Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вирусная инфекция в культуре гриба Fusicoccum amygdali del. и её влияние на микробный синтез фузикокцина

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Вирусная инфекция в культуре гриба Fusicoccum amygdali del. и её влияние на микробный синтез фузикокцина"

на правах рукописи УДК 582. S8.017:578.85/86

ДАДАШЕВА ИРИНА НАНАХИМОВНА

"ВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ В КУЛЬТУРЕ ГРИБА FUSICOCCUM AMYGDALI DEL. И ЕЕ ВЛИЯНИЕ НА ВДКРОБНЫИ СИНТЕЗ ФУЗИКОКЦИНА"

(03.00.24 - микология)

АВТОРЕФЕРАТ'

диссертации на соискание ученой степени глндидата биологических наук

V ™ Г П

- ( Ь И

2 3 fi-.ia

C'il и

Москва - 1995

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН и в "лаборатории антибиотиков Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научные руководители

Официальные оппоненты

академик РАСХН Г.С.МУРОМЦЕВ

ст.н.с-., к.б.н.

Р. А. МАКСИМОВА

доктор биологических наук, М.В¡БИБИКОВА

кандидат биологических наук, -В.Г.ДОВАХИЯ

Ведущее учреждение

РЭА им. Г.В.Плеханова

Защита состоится " ЛЗ "_1996г. в -л? час

на заседании специализированного совета Д.053.05.65..при МРУ км. М. В.Ломоносова по адресу: 119899, г.Москва, Ленинские Горы, (ЛГУ, Биологический факультет

Автореферат разослан

// ■■ Х/^ЛА^ 1996г.

Ученый секретарь специализированного.совета,, кандидат биологических наук С.Н.ЛЕКОЩЕВА

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. При разработке биотехнологических процес-. . сов получения различных биологически ак-

тивных веществ большое внимание уделяется работе со штаммами. Разработаны специальные требования к штаммам-продуцентам, такие как высокая продуктивность и скорость роста, фаго- и вирусоустойчивость, устойчивость к повышенным температурам и кислотности среды, стабильность наследования ценных признаков, способность усваивать дешеЕые и доступные субстраты и продуцировать измененный состав . компонентов биологически активных веществ. Для этих целей используют-различные методы селекции, клеточной и генной инженерии.

Одной из ватлых проблем при работе с микроорганизмами - продуцентами биологически активных веществ является сохранение их биосинтетической активности и жизнеспособности. Эти свойства могут быть обусловлены различными факторами. В частности, в некоторых случаях для грибов это может быть связано с вирусной инфекцией. Роль вирусов при этом может быть' весьма разнообразной: от воздёйствия на активность и снижения жизнеспособности, вплоть до гибели штампов. Проблема своевременного обнаружения вирусной инфекции затруднена тем, что миковирусы в большинстве случаев осуществляют латентную инфекция и не вызывают цитопа-тического действия на своих хозяевах.

Одним из новых высокоэффективных регуляторов роста растений сиро-кого спектра действия является фузикокцин (ФК) - метаболит фитопато-генного гриба Fusicoccum anïygdali Del. (Класс Deutérëmycetes, порядок Sphaeropsidales). В 1У86 году ФК А был обнаружен в _ высших растениях (Муромцев,1980;Муромцев и др.,1387).Низкая концентрация Ж в растениях хорошо коррелирует'с высоким уровнем его физиологической активности, которая на 1-2 по ряда» выше, чем у известных фитогормонов ■•(гибберел-лина, ауксина, цитокинина). Присутствие ФК А непосредственно в расте-

ниях, а также гормональный характер физиологической активности позволили отнести ФК А к фитогормонам. Фузикокцин, получаемый путем микробного синтеза, .в настоящее время активно используется в растениеводстве и научно-исследовательашх целях как препарат мембранного уровня действия. Потребность в этом веществе возрастает, что обусловливает необходимость разработки высоко эффективных биотёхнологических процессов его получения. Штамм-продуцент фузикокцина аконидиальный. В процессе культивирования меняются исходные свойства штамма: морфология, стабильность, активность. Работа с такими продуцентами, в связи с этим, затруднена и требует разработки специальных методов селекции, поддерживающих культуру. В популяции штамма-продуцента отмечены случаи появления лизисных культур. В связи с этим целесообразно проводить проверку штаммов-продуцентов на присутствие лизогенных факторов, однако такие исследования для Р.ату^аН ранее не проводились.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью настоящей работы являлось выявление

вирусной -инфекции в культуре гриба Р.ашу^аИ и установление ее влияния на микробный синтез фузикокцина. В задачи исследования входили:

1. Анализ культурально-морфологических признаков штамма Р4 Р.атудсЗаН и выявление признаков вирусной инфекции гриба.

