Вирус гепатита A: генетические особенности изолятов, выявленных в Сибирском регионе, и штаммов, адаптированных к культурам клеток

Бондаренко, Татьяна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Вирус гепатита A: генетические особенности изолятов, выявленных в Сибирском регионе, и штаммов, адаптированных к культурам клеток
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Вирус гепатита A: генетические особенности изолятов, выявленных в Сибирском регионе, и штаммов, адаптированных к культурам клеток"

ВИРУС ГЕПАТИТА А: ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗОЛЯТОВ, ВЫЯВЛЕННЫХ В СИБИРСКОМ РЕГИОНЕ, II ШТАММОВ, АДАПТИРОВАННЫХ К КУЛЬТУРАМ КЛЕТОК

03.01.03 - молекулярная биология

4055741

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 4 033 23:1

Кольцове - 2011

4855741

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Терновой Владимир Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Щелкунов Сергей Николаевич

доктор биологических наук Татьков Сергей Иванович

Ведущая организация:

ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (г. Москва)

Защита состоится «11»'марта 2011 г. в 9.00 ч. на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: 630559, р. п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел. (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Г.П. Трошкова

Актуальность исследования

Гепатит А (ГА) как заболевание широко распространен во всем мире: по данным ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется в среднем 1,4 млн. случаев заболевания вирусным ГА. По данным ФГУЗ «Федерального центра гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора, в последние 10 лет заболеваемость ГА в России регистрируется в пределах от 5 до 15 случаев на 100 тыс. населения. Вместе с тем ГА может протекать в скрытой, бессимптомной форме и поэтому реальная заболеваемость ГА, возможно, значительно превышает число задокументированных случаев. Основной механизм заражения ГА фекально-оральный, реализуемый пищевым, водным и контактно-бытовым путями.

Возбудителем заболевания является вирус ГА (ВГА), представитель рода Нера1о\1гив, семейства РкогпауггШае, порядка Ршотаукакя. Плюс-РНК геном ВГА имеет длину в 7500 нуклеотидов (н.). К 5'-концу РНК ВГА ковалентно присоединен белок УР§, а З'-конец полиаденилирован. Имеются 5'- и 3'-нетранслируемые области (НТО). Единственная открытая рамка считывания кодирует полипротеин длиной около 2228 аминокислотных остатков (а.о.), который расщепляется клеточными и вирусспецифической протеазами ЗСрго на структурные (УР1, УР2, УРЗ и УР4) и неструктурные (2А, 2В, 2С, ЗА, ЗВ, ЗСрг0 и ЗОро1) белки.

Выявление РНК ВГА . при помощи обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) в крови и фекалиях людей очень важно на ранних сроках развития болезни, до появления клинических симптомов и в сложных случаях при смешанных инфекциях. На данный момент общепринятым для генотипирования и исследования вариабельности ВГА является филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента генома в 168 н., включающего район соединения генов белков УР1/2А и содержащего прилегающие к нему части генов УР1 и 2А ВГА.

Все изоляты ВГА в настоящее время подразделяют на шесть генотипов. Генотипы I-III ВГА вызывают ГА у людей, IV-VI генотипы циркулируют в популяциях обезьян. Преобладающим у людей является генотип IA.

К сожалению, ранее определение генотипов ВГА, циркулирующих на территории России, проводилось только среди больных в европейской части и Якутии. Анализ генотипов ВГА, циркулирующих на территории Сибири, до сих пор не проводился. Учитывая численность населения, проживающего в Сибири, очевидна актуальность анализа изолятов ВГА в Сибирском регионе.

Эффективной мерой для предупреждения ГА является вакцинация населения. В Российской Федерации (РФ) вакцинация от ГА применяется с конца 90-х годов в рамках календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям. В США прививка от ГА включена в национальный календарь как обязательная для всех детей в возрасте 12—23 месяцев. В РФ в последнее время поднимается вопрос о массовой вакцинации детей от ГА, что требует получения вакцинных препаратов в достаточно больших количествах. Используемые в настоящее время штаммы ВГА для получения вакцин от ГА («Avaxim», Франция; «Havrix», Бельгия; «Vaqta», США) обладают низкой скоростью роста (21-28 дней) на культуре клеток MRC-5 (диплоидные клетки легкого человека). Вакцина от ГА, производимая в России, «Геп-А-ин-Вак» основана на штамме ВГА HAS-15, нарабатываемом на культуре клеток 4647 (клетки почки зеленой мартышки). Как и зарубежные аналоги, данный метод наработки вируса характеризуется как низкой скоростью роста, так и невысокой продуктивностью. В связи с этим актуальными становятся поиск и изучение штаммов ВГА, имеющих высокую скорость роста в культуре клеток, как экономически более выгодных при производстве вакцин.

Были опубликованы данные о нуклеотидной последовательности лишь небольшого участка гена белка УР1 штамма МБ-7. Впоследствии данный штамм после проведения последовательных пассажей был адаптирован к культуре клеток 4647 (штамм МБ-7/4647), аттестованной на территории России для использования при производстве вакцинных препаратов. В дальнейшем штамм МБ-7/4647 был использован для адаптации к культуре клеток НЕК293 (клетки почки эмбриона человека), применяемой для наработки иммунобиологических препаратов. Полученный штамм МБ-7/293, как и штамм МБ-7/4647, обладает высокой скоростью роста, что делает перспективным использование этих штаммов при разработке экономически выгодных профилактических и диагностических препаратов. К сожалению, культуральные и молекулярно-генетические свойства данных штаммов до сих пор недостаточно исследованы.

Таким образом, отсутствие информации о генетических особенностях изолятов ВГА в Сибирском регионе и необходимость детальной молекулярно-генетической характеризации быстрорастущих штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293, адаптированных к культурам клеток 4647 и НЕК293 соответственно, безусловно, определяют актуальность данной работы.

Целью настоящего исследования являлось изучение генетических особенностей изолятов ВГА, циркулирующих в Сибирском регионе, и штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293, адаптированных к культурам клеток 4647 и НЕК293 соответственно.

В соответствии с этой целью были сформулированы следующие основные задачи исследования:

1. Провести анализ серопозитивных и серонегативных в ИФА на Г£М к ВГА образцов сывороток от пациентов, поступивших в 2001-2002 годах в больницы Новосибирска, Барнаула и Иркутска, на присутствие РНК ВГА с помощью ОТ-ПЦР и в случае положительного результата определить

нуклеотидные последовательности фрагментов генов белков УР1, 2 А и 2В ВГА.

2. Провести филогенетическое сравнение полученных нуклеотидных последовательностей выявленных изолятов ВГА с нуклеотидными последовательностями известных штаммов ВГА.

3. Определить полные нуклеотидные последовательности геномов быстрорастущих штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293 ВГА, адаптированных к культурам клеток 4647 и НЕК293, и провести сравнительный анализ роли выявленных мутаций на особенности штаммов МБ-7/4647 и МБ-7/293.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые на протяжении полного эпидемического сезона (20012002 годах) было проведено изучение клинических изолятов ВГА от больных с острыми гепатитами в трёх крупных городах Сибири: Барнауле, Новосибирске и Иркутске. Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов ВГА (\Ф1, 2А и 2В) выявленных изолятов.

Определены полные нуклеотидные последовательности геномов штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293, адаптированных к культурам клеток 4647 и НЕК293 соответственно. В результате сравнительного анализа выявлены мутации, которые могут быть ассоциированы с ростовыми свойствами штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293.

Таким образом* результаты данных исследований вносят существенный вклад в изучение генетического разнообразия ВГА на территории Сибирского региона РФ и могут быть использованы для совершенствования диагностических и профилактических препаратов.

Положения, выносимые на защиту

Заболевания ГА в 2001-2002 годах в городах Барнауле, Новосибирске и

(

Иркутске (в 101 выявленном случае) обусловлены двумя вариантами ВГА субгенотипа 1А.

Ускоренную репликацию у штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293 в культурах клеток 4647 и НЕК293 определяют геномные отличия от сравниваемых штаммов в виде дупликации района в 13 н. в 5'-НТО (149-161 н.) и точечных замен в гене VP3 (1692 н.) и в сайте протеолиза 2В/2С.

Геномные отличия штамма ВГА МБ-7/293 от штамма ВГА МБ-7/4647 в 5'-НТО (13, 21 н.) и в сайте протеолиза 2А/2В приводят к уменьшению времени наработки вируса с 7-12 дней до 4-7 дней.

Апробация работы и публикации

Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях: «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека» (Украина, Судак, 2004), «Генодиагностика инфекционных болезней» (Сосновка, 2005), «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты и проблемы безопасности крови» (Томск, 2007), «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010). По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК, получен патент РФ.

Вклад автора

Данные секвенирования получены лично автором и в соавторстве с к.б.н. Терновым В.А. и к.б.н. Чаусовым Е.В. Сравнительный анализ проведен лично автором. Культивирование и оценка эффективности культивирования штаммов ВГА проводились совместно с к.б.н. Святченко В.А. и с.н.с. Киселевым H.H.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из «Введения» и разделов «Обзор литературы», «Материалы и методы» и «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков и 8 таблиц. Библиография включает 230 источник, в том числе 206, опубликованных в иностранных журналах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали сыворотки крови и фекалии, собранные в 2001— 2002 годах от пациентов, поступивших в инфекционные больницы Новосибирска, Барнаула, Иркутска. Все поступившие сыворотки были проверены в ИФА на наличие специфических антител класса IgM к ВГА с помощью тест-систем ВГА«Вектогеп A-IgM» («Вектор-Бест», Россия).

Исследование проводили с соблюдением принципов добровольности и. конфиденциальности в соответствии, с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан». Забор крови проводили после получения письменного согласия информированного пациента с использованием стерильных одноразовых систем «Вакутайнер».

Культуры клеток 4647 и НЕК293 и штамм МБ-7/4647 получали из банка клеточных культур ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Выделение вирусной РНК из клинических образцов и препарата ВГА из культур клеток проводился с помощью TMzol® (GibcoBRL) согласно инструкции производителя. В ОТ-ПЦР использовали олигонуклеотидные праймеры, рассчитанные с помощью программы OLIGO, на основе предложенных ранее. ПЦР-фрагменты анализировали гель-электрофорезом в 2 % агарозном геле и очищали при помощи наборов S.N.A.P.™ Gel Purification Kit для агарозных гелей (Invitrogen). Определение нуклеотидной последовательности проводили на приборе Beckman CEQ2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Inc.) с помощью наборов Beckman sequencing Kit согласно инструкции производителя.

Филогенетический анализ осуществляли с помощью программы MEGA 4 в сравнении с нуклеотидными последовательностями ВГА из базы данных GeneBank генотипов: IA — HAS-15 (здесь и далее - номер последовательности в базе данных GenBank Х15464), CR326 (Ml 0033,1), GBMwt (Х75215), GBM/HFS (X75216), M2 (AY974170), H2 (EF406357) DL3 (AF512536), АН2 (АВ020565), FH2(AB020568), FG (X83302), Moscow-1999-122 (AY226591), Serpukhov-2001-

101(AY226610), Podolsk-2001-83 (AY226609), IT-ILG-00 (AJ505623), BaliA06-72 (AB298164.1); IB генотипа - HM175wt (M14707), HM175/7 (M16632),' HM175/43С (M59809), HM175/24A (M59810), MBB (M20273), Germany 2007/2008 (EU416258); НА генотипа - CF53Bern (AY644676); IIIA генотипа -Nor21 (AJ299464); V генотипа-AGM27 (D00924).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительный генетический анализ изолятов В ГА, выявленных в Сибирском регионе в 2001 - 2002 годах

Необходимо отметить, что три крупных города Сибири - Новосибирск, Барнаул и Иркутск - являются большими транспортными узлами, что позволяет говорить об исследовании основных штаммов ВГА, циркулирующих на территории Сибири.

В первой части исследования использовался фрагмент генома ВГА длиной 309 н. (2852-3161 н., координаты по геному штамма HAS-15 (Х15464)), который включает в себя общепринятый при исследованиях вариабельности ВГА участок генома в 168 н. (2924-3092 н.), и содержал фрагмент гена белка VP 1, ген белка 2А и часть гена белка 2В.

На присутствие РНК ВГА методом ОТ-ПЦР был исследован 131 образец (45 образцов сывороток и 86 фекалий) от пациентов с серопозитивными в ИФА на IgM к ВГА сыворотками, поступившими в 2001-2002 годах в больницы Новосибирска, Барнаула и Иркутска с диагнозом «острый гепатит», и 101 образец серонегативных в ИФА сывороток от пациентов с диагнозом «вирусный гепатит невыясненной этиологии».

Из 45 серопозитивных в ИФА на IgM к ВГА образцов сывороток крови РНК ВГА была обнаружена в 25 случаях. Процент выявления РНК ВГА составил 55,6 %. Из 86 образцов фекалий от пациентов с серопозитивными в ИФА на IgM к ВГА сыворотками, в 64 образцах была обнаружена РНК ВГА, что составило 74,4 %. Выявляемость РНК ВГА была выше в образцах фекалий, что согласуется с литературными данными о кратковременной виремии и более

длительной экскреции вируса с фекалиями. Таким образом, РНК ВГА была обнаружена в 89 случаях из 131.

РНК ВГА среди 101 серонегативного в ИФА на IgM к ВГА образца сывороток была выявлена в 12 образцах (11,8% случаев), что подтверждает необходимость использования метода ОТ-ПЦР для более достоверного выявления геномной РНК ВГА у больных при диагностике заболеваний печени. При этом в трех случаях было выявлено смешанное инфицирование вирусами гепатитов С и А. .

Таким образом, были определены нуклеотидные последовательности фрагментов, полученных в ОТ-ПЦР, для 101 изолята ВГА (89 серопозитивных и 12 серонегативных в ИФА на IgM к ВГА) с исследуемой территории.

