.» и «ФТИО+конц.» составлялоот 15 до 30 мг/л. Анализ функциональных характеристик двух систем сравнения показал различие вида зависимостей СсР.-рН, разный (повторяющийся для разных образцов воды) наклон прямых а-иср., Су-иср. (рис.8), разную скорость и степень агрегации (Молодкина, Коликов, 2000).

Рис.8 Зависимости сг - и^. и Су - и,,,, для систем «ФТ+конц» и «ФТИО+конц»

Полученные результаты подтверждают, что уменьшение концентрации ГВ в дисперсионной среде смещает адсорбционное равновесие и приводит к десорбции подобных соединений из поверхностного слоя коллоидных частиц.

Глава б Обновление дисперсной фазы в полидисперсных концентрированны! системах

Обновление дисперсной фазы в полидисперсных концентрированных ВВССБС может происходить как самопроизвольно, так и вызываться искусственно для получения информации о состоянии той части фазы, которая изначально находится за пределами чувствительности метода анализа. Использование методов светорассеяния для одновременной регистрации частиц высокодисперсного и ультрадисперсного диапазона ограничено зависимостью интенсивности рассеянного света от шестой степени размера. Однако можно изучать их элекгроповерхностных свойства методами микроэлектрофореза и поточной ультрамикроскопии путем провоцирования процесса агрегации.

Предлагаемые приемы работы, а также информационные возможности такого варианта изучения ВВССБС, рассмотрены в работе на примере дисперсий мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью (МКБ) (гл.6) и водопроводной воды (гл.5).

Из литературы известно, что моча в норме и в патологии содержит биологически активные вещества, в частности белки (в щученных нами образцах - 12-40 мг/л). Именно белкам отводится роль либо защитных «коллоидов» (окружающих кристаллоиды и препятствующих их соединению между собой), либо матриц конкрементов, способствующих склеиванию выпавших из раствора кристаллов. Т.е. коллоиды мочи здоровых, либо больных МКБ образуются при участии белков. В работе сделана попытка

выявить наличие белковой компоненты . путем сравнения функщюнальных электрокинетических характеристик коллоидов и показателей агрегации.

Системы мочи подвергали трансформации для удаления избыточных растворенных солей - источников образования новых кристаллоидов. При этом основная цель состояла в сохранении коллоидов всего диапазона размеров и белковых соединений. Преобразование системы проводили с помощью щадящих методов гель-фильтрации с использованием акрилекса Р6 (пределы фракионирования 103-6*103) и диализа с исключаемой ММ 6*103. Приготовление рабочих дисперсий г путем введения преобразованной системы в раствор 10"3 М №С1 заданной кислотности в соотношении 1:20 или 1:10.

При получении функциональных характеристик систем с обновляющейся дисперсной фазой, следует: а) измерение счетной концентрации взвешенных частиц дополнять экспресс-анализом распределения по размеру; б) их электрофоретическую подвижность измерять неоднократно, выбирая время анализа по кривой коагуляции, в) анализировать электрокинетичсские характеристики и показатели агрегации только совместно и при обязательном привлечении экспресс-анализа размеров частиц

Электрокинетические функциональные характеристики коллоидов мочи определены для шести образцов мочи здоровых людей и больных МКБ, трансформированных двумя способами (рис.9). Для образцов мочи здоровых людей точки ложатся на одну кривую, для которой модуль снижается с уменьшением рН в диапазоне рН 2-6 (ионы Н+ и ОН" -потенциалопределяющие). Изоэлектрическое состояние достигается при рН <3.

----------------- 20-1- ----:----------

13 5 7 '91 3 5 7 9

Рис. 9 Зависимости С^.-рН для систем, приготовленных из мочи здоровых людей (а) и больных МКБ (б) ,(а):кривые1,2 -образец №1; кр.З-№2; кр.4 - №2а; кр.5,6 - №3; Время с момента приготовления системы (АО : 1,3,5 - (40-85)мин,2-5ч, 6-(50-52)ч (б):кривая 1 - обр. №4; кр.2 - №4а; кр.3,4 - №5; кр.5,6 - Авб 1,2,3,5-(40-85)мин; 4,6 -23сут. Номера без индексов - диализ; с индексом «а»-гель-хроматограф.

Выполнение перечисленных выше рекомендаций показало, что экспериментальные точки рис.9 несут информацию об изначально различных по размеру коллоидах. Так, например, анализ начальных участков кривых коагуляции (рис. 10) свидетельствует о том, что при рН 4,3-8,3 размер частиц соответствует размеру коллоидов в исходных системах. Уменьшению рН до значений 3,05 и 3,35 соответствует эффект появления в поле зрения сверхмелких частиц с резким возрастанием общей счетной концентрации (падением 1/у в пять раз) - это результат агрегации частиц ультрадисперсного диапазона. А в области, близкой к изоэлекгрическому состоянию (рН 2,7 и 1,9), при первом измерении регистрируются частицы, являющиеся «выросшими» агрегатами ультрадисперсных- Т.о. экспериментальные точки на кривой ¿^..-рН, полученные в первые 20-60 минут после приготовления рабочих систем, отражают свойства агрегатов и ассоциатов, возникших из коллоидов разных размеров. Вместе с тем взаимосогласованность полученных данных, а также результаты измерения электрофоретической подвижности частиц через 5 и 50-52 часа после приготовления дисперсий, т.е. после заметной или полной смены состава «видимых» коллоидов, показывают, что коллоиды мочи здоровых людей широкого диапазона размеров имеют одинаковые электрокинетические свойства.

1/^10', см1 Моча здорового, образец N23

Рис.10 Зависимости обратной счетной концентрации коллоидов мочи от времени в растворах №С1 при разных значениях рН

Для систем, приготовленных из мочи больных МКБ, показано (рис.9б) различное положение изоэлекгрических точек, а также отличие наклона кривых С^-рН по отношению к оси абсцисс и возможное изменение С^, при больших временах хранения дисперсий, т.е. после полной (двух-трехкратной) замены дисперсной фазы видимого диапазона. Т о взвешенные частицы образцов мочи разных больных МКБ обладают неодинаковыми электрокинетическими свойствами.

Полученные результаты согласуются с данными об отсутствии в заметных количествах в моче больных с уратными камнями ССК-растворимых белков (содержащих дикарбоновые аминокислоты и сиаловую кислоту) с низкими значениями ЮТ (Миронов, 1991), с разными диапазонами колебания рН мочи больных с оксалатными, • уратными и фосфатными камнями (рК соответствующих кислот равны 4,3; 5,45; 7,2) (Чугай, 1989).

Характеристические функции Сти-Шср1 и Су-ШцД показали существенную неоднородность по электрокинетическим свойствам систем мочи здоровых людей по сравнению с больными МКБ. Если для первых отмечено сходство с биосистемами (вирусом гриппа), то для вторых - с коллоидами из полистиролыгого латекса (Ревут, Усьяров 1981). Это не противоречит гипотезе о стабилизации кристаллоидов мочи здоровых людей белковыми ассоциатами, но также гипотезе о буферном влиянии почечных камней (Чугай, 1989).

Сравнение показателей поведения дисперсий мочи здоровых людей при агрегации с электрокинетическими данными показало возможность охарактеризовать одинаковым образом коллоиды образцов мочи здоровых людей, принадлежащие разным пациентам и относящиеся изначально к разным диапазонам дисперсности. А именно, в широком диапазоне рН (от 1,9 до 8,75) выделить интервалы рН, которым соответствуют характерные средние значения ¿¡-потенциала (в диапазоне Ср. от +3 до -ЗЗмВ) и соответствующий характер (кинетика) агрегации коллоидов (Молодкинаидр., 1997, 2000).

Глава 7 Практическое приложение разработок и результатов исследования, представленных в работе ^. .

В седьмой главе изложены результаты решения отдельных прикладных ,задач медицинской биотехнологии и экологии, в которых нашли применение созданные в работе установки, разработашиые методики, а также использованы выводы, полученные при изучении ВВССБС. ... ,.,

Так по вопросам, связанным с вакцинным производством, предложено: а)использование методики модифицирования макропористых кремнеземов поливинилпирролидоном в производстве противовирусных вакцин; б)электрокинетический тест, позволяющий выбирать (га альтернативных вариантов) метод очистки и концентрирования препаратов вируса гриппа при создании противогриппозных вакцин; в)электрокинетическая методика, позволяющая определять срок годности очищенного вирусного препарата; г)методика выбора производственного вакцинного штамма, основанная на сравнении электрокинетических и агрегативных функциональных характеристик.

Для решения технологических и научных задач, связанных с проблемой получения чистой питьевой воды: а)изучен процесс адсорбции коллоидных примесей водопроводной воды на образцах макропористого угля АУГ, рекомендованных на основании результатов изучения коллоидной системы питьевой воды; б)дано объяснение низкой эффективности использования озонирования для обеззараживания водопроводной воды г.Санкт-Петербурга; в)дано объяснение низкой эффективности использования полимерных фильтрующих элементов пространственно-глобулярной структуры для обеззараживания водопроводной воды Санкт-Петербурга (по сравнению с питьевой водой г. Алма-Аты) и мониторинга поверхностных вод по санитарно-бактериологическому показателю; г) предложен набор показателей и методов их определения для контроля локальных водоочистных установок индивидуального и коллективного пользования.

Рекомендован подход к разработке методик анализа мочи для диагностики МКБ,

Основные результаты и выводы

1. Разработан, аппаратурно и методически обеспечен, реализован комплексный подход к изучению водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем, включающий: их целевую трансформацию для получения информативного уровня структурной организации; определение методами микроэлектрофореза и поточной ультрамикроскопии функциональных электрокинетических характеристик и показателей агрегации; анализ суммарного содержания полученных данных в соответствии с уровнем организации трансформированной системы.

2. Показано, что при реализации комплексного подхода на разных уровнях структурной организации высокодисперсных белоксодержащих систем можно выявить:

•на уровне предельно упрощенной системы - молекулярные и надмолекулярные (межчастичные) механизмы процессов, происходящих с участием однотипных коллоидов; •на уровне организации системы с вариантами (по составу и количеству) соотношений между взвешенными и растворенными компонентами - участие молекулярных биокомпонентов в формировании поверхностной структуры взвешенных частиц; •на уровне, отвечающем полидисперсной агрегирующей системе (с обновляющейся дисперсной фазой) - различие или сходство поверхностных свойств частиц ультрадисперсного и высокодисперсного диапазона.

3. Продемонстрированы возможности созданного аппаратурно-методического обеспечения в определении суммарной длительности процессов молекулярного и надмолекулярного взаимодействия, завершающихся структурной перестройкой системы.

4. Показана результативность разработанного подхода в решении фундаментальных и прикладных задач, связанных со 'значимыми для медицины, биотехнологии, экологии высокодисперными белоксодержащих системами.