2. Разработка экспресс-метода выявления вирусной инфекции в культуре Р.ату^аИ с использованием УФ-облучения. Изучение влияния УФ-облучения на 1С/ль туру гриба и на проявление вирусной инфекции.

3. Разработка методов выделения и очистки вирусных частиц (ВЧ) из мицелия Р.атуейаН; электронномикроскопический анализ мицелия и ВЧ, установление морфологии и типа нуклеиновой кислоты ВЧ Р-ату^аН.

4. Установление влияния вирусной инфекции .на образование фузикокцина.

5. Разработка способов оздоровления штамма-продуцента, фузикокцина, пораженного вирусной инфекцией с применением физических, химических и биотехнологических методов. ■ ■

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые для продуцента фузикокцина Р.атуейаП показано присутствие ВЧ в мицелии гриба. Установлено отрицательное влияние ВЧ на уровень фузикокцин-синтезирующей активности продуцента и его куль тураль но- морфологические свойства.

■ Разработал способ выделения и очистки ВЧ из . мицелия Р. ату^аИ, показана морфология, установлен тип нуклеиновой кислоты ВЧ. Впервые проведено электронномикроскопическое изучение ВЧ и мицелия штамма-продуцента фузикокцина, содержащего ВЧ и свободного от них.

Изучено влияние УФ-облучения на культуру гриба, показано стимулирующее влияние ультрафиолетового света на развитие вирусной инфекции.

Показаны возможные пути инактивации ВЧ или освобождения культуры гриба от вирусной инфекции: ингибирование ВЧ под действием термической обработки мицелия, выращивание гриба на средах, содержащих этидий бромид, использование протопластных культур.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Полученные результаты позволили выявить

характерные особенности продуцента фузикокцина, его изменчивость, подверженность вирусной инфекции.

Разработан метод выделения и очистки ВЧ из культуры гриба-продуцента фузикокцина. Установлен морфологический тип, размер и нуклеиновый состав ВЧ Р.аптейаН.

Предложены приемы освобождения культуры гриба ст вирусной инфекции, позволяющие сохранить для производства высокоэффективные штаммы продуцента фузикокшша-.В гачестве экспресс-метода обнаружения вирусной инфекции в культуре Р.апу^аН предложено использовать УФ-облучение. ,

АПРОБАПИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы докладывались: на заседании лаборатории прикладной микологии ВНИИСБ (Москва, 1993), на .заседаниях кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ (Москва, 1990,1995), на конференции "Физиология и биохимия мицелиальных грибов в связи с проблемами биотехнологии" (Москва, 1994). '

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликованы 2 печатные работы.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, описания объекта, материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 16 таблиц, 25 рисунков. Список цитируемой литературы включает 125 наименований, из которых 67 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе били использованы изоляты исходной (мицелиальной) и про-топластной линии штамма F4 F.amygdali коллекции ВНИИСБ и лаборатории антибиотиков МГУ.

Исходную культуру хранили на плотной разбавленной водопроводной водой в три раза среде N1 (г/л: сахароза - 30, NaNÛ3 - 2, MgSÛ4 - 0.5, FeSÛ4 - 0.01, КН2РО4 - 1, КС1 - 0.5. pH 6.0), обогащенной кукурузным экстрактом (10 мл/л), _род вазелиновым маслом при 5°С.

Культивирование и мицелиальный рассев осуществляли на среде N2

(неохмеленное пивное сусло (7°Б) и 20 г/л агара), выращивали в течение » • • < »

5-7 суток при 25°С.

Изучение стабильности морфологических и биосинтетических свойств отдельных изолятов мицелиальной и протопластной линий штамма F4 проводили при пассироваши в течение 6 пассажей и хранении при обычных условиях (+4°С) на поверхности скошенного агара..