Сравнение определенных частичных нуклеотидных последовательностей геномов 101 изолята ВГА (62 изолята из Иркутска, 23 из Новосибирска, 16 из Барнаула) с таковыми известных штаммов показало, что все последовательности группируются с последовательностями 1А-субгенотипа (рис. 1). Изоляты внутри субгенотипа 1А образовывали 2 группы. Первая группа объединила 92 изолята (из всех трёх городов), филогенетически близких к штаммам ВГА HAS-15 (США), CR-326 (Коста-Рика); М2 (Куба), IT-ILG-00 (Италия), BaliA06-72 (Индонезия). Вторая группа объединила 9 изолятов из Новосибирска (TTG413 и TTG415), Барнаула (KNG305) и Иркутска (CHAP 310, 319, 323; LVV 77, 88, 92), филогенетически близких к российским штаммам и штаммам из Японии (АН2, FH2). При этом 20 изолятов 1-й группы оказались идентичными между собой и не отличались от штамма ВГА HAS-15.

Между изолятами ВГА первой группы из разных городов не оказалось существенных отличий. Видимо, в данное время на территории трёх крупных городов Сибири циркулировали генетически близкие варианты ВГА IA-субгенотипа. Во вторую группу также вошли изоляты из всех трёх городов.

*Г [Б] Н1А247 ■у (И] 1ЛЛ/191 < (И||_«У171 И СНАР348

• {[Н] ТТ0441

1 |Н] иУАБгвО Г |И] СНАР326Ь ' |Н] ТТ6431

г 1Н] ттезаг , [Н]иУА3244

• - (И) СНАР423 ' - [и] оуилш ' - |н]ттезвэ

ИОУшяа

[И] СНАР230Ь

- |И] руиАбаь

1Н] М012В6 [И] РУиА132 [И|СНАР137Ь [И] ОУиАКН) 1И]СНАР185Ь -[И] LW140Ь . [И] СНАР387

- 1ЛЛЛ42 [Н]КЛЛ36

] " [И| LW7в >ПН)ВТС124 [И) LW189 НА315

■ Я [Н] М01311

■ -[И] СНАР381

, [И] ТТС401

1 [И] LW167Ь Г [Щ СНАР209

• [Н] ттсзэ« " [И] СНАР415

1-[И1СНАР368

>-[И]1ЛЛ/165 . (ИЮУШШ : [и| эуиА12з ¡И] СНАР374 ~ [Н1 М01292 " [И] СНАР419

■ Ч--[41 СНАР338

Ц {Н]1ЛГА844

-(Н1иУАв282

"*— [М1 агй141

• [Н) ТТй403 ¡Н) КМ 26

-{И] СНАР158Ь ь " [Н) ВТО 27 [Н]КЫ015 [И] СНАР222 М2 ' '1Н1КШИ7 " ¡И] |_\Л/47Ь [Н]КМС207 "|Б1 Н1А291 , [И] ОУ11А223 [И] ОУиА125 " ГН1 КЫ0286 « - |И] СНАР424 " [Н] ^297 Г |Н] М01282 Г [И] СНАР422 ¡пицлллзз Г |И] СНАР377 I [Н] М01253 1 [Н] Гге423

- [Н] Ю№268 " 1Т-11.0-00

• [И] СНАР322 -[И1СНАР383

Ч—[Н1ТТ3422 " _ [И] 1Л/У79Ь

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе частичных (УР1, 2 А 2В) нуклеотидных последовательностей геномов ВГА, выявленных в изолятах, циркулирующих на территории Сибири. Примечание -

Здесь и далее длина линии отражает генетическую дистанцию. Значения индекса поддержки в узлах ветвей указаны после 1000 репликаций.

[Н] - Новосибирск, [Б] - Барнаул, [И] -Иркутск. Прототипные изоляты выделены жирным шрифтом

1 группа

01*326 ВаПА06-075 |—АН2

!-РН2

61 Moscow1999 И 5егриЬоу2001-533 . тг [Н] тазо5

РойоИк-2001-83 ¿кг—|Н]тта413 Т Г1Н1ТТСЧ15 Л Г(И] СНАР318 ЦИ] СНАР319 » ь [И] LW92 , [И] 1ЛЛ/77

[И] СИАР323 п [И] |_\Л/88 1—1 вВМ»! 3« Рй мвв

— Сегтапу2007/08 97—НМ1751К

- СР53Вет

-АВМ27

2 фуппа

4с

Наличие двух групп свидетельствует об одновременной циркуляции двух вариантов ВГА 1А-субтипа. Все выявленные изоляты отличаются от зарубежных европейских изолятов вВМ (Германия) и БО (Италия), образующих отдельную ветвь внутри 1А-субгенотипа.

Фрагменты геномов 66 изолятов содержали значимые нуклеотидные отличия, приводящие к аминокислотным отличиям в белках УР1, 2А и 2В. Среди них были выявлены ранее не описанные варианты ВГА, имевшие

Город Втким Балок, положение а .о.

про».

Про*.

Ир«.

8-ек.

Яр*. прк. Ир«. Ир«. Иря.

Ир«-

Ир*. В»р«. Ир*. Ярк. Ир«.

Ир«.

II':

BASIS

amrt

СХ32С К2 ГО

АИ2 ГВ2 В »11*0«-О " .

хт-хьа-»«

Mo>cevl»»S .

••rpvbov2<.

Vodelak-20.

СГ53В*ЕВ

N0*21

АСМ27

8M17S»t

в*лкьпу20(

MSB

twin

BTT5I2I

СВАГЭ1*

TTQ441

UYAS2I0

LW7*

CHWlJTb

CHATltSb

CHXP326b

СНЛГЭ4*

СНММ2Э

omnsob

СНАМЭОЬ

DYU&SIb

CW3I3

CHAP Я 7

МОП»*

LWHOb

LWJ71

LW191

HIM 4 7

LW79b

LWI2

cn»l) askr«i»

СИЛРЭЭС

UYAI4 4

WM}>2

BTOHl

МПЛ123

KOI292

РТОМЭ2

PTOA90

X.W142

TTS382

(7УМ244

CHAF322

CHXP323

СВЛРЭМ

UVTEOSZfY ГГЯАИЛЭТЛ MLSTT:

! -MSR IAMD1253V DDFKSEZDMt FCSSIECRK* YKELXLJVCK QRLKTAOEEL SWEVLPPPRK MOLTS >

Irli'yj-.

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей белков VP1,2А, 2В (103 а.о.) ВГА, выявленных на территории Сибири, и прототипных штаммов. Примечания -

Координаты даны по HAS-15. Идентичные аминокислоты показаны точками. Сходные аминокислотные отличия обведены рамкой. Прот. - прототипный штамм; Н-ск. -Новосибирск; Ирк. - Иркутск; Барн. - Барнаул

уникальные аминокислотные отличия в белках \Ф1, 2А и 2В по сравнению с известными штаммами ВГА, что показано на рис. 2.

Идентичные отличия (заключены в прямоугольники на рис. 2) в исследуемых белках встречались чаще в одном из городов (Иркутск: 8ег(736)-»РЬе; Аг£(748)->Ьуз, РЬе(837)-»Ьеи; Новосибирск Ьеи(836)->Рго), однако такие же замещения редко, но встречались и в других городах.

Таким образом, были исследованы и охарактеризованы изоляты ВГА, выявленные в 2001-2002 годах в Сибирском регионе.

Сравнительный анализ пуклеотидных и аминокислотных последовательностей штамма МБ-7/4647 с аналогичными характеристиками известных штаммов ВГА

Исходный штамм ВГА МБ-7 был получен из изолята, выделенного в 1988 году от больного ГА в Новосибирске, адаптирован к росту в культуре клеток РШ1К-4. Исследуемый в данной части работы штамм МБ-7/4647 был получен после адаптации штамма МБ-7 к росту в культуре клеток 4647.

На первом этапе была определена полная нуклеотидная последовательность геномной РНК штамма ВГА МБ-7/4647 (ЕШ51188). РНК штамма МБ-7/4647 состоит из 7487 н. (без учета полиА-тракта) и кодирует полипротеин длиной 2225 а.о. (АВХ44727). 5'-НТО (749 н.) предшествует единственной открытой рамке считывания (6675 н.), за которой следует З'-НТО (63 н.). 5'-НТО генома штамма МБ-7/4647 содержит два пиримидиновых тракта. Первый (99-138 н.) состоит на 95 % из пиримидиновых оснований. Второй тракт (727-736 н.) расположен непосредственно перед инициирующим кодоном.

Нуклеотидный состав генома штамма МБ-7/4647 (А - 29.3 %, С - 16 %, в - 21,8 % и и - 32.9 %), подобно другим ранее описанным штаммам ВГА, характеризуется очень низким содержанием в+С (38 %). 5'-НТО генома штамма МБ-7/4647 имеет С+С-содержание, равное 47 %.

Для сравнительного анализа нуклеотидной последовательности штамма МБ-7/4647 использовали вакцинный штамм HAS-15, М2 (Куба), штамм GBM (основа вакцины «Avaxim»), штамм CR-326 (основа вакцины «Vaqta»), штаммы, выделенные на территории Китая, - Н2 (основа живой атгенуированной вакцины, лицензированной в КНР) и DL3; FG (Италия), два японских штамма АН2 и FH2; два штамма IB субгенотипа - НМ175/7 (основа вакцины «Havrix») и MBB, а также представители трёх других генотипов -CF53Bern (IIA), Nor21 (IIIA), AGM27 (V).

При сравнении нуклеотидных последовательностей кодирующей части геномов разных штаммов ВГА был проведен анализ филогенетического

НА

■ М2

IA 89

ЕЛА.

L-MB-7/4647 951HAS-15

-;DL3

-FH2

— АН2 -Н2

GBWHFS

-FG

— HM17W

— MBB: -CF53Bern

--Мог21

--AGM27

0 02

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнения кодирующей части геномов штаммов ВГА.

Примечание - Генотипы и субгенотипы отмечены над ветвями. ВГА генотипов: 1А-НАБ-15 (X15464), СВМ/ОТЗ (Х75216), М2 (АУ974170), Н2 (ЕР4063 57) ЭЬЗ (АР512536), АН2 (АВ020565), РН2 (АВ020568), РО (Х83302),); 1В-НМ175/7 (М16632) МВВ (М20273); 11А-СР53Веш (АУ644676); ША-№)г21 (А1299464); У-АОМ27 (Э00924)

родства штамма МБ-7/4647 с 14 штаммами. Результаты показали (рис. 3), что 11 штаммов ВГА, относящихся к 1-Му генотипу, формировали 4 субкластера. Штамм МБ-7/4647 входил в первый субкластер вместе с вакцинным штаммом HAS-15. В три первых субкластера входили штаммы, относящиеся к субгенотипу IA; в четвёртый - штаммы субгенотипа IB. Внешнюю группу сравнения формировали штаммы CF53Bern (генотип IIA), Nor21 (генотип IIIA) и AGM27 (генотип V).

Из анализа филогенетического родства видно, что ближайшим к штамму МБ-7/4647 является штамм HAS-15, используемый для приготовления вакцины «Геп-А-ин-Вак» в РФ. Ввиду этого автором проводилось сравнение в первую очередь с ним. Примечательно, что сравнение нуклеотидных последовательностей штамма МБ-7/4647 в области генов VP1-2B (28523161 и.), использованной в первой части работы, показало их идентичность как с HAS-15, так и с 20 изолятами 1-й группы IA-субтипа ВГА, выявленных нами на территории Сибири.

В целом, при сравнении геномов штаммов МБ-7/4647 и HAS-15, выявлено 48 нуклеотидных отличий, тогда как между последовательностями геномных РНК штаммов НМ175/7 и GBM/HFS (генотипы IB и 1А соответственно), на основе которых выпускаются вакцины «Havrix» и «Avaxim», выявляется более 300 нуклеотидных отличий, а между штаммами HAS-15 и GBM/HFS, относящихся к одному субгенотипу (IA), более 150.

В табл. 1 представлены данные, показывающие степень нуклеотидной идентичности штамма МБ-7/4647 со сравниваемыми штаммами (как по полному геному, так и по его отдельным районам). Штамм МБ-7/4647 был близок к вакцинному штамму HAS-15 и штамму М2 с процентом идентичности 99,4 % и 99,1 % соответственно.

В дальнейшем был проведен анализ отличий в нуклеотидной и аминокислотной последовательностях отдельных районов генома штаммов МБ-7/4647 и HAS-15.

Таблица 1.

Идентичность (в %) нуклеотидных последовательностей геномов различных штаммов ВГА с геномом штамма МБ-7

Название штамма Наз 15 ЙВМ/ НИБ С11 326 Н2 МЛ М2 АН2 РН2 Рв НМ175; 7 МВВ ЖЗВега Чог21 \GM27

Номер в вепВапк XI5464 Х75216 сГ т о о 3 №406357 АР512536 1 АУ974170 АВ020565 1 . АВ020568 Х83302 М16632 1 М20273 1 АУ644676 А1299464 ГЮ0924

Полный геном 99,4 96,3 96,1 95,3 95,2 99,1 95,5 95,3 94,0 91,2 91,0 85,7 82,3 82,9

5'-НТО 98,2 96,5 98,3 96,5 95,1 - 94,7 96,2 94,9 92,9 93,2 90,0 82,2 92,1

УР4 100 98,2 97,4 97,1 95,4 100 98,1 95,3 98,1 91,0 88,6 90,3 94,0 82,5

УР2 100 96,3 94,6 95,3 95,2 юо 94,6 94,2 95,5 91,3 91,2 84,1 81,9 81,6

УРЗ 99,9 97,5 97,1 95,4 94,6 99,4 95,2 95,1 96,2 90,6 91,0 86,0 83,7 82,0

УР1 97,8 96,3 94,2 96,2 96,2 99,2 95,1 95,1 94,5 89,9 '90,4 87,1 80,8 78,2

2А 100 96,1 97,4 96,8 94,7 99,4 94,3 93,5 96,0 90,2 93,7 83,8 79,1 80,9

2В 100 95,2 - 95,1 95,1 99,2 95,4 94,7 94,1 91,3 90,6 85,1 80,0 78,3

2С 99,4 95,4 - 96,3 94,2 99,1 94,6 94,4 94,3 88,5 88,4 85,0 81,1 74,2

ЗА 98,6 91,1 - 92,2 92,7 96,1 91,3 90,1 91,6 90,7 87,3 83,2 75,3 80,0

ЗВ 100 95,3 - 92,5 95,1 98,2 94,5 91,3 95,7 88,5 88,7 88,2 82,7 81,3

ЗС 100 96,4 - 96,1 95,4 99,3 96,5 96,2 95,0 91,3 91,0 84,1 83,0 80,9

ЗБ 99,7 96,5 - 96,2 95,2 99,2 96,4 96,1 94,2 92,8 92,5 84,8 82,2 86,0

З'-НТО 100 97,3 98,4 98Д 100 100 100 100 98,3 92,3 94,0 92,0 81,2

В 5'-НТО (149-161 н.) генома штамма МБ-7/4647 по сравнению с НА8-15 присутствует вставка из 13 н. (5'-СТАААТАТГСАТТ-3'), являющаяся повтором. Такой же повтор присутствует у адаптированных к культуре клеток РШС быстрорастущих штаммов НМ175/43С (М59809), НМ175/24А (М59810). У остальных сравниваемых штаммов данная вставка отсутствовала.