5. Установлено, что к вирионам гриппа с микромозаичной структурой поверхности и способностью поверхностных гликопротеидов к конформационным превращениям, применима модель жесткой коллоидной ; частицы. Их поведение в разных конформационных состояниях можно описывать с позиций теории двойного электрического слоя и теории взаимодействия гидрофобных коллоидов ДЛФО (с учетом или без учета представления о граничных слоях.

6. Установлено, что генетически обусловленные конформационные изменения поверхностных гликопротеидов вирусных частиц проявляются электрокинетически и могут быть опйсайы через функциональные электрокинетические показатели С-рЦ, С-С ал-та, Оиср.

7. Установлено, что конформационные изменения поверхностных гликопротеидов вирусных частиц могут провоцировать процесс структурной перестройкисистемы вирионов (на уровне межчастичных взаймодействий), которая может быть описана в

терминах'кйнетики агрегации 1^11,0311.2.

8. Установлено, что Санкт-Петербургская водопроводная вода принадлежит к определенному типу высйкодисперсной структурно слоАшой белоксодержащей системы с характерньш набором функциональных электрокинетических и агрегативных показателей.

9. Установлено, что высокодисперсные примеси водопроводной воды Санкт-Петербурга ■ содержат белковые соединения и гуминовые вещества, определяющие их

электроповерхностные свойства и устойчивость системы к агрегации.

10. Установлено, что моча здоровых людей, лишенная низкомолекулярных компонентов (с ММ <6000), может быть охаракгеризована как однотипная полидисперсная структурно сложная беЗюкгодержащая система.' '- '

.11..Установлено, что коллоидные (кристаллоидные) компоненты мочи здоровых людей высокодисперсного и ультрадисперсного диапазона обладают статистически одинаковыми электрокинетическими свойствами, и одинаковой, электростатически обусловленной, способностью к агрегации,-.:.

12. Решены (показан путь к решению) ряда прикладных задач вакцинного производства, таких как выбор вакцинного штамма, технологии очистки вирусов, выбор адсорбентов, носителей,методов их модифицирования, определение срока годности вакцинного

препарата; задач водоподготовки, мониторинга и очистки питьевой воды, диагностики

мочекаменной болезни.

Основные публикации по теме диссертации:

1. Хроматографическая очистка и концентрирование аллантоисной культуры вируса гриппа (штамм А2-36 /Виктория-72/) С.Е Бреслер, В.М Коликов, В.М.Молодкин и др. Тр.НИИЭМ им.Пастера.-Л., 1973.-Т.42: Респираторные вирусные инфекции,- С.22-25

2. Жидкостная ситовая хроматография вируса гриппа на модифицированных пористых стеклах / Б.В. Мчедлишвили, С.П. Жданов, Н.В. Катушкина и др. // Тр.НИИЭМ им.Пастера. - Л., 1976.-Т.47: Убитая гриппозная вакцина - С.43-49

3. Молодкина Л.М., Мчедлишвили Б.В. Методика модифицирования макропористых кремнеземов поливинилпирролидоном / Тр.НИИЭМ им. Пастера.-Л.,1979.-Т,52: Этиология и специфическая профилактика гриппа,- С.92-95

4. Адсорбция и хроматография вирусов на модифицированных макропористых кремнеземах / С.Е. Бреслер, В.И. Борисова, А.И. Кёстнер и др. //1 Всесоюзн. симп. по молек. и жидк. хроматографии / Дзержинск, 15-20 окт. 1979/: Тез. докл.- Дзержинск, 1979. - С.55

5. Очистка суспензии вирусов гриппа на модифицированных макропористых кремнезёмах / В.И.Борисова, В.М. Коликов, Б.В. Мчедлишвили и др. //I Всесоюзн.конф. «Хроматография в биологии и медицине» /Москва, 21-25 нояб.1983/: Тез. докл ,-М., 1983.-С. 156-157

6. .Макарова C.B., Мчедлишвили Б.В, Молодкина Л.М. Модифицированные макропористые стекла для хроматографии биополимеров. / Там же - С.286-287

7. Структура, адсорбционные и хроматографические свойства макропористых стекол, модифицированных полимеризацией N-винштирролидона/ Б.В. Мчедлишвили, А.М. Смирнов, О Н. Мертвужина и др. // Коллоид, журн-1984.-Т.46, № 1. - С.132-136

8. Исследование устойчивости частиц вирусов гриппа в растворах электролитов / Ю.М Чернобережский, Е.В. Голикова, Л.М.Молодкина и др. // VTII международн. конф. по поверхн.силам /Москва,3-дек. 1985/:Тез. докл., 1985. - С.30

9. Изучение электрофорстической подвижности вирусов гриппаА1/Лешшград/ и АЗ/Ленинград/ /Л.М Молодкина, В.М Молодкин, O.A. Вострюхина и др. И Коллоид, журн,- 1986.-Т.48, №1,- С.83-89

Ю.Определение размера частиц вируса гриппа методом поточной ультрамикроскопии / Л.М.Молодкина, Д.Г.Селентьев, Е.В. Голикова и др. // Коллоид. журн.-1987.-Т.49, №3,-С.580-583

11 .Исследование агрегации вирусов гриппа Al в растворах NaCl / Л.М.Молодкина, Д.Г.Селентьев, Е.В. Голикова и др // Коллоид. журн.-1988.-Т.50, №5 - С.848-854

12.Сравнение электроповерхностных свойств и агрегативной устойчивости дисперсий вируса гриппа А1/ Л.М.Молодкина, Е.В. Голикова, Ю.М Чернобережский, В.М. Коликов //Всесоюзн. конф. «Коагулянты и флокулянты в очистке природных и сточных вод» /Одесса,12-14 окг. 1988/:Тез. докл., 1988. - С.55-56

13 .06 особенности кинетики коагуляции дисперсии вируса гриппа в 0,1 M рас-творе NaCl Л.М.Молодкина, Л И Арабова, Е.В.Голикова, Ю.М. Чернобережский // Коллоид, журн,-1989,-Т.51,№5. -С. 618- 619

14.The electrokinetic properties and aggregaive stability of the influenza virus dispersions purified by large-scale chromatography on macroporous glass / Yu.M Chemoberezsky., L.M.,Molodkina E V.GoIikova, V.M. Kolikov//32-nd IUP AC Congr. /Stokholm, august, 2-7,1989/ Abstr. -P.34

15.Flow ultraraicroscopy investigation of the aggregative stability ofthe influenza virus dispersions/ L.M.Molodkina, E. V. Golikova, Yu Chernoberezhsky, V.M. Kolikov // :11-th European Conférence «Chemistry of interfaces» /Berline, apr.,23-28 1990/ Abstr. - P.28

16.Голикова E.B. Молодкина Л.М., Янклович А.И. Ультрамикроскопическое исследование коагуляции водных дисперсий частиц с лиофилизованной поверхностью с целью оптимизации процессов водооч'истки и водоподготовки /Всес.конф.«Коллоидно-химические проблемы экологии» /Минск, 28-30 мая 1990/. Тез. докл.-Минск.-С.29

17. Кинетика коагуляции дисперсии вируса гриппа в растворах NaCl / E.B. Голикова, Л.М.,Молодкина, Ю.М. Чернобережский и др. // Междунар. конф. по поверхн. силам /Москва,13-15 нояб.1990/ :Тез . докл.-NÏ., Наука, 1990. - С.56-57

18.Исследование гетерокоагуляции частиц в смешанных биоминеральных дисперсиях методом светорассеяния /' О.Л. Власоьа, А.Г. Безрукова, Л.М.Молодкина, В.М. Коликов. Там же - С.19

19 . Surface electrochcmistry and aggregative "stability of influenza virus dispersion / E.V.Golicova, L.M Molodkina., V.M. Kolikov, Yii.M: Chernoberezhsky // 33-d IUPAC Congrcss /Budapesht,Àug. 17-22, 1991/ Abstr. -P.27 . ..v-i

20. Стерилизующая фильтрация модельных питательных сред на кассетных модулях с трековыми мембранами / О.Л. Власова, Л.М.Молодкина, В.М. Коликрв Б.В. ' . , Мчедлишвили // 4-е Пущинское совещание «Культивирование клеток животных и человека. Проблемы цитологии» /Пущино, 5-7 апр. 1994/ :Тез. докл.-Пущино, 1994-С.27

21.Молодкина Л.М., Дмитренко А.Л.,Коликов В.М. Электрокинетическое поведение и агрегативная устойчивость дисперсий примесных частиц водопроводной воды в присутствии 1:1 и 2:1-зарядных электролитов / Междунар. конф. «Коллоидная химия в решении проблем охраны окружающей среды» /Минск,15-17нояб. 1994/: Тез. докл,-Минск,1994. - С.66-68

22.Коллоидно-химическая характеристика высокодисперсных примесей водопроводной воды г. Санкт-Петербурга В.М. Коликов, Л.М.Молодкина, М.П. Вовк, К.В.Бунтов // Там же.-С.69-71

23.Коллоидные примеси водопроводной воды - токсическая опасность, причины устойчивости, условия коагуляции / Л.М Молодкина, М П. Вовк, А.Л. Дмитренко, В.М. Коликов // Материалы международного конгресса «Вода:экология и технология» /Москва, 6-9 сент. 1994/. - M.,Т. - С.508-516

24.Молодкина Л.М., Голикова Е.В., Чернобережский Ю.М. Вариация электрофоретической подвижности частиц вируса гриппа различных штаммов // 2-я междунар.конф. «Биоколлоид 95» /Киев, 20-22 июня 1995/: Тез.докл.- Киев,1995. - С. 12

25.Электрокинетические свойства взвешенных частиц питьевой воды г. Санкт-Петербурга /Л.М. Молодкина, В.М: Коликов, К.В. Бунтов, А Л. Дмитренко // Там же. - С.21

26. Агрегация взвешенных частиц питьевой воды г. Санкт-Петербурга в присутствии 1:1 и 2:1 -зарядных электролитов / В.М. Коликов, Л.М.Молодкина, К.В. Бунтов, А Л .Дмитренко//Там же. С.27

27.Flow ultramicroscopy investigation of the aggregative stability of influenza virus dispersions L.M.Molodkina, E. V Golicova,. Yu.M. Chernoberezhsky, V. M. Kolikov //Colloids and surfaces A:Physico-chemical and engineering aspects, 1995,-P. 1-9 .