Биосинтез фузикокцина проводили при глубинном культивировании продуцента в конических колбах емкостью 750 мл со 100 мл среды, на качалке, при 240 об/мин и 25°С. Биосинтез осуществляли по двухфазной схеме:

- выращивание посёвного мицелия на среде N3, ' содержащей соевую муку' (Краснолольекая, 1982); в течение 48-72 час.

- собственно биосинтез в течение 72-96 час на синтетической среде N4 (Аббасова, 19S8). Иностляцию сред осуществляли из расчета 10 7. посевного материала от объема ферментационной среды.

Концентрацию фузикокцина (мкг/мл) в культуральной лидкости (КК) определяли модифицированным во ВНИИСБ спектрофотометрическим методом Эвиденте (Evidente а. е.,1979).

Для накопления ВЧ культуру гриба "выращивали в 150 мл среды N3 в колбах, на качалке, в течение 3-7 суток, в зависимости от задач, при 25°С. Мицелий отфильтровывали. Фильтрат осветляли 1/7 объемной частью хлороформа, встряхивали в течение 30 мин на качалке, клеточный детрит удаляли центрифугированием (3000g). Надосадочную жидкость (мицелиаль-ный эютракт) использовали в дальнейшей работе или хранили при -4°С.

Осаждение.и очистку ВЧ проводили с помощью охлажденного' этанола, ацетона с последующим замораживанием,. полиэтиленгликши (ПЭГ фирмы "Loba-chemie", М.м.6000), дифференциального центрифугирования. Полученный материал пропускали через систему микрофильтров ("Mllllpora") с ••диаметром пор 0.47, 0.45 и 0.22 нм. ,

* • • «.V « i

Спектрофотометрический анализ проводили на приборе фирмы "Back-man" в диапозоне длин волн 200-300 нм.

• Выделение и очистку ds RNA из мицелия гриба проводили по общепринятой методике (Методы вирусол. и мол. биологии, 1972). :

Микроскопическое исследование проводили при помощи светового микроскопа МБА-1 путем прижизненного окрашивания -мицелия нейтральным красным в разведении 1:2000.

Для электронномикроскопического исследования ультратонких срезов мицелий F.amygdali фиксировали 2,5 Х-ным раствором глутаральдегида и 1 %-ным раствором 0s04 в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8-7,2. Обезвоживание осуществляли в спиртах 30-100 7.. Объект заливали смолой ЭПОНарал-бит. Блоки резали на микротоме фирмы "LKB". Срезы контрастировали 2 £-ным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца. Просматривали в электронном микроскопе "Hitachy Н-500", рабочее увеличение 8 000-60 ООО.

Электронномикроскопическое исследование ВЧ F.amygdali проводили путем нанесения'вирусной суспензии на сетки Для электронной ' микроскопии. Контрастировали 2 %-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты и просматривали в электронных микроскопах "YEOL JEM-100В" "и "Hitachy Н-500", рабочее увеличение 50 000-200 ООО.

уф-облучение изолятов штамма F4 проводили на установке из двух ламп БУФ-15 с отражателем, мощностью 2000 зрг/мм2/сек, на расстоянии 30 см от ламп. Облучению подвергали 24-часовые культуры гриба на чашках Петри при экспозиции 30, 60, 120 сек, а также 5, 10 и 20 мин.

Этидий бромид (ЭБ) добавляли к среде N2 в концентрациях 5, 10, 30 и 60 мкг/мл.

Термическую обработку F.amygdali осуществляли на стадиях посевного 'мицелия и собственно биосинтеза,' и культивирования на твердых средах. Во всех случаях контрольное выращивание проводили при 25°С. При

глубинном культивировании проводили: 1,- выращивание посевного мицелия при 37°С в течение 120 мин, далее кулътизирование при 25°С; 2,- Через 24 часа после засева посевным мицелием среды N4 проведение термической обработки при 37°С в течение 120 мин, далее при 25°С; 3,- Через 24 и 48 час после засева посевным мицелием среды N4 проведение термической обработки при 37°С в течение 120 мин, далее при 25°С.