З'-НТО штамма МБ-7/4647, как и у ряда других штаммов, была идентична таковой у НА8-15, что полностью согласуется с известными данными о высокой степени консервативности данного участка генома.

В кодирующей части генома штамма МБ-7/4647 по сравнению с НА8-15 выявлено 34 нуклеотидных отличия. 16 точечных отличий было в генах: \Ф1 -2, УРЗ - 1, 2С - б, ЗА - 3, Зр - 4, один фрагмент из 18 и. (5-

С А АСС АТОАССО АТТТА А-3'), присутствующий в составе гена УР1 штамма МБ-7/4647 и отсутствующий в соответствующей области генома НА5-15.

В табл. 2 представлены данные по сравнению аминокислотных последовательностей штамма МБ-7/4647 с отобранными для сравнения штаммами ВГА. Процент идентичности полипротеинов штамма МБ-7/4647 и штаммов НАБ-15 и М2 превышает 99%, а у остальных штаммов 1А-субгенотипа составляет 98 %.

Таблица 2.

Количество отличий и степень гомологии протеинов штамма МБ-7/4647

Название белка Количество а. о. Штамм

HAS-15 GBIWHFS СИ 326 X DL3 С4 5 АН2 см X LU О U- НМ175/7 мвв J CF53Bem 5 о 2 i- AGM27

Полипротеин 2225 16 25 9 29 37 19 25 30 53 48 50 87 138 167

99,3 98,9 98,9 98,7 98,3 99,1 98,9 98,6 97,6 97,8 97,7 96,1 93,8 92,5

УР4 23 1 1 1 1 1

100 100 100 100 95,7 100 100 100 100 95,7 95,7 95,7 95,7 100

УР2 222 4 2 3 2 3 5

100 100 98,2 100 100 100 100 100 99,1 98,6 99,1 100 98,6 97,7

УРЗ 246 1 1 1 2 2 1 1 1 3 2 2 6 3 8

99,6 99,6 99,6 99,2 99,2 99,6 99,6 99,6 98,8 99,2 99,2 97,6 98,8 96,7

УР1 263 8 1 4 1 1 1 1 1 7 3 3 2 11 16

97 99,6 98,5 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 97,3 98,9 98,9 99,2 95,8 94

2А 71 1 1 1 1 1 2 2 1 6 11

100 98,6 100 100 100 98,6 98,6 98,6 98,6 97,2 97,2 98,6 91,5 84,5

2В 251 5 - 7 7 4 5 8 10 5 5 10 19 21

100 98 97,2 97,2 98,4 98 96,8 96 98 98 96 92,4 91,6

2С 335 4 6 - 7 10 6 7 9 14 16 19 22 25 36

98,8 98,2 97,9 97 98,2 97,9 97,3 95,8 95,2 94,3 93,4 92,5 89,3

ЗА 72 1 6 - 5 5 4 6 5 7 6 7 8 16 13

98,6 91,9 93,2 93,2 94,6 91,9 93,2 90,3 91,9 90,5 89,2 78,4 82,4

ЗВ 23 - 1 1

100 100 100 100 100 100 100 100 95,7 100 100 100 95,7

зс 219 1 - 1 3 1 1 2 1 1 3 7 11

100 99,5 99,5 98,6 100 99,5 99,5 99,1 99,5 99,5 98,6 96,8 95

зэ 489 2 4 - 6 8 2 3 4 7 8 8 34 47 45

99,6 99,2 98,8 98,4 99,6 99,4 99,2 98,6 98,4 98,4 93 90,4 90,8

Примечание - В столбцах в верхпей части ячейки указано число замен в соответствующем протеине, в нижней части ячейки - процент гомологии аминокислот. «-» отсутствие данных. Все данные приведены в сравнении с аминокислотами штамма МБ-7/4647.

В белке VP1, начиная с 26-й аминокислоты от N-конца, выявлены дополнительные 6 а.о. в сравнении со штаммом HAS-15 - Thr-Thr-Met-Arg-Asp-Leu. Надо отметить, что эта последовательность из 6 а.о. присутствует так же у остальных сравниваемых штаммов, в том числе и у штаммов НМ175/7, CR326 и GBM/HFS, на основе которых производятся вакцины от гепатита А. В работах Ю.А. Овчинникова с соавт. (1985) и В. Robertson с соавт. (1989) высказываются предположения, что делеция фрагмента белка VP1 (6 а.о.) штамма HAS-15 произошла в процессе адаптации вируса к клеточной культуре FRhK-4. Делеция в белке VP1, как у штамма HAS-15, обнаружена и у штаммов FG и GBM/FRhK.

Еще два точечных аминокислотных отличия от HAS-15 идентифицированы в составе белка VP1 Ala(534)->Val и Lys(660)->Glu. Второе отличие интересно тем, что у остальных сравниваемых штаммов также присутствует Glu 660, a Lys определяется только у штаммов HAS-15 и М2.

При сравнении расчётной вторичной структуры с помощью программы PSIPRED v. 2.6 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred /psiform.html) белков VP1 у штаммов HAS-15 и МБ-7/4647 предсказаны структурные различия в N-концевой области (рис. 4). В рамке на рис. 4 указана часть белка VP1,

HAS-15 * МБ-7/4647

:cooti с-*"¡ Шгоаьза^^тшьа^ьзздцдзззззвj

Predi __ ' C¿> Pr»¿i _]___

Predi ccc cecee cecee нассссссссссссссссгссед&ссй predi" Kccccwcccccéccccccccccciftaceaccccccccc

AXi VGODSCWSmSTEÜBVP№ir/GIKCKAMWatMCW3GVQ XAi VGQOSCGgSTTVS TaOMVeaPQVGltTHBOlfcCKAWBOKrt

10 20 30 40 10 20 30 40

с«*! i Зпаяздаш*вдпаяядзаз»я»1^ ■ с«»"

-ег-Л—1ПЯЯ--К^И --—ÍEZ3-

Predl ССССиЕВСССЕиШШНССССССССССССССССССШЦНЦ ААi APVGMrriaoeVIAKKVPETFPalJÍPGESRHTSDfiHSIY

Рис. 4. Предсказанная вторичная структура белков VP1 штаммов HAS-15 и МБ-7/4647.

Примечание - Conf - достоверность предсказания вторичной структуры. Pred -предсказанная вторичная структура. АА - аминокислотная последовательность. Цилиндр - а-спираль, стрелка - ß-складка. Рамкой обозначена часть белка VP1, отсутствующая в протеине штамма HAS-15

отсутствующая в протеине штамма HAS-15. У штамма HAS-15 обнаружена небольшая а-спираль (14-15 а.о.), которой нет у штамма МБ-7/4647. Следующая за а-спиралью Р-складка (3&-37а.о.) у штамма HAS-15 оказалась короче, чем р-складка (26-28 а.о.) у штамма МБ-7/4647. Если у штамма МБ-7/4647 р-складка начиналась там, где у HAS-15 была делеция и до следующей р-складки было 22 а.о., то у HAS-15 до следующей р-складки было 7 а.о. Это было общим отличием штаммов HAS-15, FG, GBM/FRhK с делецией в данном районе белка VP1.

Известно, что N-концевые части белков VP1, VP2, VP3 ВГА участвуют в формировании капсида. Возможно, что вышеупомянутые различия влияют на эффективность процесса сборки вирионов в клетках определенных хозяев. Изменения в структуре основного поверхностного белка может свидетельствовать об изменении взаимодействия вируса с рецепторами хозяйских клеток.

Следует отметить, что отличие, выявленное в белке VP3 Asp(316)->His в результате замены G(1692)->C, присутствует только у исследуемых штаммов МБ-7/4647 и МБ-7/293. Та же позиция в белке VP3 Asp(316)->Ala отлична у адаптированных к культуре клеток FRhK быстрорастущих штаммов НМ175/43С и НМ175/24А от всех сравниваемых штаммов, что, по-видимому, говорит о критичности отличий в данном районе для скорости их роста в культуре клеток.

Остальные аминокислотные отличия были отмечены в неструктурных белках: 2С - 4, 3 А - 1 и 3D - 2.

В сайте протеолиза 2В/2С выявлено отличие Phe(1092)->Ile у штамма МБ-7/4647 от штамма HAS-15. Аминокислота Phe встречается в данном районе у остальных сравниваемых штаммов, а Не только у штамма NOR-21 генотипа IIIA. Протеин 2С обладает хеликазной активностью и модификации в этом белке напрямую влияют на синтез РНК. Следовательно, выявленные изменения

в сайте протеолиза 2В/2С влияют на увеличение скорости репликации штамма МБ-7/4647. i

В гене, кодирующем неструктурный белок 2С, отличия были локализованы в позициях 4014 [1089 (Phe->Ile)], 4838, 4913 [1388 (Met->Leu)], 4949 [1400 (Ser->Asn)] и 4997 [1416 (Phe->Ser)] (в квадратных скобках указаны значимые отличия, приводившие к замене а.о.). Ранее Эмерсоном при исследовании генетических особенностей вариантов штамма НМ-175, быстрорастущих на культуре клеток FRhK штаммов НМ175/43С (М59809) и НМ175/24А (М59810), были выявлены отличия в генах 2В (3889 (Ala->Val)) и 2С (4087 (Lis->Met), 4222 (Phe->Ser)) критичные, по их мнению, для скорости роста в культуре клеток. Однако таких отличий в гене 2В штамма МБ-7/4647 нами обнаружено не было, а в гене 2С были отличия в других районах. Таким образом, можно говорить о влиянии отличий в гене 2С штамма МБ-7/4647 на адаптацию к культуре клеток 4647, но их влияние на скорость роста требует дальнейших исследований.

В белке ЗА у штамма МБ-7/4647, участвующем в обеспечении мембранной локализации репликативного комплекса, идентифицировано отличие от HAS-15 в N-концевой области (10-й а.о.) А1а(1433)->Рго. Обе аминокислоты, Ala и Pro, являются неполярными алифатическими аминокислотами.

Расчётный внутримембранный участок белка ЗА штаммов МБ-7/4647 и HAS-15 локализуется в районе 38-57 а.о. (ТМНММ Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/).

В белке 3Dpo1 (РНК-полимераза) были обнаружены два отличия: уникальное Gly(2006)->Ala и Cys(2034)->Tyr, встречающееся в этой же позиции протеина у штаммов GBMwt, GBM/FRhK, CF53Bern, AGM27. Данные отличия локализовались в функциональном субдомене РНК-полимеразы и могли влиять на эффективность репликации.

Таким образом, было подтверждено, что штамм МБ-7/4647 относится к генотипу IA и ближайшим к нему из известных штаммов является вакцинный штамм HAS-15. Сравнительный анализ выявил мутации, которые могут быть ассоциированы с ростовыми свойствами штамма МБ-7/4647.

Сравнительный анализ нуклсотндных и аминокилотных последовательностей штамма МБ-7/293, адаптированного к росту в культуре клеток НЕК293, и штамма МБ-7/4647, адаптированного к росту в культуре клеток 4647, с аналогичными характеристиками известных штаммов ВГА

С целью выявления и анализа молекулярных изменений, накапливающихся в геноме ВГА в процессе адаптации вируса к репликации in vitro, и определения их влияния на репликативные свойства вируса была проведена адаптация штамма МБ-7/4647 ВГА к культуре клеток НЕК293 и получен штамм МБ-7/293.

При этом был проведен сравнительный анализ скорости роста штаммов МБ-7/293 и МБ-7/4647. Кинетика накопления антигена и инфекционного вируса в клетках НЕК293 и 4647, инфицированных штаммами ВГА МБ-7/293 и МБ-7/4647, показана на рис. 5.

В инфицированных штаммом МБ-7/293 клетках НЕК293 появление вирусспецифического антигена и инфекционного вируса достигает значительного уровня уже к 4-м суткам после заражения, максимальные значения отмечаются на 6-7 сутки. Штамм МБ-7/4647 на культуре НЕК293 реплицируется очень слабо. На культуре клеток 4647 достоверных отличий в репликативной активности штаммов МБ-7/293 и МБ-7/4647 не отмечено. Ранее подобная способность к репликации была отмечена у штамма GBM при адаптации к культурам клеток FRhK и HFS. Штамм GBM/FRhK мог расти в дальнейшем только на FRhK, в противоположность этому вариант GBM/HFS мог продуцироваться и на FRhK и HFS.

А.