28.Молодкина Л.М., Вовк М.П., Коликов В.М. Трековые мембраны в задаче анализа и удаления коллоидно растворенных токсичных примесей водопроводнои'водьг/ Росс, конф. по мембранам и мембранйым технологиям «Мембраны-95» /ВлйдиМир'З-б' окт. 1995/ Тез.докл. 1995. -С.71

29.Биотехнологические приложения трековых мембран / О.Л Власова., Л.М. Молодкина,

B.М.Коликов, Б.В. Мчедлишвили. // Там же.-С.73

30.The behavior of influenza virus dispersions in the presence of CaCl 2 and BaCl 2 / L.M. Molodkina,, E.V Golicova,Yu.M. Chernoberezhsky, V.M. Kolikov// 11-th International conference «Surface Forces»/ Moscow, June 25-29, 1996/ Abstr.-P.86

31 .Molodkina L.M., Vovk M.P. Kolikov V.M. Aggregative stability and coagulation of suspended tap water contaminants, там жеР.87

32. Адсорбция коллоидных примесей водопроводной воды и фульвокислот на активированных углях, полученных формованием ультрадисперсных порошков / Л.М. Молодкина, М.П.Вовк, Д.В.Федорович, В.М.Коликов II Международный конгресс «Вода: экология и технология ЭКВАТЭК-96» /Москва, 17-21сент. 1996/, М. - С.228-229

33.Adsorption of tap water colloid contaminants and fiilvic acids on activated carbon formed from ultradisperse powder / L.M.,Molodkina, M P.Vovk, D.V.Fedorovich, V.M.Kolikov //Second Intern. Congr. «Water: ecology and technology», ECWATECH -96, /Moscow, Sept. 17-21,1996/,Abstr. - P. 176-177

34.Dispersion of the electrophoretics mobility of three influenza virus strains / L.M.Molodkina, E.V Golicova, V .M. Molodkin, Yu.M. Chernoberezhsky // 9-th Intern.conf.on Surface and Colloid Science/Sofia, July 6-12, 1997/Book of abstr.665.Fl .-P.356-357

35.Концепция экологического образования в техническом университете / М.П.Федоров, МБ Шилин, К.К.Гомоюнов, И.А.Заир-Бек, В.М.Коликов, В.И.Масликов, Л.М.Молодкина, Н.Н.Ролле, АИШишкин Изд-во СПбГТУ, 1998.-45с.

36.Молодкина Л.М., Голикова Е.В., Молодкин В.М. Коллоидно-химические основы процессов медицинской биотехнологии / Научно-технические ведомости СПбГТУ, 1998, №2-3 (12-13). -С.117-120

37.Власова О.Л., Молодкина Л.М., Вовк М.П. Разработка перспективных методик использования плазмофильтров на основе трековых мембран / Научно-технические ведомости СПбГТУ, 1998, №2-3 (12-13) . - С.128-132

38.Безрукова А.Г., Власова О.Л., Молодкина Л.М. Фундаментальные исследования природных вод как элемент программы экологической безопасности / Материалы П1 Всероссийской научно-технической конференции «Фундаментальные исследования в технических университетах» (С.-Петербург, 10-11 июня 1999г.), СПб, 1999 - С.150-151

39.Власова О.Л., Тимофеев АН., Молодкина Л.М., Безрукова А.Г. Комплексный анализ параметров состояния биомедицинских дисперсных систем / Труды Международной научно-практической конференции «Измерительные информационные технологии и приборы в охране здоровья (МЕТРОМЕД-99)», (Санкт-Петербург, 29 июня-1 июля 1999г.), Санкт-Петербург, 1999. - С.21-22

40.Безрукова А.Г., Власова О.Л., Молодкина Л.М., Коликов В.М. Многопараметрический анализ смешанных биоминеральных дисперсных систем (Модели природных вод) / Тез. докл. II съезда биофизиков России (Москва,25-27 авг. 1999г.), Москва, П т.,VIII.3. - С.585

41.Молодкина Л.М. Изучение структуры биоминеральных дисперсии экомедицинской принадлежности на базе методов микроэлектрофореза и поточной ультрамикроскопии /Тез. докл. II съезда биофизиков России (Москва,25-27 авг, 1999г.), Москва, III т.,1Х.62 -

C. 696

42.Молодкина Л.М., Коликов В.М. Комплексный подход к изучению высокодисперсных структурно сложных биоминеральных систем /Научно-технические ведомости СПбГТУ. - 2000., №2 (20). С.58-69

43.Heteroaggregation in mixtures of biological and mineral disperse systems / A.G.Bezrukova, O.L.Vlasova, N.A. Karamyan, L.M.Molodkina //10-th Intern, conf. on and Colloid and Interface Science /Briston, July 23-28,2000/Book of abstr. BAP 30

36

4

44.BezrukovaA.G.,; Vlasova O.L., Molodkina L.M Optical and electrokinetic properties of biological and mineral disperse systems knd their mixtures /Intern.symp. on Electrokinetic Phenomena, /Dresden, October 3-6, 2000/ iAbstr. P.40

45.Способ получения вакцины / C.E. Бреслер,' HB Железнова, Н.В. Катушкйна и др. // А с.579309 СССР МКИ С12 К 5/00.-№1967101/28-13; Заявл. 16.11.73; опубл. 05.11.77, Бюл.№41

46.Способ приготовле1шя сорбента / В.Н. Борисова, С.Е. Бреслер, Н.С. Головина и др. // А.с.671385 СССР МКИ С12 К7/00, С01 В ЗЗ/ОО.-Х» 2523515/28-18;Заявл.31.08.77; Опубл. не подлежит' '" ' "■ '

47.Способ получения cop6eirra: В.М Коликоп, С.Е.Бреслср, Н.В.Катушкми и 'др. //

A.с.963156 СССР,№ 2461698;'3аквл.0$.0377; Опубл. не подлежит ''

48.Способ получения пористого кремнезе^содёржащего материала для Хроматографии биополимеров / С.В.Макарова, В.М.Коликов, А.С.Те'легин и др. // А.с.747513 СССР,МКИ В 01 1/222,В 0Г15/08,С12 13/06.-№ 2578926/23-26,Заявл. 15.02.78; Опубл. 15.07.80,- Бюл.№26 . . . ; /

49.Способ получегшя сорбента' для очистки вирусных 'суспензий В.Н.Борисова,

B.М.Коликбв;' И.Н.Красильников и др,7/ А.с.811664 СССР МКИ В 01 20/10, С 12 7/00,- №2826410/23-6; Заявл. 26.07.79; Опубл. не подлежит

50:Method of producing vaccincs/ S.E.Bresler et al //Pat, 4071619 (USA)

51.Verfahreniumherstellungvonvakzinen/S.E.Bresleretal. //Pat. 114615(DDR)

52.Zpusob vyroby vakcin / S.E.Bresler et al.// Pat. 1721 ] l(Chekoslovakiya)

53.Precede de preparation de vaccina/ S.E.Bresler et al.//Pat. 2251334 (France) ' ' '

54. Verfahren zum herstellung von inaktivierten imfstoffcn gegen viruskrankheiten / S.E.Bresler et al.//Pat 2452919 (FRG)

55 Method for producting vaccines/ S.E.Bresler et al. //Pat.1032509 (Japan)

56.Eljaras vakcinak eloallistasara / S.E:Bresler et al.//Pat. 175489 (VNR)

57. Satt ett framstalla ettvaccin/S.E.Bresler et al.//Pat.418573 (Sweden)

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Молодкина, Людмила Михайловна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Методы исследования высокодисперсных биоминеральных систем

1.2. Структура и физико-химические свойства вируса гриппа типа А.

1.3. Электроповерхностные свойства и агрегативная устойчивость вирусных систем.

1.4. Дисперсная система питьевой воды.

1.5. Состав и физико-химические свойства дисперсной системы мочи.

2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты и материалы

2.2. Методы исследования

3. Трансформация структуры высокодисперсных белоксодержащих систем

3.1. Концепция комплексного подхода к изучению водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем

3.2. Методы получения трансформированных состояний водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем.

4. Выявление особенностей поверхностной структуры однотипных коллоидов на предельно упрощенных дисперсных системах.

4.1. Выбор информативного уровня структурной организации системы

4.2. Обоснование выбора информативного набора физико-химических характеристик биоколлоидов.

4.3. Функциональные электрокинетические характеристики системы вирионов.

4.4. Функциональные характеристики агрегативной устойчивости системы вирионов гриппа.

5. Роль компонентов дисперсионной среды в формировании структуры биоминеральных коллоидов.

5.1. Доказательство принадлежности водопроводной воды к определенному виду высокодисперсной структурно сложной белоксодержащей системы .,.

5.2. Трансформация системы с обеднением дисперсионной среды по всем компонентам

5.3. Трансформация системы с обеднением дисперсионной среды по одному типу компонентов.

6. Обновление дисперсной фазы в полидисперсных концентрированных системах.

7. Практическое приложение разработок и результатов исследования, представленных в работе

7.1 Вопросы производства противовирусных вакцин.

7.2. Научные и практические задачи водоочистки и водоподготовки.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химический анализ высокодисперсных белоксодержащих систем на основе микроэлектрофореза и поточной ультрамикроскопии"

Диссертационная работа посвящена разработке и реализации подхода к изучению водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем (ВВССБС), необходимому для понимания физико-химической природы и механизмов процессов структурных изменений, происходящих на разных уровнях их организации.

Такие системы широко распространены в природе и в техносфере. Их отличает характерный размер взвешенных частиц, не превышающий 200 нм, полидисперсность, многокомпонентность, присутствие белковых соединений в растворенном состоянии, в виде ассоциатов и входящих в состав биоминеральных частиц. К ВВССБС относятся системы, чрезвычайно важные для биотехнологии, экологии, медицины - это, например, сырье и продукты вакцинного производства, питьевая вода, биологические жидкости человека и животных. Под влиянием внешних воздействий в таких системах происходят конформационные изменения белковых молекул, взаимодействия между различными компонентами. Эти процессы ведут к структурным изменениям на молекулярном, надмолекулярном, межчастичном уровне. Понимание их природы и механизмов важно не только в познавательном, причинном и прогностическом плане. Оно необходимо и в практической работе с высокодисперсными белоксодержащими системами - при производстве биологически активных препаратов, получении чистой питьевой воды, в медицинской диагностике и т.п. Все это определяет актуальность тематики исследования.

Обычно при практическом изучении ВВССБС проводят компонентный анализ с последующей постановкой модельных экспериментов над индивидуальными компонентами при варьировании отдельных факторов, либо с организацией многофакторных исследований. В представленной работе предлагается иной подход. Он основан на экспериментальном определении функциональных характеристик состояния и поведения компонентов, несущих обобщенную информацию о системе на выбранном уровне ее структурной организации, на установлении физико-химической природы определяющих их причин. Возможность выбора таких «носителей информации» связана с тем, что электроповерхностные свойства взвешенных частиц отображают состав и свойства поверхностно активных (в том числе белковых) молекулярно растворенных соединений, а также веществ, диссоциированных на ионы; в свою очередь, электроповерхностные свойства определяют силы взаимодействия между частицами, т.е. возможность и характер их агрегации.

Цель настоящей работы состояла в разработке, аппаратурно-методическом оформлении и реализации подхода к изучению водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем экологического и медицинского назначения.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

1. сформулировать принципы и разработать концепцию подхода к изучению ВВССБС;

2. создать аппаратурно-методический комплекс для регистрации высоко дисперсных белоксодержащих частиц с возможностью определения их концентрации, размера, электрокинетических свойств, распределения частиц по этим показателям;

3. выбрать методы и материалы для фракционирования и концентрирования компонентов ВВССБС, не повреждающие их структуру, и разработать на их основе методики целевой трансформации систем для их перевода на определенный уровень структурной организации;

4. обосновать выбор информативного набора физико-химических характеристик ВВССБС, которые следует определять для разных уровней их структурной организации;

5. на примере ВВССБС, значимых для медицинской биотехнологии и экологии, продемонстрировать научно-практические возможности разработанного подхода и созданного аппаратурно-методического комплекса.