При культивировании на твердых средах: 1.- Выращивание при 33°С в течение 7 суток-, 2.- При 37°С в течение 7 суток; 3.- При 33°С в течение 72 час, далее при 25°С в течение 96 час; 4.- При 37°С в течение 72 час, далее при 25°С в течение 96 час.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исходный штамм Р^соссит атувс1аП Р4 - из коллекции ВНИИСБ в пробирках на поверхности скошенного агара (среда N1) формировал бархатистые, плотные, белые колонии. Пигментация субстратного мицелия желто- ¡соричневая с возрастом темнеющая. Спороношение отсутствует. Активность 110 мкг/мл.

•Путем мицелиального рассева и протопластирования мицелия штамма Р4 был получен ряд изолятов, составивших мщелиальную и протопластную линии Р.ату^аН. Изоляты оценивались по характеру роста и пигментации воздушного мицелия, наличию или отсутствию лизисных бляшек, а также по уровню биосинтетической активности. Описание колоний проводили спустя 5-7 суток роста на среде N2; Были выявлены 4 основных морфологических типа колоний, встречающихся как среди мицелиальных, так и среди протопластных .изолятов-,,.. и 2 морфологических типа колоний, характерных только для мицелиальных'изолятов.

Так колонии типа "1" (белые, компактные, плотные, барх'атистые, равномерноопувенные) и типа "2" (белые, распростертые, пушистые, не-равномерноопутенные), характеризуются отсутствием темного субстратного мицелия. Для- типа "2" характерно присутствие лизисных бляшек на поверхности воздушного мицелия. %ч

Колонии типа "3" (кремовые, распростертые, бархатистые, равномер-ноопушенные) и типа "4" (кремовые, распростертые, пушистые, неравно-мерноопушенные) характеризуются сильной пигментацией субстратного мицелия от светло-коричневой до черной, для'типа "4" характерно наличие лизисных бляшек на поверхности воздушного мицелия.

Колонии типов "5" и "6" характеризуются наличием белого, распростертого, пушистого мицелия, лизисные бляшки не образуются. Для колоний типа "6" характерна темная окраска субстратного мицелия.

Среди изолятов мицелиальпой линии чаще всего встречаются колонии с морфологическим типом "4" (31,8%).Среди изолятов протопластной линии более часто встречаются колонии с морфологическим типом "5" (38,92).

Концентрация фузикокцина в культуравьной жидкости у полученных изолятов колебалась'в пределах 0-570 мкг/мл. Более 702 изолятов мице-лиальной линии с активностью ниже 200 мкг/мл. 902 изолятов протопластной линии с активностью более 300 мкг/мл. -

Были получены коэффициенты ассоциации, позволяющие рассчитать тесноту связи между различными качественными признаками по Пирсону (Лакин,1990). Корреляция между признаками биосинтетической активности, пигментацией субстратного мицелия, степенью опушенности воздушного мицелия и наличием лизисных бляшек не установлена.

Изоляты протопластной линии по морфологическим признакам и в отношении образования фузикокцина более стабильны. Спустя 48 недель от * . . »

начала хранения и 6 пассажей активность прагашески не менялась, в то время как кзоляты ыиаелиальнои линии постоянно теряли активность. Из-

менения морфологических признаков у изолятов протопластной линии не наблюдалось. Среди изолятов мицелиальной линии штамма F4 наблюдалось усиление пигментации субстратного мицелия, кроме того при пересевах на 4-5 сутки роста возможно появление мелких литических бляшек диаметром 1-3 мм, которые либо зарастают мицелием к 10-14 суткам культивирования, либо сливаются,-образуя "лысые" участки колоний, полностью лишенные воздушного мицелия.

Несмотря на отсутствие корреляции между способностью гриба к био" синтезу фузикокцина и наличием лизисных бляшек на поверхности колоний, лизисные штаммы обладают целым рядом отрицательных свойств, а именно снижением способности к росту, непредсказуемостью характера роста при пассировании, раннего лизиса культуры гриба при хранении и потере ее вследствие этого. Все это послужило основанием для более внимательного изучения возможной, вирусной инфекции в культуре F.amygdall.