Срок культивирования, сутки

-Л-МБ-7/293, ККНЕК29Э -»-МБ-7/4647, КК Н£К29з| —&—МБ-7/293. КК4647 -о-МБ-7/4647. КК 4647 |

Срок культивирования, сутки

-*-МБ-7/293, ККНЕК233 -о-МБ-7М647, ККНЁК293! -д-МБ-7/293, КК4647 -о-МЕ-7/4647, КК 4647 |

Рис. 5. Кинетика накопления инфекционного ВГА (А) и антигена (Б) в клетках НЕК293 и 4647 инфицированных штаммом МБ-7/293 и штаммом МБ-7/4647. Примечание - КК-культура клеток

Кинетика накопления вирусспецифического антигена и инфекционного вируса в клетках НЕК293, инфицированных штаммом МБ-7/293, существенно опережает таковую в клетках 4647, инфицированных штаммом МБ-7/4647 или штаммом МБ-7/293. Эффективность системы наработки ВГА при использовании штамма МБ-7/293 и клеток НЕК293 (максимальные значения титра вирусспецифического антигена - 1/512 и инфекционного титра вируса ИД50/мл - 1/2-107) значительно превосходит штамм МБ-7/4647 в клетках 4647 (1/64 и 1/106 соответственно).

Таким образом, штамм МБ-7/293 при культивировании на культуре клеток НЕК293 значительно превосходит штамм МБ-7/4647 при культивировании на клетках 4647 как по продуктивности (количеству инфекционного вируса и вирусспецифического антигена), так и по скорости накопления антигена и вируса.

Была определена полная нуклеотидная последовательность геномной РНК штамма ВГА МБ-7/293 (110437707) и проведено сравнение нуклеотидных последовательностей геномных РНК штаммов МБ-7/293 и МБ-7/4647 (табл. 3). Обнаруженные замены локализовались в 5-НТО и генах белков УРЗ, УР2, УР1, 2В, 2С, ЗА ЗС, ЗБ. Всего было выявлено 23 нуклеотидные замены в' сравнении с геномом МБ-7/4647, из них 10 замен привели к изменениям в аминокислотной последовательности в белках УРЗ, УР1, 2В, 2С и ЗА.

В геноме штамма ВГА МБ-7/293 в 5'-НТО позиции 13, 21 и 702 н. отличались от штамма ВГА МБ-7/4647. Первые две замены приводили к увеличению петли в расчётной вторичной структуре РНК, что, вероятно, влияло на репликацию, так как в районе 1-98 н. находятся значимые для репликации домены 1 и И.

Из табл. 3 видно, что аминокислотные отличия штаммов МБ-7/4647 и МБ-7/293 находятся в структурных белках УРЗ (1 замещение), УР1 (1 замещение), и неструктурных белках 2В (5 замещений) и 2С (3 замещения).

В гене 2В интересна замена А(3263)-^Т, связанная с замещением Ьу5(839)->А$п. Оказалось, что замещение Ьу5(839)->А$п в сайте протеолиза 2А/2В штамма МБ-7/293 присутствует и у быстрорастущих в культуре клеток РЯЬК штаммов НМ175/43С и НМ175/24А. Ввиду этого, данный район в .белке 2В (839 а.о.) в сайте протеолиза 2А/2В, также является определяющим в формировании быстрорастущих штаммов ВГА при. адаптации их к культурам клеток.

При анализе расчётного гидрофобного профиля было выявлено, что положения замещений аминокислот, произошедшие в белках 2В и 2С штамма

МБ-7/293 на Ы-концевых участках, в гидрофильной части белка 2В (84-й а.о.) и С-концевом участке белка 2В, находятся на поверхности белковых структур и значимы для функционирования белков и во взаимодействии с другими белками.

Таблица 3.

Отличия в нуклеотидных последовательностях геномов и в аминокислотных последовательностях штаммов МБ-7/293 и МБ-7/4647 (позиции н. по геному и

Район генома Позиция н. в геноме Нуклеотид в МБ-7/4647 Нуклеотид в МБ-7/293 [замещение а.о.]

5'-НТО 13 С Т

21 в А

702 Т в

УР2 998 т С

УРЗ 1520 А Т[Е(257)->0]

УР1 2282 Т С

2505 Т А [Ц586)-»М]

2В 3263 А 'Г [К(839)-»Ы]

3277 А в [У(844)-»С]

1; 3287 в С [Е(847)-»0]

3327 в А [0(861)->М]

3425 С Т

3504 т А [У(919)->М]

2С 4014 А Т [N(1089)-» У]

4063 в А[8(1105)->Ы]

4140 в А[У(1131)-»1]

4712 Т С

ЗА 5051 . т С

3 С 5559 с Т

5744 с Т

ЗБ 6194 А С

6596 С Т

6902 т С

Таким образом, перечисленные отличия в 5'-НТО (13, 21 и 702 н.), а также в генах \'РЗ, 2В и 2С возникали при адаптации вируса к клеткам НЕК293. Замены в 5'-НТО (13, 21 н.) и в гене 2В (3263 н.) приводили к более быстрой репликации штамма МБ-7/293.

В работе впервые охарактеризованы полные нуклеотидные последовательности геномов быстрорастущих штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293 на культурах клеток 4647 и НЕК293 соответственно, перспективных доя производства диагностических и вакцинных препаратов.

Выводы

1. В результате проведения ОТ-ПЦР серопозитивных и серонегативных в ИФА на IgM к ВГА образцов сывороток от пациентов, поступивших в 2001 -2002 годах в больницы Новосибирска, Барнаула и Иркутска, в 101 случае была обнаружена РНК ВГА и определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов VP1,2А, 2В.

2. Сравнительный анализ частичных (VP1-2A-2B) нуклеотидных последовательностей выявленных изолятов ВГА показал принадлежность их всех к IA-субгенотипу. Выявленные изоляты образовали внутри IA-субгенотипа 2 группы, что свидетельствует об одновременной циркуляции двух вариантов ВГА 1А-субтипа.

3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293 с геномами известных штаммов ВГА выявил отличия, которые играют ключевую роль в увеличении скорости репликации, а именно: дупликацию района в 13 н. в 5'-НТО (149-161 н.), отличия в гене VP3 (1692 н.) и в сайте протеолиза 2В/2С.

4. Показано, что замены в 5'-НТО (13, 21 и 702 н.), а также в генах VP3, 2В и 2С возникали при адаптации вируса к клеткам НЕК293. Замены в 5'-НТО (13, 21 н.) и в сайте протеолиза 2А/2В приводили к более быстрой репликации штамма МБ-7/293.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1. Терновой В.А., Чаусов Е.В.. Бондаренко Т.Ю.. Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов C.B. Генетическое разнообразие вируса гепатита А в Сибири // Вопросы вирусологии. - 2006. - Т. 51. - № 1. - С. 23-27.

2. Бондаренко Т.Ю.. Терновой В.А., Святченко В.А., Киселев H.H., Чаусов Е.В., Мунтянова М.А., Немцов Ю.В., Яшин В.В., Крюк Н.И., Куслий А.Г., Никулин Л.Г., Нетесов C.B. Полная геномная последовательность быстро реплицирующегося штамма вируса гепатита А МБ-7 и ее характеристика в сравнении с нуклеотидными последовательностями других штаммов вируса гепатита А // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2010. -№ 1.-C.33-39.

Патент

1. Святченко В.А. Киселев H.H., Терновой В.А., Бондаренко Т.Ю.. Куслий А.Г., Никулин Л.Г., Мироненко В.В., Молокеев A.B., Ясудис Г.В., Гусева И.А., Нетесов C.B. Штамм вируса гепатита А (ГепА-293), адаптированный к культуре клеток"НЕК293 для приготовления вакцинных и диагностических препаратов. Патент РФ №2306336, БИ №10 от 10.04.07.

Доклады и тезисы на конференциях

1. Чаусов Е.В., Терновой В.А., Бондаренко Т.Ю.. КочневаГ.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Нетесов C.B. Генетическое разнообразие вируса гепатита А в Сибири // «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека», Украина, Судак, 2004, С.154-156.

2. Бондаренко Т.Ю., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Яшин В.В., Мунтянова М.А., Нетесов C.B. Полная нуклеотидная последовательность генома цитопатического штамма вируса гепатита А МБ-7 // «Генодиагностика инфекционных болезней», Сосновка, Новосибирская обл., 2005, С.33-34.

3. Бондаренко Т.Ю.. Терновой В.А., Святченко В.А., Киселев H.H., Нетесов C.B. Исследование молекулярной структуры штаммов ГепА-293 и МБ-7 вируса гепатита А // «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты и проблемы безопасности крови», Томск, 2007, С. 140-141.

4. Бондаренко Т.Ю., Терновой В.А., Святченко В.А., Киселев H.H., Нетесов, C.B. Сравнительный. анализ молекулярных механизмов адаптации штамма МБ-7 вируса гепатита А к культурам клеток 4647 И НЕК293 // «Молекулярная диагностика-2010», Москва, 2010, С.202-203.

БОНДАРЕНКО ТАТЬЯНА ЮРЬЕВНА

ВИРУС ГЕПАТИТА А: ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗОЛЯТОВ, ВЫЯВЛЕННЫХ В СИБИРСКОМ РЕГИОНЕ, И ШТАММОВ, АДАПТИРОВАННЫХ К КУЛЬТУРАМ КЛЕТОК.

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Подписано в печать 26.01.2011. Заказ №4. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии Института катализа СО РАН 630090 Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бондаренко, Татьяна Юрьевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие сведения о гепатите А и его возбудителе.

1.2. Жизненный цикл ВГА.

1.3. Клиническая картина гепатита А, динамика иммунного ответа, диагностика.

1.4. Генотипы и географическое распространение ВГА.

1.5. Адаптация ВГА к росту в культуре клеток.

1.6. Вакцины.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Вирус гепатита A: генетические особенности изолятов, выявленных в Сибирском регионе, и штаммов, адаптированных к культурам клеток"

Гепатит А (ГА) как заболевание широко распространен во всем мире: по данным ВОЗ ежегодно в мире регистрируется в среднем 1,4 млн. случаев заболевания вирусным ГА. По данным ФГУЗ «Федерального центра гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в последние 10 лет заболеваемость ГА в России регистрируется в пределах от 5 до 15 случаев на 100 тыс. населения. Вместе с тем ГА может протекать в скрытой, бессимптомной форме и поэтому реальная заболеваемость ГА, возможно, значительно превышает число задокументированных случаев. Основной механизм заражения ГА фекально-оральный, реализуемый пищевым, водным и контактно-бытовым путями.

У взрослых людей ГА обычно протекает остро, а у детей в большинстве случаев характерно бессимптомное течение заболевания (Lednar, 1985, Dotzauer, 2008).

ГА в основном заканчивается выздоровлением. Иногда возможны осложнения, проявляющиеся рецидивами и поражениями желчевыводящих путей. Случаи смертельных исходов регистрировались у больных старшего возраста и при сопутствующих заболеваниях (Tabor, 1984; Gust, 1992; Hanna, 2000). Риск летального исхода при гепатите А составляет менее 0,1% у детей, у людей моложе 40 лет риск возрастает до 0,3%, у лиц старше 40 лет- до 2,1 % (Vento, 1998). В Шанхае во время большой вспышки ГА в 1988 г. было зарегистрировано 47 случаев смерти на 300 000 человек, что составило 0,015 % (Yao, 1991).

Возбудителем заболевания является вирус ГА (ВГА), представитель рода Hepatovirus, семейства Picornaviridae, отряда Picornavirales. Плюс-РНК-геном ВГА имеет длину в 7500 нуклеотидов (н.). К 5'- концу РНК ВГА ковалентно присоединен белок VPg, а 3'-конец полиаденилирован. Имеются 5'- и 3'-нетранслируемые области (НТО). Единственная открытая рамка считывания кодирует полипротеин длиной около 2228 аминокислотных остатков (а.о.), который ко- и посттрансляционно расщепляется клеточными и вирусоспецифической протеазами на структурные (VP1, VP2, VP3 и VP4) и неструктурные (2А, 2В, 2С, ЗА, ЗВ, ЗСрго и 3Dpo1) белки.

Лабораторная диагностика ГА в начале его изучения включала выявление антигена (АГ) в фекалиях и в сыворотке крови и определение различных классов антител (AT) к ВГА в сыворотке крови, в первую очередь AT класса IgM. Обнаружение AT к ВГА класса IgG указывает на перенесенную инфекцию или поствакцинальный иммунитет. Важно отметить, что виремия и выделение вируса во внешнюю среду начинаются после первой недели от начала контакта с возбудителем, т. е. раньше появления клинических симптомов (данные CDC, http://www.cdc.gov/hepatitis/HAV/index.htm). Таким образом, происходит большое и неконтролируемое выделение вирионов зараженным человеком и их распространение.

В последнее время всё чаще используется детекция РНК ВГА при помощи метода обратной траснкрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР), который является очень чувствительным, специфичным и быстрым способом выявления РНК возбудителя. Выявление РНК ВГА при помощи ОТ-ПЦР в крови и фекалиях людей очень важно на ранних сроках развития болезни, до появления клинических симптомов и в сложных случаях при смешанных инфекциях (Глухов, 2004). На данный момент общепринятым для генотипирования и исследования вариабельности ВГА является филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента генома (168 н., 2925-3092 н.), включающего 'район соединения генов VP1/2A и содержащего прилегающие к нему части генов VP1 и 2А ВГА (Robertson, 1992).

Все изоляты ВГА в настоящее время подразделяют на шесть генотипов (Robertson, 1992, Costa-Mattioli, 2003). Генотипы I - III ВГА вызывают гепатит А у людей, IV — VI генотипы циркулируют в популяциях обезьян. Преобладающим у людей является генотип IA (Costa-Mattioli, 2003; Davidkin, 2007; Nainan, 2005; Pina, 2001; Robertson, 1992).

К сожалению, ранее определение генотипов ВГА, циркулирующих на территории России проводилось только среди больных в европейской части и

Якутии (Карандашова, 2006; Davidkin, 2007). Анализ генотипов ВГА, циркулирующих на территории Сибири, до сих пор не проводился. Учитывая численность населения, проживающего в Сибири, очевидна актуальность анализа изолятов ВГА в Сибирском регионе.