На основании анализа литературных данных, а также результатов собственных экспериментальных исследований, обоснован и разработан комплексный подход к изучению ВВССБС экологического и медицинского назначения, включающий: а) трансформацию (структурное упрощениеj исследуемой системы, проводимую для получения информативного уровня ее структурной организации; б) формирование на новом уровне структурной организации одной или нескольких систем сравнения, различающихся по заданному признаку; в) экспериментальное определение функциональных характеристик взвешенных частиц, отражающих их электрокинетические свойства и поведение при агрегации; г) анализ суммарного содержания полученных характеристик с учетом уровня организации трансформированной системы.

Созданы и методически обеспечены высокочувствительные установки на основе методов микроэлектрофореза (МЭФ) и поточной ультрамикроскопии (ПУМ), что позволяет: регистрировать коллоидные частицы размером более 65 нм (при относительном показателе преломления, равном 1,20); различать агрегаты из двух, трех частиц и образования в виде «гроздьев»; определять распределение по размерам и по электрофоретической подвижности, получать первое показание через 5 минут (ПУМ) и через 10 минут (МЭФ) после приготовления дисперсии. Пределы определяемых концентрации составляют см' (без разбавления), относительная погрешность измерения - 5-10%.

На примере конкретных дисперсий обоснованы определяемые функциональные характеристики для разных уровней структурной организации ВВССБС.

Для трех уровней структурной организации ВВССБС на трех конкретных типах высокодисперсных белоксодержащих систем продемонстрированы возможности разработанного подхода с получением информации о физико-химической природе и процессах структурных изменений.

Представленная работа - ее результаты и выводы, можно рассматривать как вклад в развитие нового научного направления в биофизике и в биоколлоидной химии, изучающего неравновесные процессы в высокодисперсных структурно сложных системах, содержащих биологически активные компоненты.

Разработанный в диссертации, аппаратурно и методически обеспеченный, комплексный подход как раз позволяет изучать механизмы молекулярных, надмолекулярных и межчастичных процессов, происходящих в ВВСС системах с участием белковых (или производных от них) соединений.

С помощью разработанного подхода конкретные системы, значимые для медицины, медицинской биотехнологии и медицинской экологии (дисперсии вируса гриппа, питьевая вода Санкт-Петербурга, моча здоровых людей и больных мочекаменной болезнью), охарактеризованы через набор функциональных физико-химических показателей: Q- рН|,, С-Сэл.к , ц-1 |рн. с , o-Ucp., Cv-Ucp, 1/v-t |рн, с, относящихся к разным уровням их структурной организации. Характеристика электрокинетических свойств, выраженных в виде зависимостей от параметров среды, определяющих строение границы раздела фаз и возможность конформационных перестроек в белковых компонентах, в совокупности с характеристикой агрегативной устойчивости, определяемой электроповерхностными свойствами, дала возможность понять физико-химическую природу процессов, происходящих или ранее произошедших с системами и прогнозировать из поведение в будущем.

Результаты, полученные при разработке и реализации подхода, нашли применение в технологиях производства чистых вирусных препаратов и препаратов белков плазмы крови. Даны рекомендации по физико-химическому определению штаммовых отличий вируса гриппа, выбору вакцинного штамма и предпочтительной технологии очистки и концентрирования вирусов в вакцинном производстве, определению срока годности очищенного вирусного препарата. Получена практически важная информация о коллоидных компонентах питьевой (водопроводной) Санкт-Петербурга в связи с их потенциальной аллергенной и канцерогенной опасностью, о причинах устойчивости коллоидной системы водопроводной воды, об источнике попадания высокодисперсных примесей в водопроводную сеть. Выданы обоснованные экспериментально проверенные рекомендации по мембранному и адсорбционному вариантам удаления коллоидных компонентов. Показана негативная роль коллоидных и молекулярно растворенных компонентов водопроводной воды в технологиях ее обеззараживания путем озонирования или ионообменной фильтрации через ПГС-фильтры, а также в использовании мембранной и ионообменной фильтрации в мониторинге воды по санитарно-бактериологическим показателям. Получены результаты, позволяющие рекомендовать использование предложенного подхода для разработки методики диагностики мочекаменной болезни.

Результаты работы также используются в научно-педагогической практике автора при чтении курсов лекций, ведении лабораторных занятий и НИР по дисциплинам «Физико-химические методы анализа», «Мониторинг окружающей среды», «Инженерные основы защиты природы», «Коллоидная химия», «Физическая биохимия» для студентов кафедры экологических основ природопользования инженерно-строительного факультета, факультета медицинской физики и биоинженерии, кафедры биофизики физико-механического факультета Санкт-Петербургского технического университета.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Молодкина, Людмила Михайловна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Разработан, аппаратурно и методически обеспечен, реализован комплексный подход к изучению водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем, включающий: их целевую трансформацию для получения информативного уровня структурной организации; определение методами микроэлектрофореза и поточной ультрамикроскопии функциональных электрокинетических характеристик и показателей агрегации; анализ суммарного содержания полученных данных в соответствии с уровнем организации трансформированной системы.

2. Показано, что при реализации комплексного подхода на разных уровнях структурной организации высокодисперсных белоксодержащих систем можно выявить, •на уровне предельно упрощенной системы - молекулярные и надмолекулярные (межчастичные) механизмы процессов, происходящих с участием однотипных коллоидов;

•на уровне организации системы с вариантами (по составу и количеству) соотношений между взвешенными и растворенными компонентами - участие молекулярных биокомпонентов в формировании поверхностной структуры взвешенных частиц; •на уровне, отвечающем полидисперсной агрегирующей системе (с обновляющейся дисперсной фазой) - различие или сходство поверхностных свойств частиц ультрадисперсного и высокодисперсного диапазона.

3. Продемонстрированы возможности созданного аппаратурно-методического обеспечения в определении суммарной длительности процессов молекулярного и надмолекулярного взаимодействия, завершающихся структурной перестройкой системы.

4. Показана результативность разработанного подхода в решении фундаментальных и прикладных задач, связанных со значимыми для медицины, биотехнологии, экологии высокодисперными белоксодержащих системами.

5. Установлено, что к вирионам гриппа с микромозаичной структурой поверхности и способностью поверхностных гликопротеидов к конформационным превращениям, применима модель жесткой коллоидной частицы. Их поведение в разных конформационных состояниях можно описывать с позиций теории двойного электрического слоя и теории взаимодействия гидрофобных коллоидов ДЛФО (с учетом или без учета представления о граничных слоях.

6. Установлено, что генетически обусловленные конформационные изменения поверхностных гликопротеидов вирусных частиц проявляются электрокинетически и мотут быть описаны через функциональные электрокинетические показатели £-рН, С,

Сэл-та, Cy-Ucp.

7. Установлено, что конформационные изменения поверхностных гликопротеидов вирусных частиц могут провоцировать процесс структурной перестройки системы вирионов (на уровне межчастичных взаимодействий), которая может быть описана в терминах кинетики агрегации 1/v-t | Рн, см, z.

8. Установлено, что Санкт-Петербургская водопроводная вода принадлежит к определенному типу высокодисперсной структурно сложной белоксодержащей системы с характерным набором функциональных электрокинетических и агрегативных показателей.

9. Установлено, что высокодисперсные примеси водопроводной воды Санкт-Петербурга содержат белковые соединения и гуминовые вещества, определяющие их электроповерхностные свойства и устойчивость системы к агрегации.

10. Установлено, что моча здоровых людей, лишенная низкомолекулярных компонентов (с ММ <6000), может быть охарактеризована как однотипная полидисперсная структурно сложная белоксодержащая система.

11. Установлено, что коллоидные (кристаллоидные) компоненты мочи здоровых людей высокодисперсного и ультрадисперсного диапазона обладают статистически одинаковыми электрокинетическими свойствами и одинаковой, электростатически обусловленной, способностью к агрегации.

12. Решены (показан путь к решению) ряда прикладных задач вакцинного производства, таких как выбор вакцинного штамма, технологии очистки вирусов, выбор адсорбентов, носителей, методов их модифицирования, определение срока годности вакцинного препарата; задач водоподготовки, мониторинга и очистки питьевой воды, диагностики мочекаменной болезни.

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Молодкина, Людмила Михайловна, Санкт-Петербург

1. Методы практической биохимии / Ред. Б. Уильяме, К. Уилсон., М.: Мир, 1978. -270 с.

2. Исследование взаимодействия Bacillus subtilis с частицами коллоидного золота методом ИК-спектроскопии / Ф.Д. Овчаренко, Н.В.Перцев, З.Р.Ульберг и др. // Коллоид, журн. 1987. - Т.49, № 5. - С.898-902.

3. Шифрин К С. Введение в оптику океана. Л., 1983.-277с.

4. Кленин В.И., Щеголев С.Ю., Лаврушин В.И. Характеристические функции светорассеяния дисперсных систем. Саратов, 1977. 176 с.

5. Камминз Г.З. Применение спектроскопии оптического смешения в биологии // Спектроскопия оптического смешения и корреляции фотонов. М.: Мир, 1978. - 287 - 329

6. Mie G. Beitrage zur optik trtiber Medien, speziell kolloidar Metallosungen //Annal. Phys.Leipzig.-1908.-Bd 25,H.25. S. 377-445

7. Ван де Хюлст Г. Рассеяние света малыми частицами: Пер. с англ. М.: Изд-во иностр. Лит., 1961.-536 с.

8. Ю.Лопатин В.Н., Захарова В.А., Сидько Ф Я. Коэффициенты ослабления и рассеяния однородных малых сферических частиц // Рассеяние и поглощение света малыми сферическими частицами. Красноярск, 1978. - С. 19-42 - (Тр. Ин-та/Ин-т физики СО АН СССР)

9. Н.Лопатин ВН., Немченко И.А. Исследование поляризации света, рассеянного «мягкими» малыми сферическими частицами. // Там же. С. 8-11.

10. Лопатин В.Н., Сидько Ф.Я. Индикатрисы и степень поляризации излучения, рассеянного «мягкими» малыми биологическими частицами . Красноярск, 1977. - 33с.

11. Лопатин ВН., Сидько Ф.Я. Введение в оптику взвесей клеток. Новосибирск. Наука. Сиб. отд-ние, 1988. - 240 с.

12. H.Horan Р.К., Wheeles L.L. Quantitative single cell analysis and sorting II Science. 1977. -Vol. 198,N4313. - P. 149-157.

13. Pernick B.J., Wohlers M.R., Mendelsohn J. Paraxial analysis of light scattering by biologocal cells in a flow system // Appl. Optics. 1978. - Vol. 17, N 20, - P. 3205-3215.