Проводилось изучение влияния УФ-облучения на торфолого-культу-ражьныё свойства изолятов мицелиальной и протопластной_ линий штамма F4. УФ-облучению подвергали изоляты со сходными морфологическими признаками, полученные в результате мицелиального рассева и формирующие-на чашках Петри (среда N2) типы колоний 4,5 и 6. УФ-облучение вызывало сильную морфологическую изменчивость колоний гриба, что особенно проявлялось у изолятов мицелиальной линии. Наибольшую морфологическую изменчивость вызывало облучение с экспозицией 30 сек. Так в контроле изоляты мицелиальной линии представлены 4,5 и 6 морфологическими типами колоний. Под действием УФ-света 90Z колонии с морфологическим типом 4 формируют лизисные бляшки и сектора, лишенные воздушного мицелия, отмечается зональный (301), паутинистый (20Z), ватообразныи (20Z) рост воздушного мицелия,, а тагае формирование "wet"-колоний (10%). Тогда как в контроле лизисные бляшки отмечены у 56,61 колоний, а изменений роста воздушного мицелия не наблюдается. Колонии, формирующие мицелий

••wef'-типа, были выделены в новый морфологический тип 7. Для него характерны белые, распростертые, неравномерноопушенные колонии с признаком "wet" ("мокрый", матовый воздушный мицелий), субстратный мицелий не пигментирован. После УФ-облучения колоний с морфологическим типом 5 в его популяции 40,9Z составляли колонии с лизисными бляшками и 36,4% "wet''-колонии. . Ч\

Для изолятов протопластной линии штамма F4, представленных в контроле колониями с морфологическими типами 5 и 6, характерна большая стабильность морфологических признаков. Под действием УФ-света 66,7% и 74,3% колоний 5 и 6 типов оставались неизменными, а 33,3% и 25,7% колоний имели лизисные бляшки, тогда как в контроле только только 3,32 от общего числа изолятов имели лизисные бляшки. В контроле у мицели-альных изолятов выделяли ds RNA, у протопластных изолятов ds RNA не обнаружена.

У изолятов обеих линий после УФ-облучения наблюдалась тенденция к снижению способности образования фузикокцина. Количество изолятов с низкой ФК-синтезирующей активностью возрастало по сравнению с- контролем (Рис.1).

Таким образом УФ-облучение усиливает морфологическую изменчивость F.amygdali. По характеру изменчивости (возникновению лизисных зон, формированию колоний с паутинистым, ватообразным, зональным ростом воздушного мицелия и "wet''-колоний) можно говорить об усилении под действием УФ-света возникновения признаков, связываемых нами с вирусной инфекцией, , что косвенно указывает на стимуляцию вирусной инфекции УФ-облучением. Выделение ds RNA из изолятов обеих линий, образующих на поверхности колоний лизисные пятна после облучения УФ-светом подтверждает это положение. В связи с этим применение УФ-облучения можно использовать '"в качестве' экспресс-метода обнаружения вирусной инфекции в культуре F.amygdali.

' Рис.1. Влияние УФ-облучения на ФК-синтезирующую активность -1 штамма Г4.

Дальнейшей задачей являлась разработка методов выделения и очистки ВЧ из мицелия Г.ату^аЛ.

В работе использовали изоляты мицелиальной линии штамма Р4,формирующие на среде N2 гаэлонии с крупными лизисными бляшками и секторами, лишенными воздушного мицелия.

. Были испытаны методы осаждения ВЧ ацетоном с последующим • замораживанием, ПЭГом, охлажденным этанолом, дифференциальное центрифугирование, а также комбинации этих методов.

Наилучшие результаты при определении суммарного количества ВЧ в мицелии шталла Р4 достигнуты при использовании методов осаждения ВЧ из мицелиального экстракта ацетоном (в-соотношении 1:1) с последующим замораживанием в сочетании с дифференциальным центрифугированием. Отношение оптических плотностей Е2б<УЕ2ео=1.73. При исследовании такого материала в электронном микроскопе были видны разрушенные вкрионы и кристаллы вирусов. Вирусная суспензия была загрязнена неспецифическими примесями.

Осаждение ВЧ с -помощью ПЭГ не было достаточно эффективным, так как при 8 Х-ной концентрации ПЭГ в вирусной суспензии большое количество ВЧ оставалось в надосадочной жидкости, а при концентрации ПЭГ

10-12% исследованные в электронной микроскопе препараты не отличались меткостью, по-видимому, из-за адсорбции примесей на поверхности ВЧ.