Эффективной мерой для предупреждения ГА является вакцинация населения. В Российской Федерации (РФ) вакцинация от ГА применяется с конца 90-х годов в рамках календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям (http://www.privivki.ru/calendar/mssian.htm). В США прививка от ГА включена в национальный календарь как обязательная для всех детей в возрасте 12-23 месяцев (http://www.cdc.gov/vaccines/events/calendar.htm). В РФ в последнее время начал подниматься вопрос о массовой вакцинации детей от ГА, что требует получения вакцинных препаратов в достаточно больших количествах. Используемые в настоящее время штаммы ВГА для получения вакцин от ГА («Avaxim» (France), «Havrix» (Belgium), «Vaqta» (USA)) обладают низкой скоростью роста (21-28 дней) на культуре клеток MRC-5 (диплоидные клетки легкого человека). Ис ходные изоляты ВГА, используемые в приготовлении вакцин, имеют различное географическое происхождение, но вакцины на их основе применимы повсеместно, т. к. вариации генома малозначимы для серологических характеристик.

Вакцина «Геп-А-ин-Вак», производимая в России, основана на штамме HAS-15 ВГА, нарабатываемом на культуре клеток 4647 (клетки почки зеленой мартышки). Как и зарубежные аналоги, данный метод наработки вируса характеризуется как низкой скоростью роста, так и невысокой продуктивностью. В связи с этим актуальными становятся поиск и изучение штаммов ВГА, имеющих высокую скорость роста на культуре клеток, как экономически более выгодных при производстве вакцин.

В ГНЦ ВБ «Вектор» в начале 90-х годов в результате адаптации изолята ВГА, выделенного от больного гепатитом А (г.Новосибирск, 1988 г.), к культуре клеток FRhK-4 (клетки почки эмбриона макаки-резус) был получен штамм МБ-7, который обладает высокой скоростью роста. Были опубликованы данные о нуклеотидной последовательности лишь небольшого участка гена VP1 штамма МБ-7 (Майданюк, 1993). Впоследствии данный штамм после проведения последовательных пассажей был адаптирован к культуре клеток 4647 (штамм МБ-7/4647), аттестованной на территории России для использования при производстве вакцинных препаратов. В дальнейшем штамм МБ-7/4647 был использован для адаптации к культуре клеток НЕК293 (клетки почки эмбриона человека), применяемой для наработки иммунобиологических препаратов. Полученный штамм МБ-7/293, как и МБ-7/4647, обладает высокой скоростью роста, что делает перспективным использование этих штаммов при разработке экономически выгодных профилактических и диагностических препаратов. К сожалению культуральные и молекулярно-генетические свойства данных штаммов до сих пор недостаточно исследованы.

Таким образом, отсутствие информации о генетических особенностях изолятов ВГА в Сибирском регионе и необходимость детальной молекулярно-генетической характеризации быстрорастущих штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293, адаптированных к культурам клеток 4647 и НЕК293 соответственно, безусловно определяют актуальность данной работы.

В соответствии с этой целью, были сформулированы следующие основные задачи исследования:

1. Провести анализ серопозитивных и серонегативных в ИФА на IgM к ВГА образцов сывороток от пациентов, поступивших в 2001-2002 годах в больницы Новосибирска, Барнаула и Иркутска, на присутствие РНК ВГА с помощью ОТ-ПЦР и в случае положительного результата определить нуклеотидные последовательности фрагментов генов белков VP1, 2А и 2В ВГА.

Научная новизна и практическая значимость работы:

Впервые на протяжении полного эпидемического сезона (2001-2002 годах) было проведено изучение клинических изолятов ВГА от больных с острыми гепатитами в 3-х крупных городах Сибири: Барнауле, Новосибирске и Иркутске. Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов ВГА (УР1, 2А и 2В) выявленных изолятов.

Таким образом, результаты данных исследований вносят существенный вклад в изучение генетического разнообразия ВГА на территории Сибирского региона РФ и могут быть использованы для совершенствования диагностических и профилактических препаратов.

Положения, выносимые на защиту.

Заболевания ГА в 2001-2002 годах в городах Барнауле, Новосибирске и Иркутске (в 101 выявленном случае) были обусловлены двумя вариантами ВГА субгенотипа IA.

Ускоренную репликацию у штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293 в культурах клеток 4647 и НЕК293 определили геномные отличия от сравниваемых штаммов в виде дупликации района в 13 нуклеотидов в 5'-НТО (149-161 н.) и точечных замен в гене VP3 (1692 н.) и в сайте протеолиза 2В/2С.

Геномные отличия штамма ВГА МБ-7/293 от штамма ВГА МБ-7/4647 в 5'-НТО (13,21 н.) и в сайте протеолиза 2А/2В приводят к уменьшению времени наработки вируса с 7-12 дней до 4-7 дней.

Апробация работы и публикации. Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях: «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека» (Украина, Судак, 2004), «Генодиагностика инфекционных болезней» (Сосновка, 2005), «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты и проблемы безопасности крови» (Томск, 2007), «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010). По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК, получен патент РФ.

Вклад автора:

Данные секвенирования получены лично автором и в соавторстве с к.б.н. Терновым В.А. и к.б.н. Чаусовым Е.В. Сравнительный анализ проведен лично автором. Культивирование и оценка эффективности культивирования штаммов ВГА проводились совместно с к.б.н Святченко В.А. и с.н.с. Киселевым H.H.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Бондаренко, Татьяна Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. В результате проведения ОТ-ПЦР серопозитивных и серонегативных в ИФА на 1§М к ВГА образцов сывороток от пациентов, посту пивших в 20012002 годах в больницы Новосибирска, Барнаула и Иркутска, в 101 случае была обнаружена РНК ВГА, и определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов УР1, 2А, 2В.

2. Сравнительный анализ частичных (УР1-2А-2В) нуклеотидных последовательностей выявленных изолятов ВГА показал принадлежность их I всех к 1А субгенотипу. Выявленные изоляты образовали внутри 1А-субгенотипа 2 группы, что свидетельствует об одновременной циркуляции двух вариантов ВГА 1А субтипа.

3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293 с геномами известных штаммов ВГА выявил отличия, которые играют ключевую роль в увеличении скорости репликации, а именно: дупликацию района в 13 н. в 5'-НТО (149-161 н.), отличия в гене УРЗ (1692 н.) и в сайте протеолиза 2В/2С.

4. Показано, что замены в 5'-НТО (13, 21 и 702 н.), а также в генах УРЗ, 2В и 2С возникали при адаптации вируса к клеткам НЕК293. Замены в 5'-НТО (13, 21 н.) и в сайте протеолиза 2А/2В приводили к более быстрой репликации штамма МБ-7/293.

Благодарности

Автор выражает благодарность своим коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена диссертационная работа, а именно: к.б.н. Терновому В.А., д.б.н., член-корр. РАН, проф. Нетёсову C.B., к.б.н. Святченко В.А., Киселеву H.H., к.б.н. Чаусову Е.В., к.б.н. Кочневой Г.В., к.б.н. Сиволобовой Г.Ф., к.б.н. Гражданцевой A.A., к.б.н. Плясуновой И.В., к.ф.-м.н Швалову А.Н., д.б.н., проф. Локтеву В.Б., к.б.н. Ерошкиной Г.А., Мунтяновой М.А., Немцову Ю.В., Яшину В.В., к.б.н. Куслий А.Г., Никулину Л.Г., Акинфеевой ЛА., а также врачам инфекционных больниц, которые осуществляли сбор образцов: в 1-ой Муниципальной инфекционной клинической больнице (г. Новосибирск) Сахаровой Е.Г., Черноусовой Н.Я., Красильниковой И.В., Козлову Д.И., Бурмистровой Т.Г., Томиленко Т.Г., Фихман Е.А., Мельниковой О.В., Ульяновой Я.С.; в городской инфекционной клинической больнице N5 (г. Барнаул) Гранитову В.М., Клиновенко Н.Г., Хорошиловой И.А., Матрос О.И.; в городской инфекционной клинической больнице (г. Иркутск) Губановой Л.И., Четверикову А.П., Данилову Ю.А., Леоненко В.В.

Настоящая работа выполнена при поддержке:

- гранта МНТЦ-1637Р «Изучение встречаемости, распределения генотипов и молекулярной вариабельности вируса гепатита С в сибирских регионах России»;

-грантов Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ «НШ-387.2008.4»; «НШ-65387.2010.4»; -гранта МФТИ №00012/00049 «Создание референс-лаборатории для ПЦР-диагностики вирусных гепатитов»;

-Госконтракта №02.740.11.0767 «Выявление вирусных возбудителей заболеваний актуальных для здравоохранения Западной Сибири (гепатиты, гастроэнтериты, серозный менингит), изучение их генетического разнообразия в целях разработки и совершенствования диагностикумов».

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с поставленными задачами нами был проведен анализ 131 образца (45 сывороток, 86 фекалий) от пациентов с серопозитивными в ИФА сыворотками, поступивших в 2001-2002 годах в больницы Новосибирска, Барнаула и Иркутска с диагнозом «острый гепатит» и 101 образец серонегативных в ИФА сывороток от пациентов с диагнозом «вирусный гепатит невыясненной этиологии» на присутствие РНК ВГА.

С помощью ОТ-ПЦР- анализа РНК ВГА была выявлена у 101 пациента (89 серопозитивных и 12 серонегативных) и определена нуклеотидная последовательность фрагментов генов VP 1, 2В и гена 2А ВГА.

Проведен сравнительный анализ полученных данных с известными нуклеотидными последовательностями различных штаммов ВГА. Филогенетический анализ показал принадлежность всех выявленных изолятов ВГА к IA субгенотипу. Выявленные изоляты образовывали внутри IA субгенотипа 2 группы (ветви). 1-я группа объединяла 92 изолята (91 %), выделенных на территории трех городов (Новосибирск, Барнаул, Иркутск), и близка к штаммам ВГА HAS-15 (США), CR326 (Коста Рика); М2 (Куба), IT-ILG-00 (Италия) и BaliA06-72 (Индонезия). 2-я группа объединяла изоляты, выделенные в г. Новосибирске TTG413 и TTG415, г. Барнауле KNG305 и г. Иркутске (CHAP 310, 319, 323; LVV 77, 88, 92) и была близка к европейским российским штаммам и штаммам (АН2, FH2) из Японии. При этом 20 изолятов по исследуемому району генома оказались идентичными между собой и не отличались от штамма ВГА HAS-15. 81 изолят в части генома (VP1/2A, 2В) имел уникальные нукггеотидные замены, не имеющие аналогов в международных базах данных. 66 изолятов имели отличия от штамма HAS-15 в исследуемых белках VP1, 2А и 2В. Некоторые замещения в белках VP1, 2А и 2В оказались сходными, объединяя таким образом изоляты циркулирующие в данном регионе.

Были секвенированы геномы быстрорастущих на культурах клеток 4647 и НЕК293 штаммов ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293 и проведен их сравнительный анализ с геномами других быстрорастущих и медленно растущих на культурах клеток штаммов ВГА.Было показано, что штамм МБ-7/4647 относится к субгенотипу IA ВГА и близок по нуклеотидным последовательностям штамму HAS-15 99,4 % основе вакцины «ГЕП-А-ин-ВАК» (Россия). Со штаммом GBM (основе вакцины «Avaxim», Pasteur Merieux, France) - 96.3 % гомологии; 96.1 % со штаммом CR-326 (основе вакцины «Vaqta», Merck, USA); и 91.2% со штаммом НМ-175 (основе вакцины «Havrix», GSK, Belgium). При сравнении геномов штаммов МБ-7/4647 и HAS-15 выявлено 48 нуклеотидных отличий (в 5'НТО-13, в генах белков VP 1-18, VP3-1, 2С-6, ЗА-З и 3D-4). Из них 16 отличий привели к отличиям в аминокислотных последовательностях вирусных белков.

При сравнении геномов штаммов МБ-7/4647 и МБ-7/293 были обнаружены 23 нуклеотидных замены (в 5'-НТО-3, в генах VP2-1, VP3-1, VP 1-2, 2В-6, 2С-4, ЗА-1, ЗС-2, 3D-3), из них 10 - привели к изменениям в аминокислотных последовательностях белков.

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей выявил уникальные отличия от сравниваемых штаммов, которые могли объяснить быстрый рост обоих полученных новых вариантов штамма МБ-7. В частности, в 5'-НТО (149-161 н.) у штаммов МБ-7/4647 и МБ-7/293 и у других адаптированных к культуре клеток быстрорастущих штаммов НМ 175/43С, НМ175/24А присутствовала вставка-повтор из 13 нуклеотидов, которая отсутствовала в 5'-НТО 15-ти других сравниваемых штаммов, не обладающих быстрым ростом. В белке VP3 штаммов МБ-7/4647 и МБ-7/293 присутствовала His(316) вместо Asp в отличие от других сравниваемых штаммов. У быстрорастущих штаммов ВГА НМ175/43С (М59809) и НМ175/24А (М59810) в белке VP3 присутствовало замещение в том же месте белка Ala (316) вместо Asp. В белке 3Dpo1 (РНК-полимераза) штаммов МБ-7/4647 и МБ-7/293 по сравнению с HAS-15 были обнаружены два отличия: уникальное

Gly(2006)->Ala, и Cys(2034)-^Tyr, встречающееся у штаммов GBMwt, GBM/FRhK, CF53Bern, AGM27. Данные отличия локализовались в функциональном субдомене РНК-полимеразы и могли влиять на эффективность репликации.

В сайте протеолиза 2В/2С выявлено отличие Phe(1092)->Ile у штамма МБ-7/4647 и МБ-7/293 от штамма HAS-15 и других сравниваемых штаммов.

В 5'-НТО в геноме штамма ВГА МБ-7/293 найдены отличия в 13-м, 21-м и 702-м н. от штамма ВГА МБ-7/4647, которые возникали при адаптации вируса к клеткам НЕК293. Замены в 5'-НТО (13, 21 н.) и в гене белка 2В (3263 н.) приводили к более быстрой репликации штамма МБ-7/293.