14. Hercher М., Mueller W., Shapiro H. Detection and Discrimination of individual viruses by flow Cytometry//J. Chystochem. and Cytochem, 1979. V.27, N1, P. 350-352.

15. Хайруллина А.Я. Исследование биоклеток методами светорассеяния // Распространение света в дисперсной среде. Минск: Наука и техника, 1982. - С.275-292.

16. Приезжев А.В., Романовский Ю.Н. Лазерная доплеровская спектроскопия и ее применение в биологии // Квантовая электрон. , 1978. Т. 5, № 10. - С. 2237-2243.

17. Chen S.H., Holz М., Tartaglia P. Quasi-elastic light scattering from structured particles // Appl. Optics. 1977. - Vol. 16, N1. - P. 187-194.

18. Nossal R. Spectral analysis of laser light scattered from notice microorganism // Biophys. J., 1971,-Vol. 11, N 5. P.341-353.

19. Versmold H., Hartl W. Kinetics of coagulation by dynamic light scattering // J. Chem. Phys., 1984. Vol.79, N 8. - C.4006-4009.

20. Еськов А.П., Арефьев И.М. Дисперсионный анализ вирусных суспензий методом спектроскопии оптического смешения//Вопр. вирусологии. 1980. - Т.25, №1. - С.29-32.

21. Клюбин В В. Метод динамического светорассеяния в исследованиях состава водных дисперсий полимеров / Исследование воды и водных систем физическими методами // Молекулярная физика и биофизика водных систем, вып.7, 1989. С. 181-196.

22. Агрегация дисперсий липополипротеидов по данным светорассеяния / Т.Г.Брагинская, А С. Кузнецов, А.Г.Безрукова и др. / Там же. С. 196-203.

23. Щеголев С.Ю. Физико-химический анализ дисперсных систем на основе спектротурбидиметрии . Автореф. дисс. .д-ра хим. наук., Саратов, 1999. 39с.

24. Дерягин Б.В, Власенко Г Л. Поточный метод ультрамикроскопического измерения частичных концентраций аэрозолей и других дисперсных систем // Доклады АН СССР. -1948. Т. 63, № 2. - С. 155-160.

25. Дерягин Б.В., Чураев В.В., Власенко Г.Я. Поточный ультрамикроскоп с автоматическим счетом аэрозольных частиц //Коллоид, журн. 1961. Т. 23, № 2. - С. 234237.

26. Derjaguin B.V., Vlasenko G.Ja. Flow-ultramicroscopic method of determining the number concentration and particle size analysis of aerosols and hydrosoles // J. Colloid Interface Sci. -1962. Vol. 17, N 7. - P.605-627.

27. Кудрявцева И.М., Дерягин Б.В. Лабораторная установка для измерения концентрации частиц и дисперсионного состава гидрозолей и олеозолей // Коллоид, журн. 1963. - Т. 25, № 6. - С. 739-741.

28. Установка для определения взвешенных частиц в высокочистых жидкостях методом лазерной ультрамикроскопии / Г.Г.Девятых, М.С.Чупахин, В.А.Крылов и др. // Заводская лаборатория. 1980. - Т.46, № 10. - С. 921-922.

29. Бабюк А.Г., Лычников Д.С., Бабюк М.А. Применение монохроматического когерентного источника света в поточной ультрамикроскопии // Коллоид, журн. 1981. -Т. 43, №6. - С. 1146-1150.

30. Мавлиев Р.А., Анкилов АН., Куценогий К.П. Телевизионный анализатор субмикронных аэрозолей // Коллоид, журн. 1983. - Т.43, № 6. - С. 1089-1095.

31. Устройство для измерения концентраций и размеров частиц в жидкостях / С.В.Кузьмин, С.А.Саунин, Ю.А.Сприжицкий и др. // Приборы и техн. эксперимента. -1983, № 1.-С. 165-167.

32. Кузьмин С.В. Особенности определения спектров размеров и концентраций частиц ультрамикроскопическим методом с лазерным освещением // Коллоид, журн. 1984. -Т.46, №2. - С. 355-358.

33. Жуланов Ю.В., Садовский Б.Ф., Петрянов И.В. Использование резонатора ОКГ для повышения чувствительности лазерных аэрозольных спектрометров // Докл. АН СССР. -1975. Т. 222, № 4. - С. 810-812.

34. Лазерный спектрометр субмикронных аэрозолей / Ю.В.Жуланов, Б.Ф.Садовский, И.А.Невский, И.В. Петрянов // Коллоид, журн. 1977. - Т.39, № 6 . - С. 1064-1069.

35. A method for measuring particles and aggregate size distribution in colloidal dispersions / N.Buske, H.Gedan, H.Liebtenfeld et al. // Colloid Polimer Sci. 1980. - Vol.258, N. 11. - P. 13031304.

36. Пат. 4395676 США МКИ G 01 № 27/00 Focused aperture module / J.D.Holinger, M R.Groves, W.RHogg. -N 209611, Заявлено 24.11.80; Опубл. 26.07.83.

37. А.С. 851198 СССР, МКИ G 01 № 15/02. Аэрозольный фотоэлектрический анализатор / К.П.Куценогий, А.Г.Семенов, АН.Анкилов и др. № 2453437/18-25; Заявл. 08.02.77; Опубл. 05.01.81. -Бюл. №1. - С. 28.

38. Umhauer Н. Particle size distribution analysis by scuttered light measurements using an optically defined measuring volume // J. Aerosol Sci. 1983. - Vol.14, N 6. - P.765-770.

39. Чернобережский Ю.М., Голикова E.B. Применение метода поточной ультрамикроскопии для суждения о механизме процесса коагуляции // Коллоид, журн. -Т.34. 1972, № 5. - С.793-795.

40. Чернобережский Ю.М., Гималова И.М., Голикова Е.В. О возможности определения критической концентрации мицеллообразования методом поточной ультрамикроскопии // Коллоид, журн. 1980. -Т. 42, № 5. - С. 1027-1028.

41. Чернобережский Ю.М., Голикова Е.В., Марковский В.М. Агрегация частиц водной дисперсии природного алмаза в растворах цетилтриметиламмоний бромида // Коллоид, журн. 1987. Т. 49, № 6. С. 1200-1201.

42. Иогансон О.М. Агрегативная устойчивость дисперсий оксидов вблизи их точек нулевого заряда. Автореф. дисс. . к.х.н. СПб., 1995. 16с.

43. Дуда Л.В. Агрегативная устойчивость смешанных дисперсных систем, содержащих частицы с различной степенью гидрофильности. Автореф. дисс. . к.х.н. СПб., 1998. 16с.

44. Томах Ю.Ф. Некоторые физико-химические и биохимические признаки нефролитиаза// Урология и нефрология. 1993, № 6. - С. 19-22.

45. Гамаюнов Н.И., Косов В.И., Масленников Б.И. Ионообменные процессы и электрокинетические явления в набухающих природных и синтетических ионитах: Монография. Тверь: ТГТУ. 1999. - 156 с.

46. Либинсон Г.К. Физико-химические свойства карбоксильных катионов. М.: Недра. -1969.

47. Longaworth L.G. Electrophoretic potential of proteins // Can. Chem. Oroc. 1950. -Vol.34, P.204-211.

48. Bier M. Electrophoresis. N.-Y., 1959. 450 p.

49. Гирфанова ТФ. Сравнение электроповерхностных свойств и агрегативной устойчивости неорганических и биологических объектов на примере кварца и клеток Escherichia coli. Автореф. дис.,.канд. хим. наук. - Л., 1985. - 18 с.

50. Электроповерхностные свойства карбоксильного латекса и их анализьна основе модели ионных пар / В.Е.Шубин, И.В.Исакова, М П.Сидорова и др. // Коллоид, журн. -1990.-Т. 52, №5. С. 935-941.

51. Марковский В.М. Электроповерхностные свойства и устойчивость дисперсий алмаза в растворах поверхностно-активных веществ. Автореф. дисс. . канд. хим. наук. -Л, 1991.-20 с.

52. Электроповерхностные свойства и агрегативная устойчивость дисперсий ТЮг и ZrOz / Е.В.Голикова, О.М.Рогоза, Л.М.Щелкунов, Ю.М.Чернобережский У/ Коллоид, журн. 1995. - Т. 57, № 1. - С.25-29.

53. Электроповерхностные свойства и агрегативная устойчивость дисперсий ТЮг и Z1O2/ О.М.Рогоза, Е.В.Голикова, Ю.М.Чернобережский // Коллоид, журн. 1995. - Т. 57, № 2. - С.226-230.

54. Interaction of cations with negatively charged vesicles formed from headgroup modified phospholipids. I Microelectrophoresis У O.Zschorning, K.Arnold, R.Krahl, H.-P.Kertscher //Stud. Biophys. 1987,- Vol. 118, N 1-2. P.35-44.

55. Interaction of cations with negatively charged vesicles formed from headgroup modified phospholipids. IIEPR measurements / O.Zschorning, K.Arnold, RKrahl, H.-P.Kertscher //Stud. Biophys. 1987,- Vol. 118, N 1-2. P.45-51.

56. Толстой НА., Спартаков А.А., Трусов А.А. Электрооптические свойства лиофобных коллоидов. Методика П2-поля, дальнейшее доказательство поверхностной природы жесткого диполя коллоидных частиц// Коллоид, журн. 1967. - Т. 29, № 4. - С. 584-590.

57. Толстой Н.А., Спартаков А.А., Трусов А.А. Жесткий электрический дипольный момент коллоидных частиц // В сб. Исследования в области поверхностных сил. М.: Наука, 1967. С. 56-78.

58. Изучение постоянного электрического дипольного момента коллоидных частиц в полидисперсных коллоидах / В.В.Войтылов, А.А. Спартаков, Н.А.Толстой, А.А.Трусов // Коллоид, журн. 1981. - Т. 43, № 1. - С. 3-8.

59. Войтылов В.В., Кокорин С. А., Трусов А. А Исследование анизотропии электропроводности коллоидов и суспензий, наведенной внешним электрическим полем //Коллоид, журн. 1986. - Т. 48,№ 1. - С. 139-141.

60. Влияние электрического поля на электропроводность дисперсных систем / Войтылов В В., Кокорин С.А., Трусов А.А и др. // Коллоид, журн. 1986. - Т. 48, № 6. -С.1126-1133.

61. Войтылов В.В., Кокорин С.А., Трусов А.А. Исследование поверхностной проводимости и геометрических размеров палыгорскита в воде / Межведомственный сборник. Исследование воды и водных систем физическими методами. Л.: Изд-во ЛГУ. -С.216-223.

62. Шатаева Л.К., Кузнецова Н.Н., Елькин Г.Э. Карбоксильные катиониты в биологии. Л: Наука, 1979. -286 с.

63. Коликов В.М, Мчедлишвили Б.В. Хроматография биополимеров на макропористых кремнеземах. Л.: Наука, 1986. - 190 с.76.0стерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот . М.: Наука, 1985. -536 с. - 320 с.