При осаждении ВЧ F.amygdali охлажденным этанолом первоначально была установлена оптимальная концентрация этанола в растворе - 50Х.

Спектрофотометрическая кривая вирусного препарата, очищенного этим способом имела характерную для нуклеопротеидов кривую поглощения УФ-лучей (Рис.2): минимум при 240 нм, .максимум при 265 нм. Отношение оптических плотностей Е260/Е280=1.62. Электронномикроскопическое исследование вирусных суспензий, очищенных этим методом, показало присутствие вирусных частиц диаметром 20 нм.

RES 2.0000 1.0000 0.0000

Рис.2. Спектрофотометрическая.кривая поглощения УФ-лучей вирусным препаратом, очищенным с использованием 502-ного этанола

Было проведено определение типа нуклеиновой кислоты ВЧ F.amygdali и установлено, что ВЧ содержат ds RNA. Прохождение ds RNA. злюируемой из раствора, было зарегистрировано на увикорде (Рис.3). Бри этом сравнительное изучение изолятов мицелиалъной и протопластной линий штамма • F4 показало присутствие ds RNA е изолятах мицелиалъной линии и отсутствие таковой в изолятах протопластной линии.. .

Рис.3, регистрация прохождения ds RNA, элюируемой из раствора' вирусной суспензии на увикорде

- О степени инфицированносги ВЧ мицелия, полученного при глубинном культивировании Р.ашугйаН, судили по накоплению суммарных нуклеопро-теидов (НП) в мицелии гриба на 72, 120 и 168 час у изолятов с нормальным ростом и с зонами лизиса мицелиальной и протопластной линий штамма Р4. Для осаждения ВЧ из мицелиального экстракта использовали метод осаждения охлажденным этанолом и -дифференциальное центрифугирование ("Рис. 4).

НП

усл.ед.

Изоляты мицелиальной линии с зонами лизиса (1), нормальный рост (2).

Изоляты протопластной линии с зонами лизиса (3), нормальный рост (4).

Рис!. 4.' Динамика накопления НП в мицелии изолятов мицелиальной й • протопластной линии штамма Р4 Р.ату{$аН.

Наибольшее количество НП отмечено у изолятов мицелиальной линии, особенно у изолятов с ярко выраженными лизисными бляшками. По мере культивирования количество НП возрастает, достигая максимума к • 120 час, в более поздние сроки суммарное количество НП продолжает оставаться на высоком уровне, тогда как у изолятов протопластной линии суммарное количество НП относительно ниже и наблюдается снижение содержания НП в-мицелии после 120 час культивирования.

Была изучена возможность передачи вирусной инфекции от линии к линии внутри штамма F4. В качестве инфицирующего материала использовали мицелиальные экстракты (МЭ), полученные из изолятов мицелиальной и протопластной линий соответственно. Полученные результаты не дают возможности с полной достоверностью утверждать передачу признаков посредством МЭ, однако среди обработанных вариантов отмечается более частое возникновение колоний с характерными признаками вирусной инфекции, как-то лизисные бляшки, отсутствие воздушного мицелия, "wet"-колонии.

Было изучено действие зтидия бромида (ЗБ) на изменчивость, рост и биосинтез фузикокцина штамма F4. Отдельные изоляты мицелиальной и протопластной линий -штамма F4 были высеяны на среду N2, содержащую различные концентрации ЗБ. ЭБ практически не оказывал влияния на рост

1 > изолятов протопластной линии, рост мицелиальных изолятов существенно

отличался. Колонии характеризовались равномерной опушенностью воздушного мицелия, активным зарастанием лизисных участков мицелия. Диаметр колоний почти в два раза возрастал, наблюдался активный'подрост вторичных колоний без лизиспых пятен. ЭБ оказывал положительное влияние на биосинтез фузикокцина при внесении ЗБ в среду для биосинтеза. Наблюдалось значительное увеличение активности "КЖ и биомассы мицелия. Однако продуктивность при этом не менялась, очевидно, что более интен-

фусиксжшш мкг/мл

700

600

500

400

300

200

биомасса Мг/мл

2617 2590

2540 2486 2341

1850 1833 1735

» 8 % Щ

Ш Ш § §

11111 14?: §§§11

12345 12345

12345 12345

Рис.5 Влияние ЗБ на Риз1соссиш апуё^аи

[]- Протопластная линия § - Мицелиальная линия

Концентрация ЭБ в среде (мкг/мл): 1 - контроль,

2-5,

•'.'.■■ •' ' . 3 - 10.