Таким образом, в работе впервые были исследованы и охарактеризованы изоляты, выявленные в 2001-20021 годах в Сибирском регионе, и быстрорастущие штаммы ВГА МБ-7/4647 и МБ-7/293, перспективные для производства диагностических и вакцинных препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бондаренко, Татьяна Юрьевна, Кольцово

1. Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь вирусные гепатиты. Изд.2-е. М.- Амипресс.- 304с.

2. Бондаренко A.JL, Устюжанов В., Вожегова П., Стражникова Г.А. Взаимосвязь антигенов HLA с клиническими особенностями микст-инфекции гепатита и носительства HBV.// ЖМЭИ.- 2007.-№3-С.30-34.

3. Бондаренко А.Л. Вирусные гепатиты у подростков. Киров.- 2002.

4. Виноградова Е., Яковлев A.A., Демиденко Т. П. Вирусный гепатит А: замедленный случай // Клин. Медицина.- М.-1996;74(9):29-31.

5. Воробьев Д.Г. Вторичная структура РНК и методы её расчета/ http://www.bionet.nsc.ru/chair/cib/lektcii/ Lecture5Part3 .html.

6. Глухов А.И., Гордеев С.А., Альтшулер M.JI., Блинкова Л.П., БыченкоI

7. А.Б., Тенцов Ю.Ю., Северин С.Е. Исследование эффективности и области применения метода гнездовой ПЦР при диагностике гепатита А. // ЖМЭИ. -2004-№б.-С.88-91.

8. Жданов В.М., Ананьев В.А., Стаханов В.М. Вирусные гепатиты. М.-Медицина.- 1986.- С.20-63.

9. Змызгова A.B., Тульченецкая Т.А. Антигены гистосовместимости HLA у больных острым вирусным гепатитом А и В. // Вирусные гепатиты.- М.-1983.

10. Иммунопрофилактика. 2000. Ред. Таточенко В.К., Озерецковский А. М.-2000.-С.80-83.

11. Инфекционные заболевания в России (1913-2002 гг.): Информ. сб. стат. и аналит. материалов. М.- 2003.-С.66-69.

12. Костюченко В.А, Месянжинов В.В. Архетиктура сферических вирусов. // . Успехи биологической химии.- 2002.-Т.42-С.177—192.

13. Кулик Л., Иванов B.C., Чикин Л.Д. // Биорганическая химия. 1994.- Т.20.-С.709- 718.

14. Кусов Ю.Ю., Эльберт Л.Б., Казачков Ю.А. Изучение специфическойIактивности, реактогенности и безопасности культуральной инактивированной вакцины против гепатита А. // Итоги науки и техники. Вирусология, 1990, Т.22, с. 14.

15. Миронова Л.Л., Курбатов A.B., Грачев В.П., Кузнецова В., Стобецкий

16. B.И. Перевиваемая линия клеток почек мартышки № 4647 и ее использование в вирусологической практике. // Вопросы вирусологии.-1984.-Т. 29-№4-С.503- 506.

17. Михайлов М.И., Шахгильдян И.В., Онищенко Г.Г. Энтеральные вирусные гепатиты (этиология, эпидемиология, диагностика, профилактика). — М.- 2007.

18. Овчинников Ю.А., Свердлов Е.Д., Царев С.А., Арсеньян С.Г., Рохлина Т.О., Чижиков В.Е., Петров H.A., Приходько Г.Г., Блинов В. М., Василенко

19. Рахманова А.Г., Пригожина В.К., Неверов В. А., Яковлев А. А., Виноградова Е. // Вирусные гепатиты «ССЗ».- СПб.- 1995.

20. Синглер М., Берг П., Гены и геномы. // Т.2.- М.- 1998.- С.114.

21. Тульченецкая Т.А., Покровский В.И., Змызгова А.В. Распределение антигенов HLA у больных острыми вирусными гепатитами А и В. // Сов. мед.- 1984.-№11.-С.100-102.

22. Указ Президента РФ от 24.12.1993 №2288, Федеральные законы от 02.03.1998 №30-Ф3, от 20.12.1999 № 214-ФЗ. «Основы законодательства РФ об охране здоровья граждан».

23. Эсауленко Е.В., Горчакова О.В., Мукомолов C.JL, Железнова В., Сабаш В. 1А субгенотип вируса гепатита А и варианты клинического течения заболевания у взрослых. // Инфекционные болезни.- 2006.-Т.7-С.541-549.

24. Acharya R., Fry Е., Stuart D., Fox G., Rowlands D. and Brown F. The three-dimensional structure of foot-and-mouth disease virus at 2.9 A resolution. // Nature. 1989. - V.337 - p.709-716.

25. Agol V.I. The 5'-untranslated region of picornaviral genomes. // Adv. Virus Res. 1991.-V.40-p.l03-180.

26. Allaire M. and James M. Deduction of the 3C proteinases' fold. // Nat. Struct. Biol. 1994. - V.l - p.505-506.

27. Aragones L., Bosch A. and Pinto R.M. Hepatitis A virus mutant spectra under the selective pressure of monoclonal antibodies: codon usage constraints limit capsid variability. // J. Virol. 2008. - V.82 - p.1688-1700.

28. Arankalle V.A. and Ramakrishnan J. Simian hepatitis A virus derived from a captive rhesus monkey in India is similar to the strain isolated from wild African green monkeys in Kenya. // J. Viral Hepat. 2009. - V.16 - p.214-218.

29. Arauz-Ruiz P., Sundqvist L., Garcia Z., Taylor L., Visona K., Norder H. and Magnius L.O. Presumed common source outbreaks of hepatitis A in an endemic area confirmed by limited sequencing within the VP1 region. // J. Med. Virol. -2001.- V.65 p.449-456.

30. Baird S.D., Turcotte M., Korneluk R.G. and Holcik M. Searching for IRES. // RNA. 2006. - V.12 - p.1755-1785.i

31. Beard MR, Lemon SM, Hepatitis A virus (Picornaviridae). Academic Press.1999.-P.631.

32. Beneduce F., Pisani G., Divizia M., Pana A. and Morace G. Complete nucleotide sequence of a cytopathic hepatitis A virus strain isolated in Italy. // Virus Res. 1995. - V.36 - p.299-309.

33. Binn L.N., Lemon S.M., Marchwicki R.H., Redfield R.R., Gates N.L. and Bancroft W.H. Primary isolation and serial passage of hepatitis A virus strains in primate cell cultures. // J. Clin. Microbiol. 1984. - V.20 - p.28-33.

34. Boggs J.D., Melnick J.L., Conrad M.E. and Felsher B.F. Viral hepatitis. Clinical and tissue culture studies. // JAMA. 1970. - V.214 - p. 1041-1046.

35. Borman A.M. and Kean K.M. Intact eukaryotic initiation factor 4G is required for hepatitis A virus internal initiation of translation. // Virology. 1997. - V.237 - p.129-136.

36. Bosch A., Guo K.J., Gonzalez-Dankaart J.F., Arnijas X., Guix S., Sanchez G., Ribes E. and Pinto R.M. Recombinant hepatitis A virus polyprotein expressed in E. eoliE. coli assembles in subviral structures.- 1997. V. - p. 27-31.

37. Bosch A., Gonzalez-Dankaart J.F. , Haro I., Gajardo R., Perez J.A. and Pinto R.M. A new continuous epitope of hepatitis A virus. // J. Med. Virol. 1998. -V.54 - p.95-102.

38. Bower W.A., Nainan O.V., Han X. and Margolis H.S. Duration of viremia in hepatitis A virus infection. // J. Infect Dis. 2000. - V.182 - p.12-17.

39. Brack K., Frings W., Dotzauer A. and Vallbracht A. A cytopathogenic, apoptosis-inducing variant of hepatitis A virus. // J. Virol. 1998. - V.72 -p.3370-3376.

40. Brncic N., Matic-Glazar D., Viskovic I., Grzetic M. and Racki S. Acute renal failure complicating nonfulminant hepatitis a in HLA-B27 positive patient. // Ren Fail. 2000. - V.22 - p.635-640.

41. Brown E.A., Jansen R.W. and Lemon S.M. Characterization of a simian hepatitis A virus (HAV): antigenic and genetic comparison with human HAV. // J. Virol. 1989. - V.63 - p.4932-4937.

42. Bruisten S.M., van Steenbergen J.E., Pijl A.S., Niesters H.G., van Doornum G.J. and Coutinho R.A. Molecular epidemiology of hepatitis A virus in Amsterdam, the Netherlands. // J. Med. Virol. 2001. - V.63 - p.88-95.

43. Byun K.S., Kim J.H., Song K.J., Baek L.J., Song J.W., Park S.H., Kwon O.S., Yeon J.E., Kim J.S., Bak Y.T. and Lee C.H. Molecular epidemiology of hepatitis A virus in Korea. // J. Gastroenterol. Hepatol. 2001. - V.16 - p.519-524.i

44. Chen Y., Mao J., Hong Y., Yang L., Ling Z. and Yu W. Genetic analysis of wild-type hepatitis A virus strains. // Chin Med. J. (Engl. ). 2001. - V.114 -p.422-423.

45. Ching K.Z., Nakano T., Chapman L.E., Demby A. and Robertson B.H. Genetic characterization of wild-type genotype VII hepatitis A virus. // J. Gen. Virol. -2002. V.83 -p.53-60.

46. Chironna M., Grottola A., Lanave C., Villa E., Barbuti S. and Quarto M. Genetic analysis of HAV strains recovered from patients with acute hepatitis from Southern Italy. // J. Med. Virol. 2003. - V.70 - p.343-349.

47. Chow M., Newman J.F., Filman D., Hogle J.M., Rowlands DJ. and Brown F. Myristylation of Picornavirus capsid protein VP4 and its structural significance. //Nature. 1987. - V.327 - p.482-486.

48. Cockayne E.A. Catarrhal jaundice, sporadic and epidemic, and its relation toiacute yellow atrophy of the liver. // QJM. 1912. - V.os6 - p. 1-29.

49. Cohen J.I., Ticehurst J.R., Feinstone S.M., Rosenblum B. and Purcell R.H. Hepatitis A virus cDNA and its RNA transcripts are infectious in cell culture. // J. Virol. 1987. - V.61 - p.3035-3039.

50. Costa-Mattioli M., Di Napoli A., Ferre V., Billaudel S., Perez-Bercoff R. andi

51. Cristina J. Genetic variability of hepatitis A virus. // J. Gen. Virol. 2003. - V.84- p.3191-3201.

52. Coulepis A.G., Locarnini S.A., Westaway E.G., Tannock G.A. and Gust I.D. Biophysical and biochemical characterization of hepatitis A virus. // Intervirology. 1982. - V.18 - p. 107-127.

53. Cui W., Dong Y., Fang F. and Li G. Tumor necrosis factor alpha, interleukin-6, interleukin-8, and interferon alpha in children with viral hepatitis. // J. Tongji Med. Univ. 1998. - V.18 - p.247-249.

54. Daemer R.J., Feinstone S.M., Gust I.D. and Purcell R.H. Propagation of human hepatitis A virus in African green monkey kidney cell culture: primary isolation and serial passage. // Infect Immun. 1981. - V.32 - p.388-393.

55. Dautovic-Krkic S. Persistence of IgM anti-HAV in prolonged form of HAV-infection. // Med. Arh. 2005. - V.59 - p.91-93.

56. DeStefano J.J. and Titilope O. Poliovirus protein 3AB displays nucleic acid chaperone and helix-destabilizing activities. // J. Virol. 2006. - V.80 - p. 16621671.

57. Diaz B.I., Sariol C.A., Normann A., Rodriguez L. and Flehmig B. Genetic relatedness of Cuban HAV wild-type isolates. // J. Med. Virol. 2001. - V.64 -p.96-103.

58. Dienstag J.L., Routenberg J.A., Purcell R.H., Hooper R.R. and Harrison W.O. Foodhandler-associated outbreak of hepatitis type A. An immune electron microscopic study. // Ann. Intern. Med. 1975. - V. 83 - p.647-650.

59. Dotzauer A., Hepatitis A Virus. Elsevier. Academic Press, London. 2008, p. 343-350.

60. Duke G.M. and Palmenberg A.C. Cloning and synthesis of infectious cardiovirus RNAs containing short, discrete poly(C) tracts. // J. Virol. 1989. -V.63 - p. 1822-1826.

61. Duke G.M., Osorio J.E. and Palmenberg A.C. Attenuation of Mengo virus through genetic engineering of the 5' noncoding poly(C) tract. // Nature. 1990. - V.343 - p.474-476.

62. Echeverri A., Banerjee R. and Dasgupta A. Amino-terminal region of poliovirus 2C protein is sufficient for membrane binding. // Virus Res. 1998. -V.54 - p.217-223.

63. Ehrenfeld E, Teterina NL (2002), Initiation of translation of picornavirus RNAs: Structure and function of the internal ribosome entry site., in Molecular Biology of Picornaviruses, ed. Semler BL and Wimmer E, AMS Press, Washington, DC p 159-169

64. Emerson S.U., McRill C., Rosenblum B., Feinstone S. and Purcell R.H. Mutations responsible for adaptation of hepatitis A virus to efficient growth in cell culture. // J. Virol. 1991. - V.65 - p.4882-4886.

65. Emerson S.U., Huang Y.K., McRill C., Lewis M. and Purcell R.H. Mutations in both the 2B and 2C genes of hepatitis A virus are involved in adaptation to growth in cell culture. // J. Virol. 1992.- V.66 - p.650-654.

66. Endo K., Takahashi M., Masuko K., Inoue K., Akahane Y. and Okamoto H. Full-length sequences of subgenotype IIIA and IIIB hepatitis A virus isolates: characterization of genotype III HAV genomes. // Virus Res. 2007. - V.126 -p.116-127.

67. Feigelstock D., Thompson P., Mattoo P., Zhang Y. and Kaplan G.G. The human homolog of HAVcr-1 codes for a hepatitis A virus cellular receptor. // J. Virol. 1998. - V.72 - p.6621-6628.