64. Измайлова В.Н., Ямпольская Г.П., Сумм Б.Д. Поверхностные явления в белковых системах. М.: Химия, 1988. 240 с.

65. Золотарев В.М., Лыгин В.И., Тарасевич Б.Н. // Успехи химии,- 1981. -Т.1, №1. С.24-53.

66. Г.Л.Грановская, А.А.Мазо, В.П.Мелешко, Г.В.Славянская //Теория и практика сорбционных процессов // Тр. Воронеж. Ун-та. -1971. Вып. 5. - С. 46-51.

67. Мамченко А.В. Сорбция гумусовых соединений ионитами .// Химия и технология воды, 1993. Т. 15, № 4. - С. 270-294.

68. Джавец Э., Мельник Дж.Л., Эйдельберг Э.А. Руководство по медицинской микробиологии. Т.З : Пер. с англ. М.: Медицина, 1982. - 448 с.

69. AminofF D. Methods for the quantitative estimation of N-acetylneuraminic acid and their application to hydrolysates of sialomucoids. Biochem, J., 1961, Vol.81, N2. - P.384-392.

70. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. : Пер. с англ. М.:Мир. 1976. -364 с.

71. ТурковаЯ. Афинная хроматография. М., 1980. -471 с.

72. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высш. школа, 1980. -272 с.

73. Floyd R., Sharp D.G. Aggregation of poliovirus and reovirus by dilution in water // Appl. and Environ. Microbiol. 1977. - Vol. 33, N1. - P. 159-167.

74. Floyd R., Sharp D.G. Viral aggregation: quantitation and kinetics of the aggregation of poliovirus and reovirus// Appl. and Environ. Microbiol. 1978. - Vol. 35, N6. - P. 1079-1083.

75. Floyd R, Sharp D.G. Viral aggregation: effects of salts on the aggregation of poliovirus and reovirus at low pH// Appl. and Environ. Microbiol. 1978. - Vol. 35, N6. - P. 1084-1094.

76. Floyd R, Sharp D.G. Viral aggregation: buffer effects in the aggregation of poliovirus and reovirus at low and high рНУ/ Appl. and Environ. Microbiol. 1979. - Vol. 38, N3. - P.395-401.

77. Nayak Debi P., Lamb R.A. Synthesis of influenza virus components in vivo and in vitro // Optionsfor the contrio of influenza. Proc. Virstok. Ucla Symp. (Keystone, Colo, Apr. 20-25, 1985). -N.I., 1986. P. 501-508.

78. Жилинская И.Н. Структура вируса гриппа // Успехи современной биологии. 1983.Т. 95, № 3. - С. 373-382.

79. Харитоненков И.Г. Структура липидной оболочки миксовирусов // Вопр. вирусологии. 1980, № 6. - С. 654-662.

80. Харитоненков И.Г. Структура и функциональная роль углеводного компонента вируса гриппа //Вопр. вирусологии. 1981, № 3. - С. 262-271.

81. Шульц И.Т. Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин // Вирусы гриппа и грипп / Под ред. Э.Ф. Кильбурна. М.: Медицина, 1978. - С. 75-108.

82. Букер Д., Палейзи П. Биологически активные белки вируса гриппа. Нейраминидаза //Тамже. С. 109-155.

83. Шоппин П.В., Компанс Р.В. Структура вируса гриппа// Там же. С. 33-74.

84. ЮО.Тихоненко Т.И. Биохимия вирусов. М.: Медицина, 1966. - 295 с.

85. Ивков В.Г., Берестовский Г И. Динамическая структура липидного слоя. М.: Наука, 1981.- 293 с.

86. Тихоненко Т.И.Методические основы биохимии вирусов. М.: Медицина, 1973. -334 с.

87. ЮЗ.Ленинджер А. Биохимия. Мир.:, 1974, - 960 с.

88. Тихоненко Т.И. Химический состав и биохимическое строение вирусных частиц. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. М., 1962. - Т.2. - С. 260-331.

89. Синяков М.С., Харитоненков И.Г. Гемагглютинин типа НЗ вируса гриппа : конформация в растворе // Вопр. вирусологии. 1980, № 1. - С.45-49.

90. Генетика вируса гриппа: Пер с англ. / Под ред. П.Пейлиза и Д.У.Кингсбери. М.: Медицина, 1986. - 336 с.

91. Changes in the morfology of influenza particles induced at low pH / R.W.H.Ruigrok, A.F.M.Cremers, A.K.P.Beyer, de Ronde-Verloop // Archives of Virology. 1982. - Vol.82, N 34. - P.181-194.

92. On the entry of semliki forest virus into BHK-2I cells / A.Helenius, J.Kartenbeek, K.Simons, E.Fries //J.Cell. Biol. 1980. Vol.84. - P.404-420.

93. Vaananen P., Kaariainen L. Fusion and haemolysis of erythrocytes caused by three togaviruses: semliki forest virus, sindbis and rubella // J. Gen. Virol. 1980. - Vol. 46. - P. 467475.

94. O.White J., Helenius A. PH dependent fusion between semliki forest virus membrane and liposomes//Proc. Natt. Acad. Sci. USA, 1980. Vol. 77. -. 3273-3277.

95. Otero M.J., Carrasco L. Proteins are cointernalised with virion particles during early infection // Virology. 1987. - Vol. 160, N 1. - P. 75-80.

96. Huang R.T. et al. Influenza virus causes haemolysis and fusion of celles / R.T. Huang, RRott, K.H.-D.Klen // Virology. 1981. Vol. 110. - P 243-247.

97. Maeda Т., Ohnishi S.-I. Activation of influenza virus by acidic media causes haemolysis and fusion of erythrocytes // FEBS Lett. 1980. - Vol. 122. - P. 283-287.

98. Infection entry pathway of influenza virus in a canino kidney cell line / K.S.Matlin, H.Reggio, AHelenius, K.Simons // J. Cell. Biol. 1981. - Vol. 91. - P.601-603.

99. Nussbaum Ofer., Loyter Abraham. Quantitative determination of virus-membrane fusion events. Fusion of influenza virions With plasma membranes and membranes of endocytic vesicles in living cultured cells //FEBS. Lett. 1987. - Vol. 221, N 1. - P.61-67.

100. Analysis of the antigenicity of influenza virus haemogglutinin at the pH optimum of virus mediated membrane fusion / R.A.Daniels, A.R.Douglas, J.J.Skehel, D.C.Wiley //J. Gen. Virol. -1983. -V. 64. P. 1657-1662.

101. Hemolytic activity of influenza virus hemagglutinin glycoprotein activated in mildly acidic environments / S.B.Sato, K.Kawasaki, S.-I.Ohnishi // Proc. Natl. Acad. Sci. USA- 1983. Vol. 90. -P.3153-3157.

102. Changes in the conformation of the influenza virus hemagglutinin at the pH optimum of virus mediated membrane fusion / J.J.Skehel, P.M.Bayley, E.B.Brown et al. // Proc. Natt. Acad. Sci., USA. 1982. -V. 79. - P.968-972.

103. Changes in the antigenicity of the hemagglutinin molecule of H3 influenza virus at acidic pH/R/G. Webster, L.E.Brown, D.С.Jacson//Virology. 1983. - Vol. 126. - P,587-599.

104. Тэйлор Д.Ф. Выделение белков // НейратГ., Бэйли К. Белки. М., 1956. - Т. 1. - С.5.

105. MagdofF-Fairchild B.S. Electrophoretic and buoyant density variants of southern bean mosaic virus//Virology. 1967. Vol. 31. - P. 142-153.

106. Тихоненко Т.И. Биохимия вирусных частиц. М.: Медицина, 1977. - 368 с.

107. Методологические проблемы вирусологии / В.М.Жданов, Ф.И.Ершов, Д.К.Львов, М.И.Соколов. -М.: Медицина, 1975. 176 с.

108. Френкель-Конрат X. Химия и биология вирусов: Пер. с англ. М.: Мир, 1972. -336с.

109. Исследование методом спектра мутности агрегации вируса гриппа, вызванной изменением рН / С.В.Ефимов, А Г.Безрукова, Н.В.Катушкина, В.МКоликов // Коллоид, журн, 1987. - Т. 49, № 2 . - С. 345-349.

110. Справочник по свойствам, методам анализа и очистке воды. В 2-х частях. / Л.А.Кульский, Гороновский ИТ., Когановский А.М., Шевченко М.А. Киев: Наукова думка, 1989. 1209 С.

111. Бабенков Е.Д. Очистка воды коагулянтами. М.:Наука, 1977. 356 с.

112. Tomaic J., Zutic V. Humic material polydispersity in adsorption at hydrons alumina // J. Colloid and Interface Sci. 1988. - Vol. 126, N2. - P. 482-492.

113. Маляренко В.В. Природа функциональных групп и сорбционное взаимодействие гуминовых веществ в водной среде. / Химия и технология воды, 1994.-Т. 16, №6. С.592-606.

114. Почвоведение. В 2-х частях/ Г.ДБелицина, В.Д.Василевская, Л.А.Гришина и др. М.: Высш. школа, 1988.-Т.1. 400с.

115. Орлов Д.С. Спектроскопический анализ гуминовых кислот // Почвоведение, 1966, №11. С. 16-19.

116. Масленников Б.И. Исследование электрокинетических свойств гуминовых кислот: Автореф. дис. . канд. техн. наук. Калинин, 1979. 19с.

117. Масленников Б.И. Физико-химические основы ионного обмена и сорбции катионов на торфе и гуминовых кислотах: Автореф. дисс. . . д-ра техн. наук. Тверь, 1994.

118. Белами Л.И. Инфракрасные спектры сложных молекул. М., 1963. 480с.137,Schnitzer М., Shimer S. Organometalilic interaction in soil. 1. Reaction between a numberof metal ions and organic matter of pedsol Bh horizon // Soil Sc., 1963. V.96, N2. - P.86-89.

119. Шульман Ю.А. Исследование ионизации гуминовых кислот и взаимодействия их с катионами: АвтЬреф. дисс.,. канд. хим. наук. М., 1968. 20 с.

120. Лиштван И.И., Круглицкий Н.Н., Третинник В.Ф. Физико-химическая механика гуминовых веществ. Мн.: Наука и техника, 1976. 367 с.

121. Комиссаров И.Д., Логинов А.Ф., Федченко О.И. Особенности ионизации карбоксильных групп гуминовой кислоты // ЖФХ, 1962, №4. С.36.

122. Славинская Г.В., Мирошникова З.П., Зенина Т А. Изучение строения водных фульвокислот методом ИК-спектроскопии / Теория и практика сорбционных процессов. Вып. 15, 1982. -С.17-19.

123. Fu P.L.K., Symons J.M. Removing aquatic organic substanses by anion exchange resins // J. Americ. Water Works Assoc.-1990.-V.82, N10,- P. 70-77.

124. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. 238 с.