4 - 30,-■ 5 - 60.

сивный биосинтез фузикокшгаа связан с более интенсивным ростом мицелия (Рис.5). Отсутствие признаков, связываемых нами с вирусной инфекцией у изолятов, проведенных через выращивание на среде с ЭБ,' прослеживалось в течение 2-3 пассажей.

Была проведена серия опытов по термической обработке мицелия безвирусной и инфицированной ВЧ культуры Г.ату^аП в условиях глубинного культивирования при биосинтезе фузикокцина и при росте на твердых средах. ' ' " ' ^

Термическая обработка мицелия изолятов мицелиальной и протопласт-.ной линий штамма Р4 выявила их различную реакцию. В контроле изоляты протопластной линии сравнительно с изолятами мицелиальной линии дают более высокие показатели накопления биомассы и'уровня ФК-синтезирующей активности (Рис.6-1).Кроме того, протопластные изоляты слабо реагируют на термическую обработку мицелия как на стадии посевного мицелия, так и на стадии биосинтеза.

Термическая обработка мицелиальных изолятов вызывала увеличение роста биомассы и биосинтетической активности гриба, что особенно заметно на 72 и 96 час роста (Рис.6-2).

Наиболее эффективна термическая обработка на стадии биосинтеза (120 мин при 37°С) спустя 24 час от засева.посевным материалом среды для биосинтеза N4.' Такой прием позволяет поднять ФК-синтезирующую активность мицелиальных изолятов до 601. Микроскопический контроль погруженной культуры выявил положительное влияние термической обработки на состояние клеток мицелия. Если в контроле на 96 час роста изоляты мицелиальной линии представлены клетками, лишенными цитоплазмы, либо клетками с- крупными липидными каплями и наблюдается раниий активный лизис мицелия, то после тер1ягаеской обработки раннего лизиса мицелия не наблюдается, лишенные цитоплазмы клетки практически отсутствуют. В

поле зрения видны утолщенные гифы, концы которых прорастают тонким, молодым мицелием. В культуре изолятов протопластной линии лизиса не наблюдается, мицелий представлен утолщенными, ветвящимися гифами, клетки вакуолизированные, с зернистой цитоплазмой.

Фузикокцин мкг/мл

биомасса мг/мл 1400 1200 1000}-800 600 400 20010

-Контроль

- - t°C обработка

24 48 72 96 120 t.uac 2

24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 t,4ac

Рис.6 ФК-синтезирующая активность (А) и рост биомассы мицелия (Б) мицелиальных (1) и протопластных (2) изолятов штамма F4, подвергнутых термической обработке при 37°С, 120 мин.

Была проверена возможность использовать термическую- обработку мицелия гриба с признаками вирусной инфекции в условиях поверхностного культивирования в пробирках и чашках Петри при приготовлении посевных партий Р.атугйаП. Результаты приведены в Табл. 1.- Оптимальными условиями являются культивирование гриба на твердых средах при температуре 33°С в течение первых 7 суток. Это, вероятно, способствует торможению развития вирусной инфекции у изолятов мицелиальной и протопластной линий штамма Р4, что проявляется в нормальном росте гриба, уже на первых этапах культивирования. ФК-синтезирующая активность таких культур значительно выше контрольных.

Таблица 1. Влияние термической обработки мицелия Г.ашу^аН при культивировании на твердых средах

Условия культивирования Изоляты мицелиальной линии Изоляты протопластной линии

Активность КЕ,мкг/мл Морф.осс наличие лизиса эбености окраска суб.миц Активность КН,мкг/мл Морф, осс наличие лизиса збенности окраска суб. миц.

Контроль 26°С,7 сут. 130 + темная 210 * светлая

33°С,7 сут. 330 - светлая 430 -

33°С,3 сут. далее 2б°С., 250 / — 320 : -

37°С,3 сут. далее 26°С. . 250 - _ 1' _ 350 -

37°С,7 сут. 210 - роста нет

Проводили электронно-микроскопическое изучение ультратонких срезов мицелия изолятов-мицелиальной и протопластной линий штамма Р4, формирующих колонии с нормальным ростом и с лизисными бляшками.

Ультратонкая структура клеток колоний с нормальным ростом у изо-лятов мицелиальной и протопластной линий штамма Р4 практически одинакова: клеточная стенка плотная без разрывов, ядра крупные, типичные для грибов вакуоли, жировые включения, митохондрии и эндоплазматичес-кий ретикулюм, цитоплазма плотная, зернистая.

Внутриклеточное состояние гиф у изолятов мицелиальной линии, пораненных вирусом, значительно отличается от состояния нормальных клеток. Клеточная стенка с разрывами, имеет волнистую конфигурацию; между штоплазматической мембраной, состоящей из двух слоев, и клеточной стенкой на отдельных участках наблюдается образование небольших полостей. Отмечаются увеличенные в размерах,митохондрии. Наблюдается распад мицелия. В глетках видны заполнившие цитоплазму ВЧ гексагональной формы, диаметром 20 нм, с электронно-плотной сердцевиной.

ВЫВОДЫ

1. Изучены кульгурально-морфологические признаки мицелиальных и-протопдастных изолягов штамма-продуцента фузикокщна F4. Показаны изменчивость и нестабильность морфологических и биосинтетических признаков мицелиальных изолятов и относительная стабильность протопластных изолятов.

2. Выявлена вирусная инфекция в культуре гриба F.amygdali, " которая проявляется в возникновении лизисных зон на поверхности воздушного мицелия, образовании колоний со слабым ростом воздушного мицелия и "wet''-колоний. .

3. Установлено стимулирующее влияние УФ-света на вирусную инфекцию в культуре гриба, что позволяет использовать УФ-облучение в качестве экспресс-метода для выявления вирусной инфекции у F.amygdali по усилению проявления ее признаков. - •• -

"4. Разработаны методы выделения и очистки ВЧ из мицелия F.amygda-li. Оптимальным методом является осаждение ВЧ из экстрактов мицелия охлажденным этанолом в сочетании с дифференциальным центрифугированием и использованием системы микрофильтров.

5. Установлена морфология и тип нуклеиновой кислоты ВЧ F.amygda-li. Показано, что ВЧ гексагональной формы, диаметром 20 нм, содержат ds RUA.

6. Проведено электронномикроскопическое исследование мицелия изолятов птамма F4. В культуре с признаками вирусной инфекции в клетках обнаружены ВЧ. По1^зано их деструктивное влияние на клетку, проявляю-

• шееся в разрушении клеточной стенки,' образовании полостей между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной, увеличении матрикса митохондрий.

_ оо _ «к»«*

7. Установлено влияние вирусной инфекции на образование фузикокцина. Показано, что вирусная инфекция отрицательно влияет на жизнеспособность продуцента фузикокцина, приводит к снижению интенсивности роста мицелия и его способности к биосинтезу фузикокцина.

8. Возможно получение безвирусных штаммов с помощью различных методов селекции, в частности, протопластирования, выращивания гриба на средах, содержащих этидий бромид в малых дозах, а также использования термической обработки мицелия гриба.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Муромцев Г.С., Максимова P.A., Дадашева И.М. Вирусы в культуре гриба Fusicoccum amygdali Del.// Микробиология,- 1994,- Т.63, Вып.2.-С. 264-270.

2. Дадашева И.М., Максимова P.A., Еаркова Т.С., Муромцев Г.С. Сравнительное изучение мицелиального и протопластного штаммов продуцента фузикокцина Fusicoccum amygdali Del. в связи с вирусной инфекцией // Прикладная микробиология и биохимия.-1995.- В печати.

Подписано к печати" _199^года.

Отпечатано на ротапринте в Формат бумаги 30x42/4 , Производственном комбинате Объем 3 пл. Л1ггсратурного фонда .'. ■ •• Зах. / • Тнр. 100

ул. Усиевича, д. 8-г

Тел. 152-17-71