68. Feinstone S.M., Kapikian A.Z. and Purceli R.H. Hepatitis A: detection by immune electron microscopy of a viruslike antigen associated with acute illness. // Science. 1973. - V.182 - p.1026-1028.

69. Felsenstein J. Confidence Limits on Phylogenies: An Approach Using the Bootstrap. //Evolution. 1985. - V.39 - p.783-791.

70. Fernandez-Miragall O., Lopez d.Q. and Martinez-Salas E. Relevance of RNA structure for the activity of Picornavirus IRES elements. // Virus Res. 2009. -V.139 - p.172-182.

71. Flehmig B., Vallbracht A. and Wurster G. Flepatitis A virus in cell culture. III. Propagation of hepatitis A virus in human embryo kidney cells and human embryo fibroblast strains. // Med. Microbiol. Immunol. 1981. - V. 170 - p.83-89.

72. Flehmig B, Mauler RF, Noll G, Weinmann E, Gregerson JP (1988), Progress in the development of an attenuated, live hepatitis A vaccine, in Viral Hepatitis and Liver Disease, ed. Zuckerman AJ, Alan R. Liss, Inc., New York p 87-90

73. Frosner G.G., Deinhardt F., Scheid R., Gauss-Muller V., Holmes N., Messeiberger V., Siegl G. and Alexander J.J. Propagation of human hepatitis A virus in a hepatoma cell line. // Infection. 1979. - V.7 - p.303-305.

74. Fujiwara K., Yokosuka O., Fukai K., Imazelci F., Saisho H. and Omata M. Analysis of full-length hepatitis A virus genome in sera from patients with fulminant and self-limited acute type A hepatitis. // J. Hepatol. 2001. - V.35 -p.112-119.

75. Fujiwara K., Yokosuka O., Imazeki F., Saisho H., Saotome N., Suzuki K., Okita K., Tanaka E. and Omata M. Analysis of the genotype-determining regionof hepatitis A viral RNA in relation to disease severities. // Hepatol. Res. 2003. - V.25-p.l24-134.

76. Gabrieli R., Sanchez G., Macaluso A., Cenko F., Bino S., Palombi L., Buonomo E., Pinto R.M., Bosch A. and Divizia M. Hepatitis in Albanian children: molecular analysis of hepatitis A virus isolates. // J. Med. Virol. 2004. -V. 72 - p.533-537.

77. Gauss-Muller V. and Deinhardt F. Effect of hepatitis A virus infection on cell metabolism in vitro. //Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1984. - V.175 - p.10-15.

78. Gharbi-Khelifi H., Sdiri K., Harrath R., Fki L., Hakim H., Berthome M., Billaudel S., Ferre V. and Aouni M. Genetic analysis of HAV strains in Tunisia reveals two new antigenic variants. // Virus Genes. 2007. - V.35 - p. 155-159.

79. Gmyl A.P., Korshenko S.A., Belousov E.V., Khitrina E.V. and Agol V.I. Nonreplicative homologous RNA recombination: promiscuous joining of RNA pieces?//RNA. -2003. -V.9-p. 1221-1231.

80. Goodfellow I., Chaudhry Y., Richardson A., Meredith J., Almond J.W., Barclay W. and Evans D.J. Identification of a cis-acting replication element within the poliovirus coding region. // J. Virol. 2000. - V.74 - p.4590-4600.

81. Gosert R., Egger D. and Bienz K. A cytopathic and a cell culture adapted hepatitis A virus strain differ in cell killing but not in intracellular membrane rearrangements. // Virology. 2000. - V.266 - p. 157-169.

82. Graff J., Normann A., Feinstone S.M. and Flehmig B. Nucleotide sequence of wild-type hepatitis A virus GBM in comparison with two cell culture-adapted variants. // J. Virol. 1994. - V.68 - p.548-554.

83. Graff J., Cha J., Blyn L.B. and Ehrenfeld E. Interaction of poly(rC) binding protein 2 with the 5' noncoding region of hepatitis A virus RNA and its effects on translation. // J. Virol. 1998. - V.72 - p.9668-9675.

84. Graham F.L., Smiley J., Russell W.C. and Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. // J. Gen. Virol. -1977. V.36 - p.59-74.

85. Grant R.A., Filman D.J., Fujinami R.S., Icenogle J.P. and Hogle J.M. Three-dimensional structure of Theiler virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992. -V.89 - p.2061-2065.

86. Grant R.A., Hiremath C.N., Filman D.J., Syed R., Andries K. and Hogle J.M. Structures of poliovirus complexes with anti-viral drugs: implications for viral stability and drug design. // Curr. Biol. 1994. - V.4 - p.784-797.

87. Gust I.D., Coulepis A.G., Feinstone S.M., Locarnini S.A., Moritsugu Y., Najera R. and Siegl G. Taxonomic classification of hepatitis A virus. // Intervirology. 1983. - V.20 - p .1-7.

88. Gust I.D. Epidemiological patterns of hepatitis A in different parts of the world. // Vaccine. 1992. - V.10 Suppl 1 - S56-S58.

89. HALLGREN R. Epidemic hepatitis in the county of Vasterbotten in Northern Sweden II. //Acta Medica Scandinavica. 1943. - V.l 15 - p.22-35.

90. Hansen J.L., Long A.M. and Schultz S.C. Structure of the RNA-dependent RNA polymerase of poliovirus. // Structure. 1997. - V.5 - p. 1109-1122.

91. Hogle J.M., Chow M. and Filman D.J. Three-dimensional structure of poliovirus at 2.9 A resolution. // Science. 1985. - V.229 - p. 1358-1365.

92. Hughes J.V., Stanton L.W., Tomassini J.E., Long W.J. and Scolnick E.M. Neutralizing monoclonal antibodies to hepatitis A virus: partial localization of a neutralizing antigenic site. // J. Virol. 1984. - V.52 - p.465-473.

93. Ishii T., Shiroki K., Iwai A. and Nomoto A. Identification of a new element for RNA replication within the internal ribosome entry site of poliovirus RNA. // J. Gen. Virol. 1999. - V.80 ( Pt 4) - p.917-920.

94. Jackson R (2002), Proteins involved in the function of picornavirus internal ribosomal entry sites, in Molecular Biology of Picornaviruses, ed. Semler BL and Wimmer E, AMS Press, Washington, DC p 171-186

95. Jansen R.W., Siegl G. and Lemon S.M. Molecular epidemiology of human hepatitis A virus defined by an antigen-capture polymerase chain reaction method. //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990. - V.87 - p.2867-2871.

96. Jansen RW, Siegl G, Lemon SM (1991), Molecular epidemiology of human hepatitis A virus (HAV), in Viral hepatitis and liver disease., ed. Hollinger FB, Lemon SM, and Margolis HS, Williams & Wilkins, Baltimore p 58-62

97. Jindal M., Rana S.S., Gupta R.K., Das K. and Kar P. Serological study of hepatitis A virus infection amongst the students of a medical college in Delhi & evaluation of the need of vaccination. // Indian J. Med. Res. 2002. - V.115 -p. 1-4.

98. Kane M.A. Perspectives on the control of hepatitis A by vaccination. // Vaccine. 1992. - V.10 Suppl 1 - S93-S96.

99. Kaplan G., Totsuka A., Thompson P., Akatsuka T., Moritsugu Y. and Feinstone S.M. Identification of a surface glycoprotein on African green monkey kidney cells as a receptor for hepatitis A virus. // EMBO J. 1996. - V.15 -p.4282-4296.

100. Keeffe E.B. Is hepatitis A more severe in patients with chronic hepatitis B and other chronic liver diseases? // Am. J. Gastroenterol. 1995. - V.90 - p.201-205.

101. Khanna B., Spelbring J.E., Innis B.L. and Robertson B.H. Characterization of a genetic variant of human hepatitis A virus. // J. Med. Virol. 1992. - V.36 -p.118-124.

102. Khudyakov Y.E., Lopareva E.N., Jue D., Fang S., Spelbring J., Krawczynski K., Margolis H.S. and Fields H.A.- 1997. V. - 11.

103. Khudyakov Y.E., Lopareva E.N., Jue D.L., Fang S., Spelbring J., Krawczynski K., Margolis H.S. and Fields H.A. Antigenic epitopes of the hepatitis A virus polyprotein. // Virology. 1999. - V.260 - p.260-272.

104. Koff RS (1993), Viral hepatitis. , in Diseases of the liver., ed. Schiff L and Schiff ER, JB Lippincott, Philadelphia p 492-577

105. Krogh A., Larsson B., von Heijne G. and Sonnhammer E.L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. // J. Mol. Biol. 2001. - V.305 - p.567-580.

106. Krugman S., Giles J.P. and Hammond J. Infectious hepatitis. Evidence for two distinctive clinical, epidemiological, and immunological types of infection. // JAMA. 1967. - V.200 - p.365-373.

107. Krugman S., Giles J.P. and Hammond J. Hepatitis virus: effect of heat on the infectivity and antigenicity of the MS-1 and MS-2 strains. // J. Infect Dis. 1970. - V.122 - p.432-436.

108. Kumar S., Nei M., Dudley J. and Tamura K. MEGA: a biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. // Brief. Bioinform. 2008. - V.9 - p.299-306.

109. Kusov Y.Y., Probst C., Jecht M., Jost P.D. and Gauss-Muller V. Membrane association and RNA binding of recombinant hepatitis A virus protein 2C. // Arch. Virol. 1998. - V. 143 - p.931-944.

110. Kusov Y.Y., Gosert R. and Gauss-Muller V. Replication and in vivo repair of the hepatitis A virus genome lacking the poly(A) tail. // J. Gen. Virol. 2005. -V.86 - p.1363-1368.

111. Kyte J. and Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. // J. Mol. Biol. 1982. - V. 157 - p. 105-132.

112. Le S.Y., Chen J.H., Sonenberg N. and Maizel J.Y., Jr. Conserved tertiary structural elements in the 5' nontranslated region of cardiovirus, aphthovirus and hepatitis A virus RNAs. // Nucleic Acids Res. 1993. - V.21 - p.2445-2451.

113. Lednar W.M., Lemon S.M., Kirkpatrick J.W., Redfield R.R., Fields M.L. and Kelley P.W. Frequency of illness associated with epidemic hepatitis A virus infections in adults. //Am. J. Epidemiol. 1985. - V.122 - p.226-233.

114. Lemon S.M. and Robertson B.H. Current perspectives in the virology and molecular biology of hepatitis A virus. // Seminars in Virology. 1993. - V.4 -p.285-295.

115. Liljas L. Virus assembly. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1999. - V.9 - p.129-134.

116. Liu G.D., Hu N.Z. and Hu Y.Z. Full-length genome of wild-type hepatitis A virus (DL3) isolated in China. // World J. Gastroenterol. 2003. - V.9 - p.499-504.

117. Lobert P.E., Escriou N., Ruelle J. and Michiels T. A coding RNA sequence acts as a replication signal in cardioviruses. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1999. V.96-p.l 1560-11565.

118. Locarnini S. A virological perspective on the need for vaccination. // J. Viral Hepat. 2000. - V.7 Suppl 1 - p.5-6.

119. Locamini S.A., Coulepis A.G., Ferris A.A., Lehmann N.I. and Gust I.D. Purification of hepatitis A virus from human feces. // Intervirology. 1978. -V.10 - p.300-308.

120. Lodish H (2003), in Molecular Cell Biology, ed. Lodish H , Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA , Krieger M, Scott MP, Zipursky SL, and Darnell J, p 455

121. Lu L., Ching K.Z., de Paula V.S., Nakano T., Siegl G., Weitz M. and Robertson B.H. Characterization of the complete genomic sequence of genotype II hepatitis A virus (CF53/Berne isolate). // J. Gen. Virol. 2004. - V.85 -p.2943-2952.

122. Luo M., Vriend G., Kamer G., Minor I., Arnold E., Rossmann M.G., Boege U., Scraba D.G., Duke G.M. and Palmenberg A.C. The atomic structure of Mengo virus at 3.0 A resolution. // Science. 1987. - V.235 - p. 182-191.

123. Luo M., Rossmann M.G. and Palmenberg A.C. Prediction of three-dimensional models for foot-and-mouth disease virus and hepatitis A virus. // Virology. -1988. V.166-p.503-514.

124. MacCallum F.O. and Bauer D.J. Homologous Serum Hepatitis. // The Lancet. -1947. V.250 - p.691-692.

125. Mackiewicz V., Dussaix E., Le Petitcorps M.F. and Roque-Afonso A.M. Detection of hepatitis A virus RNA in saliva. // J. Clin. Microbiol. 2004. - V.42 - p.4329-4331.

126. Mao J.S., Dong D.X., Zhang H.Y., Chen N.L., Zhang X.Y., Huang H.Y., Xie R.Y., Zhou T.J., Wan Z.J. and Wang Y.Z. Primary study of attenuated live hepatitis A vaccine (H2 strain) in humans. // J. Infect Dis. 1989. - V.159 -p.621-624.

127. Mateu M.G., Camarero J.A., Giralt E., Andreu D. and Domingo E. Direct evaluation of the immunodominance of a major antigenic site of foot-and-mouth disease virus in a natural host. // Virology. 1995. - V.206 - p.298-306.

128. Mattioli S., Imberti L., Stellini R. and Primi D. Mimicry of the immunodominant conformation-dependent antigenic site of hepatitis A virus by motifs selected from synthetic peptide libraries. // J. Virol. 1995. - V.69 -p.5294-5299.

129. Mbayed V.A., Sookoian S., Alfonso V. and Campos R.H. Genetic characterization of hepatitis A virus isolates from Buenos Aires, Argentina. // J. Med. Virol. 2002. - V.68 - p.168-174.

130. McDonald S. Acute yellow atrophy . // Edinburgh Med J. 1908. - V.15 - 208.

131. McKnight K.L. and Lemon S.M. Capsid coding sequence is required for efficient replication of human rhinovirus 14 RNA. // J. Virol. 1996. - V.70 -p.1941-1952.