125. Волощук В.В. Исследование электрофоретических фракций гуминовых кислот из высокогорного торфа. Автореф. дисс. . канд. хим. наук., 1975. 33с.

126. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв. М.: Изд-во МГУ, 1974. 333с.

127. Stevenson F.J., Stability constants of Cu2+, Pb 2+ and Ca2+ complexes with humic acids / Soil Sc. Amer. J., 1976. V.40, N5. - P.665-672.

128. Влияние степени замещения неорганическими катионами водорода карбоксильных групп гуминовых кислот и их адсорбционные свойства / В. Ю. Третинник, В.В.Пархоменко, А.С.Новоторов и др. //Коллоид, журн., 1969. Т.31, №1. - С. 131-135.

129. Кадошников В.М., Куковский Е.Г. О взаимодействии гуминовых кислот с каолинитами различной степени кристалличности / Укр. хим. журн., 1973 . Т.39, №2. -С.168-171.

130. Tan К. A. The catalytic decomposition of clay minerals by complex reaction with humic andfalvic acid // Soil Sci., 1975. V.120, N3. - P.188-194.

131. Электрокинетическая характеристика гуминовых веществ. / Н.Н. Круглицкий и др. //Укр. хим. журн., 1972. Т.38, №11. - С. 1130-1132.

132. Гамаюнов Н.И., Масленников Б.И, Шульман Ю.А. Изучение ионообменных свойств гуминовых кислот электрокинетическим методом // Гуминовые удобрения. Киев, 1983. Т.8. -С.67-70

133. Гамаюнов Н.И., Масленников Б.И, Шульман Ю.А. Равновесие и кинетика ионного обмена в гуминовых кислотах // Почвоведение. 1986, №11.- С.56-59.

134. Гамаюнов НИ, Масленников Б.И, Шульман Ю.А. Ионный обмен в торфе //VIII Междунар. конгресс по торфу. Л., 1988. С. 19-24.

135. Масленников Б.И О взаимодействии гуминовых кислот с катионами поливалентных металлов // Почвоведение. 1989, №7 С. 129-133.

136. Гамаюнов Н.И., Масленников Б.И Электрокинетические свойства гуминовых кислот и торфа // Почвоведение. 1990, №4,- С.55-59.

137. Гамаюнов НИ, Масленников Б.И, Шульман Ю.А. Сорбционные свойства гуминовых кислот// Почвоведение. 1992, №1,- С. 113-116.

138. Гамаюнов НИ., Масленников Б.И, Шульман Ю.А. Исследование электрокинетических свойств водных суспензий гуминовых кислот // Докл. высш. шк.: Биолог, науки, 1991, №10. С.66-70.

139. Ardakani M.S., Stevenson F.J. Modified ion exchange method by determined of Constant stability complexes of organic matter with metals //Solid Sc.Soc.Am.Proc.,1972. V.36, N6,- P. 6.

140. Физикохимия торфа / И.И. Лиштван, Е.Т.Базин, Н.И.Гамаюнов, А.АТерентьев. М.: Недра, 1989. 304 с.

141. Gamauynov N.I., Maslennikov В.I., Shulman Ju.A. Equilibrium and kinetic of ionexchange in humic acids //Sov. Soil Sci. 1990. P.38-42.

142. Gamauynov N.I., Maslennikov B.I. Electrical properties of humic acids and peat // Sov. Soil Sci. 1990. -P.48-52.

143. Gamauynov N.I., Maslennikov B.I. Mechanism of interactions of cations with the adsorption complex of peat soil // Eurasian Soil Sci., 1992. V.7. P.32-37.

144. Gamauynov N.I., Maslennikov B.I. Sorption properties of humic acids // Eurasian Soil Sci., 1992. V.4. P. 122-126.

145. Гамаюнов НИ., Масленников Б.И Механизм взаимодействия катионов с поглощающим комплексом в торфяной почве // Почвоведение, 1992, №3. С. 146-151.

146. BeanL.L., Bull Engug and Grehit, 1966. N46. - P.56.

147. Березов ТТ., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1998. 704 с.

148. Козинец Г.И. Интерпретация анализов крови и мочи. С-Пб., 1997. 124 с.

149. ВайнбергЗ.С. Камни почек. Москва: Медицина. 1971. С.50-53.

150. Значение суточных колебаний рН мочи в распознавании химического состава мочевых камней / П.С.Серняк, В.М. Билооров, Л.М.Литвиненко и др. // Урология и нефрология. 1984., №3. С.21-26.

151. Концентрация водородных ионов мочи как один из патогенетических факторов мочекаменной болезни / Единый Ю.Т., Дзюрак B.C., Желтовская Н.И. и др. // Врачебное дело, 1987, № 12. С. 57-59.

152. Метод определения фибринолитической активности мочи // Лабораторное дело. -1987, № 5. С. 355-356.

153. Charlton С.A. //Lancet. 1967,- Vol. 3. - P. 1199-1200.

154. Жила В В., Крикун А.С. Характер изменения гомеостаза у больных нефролитиазом // Урология и нефрология. 1991, № 3. - С. 8-11.

155. Единый ЮГ, Дзюрак B.C., Желтовская Н.И. Протеолизно-ионная теория патогенеза почечно-каменной болезни // Урология и нефрология. 1989, № 6. - С. 37-40.

156. Козловский Ю.Г., Ярыгин ВН., Шокарев М.М. Коллоидный фосфат кальция (коллофан) в составе мочевых камней // Урология и нефрология. 1977., № 4. - С. 27-32.

157. Буткевич О.В. Взаимодействие почечных камней с растворами комплексующих реагентов различной природы: Автореф. дисс.канд, хим. наук. Л.: 1989. 16 с.

158. Чугай А.В. Физико-химические основы определения химического состава почечных камней: Автореф. дисс.канд. хим. наук. Донецк, 1989. 18с.

159. Миронов О.Л. Химический состав почечных камней и фракционный состав белков сыворотки крови и мочи: Автореф. дисс.канд. хим. наук. Донецк, 1991. 18с.

160. Шатохина С.Н., Шабалин В.Н. Ранняя диагностики уролитиаза, определение степени его активности и состава камнеобразующих солей мочи (система ЛИТОС) // Урология и нефрология. 1998, №1. - С. 19-23.

161. Шатохина С.Н., Шабалин В.Н. Феномен патологической кристаллизации камнеобразующих солей мочи при уролитиазе// Урология и нефрология. -1998, №2. -С. 16-20.

162. Еремеев Г.П. Биохимия развивающегося яйца птицы. Омск, 1969. - 30 с.

163. Флеров Г.Н., Барашенков B.C. Практическое применение пучков тяжелых ионов //Успехи физич. наук. 1974. - Т. 113, № 2. - С. 351-373.

164. Изучение электрофоретической подвижности вирусов гриппаА1(Ленинград) и АЗ(Ленинград) / Л.М.Молодкина, В.М Молодкин, О.А. Вострюхина и др. // Коллоид, журн,- 1986.-Т.48, №1- С.83-89.

165. Определение размера частиц вируса гриппа методом поточной ультрамикроскопии / Л.М.Молодкина, Д.Г.Селентьев, Е В. Голикова и др. // Коллоид, журн.-1987.-Т.49, №3,- С.580-583.

166. Wirsema Р.Н., Loeb A.Z., Overbeek J.Jh. Calculation of electrophoretic mobility of a spherical colloid particle // J. Colloid Interface Sri- 1966. Vol. 22. - P. 78.

167. O.Brien R.W., White L.R. Electrophoretic mobility of a spherical colloid particle // J.Chem. Soc. Faraday Trans.II. 1978. - Vol. 74, N 9. - P. 1607-1626.

168. Дерягин Б.В. Теория взаимодействия частиц в присутствии двойных электрических слоев и агрегативной устойчивости лиофобных коллоидов в дисперсных системах//Изв. АН СССР. Сер. хим. 1937, № 5 . - С. 1153-1164.

169. Дерягин Б.В., Ландау Л.Д. Теория устойчивости сильно заряженных лиофобных золей и слипания сильно заряженных частиц в растворах электролитов // Журн. эксперим. итеорет. физики. 1941. - Т.11,№ 2. - С.802-821; 1945. - Т. 15, № 11. -С.663-681.

170. Verwey E.J., Overbeek J.Th.C. Theory of the stability of lyophobic colloids. -Amsterdam: Elsevier Publ. Co.,1948. 321c., 1948.

171. Hogg R, Healy T.W., Fuerstenau D.W. Mutual coagulation of colloidal dispersions // Trans. Faraday Soc. 1966. Vol. 62, N6. - P. 1638-1651.

172. Weisse G.R., Healy T.W. Effect of particle size on colloid stability // Trans. Faraday Soc. 1970. Vol. 66, N 2. - P.490-499.

173. Дерягин Б В., Муллер В.М. О медленной коагуляции гидрофобных коллоидов // Докл. АН СССР. 1967. - Т. 176, № 4. - С. 869-872.

174. Hogg R, Yang K.C. Secondary coagulation // J. Colloid Interface Sci. 1976. - Vol. 56, N3. - P.673-576.

175. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H.Lowry, N.J.Rosebrough, A,L,Farr, R.J.Randall // J. Biol.Chem. 1951. Vol.193, N 1. - P. 265-275.

176. Peterson Garry L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. Which is more generally applicable // Anal.Biochem. 1977. -Vol. 83, N2. - P.346-356.

177. Определение количества белка, иммобилизованного на нерастворимом носителе / Ф.Ф.Дикчювене, И.И.Песлякас, МИДачене, А.Б.Паулюконис. //Методы в биохимии. Материалы II съезда биохимиков Лит. ССР (30 окт. 1975 г). Вильнюс. - 1975. - С. 13-15.

178. Хроматографическая очистка и концентрирование аллантоисной культуры вируса гриппа (штамм А2-36 /Виктория-72/) С.Е Бреслер, В.М Коликов, В.М.Молодкин и др. Тр.НИИЭМ им.Пастера.-Л., 1973.-Т.42: Респираторные вирусные инфекции,- С.22-25.

179. Ермакова Л.Э., Жура НА., Сидорова М.П. Адсорбция потенциалопределяющих ионов на пористых стеклах в растворах 1:1,2:1 и 3:1 -зарядных электролитов. // Коллоид, журн. 1993,- Т. 55, № 1. - С. 62-66.

180. Жура Н А., Ермакова Л.Э., Сидорова М.П. Структурные и электрохимические характеристики пористых стекол в растворах различных электролитов // Коллоид, журн. -1993. Т. 55, №1. - С. 67-71.

181. Сидорова М.П., Ермакова Л.Э., Жура Н.А. Расчет характеристик двойного электрического слоя пористых стекол из электрокинетических измерений // Коллоид, журн. 1993. -Т. 55, №2. - С. 148-153.

182. Жидкостная ситовая хроматография вируса гриппа на модифицированных пористых стеклах / Б.В. Мчедлишвили, С.П. Жданов, Н.В. Катушкина и др. // Тр.НИИЭМ им.Пастера. Л., 1976.-Т.47: Убитая гриппозная вакцина. - С.43-49.

183. Молодкина Л.М., Мчедлишвили Б.В. Методика модифицирования макропористых кремнеземов поливинилпирролидоном / Тр.НИИЭМ им. Пастера. Л., 1979. - Т.52: Этиология и специфическая профилактика гриппа. - С.92-95.

184. Способ получения пористого кремнеземсодержащего материала для хроматографии биополимеров / С.В.Макарова, В.М.Коликов, А.С.Телегин и др. // А.с.747513 СССР,МКИВ 01 1/222,В 01 15/08,С12 13/06.-№ 2578926/23-26;3аявл. 15.02.78; Опубл. 15.07.80,- Бюл.№26.

185. Структура, адсорбционные и хроматографические свойства макропористых стекол, модифицированных полимеризацией N-винилпирролидона / Б.В. Мчедлншвили, А.М. Смирнов, О.Н. Мертвужина и др. // Коллоид, журн,-1984.-Т.46, № 1. С. 132-136.

186. Способ приготовления сорбента / В.Н. Борисова, С.Е. Бреслер, Н.С. Головина и др. // А.с.671385 СССР МКИ С12 К7/00, С01 В 33/00.-№ 2523515/28-18;Заявл.31.08.77; Опубл. не подлежит.

187. Способ получения сорбента / В.М Коликов, С.Е.Бреслер, Н.В.Катушкина и др. //

188. A.с.963156 СССР,№ 2461698; Заявл.09.0377; Опубл. не подлежит.

189. Способ получения сорбента для очистки вирусных суспензий / В.Н.Борисова,

190. B.М.Коликов, И.Н.Красильников и др. // А.с.811664 СССР МКИ В 01 20/10, С 12 7/00.-№2826410/23-6; Заявл. 26.07.79; Опубл. не подлежит.

191. Адсорбция и хроматография вирусов на модифицированных макропористых кремнеземах / С.Е. Бреслер, В.И. Борисова, А.И. Кёстнер и др. //1 Всесоюзн. симп. по молек. и жидк. хроматографии / Дзержинск, 15-20 окт. 1979/: Тез. докл.- Дзержинск, 1979.-С.55.

192. Очистка суспензии вирусов гриппа на модифицированных макропористых кремнезёмах / В.И.Борисова, В.М. Коликов, Б.В. Мчедлишвили и др. //I Всесоюзн. конф. «Хроматография в биологии и медицине» /Москва, 21-25 нояб.1983/. Тез. докл .-М., 1983. -С. 156-157.

193. Макарова С.В., Мчедлишвили Б.В, Молодкина Л.М. Модифицированные макропористые стекла для хроматографии биополимеров. // Там же С.286-287.

194. Способ получения вакцины / С.Е. Бреслер, Н.В. Железнова, Н.В. Катушкина и др. И А.с.579309 СССР МКИ С12 К 5/00.-№1967101/28-13; Заявл. 16.11.73; опубл. 05.11.77, Бюл.№41.

195. Method ofproducting vaccines / S.E.Bresler et al. //Pat. 4071619 (USA).

196. Verfahren zum herstellung von vakzinen / S.E.Bresler et al. // Pat. 114615 (DDR).

197. Zpusob vyroby vakcin / S.E.Bresler et al.// Pat. 17211 l(Chekoslovakiya).

198. Procede de preparation de vaccins / S.E.Bresler et al.//Pat. 2251334 (France).

199. Verfahren zum herstellung von inaktivierten imfstoffen gegen viruskrankheiten / S.E.Bresler et al. // Pat 2452919 (FRG)

200. Method for producting vaccines / S.E.Bresler et al. // Pat. 1032509 (Japan).

201. Eljaras vakcinak eloallistasara / S.E.Bresler et al. // Pat. 175489 (VNR).

202. Satt ett framstalla ett vaccin/ S.E.Bresler et al. 11 Pat.418573 (Sweden).

203. Production of vaccines / S.E.Bresler et al. // Pat. 14416107 (UK).

204. Катушкина H.B. Явление критической адсорбции вирусов на макропористых силикатных сорбентах и его применение. Автореф. дисс. канд. физ-мат. наук . - Л.,1975. - 19с.

205. Молодкин В.М. Промышленная хроматография вирусов на макропористых кремнеземах в технологии получения вакцинных препаратов. Автореф. дисс. . канд. техн. наук. - Л.,1987. - 16с.

206. Вострюхина О. А. Равновесие и кинетика сорбции вирусов на макропористых кремнеземах в получении вакцинных и диагностических препаратов. Автореф. дисс. канд. хим. наук. - Л,, 1989. - 20с.

207. Хохлова Т.Д., Мчедлишвиди Б.В. Адсорбция белков на трековых мембранах // Коллоид, журн. 1996. -Т. 58, № 6. - С. 846-848.

208. Биотехнологические приложения трековых мембран / О.Л Власова., Л.М. Молодкина, В.М.Коликов, Б.В. Мчедлишвили. // Там же,- С.73.

209. Власова О.Л., Молодкина Л.М., Вовк М.П. Разработка перспективных методик использования плазмофильтров на основе трековых мембран // Научно-технические ведомости СПбГТУ, 1998, №2-3 (12-13) . С.128-132.

210. Адсорбция коллоидных примесей водопроводной воды и фульвокислот на активированных углях, полученных формованием ультрадисперсных порошков / Л.М.

211. Молодкина, М.П.Вовк, Д.В.Федорович, В.М.Коликов // II Международный конгресс «Вода: экология и технология ЭКВАТЭК-96» / Москва, 17-21 сент. 1996/, М. С.228-229.

212. Адсорбция органических веществ из воды / АМ.Когановский, Н.А.Клименко, Т.М.Левченко, И.Г.Рода. Л.: Химия, 1990. - 256 с.

213. Регламент производства вакцины гриппозной хроматографической инактивированной жидкой №124-79 УОП 616. 9211.5-085.371. Введ. МЗ СССР Группа Р-11 Коллектив авторов НИИЭМ им.Пастера и ЛПИ им.Калинина.

214. ДерягинБ.В., Чураев Н.В. Смачивающие пленки. М.: Наука, 1984. -160 с.

215. Surface electrochemistry and aggregative stability of influenza virus dispersion / E.V.Golicova, L.M Molodkina, V.M. Kolikov, Yu.M. Chernoberezhsky // 33-d IUPAC Congress /Budapesht,Aug. 17-22, 1991/Abstr. -P.27.

216. Flow ultramicroscopy investigation of the aggregative stability of influenza virus dispersions L.M.Molodkina, E.V Golicova,. Yu.M. Chernoberezhsky, V. M. Kolikov // Colloids and surfaces A:Physico-chemical and engineering aspects, 1995. P. 1-9.

217. Молодкина Л.М. Изучение структуры биоминеральных дисперсий экомедицинской принадлежности на базе методов микроэлектрофореза и поточнойультрамикроскопии // Тез. докл. II съезда биофизиков России /Москва,25-27 авг. 1999г./, Москва, III т.,IX.62 С.696.

218. Молодкина JIM., Коликов В.М. Комплексный подход к изучению высокодисперсных структурно сложных биоминеральных систем // Научно-технические ведомости СПбГТУ. 2000., №2 (20). С.58-69.

219. Молодкина Л.М., Голикова Е.В., Чернобережский Ю.М. Вариация электрофоретической подвижности частиц вируса гриппа различных штаммов // 2-я междунар.конф. «Биоколлоид 95» /Киев, 20-22 июня 1995/. Тез. докл.- Киев,1995. -С.12.

220. Карнаухов А.И., Безнис А.Т. Бионеорганическая химия. Вища шк., 1992. - 223 с.

221. Nir S.,Rein R.,Weiss L. On the applicabilityof certainapproximation of the Lifshits theorytonthin films //J.Theor. Biol. 1972. - Vol.34.- P. 135-153.

222. Visser J. Hamaker constants, a comprisen between Hamaker constants and Lifshits-van-der-Vaalsconstants //Adv. Colloid. Interface Sci. 1972,- V.3, P. 331-363.

223. Исследование устойчивости частиц вирусов гриппа в растворах электролитов / Ю.М Чернобережский, Е.В. Голикова, Л.М.Молодкина и др. // VIII международн. конф. по поверхн силам / Москва, 3-5 дек. 1985/.Тез.докл.,1985. С.30.

224. Определение размера частиц вируса гриппа методом поточной ультрамикроскопии / Л.М.Молодкина, Д.Г.Селентьев, Е.В. Голикова и др. // Коллоид. журн.-1987.-Т.49, №3,- С.580-583.

225. Исследование агрегации вирусов гриппа А1 в растворах NaCl / Л.М.Молодкина, Д.Г.Селентьев, Е.В. Голикова и др // Коллоид. журн.-1988.-Т.50, №5,- С.848-854.

226. Кинетика коагуляции дисперсии вируса гриппа в растворах NaCl / Е.В. Голикова, Л.М.,Молодкина, Ю.М. Чернобережский и др. // Междунар. конф. по поверхн. силам /Москва,13-15 нояб. 1990/ :Тез . докл.-М., Наука, 1990. С.56-57.

227. Islam А.М., Chowdhry B.Z., Snowden M.J. Heteroaggregation in colloidal dispersions//Advanced in Colloid and Interface Science. 1995. V.62. P. 109-136.153

228. Об особенности кинетики коагуляции дисперсии вируса гриппа в 0,1 М растворе NaCl / Л.М.Молодкина, Л.И Арабова, Е.В.Голикова, Ю.М. Чернобережский // Коллоид. журн.-1989.-Т.51, №5. -С. 618-619.

229. Singer P.S. Assessing ozonation research needs in water treatment // J Amer. Water Works Assoc. 1990. - Vol. 82, N 10. - P.78-88.

230. Formation of cancerogenic trihalometanes in the drinking water / K S.Mundhare, P.D.Mendel, J.E.Hanley et al. // Abstr. Pap. Pitsburg Conf. and Expos. Anal. Chem. And Appl. Spectrosc. (Neworlean, 25, Febr. 1, March- 1985). -Neworlean, 1985. - P.378.

231. Kodzi J. Contents and distribution of concentration of haloorganic compounds in river Waters //Emicon. Concern. Eng. 1992. Vol.21, N 5. - P.45-50.

232. Грановская Г. А. Сорбция гуминовых кислот и фульвокислот из природных вод макропористым ионитом. Автореф.дисс. . к.х.н. Воронеж, 1969 16 с.

233. Славинская Г.В., Кузнецова Н.С., Зеленева Л.А. Сорбция фульвокислот природных вод анионитами // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж, 1982. - вып. 15. - С. 39-42.155156

234. Рис. П 6 Зависимости обратной счетной концентрации (1/v) частиц вируса гриппа А1Киев от времени (t) в растворах NaCl 10"3 М (а), 10"2 М (б) и 10"1 М (в) при различных значениях рН. На врезках начальные участки.160161