132. McKnight K.L. and Lemon S.M. The rhinovirus type 14 genome contains an internally located RNA structure that is required for viral replication. // RNA. -1998. V.4-p.l569-1584.

133. Murray R. Viral hepatitis. // Bull. N. Y. Acad. Med. 1955. - V.31 - p.341-358.

134. Nainan O.V., Margolis H.S., Robertson B.H., Balayan M. and Brinton M.A. Sequence analysis of a new hepatitis A virus naturally infecting cynomolgus macaques (Macaca fascicularis). // J. Gen. Virol. 1991. - V.72 ( Pt 7) - p. 16851689.

135. Nainan O.V., Armstrong G.L., Han X.H., Williams I., Bell B.P. and Margolis H.S. Hepatitis a molecular epidemiology in the United States, 1996-1997: sources of infection and implications of vaccination policy. // J. Infect Dis. -2005. V.191 -p.957-963.

136. Najarian R., Caput D., Gee W., Potter S.J., Renard A., Merryweather J., Van Nest G. and Dina D. Primary structure and gene organization of human hepatitis A virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1985. - V.82 - p.2627-2631.

137. Neufeld K.L., Richards O.C. and Ehrenfeld E. Purification, characterization, and comparison of poliovirus RNA polymerase from native and recombinant sources. // J. Biol. Chem. 1991. - V.266 - p.24212-24219.

138. O'Donovan D., Cooke R.P., Joce R., Eastbury A., Waite J. and Stene-Johansen K. An outbreak of hepatitis A amongst injecting drug users. // Epidemiol. Infect. 2001. - V.127 - p.469-473.

139. Ostermayr R., von der H.K., Gauss-Muller V., Winnacker E.L. and Deinhardt F. Expression of hepatitis A virus cDNA in Escherichia coli: antigenic VP1 recombinant protein. //J. Virol. 1987. - V.61 - p.3645-3647.

140. Palmenberg A.C. and Rueckert R.R. Evidence for intramolecular self-cleavage of picornaviral replicase precursors. // J. Virol. 1982. - V.41 - p.244-249.

141. Palmenberg AC (1987), Comparative organization and genome structure in picornaviruses., in Positive strand RNA viruses., ed. Brinton MA and Rueckert RR, Alan R. Liss, New York p 25-34

142. Paul A.V., Rieder E., Kim D.W., van Boom J.H. and Wimmer E. Identification of an RNA hairpin in poliovirus RNA that serves as the primary template in the in vitro uridylylation of VPg. // J. Virol. 2000. - V.74 - p.10359-10370.

143. Pilipenko E.V., Blinov V.M. and Agol V.l. Gross rearrangements within the 5'-untranslated region of the picornaviral genomes. // Nucleic Acids Res. 1990. -V.18 - p.3371-3375.

144. Pina S., Buti M., Jardi R., Clemente-Casares P., Jofre J. and Girones R. Genetic analysis of hepatitis A virus strains recovered from the environment and from patients with acute hepatitis. // J. Gen. Virol. 2001. - V.82 - p.2955-2963.

145. Ping L.H., Jansen R.W., Stapleton J.T., Cohen J.I. and Lemon S.M. Identification of an immunodominant antigenic site involving the capsid protein VP3 of hepatitis A virus. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1988. - V.85 -p.8281-8285.

146. Ping L.H. and Lemon S.M. Antigenic structure of human hepatitis A virus defined by analysis of escape mutants selected against murine monoclonal antibodies. // J. Virol. 1992. - V.66 - p.2208-2216.

147. Provost P.J. and Hilleman M.R. An inactivated hepatitis A virus vaccine prepared from infected marmoset liver. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1978. -V.159 - p.201-203.

148. Provost P.J. and Hilleman M.R. Propagation of human hepatitis A virus in cell culture in vitro. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1979. - V. 160 - p.213-221.

149. Provost P.J., Bishop R.P., Gerety R.J., Hilleman M.R., McAleer W.J., Scolnick E.M. and Stevens C.E. New findings in live, attenuated hepatitis A vaccine development. //J. Med. Virol. 1986. - V.20 - p. 165-175.

150. Rachow A., Gauss-Muller V. and Probst C. Homogeneous hepatitis A virus particles. Proteolytic release of the assembly signal 2A from procapsids by factor Xa. // J. Biol. Chem. 2003. - V.278 - p.29744-29751.

151. Reuter G., Juhasz A., Kosztolanyi L., Lefler E. and Fekete Z. Co-circulation of genotype IA and new variant IB hepatitis A virus in outbreaks of acute hepatitis in Hungary—2003/2004. // J. Med. Virol. 2006. - V.78 - p. 1392-1397.

152. Robertson B.H., Khanna B., Nainan O.V. and Margolis H.S. Epidemiologic patterns of wild-type hepatitis A virus determined by genetic variation. // J. Infect Dis. 1991. - V. 163 - p.286-292.

153. Rossmann M.G., Arnold E., Erickson J.W., Frankenberger E.A. , Griffith J.P.,i

154. Hecht H.J., Johnson J.E., Kamer G., Luo M., Mosser A.G. and . Structure of a human common cold virus and functional relationship to other picornaviruses. // Nature. 1985.-V.317-p. 145-153.

155. Sanchez G., Pinto R.M., Vanaclocha H. and Bosch A. Molecularicharacterization of hepatitis a virus isolates from a transcontinental shellfish-borne outbreak. // J. Clin. Microbiol. 2002. - V.40 - p.4148-4155.

156. Sanchez G., Pinto R.M. and Bosch A. A novel CD4+ T-helper lymphocyte epitope in the VP3 protein of hepatitis A virus. // J. Med. Virol. 2004. - V.72 -p.525-532.

157. Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977. - V.74 - p.5463-5467.

158. Sarnow P., Bernstein H.D. and Baltimore D. A poliovirus temperatureisensitive RNA synthesis mutant located in a noncoding region of the genome . // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1986. - V.83 - p.571-575.

159. Schultz D.E., Hardin C.C. and Lemon S.M. Specific interaction of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase with the 5'-nontranslated RNA of hepatitis A virus. // J. Biol. Chem. 1996. - V.271 - p.14134-14142.

160. Seipelt J., Guarne A., Bergmann E., James M., Sommergruber W., Fita I. and Skern T. The structures of picornaviral proteinases. // Virus Res. 1999. - V.62 -p.159-168.

161. Siebke J.C., Jorgensen J.B., Laughlin W.S. and Reinicke V. Prevalence of hepatitis A and B markers in the Eskimos of Kodiak Island, Alaska. // Arctic Med. Res. 1986. - V.44 - p.48-52.

162. Siegl G., Frosner G.G., Gauss-Muller V., Tratschin J.D. and Deinhardt F. The physicochemical properties of infectious hepatitis A virions. // J. Gen. Virol. -1981. V.57-p.331-341.

163. Siegl G., deChastonay J. and Kronauer G. Propagation and assay of hepatitis Aivirus in vitro. // J. Virol. Methods. 1984. - V.9 - p.53-67.

164. Siegl G. and Lemon S.M. Recent advances in hepatitis A vaccine development. //Virus Res. 1990. - V.17 - p.75-92.

165. Skinhoj P. Epidemiological aspects of viral hepatitis A and B infections. A review with special reference to serological studies in isolated areas. // Dan. Med. Bull. 1981. - V.28 - p. 177-192.

166. Stapleton J.T. and Lemon S.M. Neutralization escape mutants define a dominant immunogenic neutralization site on hepatitis A virus. // J. Virol. -1987. V.61 -p.491-498.

167. Stene-Johansen K., Skaug K., Blystad H. and Grinde B. A unique hepatitis A virus strain caused an epidemic in Norway associated with intravenous drug abuse. The Hepatitis A Study Group. // Scand. J. Infect Dis. 1998. - V.30 -p.35-38.

168. Stene-Johansen K., Skaug K. and Blystad H. Surveillance of hepatitis A by molecular epidemiologic studies. // Tidsskr. Nor Laegeforen. 1999. - V.119 -p.3725-3729.

169. Stene-Johansen K., Jonassen T.O. and Skaug K. Characterization and genetic variability of Hepatitis A virus genotype IIIA. // J. Gen. Virol. 2005. - V.86 -p.2739-2745.

170. Tabak F., Ozdemir F., Tabak O., Erer B., Tahan V. and Ozaras R. Autoimmune hepatitis induced by the prolonged hepatitis A virus infection. // Ann. Hepatol. 2008. - V.7 - p.177-179.

171. Tassopoulos N.C., Papaevangelou G.J., Ticehurst J.R. and Purcell R.H. Fecal excretion of Greek strains of hepatitis A virus in patients with hepatitis A and in experimentally infected chimpanzees . // J. Infect Dis. 1986. - V. 154 - p.231-237.

172. Taylor M.B. Molecular epidemiology of South African strains of hepatitis A virus: 1982-1996. //J. Med. Virol. 1997. - V.51 - p.273-279.

173. Tesar M., Jia X.Y., Summers D.F. and Ehrenfeld E. Analysis of a potential myristoylation site in hepatitis A virus capsid protein VP4. // Virology. 1993. -V.194 - p.616-626.

174. Thompson A.A. and Peersen O.B. Structural basis for proteolysis-dependent activation of the poliovirus RNA-dependent RNA polymerase. // EMBO J. -2004. V.23 - p.3462-3471.

175. Ticehurst J.R. Hepatitis A virus: clones, cultures, and vaccines. // Semin. Liver Dis. 1986. - V.6-p.46-55.

176. Tjon G.M., Wijkmans C.J., Coutinho R.A., Koek A.G., van den Hoek J.A., Leenders A.C., Schneeberger P.M. and Bruisten S.M. Molecular epidemiology of hepatitis A in Noord-Brabant, The Netherlands. // J. Clin. Virol. 2005. -V.32 - p.128-136.

177. Vento S., Garofano T., Renzini C., Cainelli F., Casali F., Ghironzi G., Ferraro T. and Concia E. Fulminant hepatitis associated with hepatitis A virus superinfection in patients with chronic hepatitis C. // N. Engl. J. Med. 1998. -V.338 - p.286-290.

178. Vento S. and Cainelli F. Is there a role for viruses in triggering autoimmune hepatitis? // Autoimmun. Rev. 2004. - V.3 - p.61-69.

179. Villar L.M., Lampe E., Meyer A. and Gaspar A.M. Genetic variability of hepatitis A virus isolates in Rio de Janeiro: implications for the vaccination of school children. // Braz. J. Med. Biol. Res. 2004. - V.37 - p. 1779-1787.

180. Villar L.M., Morais L.M., Aloise R., Melo M.M., Calado I.A., Lampe E. and Gaspar A.M. Co-circulation of genotypes IA and IB of hepatitis A vims in Northeast Brazil. // Braz. J. Med. Biol. Res. 2006. - V.39 - p.873-881.

181. Wallace R.E., Vasington P.J., Petricciani J.C., Hopps H.E., Lorenz D.E. and Kadanka Z. Development and characterization of cell lines from subhuman primates. // In Vitro. 1973. - V.8 - p.333-341.

182. Wattanasri N., Ruchusatsawat K. and Wattanasri S. Phylogenetic analysis of hepatitis A vims in Thailand. // J. Med. Virol. 2005. - V.75 - p. 1-7.

183. Weitz M., Baroudy B.M., Maloy W.L., Ticehurst J.R. and Purcell R.H. Detection of a genome-linked protein (VPg) of hepatitis A virus and its comparison with other picornaviral VPgs. // J. Virol. 1986. - V.60 - p.124-130.

184. Wiedmann M., Boehm S., Schumacher W., Swysen C. and Zauke M. Evaluation of three commercial assays for the detection of hepatitis a virus. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect Dis. 2003. - V.22 - p. 129-130.

185. Winokur P.L., McLinden J.H. and Stapleton J.T. The hepatitis A virus polyprotein expressed by a recombinant vaccinia virus undergoes proteolytic processing and assembly into viruslike particles. // J. Virol. 1991. - V.65 -p.5029-5036.

186. Xiang W., Cuconati A., Paul A.V., Cao X. and Wimmer E. Molecular dissection of the multifunctional polio virus RNA-binding protein ЗАВ. // RNA. 1995.-V.l -p.892-904.

187. Yang Y., Yi M., Evans D.J., Simmonds P. and Lemon S.M. Identification of a conserved RNA replication element (ere) within the 3Dpol-coding sequence of hepatoviruses. // J. Virol. 2008. - V.82 - p. 10118-10128.

188. Yao G (1991), Clinical spectrum and natural history of viral hepatitis A in a 1988 Shanghai epidemic., in Viral hepatitis and liver disease., ed. Hollinger FB, Lemon SM, and Margolis HS, Williams & Wilkins, Baltimore p 76-78

189. Yi M., Schultz D.E. and Lemon S.M. Functional significance of the interaction of hepatitis A virus RNA with glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

190. GAPDH): opposing effects of GAPDH and polypyrimidine tract binding protein on internal ribosome entry site function. // J. Virol. 2000. - V.74 -p.6459-6468.

191. Zayc-Schmidt E.M., Pichl L., Laue Т., Heitmann A. and Schottstedt V. Travel-related hepatitis A detected by hepatitis A virus RNA donor screening. // Transfusion. 2005. - V.45 - p. 1037-1038.

192. Zhang В., Seitz S., Kusov Y., Zell R. and Gauss-Muller V. RNA interaction and cleavage of poly(C)-binding protein 2 by hepatitis A virus protease. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. - V.364 - p.725-730.

193. Zhang В., Morace G., Gauss-Muller V. and Kusov Y. Poly(A) binding protein, C-terminally truncated by the hepatitis A virus proteinase 3C, inhibits viral translation. // Nucleic Acids Res. 2007. - V.35 - p.5975-5984.

Информация о работе

Бондаренко, Татьяна Юрьевна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Вирус гепатита A: генетические особенности изолятов, выявленных в Сибирском регионе, и штаммов, адаптированных к культурам клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Вирус гепатита A: генетические особенности изолятов, выявленных в Сибирском регионе, и штаммов, адаптированных к культурам клеток - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы