Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Видовой состав госпитальных штаммов условно-патогенных микроорганизмов и их роль в развитии инфекций у новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Видовой состав госпитальных штаммов условно-патогенных микроорганизмов и их роль в развитии инфекций у новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела"

На правах рукописи

ЛЮБАСОВСКАЯ ЛЮДМИЛА АНАТОЛЬЕВНА

ВИДОВОЙ СОСТАВ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ РОЛЬ В РАЗВИТИИ ИНФЕКЦИЙ У НОВОРОЖДЕННЫХ С ОЧЕНЬ НИЗКОЙ И ЭКСТРЕМАЛЬНО НИЗКОЙ МАССОЙ ТЕЛА

03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г \ скт т

Москва - 2013 005536066

005536066

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении «Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

кандидат медицинских наук Припутневич Татьяна

Валерьевна

доктор биологических наук, доцент Ильина Елена

Николаевна

Официальные оппоненты:

Пашков Евгений Петрович - доктор медицинских наук, профессор, Лауреат

Государственной премии РФ, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Первого МГМУ им. И.М. Минздрава России

Червинец Вячеслав Михайлович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии ГБОУ ВПО Тверской государственной медицинской академии Минздрава России

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава России

Защита состоится »НОЛ^Л 2013г. в //^ часов на заседании

диссертационного совета Д-208.040.08 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им.И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119992, Москва, Трубецкая ул., д.8,стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (117998, Москва, Нахимовский проспект, Д.49).

Автореферат разослан « Й^ ^^Ь^1- 2013 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.040.08

доктор медицинских наук, профессор А.Ю.Миронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность Выхаживание глубоко недоношенных детей в последние годы стало приоритетным направлением деятельности отделений реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) новорожденных. С 1 января 2012 года Россия перешла на рекомендуемую ВОЗ регистрацию детей с массой тела при рождении от 500 грамм с включением их в государственную статистику [Приказ МЗ РФ №1687н от 27 декабря 2011 г]. Благодаря научно-техническому прогрессу в медицине появилась возможность выхаживать недоношенных детей, начиная с 22 недель гестации и массой тела от 500г. Однако усилия, затраченные на выхаживание таких новорожденных, могут оказаться тщетными при развитии госпитальных инфекций (ГИ), риск развития которых в этой группе пациентов чрезвычайно высок. Отсутствие сформировавшегося иммунитета и нормальной микрофлоры у столь недоношенных детей делает процесс их адаптации к внеутробному существованию проблематичным с различных точек зрения, в том числе и с микробиологических позиций. Отсутствие естественного процесса приобретения нормальной микрофлоры (от матери), а также массивная антибактериальная терапия, которую получают все маленькие пациенты, влекут за собой колонизацию и инфицирование госпитальными штаммами условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), которые часто (у 25-30% недоношенных детей) становятся причиной развития инфекционных осложнений госпитального происхождения [Рюмина И.И., 2013]. Такие нозологические формы, как конъюнктивит, омфалит, вентилятор-ассоциированная пневмония, катетер-ассоциированная бактериемия, некротизирующий энтероколит, сепсис сопровождаются высокой летальностью. По данным Национального комитета по внутрибольничным инфекциям (NN18, США) за 2001 год поздний неонатальный сепсис встречается у 50% новорожденных с весом при рождении менее 1500г. При этом увеличивается длительность пребывания в стационаре до 79 дней, а летальность в этой группе детей возрастает до 18%

(против 7% при отсутствии сепсиса), особенно если возбудитель — грамнегативные микроорганизмы (36%) и дрожжевые грибы (32%) [Stoll B.J., 2003].

Рациональная антимикробная терапия ГИ невозможна без современных знаний об их этиологической структуре и антибиотикорезистентности возбудителей. В этом плане актуальным представляется регулярное слежение за изменениями видового состава госпитальных штаммов микроорганизмов, циркулирующих в родовспомогательном учреждении и изучение их чувствительности к антимикробным препаратам (АМП).

Структура ГИ конкретна для каждого стационара, что обусловлено множеством факторов, таких, как техническая оснащенность отделения, квалификация персонала, контингент больных и проводимая в стационаре антибиотикополитика. С другой стороны, общие закономерности, по которым развивается эпидемический процесс, приводят к появлению общих черт в формировании «эпидемических» вариантов в популяциях госпитальных штаммов УПМ.

В современных эпидемиологических исследованиях при изучении этиологической структуры неонатальных инфекций часто используется термин «микробиологический мониторинг», под которым подразумевают плановые микробиологические обследования госпитальной среды и по клиническим показаниям - новорожденных [Сергевнин В.И., 2008]. При таком «мониторинге» получают исходные данные для ретроспективного анализа этиологической структуры уже состоявшихся ГИ и оценки эпидемиологической ситуации в отделении. В современных условиях выхаживания маловесных новорожденных центр внимания мониторинга переключается с госпитальной среды на пациента - а именно, слежение за этапами его микробной колонизации. Регулярно с двух - трех дневным интервалом проводят культуральное исследование мазков со слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), что позволяет оперативно реагировать на ситуацию патологической колонизации и предупреждать развитие

ГИ, как у конкретного пациента, так и неблагоприятной эпидемиологической ситуации в целом [Анкирская A.C., 2004]. Микробиологические исследования, проводимые с диагностической целью не должны рассматриваться как микробиологический мониторинг (поскольку изучение этиологии ГИ не является профилактическим мероприятием). Цель настоящего исследования: Выявить особенности этиологической структуры ГИ у новорожденных с очень низкой и экстремально-низкой массой тела при рождении (ОНМТ и ЭНМТ) и усовершенствовать качество микробиологического мониторинга в современных условиях перинатального Центра.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Выявить особенности колонизации условно-патогенными микроорганизмами новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении в условиях отделения реанимации.

2. Определить этиологию инфекций у новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела на основании результатов микробиологического исследования патологического материала из очагов инфекций.

3. С помощью масс-спектрометрического анализа определить видовую принадлежность коагулазонегативных стафилококков (CoNS), циркулирующих в отделении реанимации новорожденных. Используя молекулярно-генетические методы, изучить сиквенс-типы и факторы вирулентности CoNS.

4. Сопоставить данные чувствительности к антимикробным препаратам этиологически значимых условно-патогенных микроорганизмов in vitro с данными микробиологической эффективности в процессе этиотропной терапии новорожденных.

5. Определить влияние антимикробной терапии на колонизацию госпитальными штаммами УПМ новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ.

Научная новизна работы:

• Изучены особенности колонизации и инфицирования госпитальными штаммами

УПМ новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ в условиях перинатального Центра.

• Получена комплексная микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика госпитальных штаммов CoNS и показана роль штаммов с определенным генетическим профилем в развитии инфекционного процесса у новорожденных.

• Показана роль антимикробной терапии в формировании микроценоза слизистых оболочек ЖКТ у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ, а также ее влияние на этиологическую структуру ГИ у пациентов этих групп.

Личный вклад автора: Любасовская JI.A. принимала непосредственное участие в выполнении всех этапов настоящей работы: проводила посев биоматериала; выделение штаммов УПМ, видовую идентификацию, определение чувствительности к АМП, отбор штаммов CoNS для молекулярно-генетических исследований, анализ антибиотикотерапии в отделении и статистический анализ полученных данных. Практическая значимость: На основании проведенного комплексного клинического и молекулярно-генетического анализа даны рекомендации по оптимизации микробиологического мониторинга и эмпирической терапии инфекций у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ при рождении. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Метицилинрезистентные коагулазонегативные стафилококки (MRCoNS), полирезистентные штаммы энтеробактерий (Enterobacter cloacae) и дрожжевые грибы видов Candida non-albicans играют ведущую роль в этиологической структуре госпитальных инфекций у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ.

2. Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus haemolyticus преобладают в видовой структуре среди CoNS. Каждый из этих видов принадлежит к ограниченному числу сиквенс-типов. Они являются близкородственными и относятся к единому клональному комплексу. Основное их свойство - способность к длительной циркуляции в стационаре.

3. Распространение MRCoNS, несущих ген те с А и увеличение доли дрожжевых грибов Candida non-albicans, устойчивых к флюконазолу, в значительной мере является результатом селективного давления антимикробных препаратов. Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения:

Усовершенствованный алгоритм микробиологического мониторинга в ОРИТ новорожденных используется в практической работе Отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова» МЗ РФ; рекомендации по оптимизации антимикробной терапии новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ внедрены в работу Отдела неонатологии Центра. Материалы диссертации используются в лекционных занятиях при обучении на курсах повышения квалификации врачей, обучении клинических ординаторов и аспирантов, на семинарах и конференциях, проводимых в Центре. Апробация работы. Основные положения работы доложены на:

• XIV международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии, Москва, май 2012г.

• V Научно - образовательном конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии»; Москва, ноябрь 2012г.

• III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине»;Казань,ноябрь 2012г.

• 22nd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID); London, United Kingdom, март-апрель 2012г.

• 13th Asia-Pacific Congress of Clinical Microbiology and Infection (APCCMI); Beijing, China, October 2012r.

• XV международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии; Москва, май 2013г.

Обсуждение диссертационной работы состоялось на заседании апробационной комиссии (06.05.2013) ФГБУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова» МЗ РФ.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 5 статей в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК РФ, 2 работы в зарубежном издании. Структура и объем диссертации:

Работа изложена на 144 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 22 таблицами, 16 рисунками и 3 фотографиями, состоит из введения, 5 глав, включающих обзор литературы, собственные исследования и их результаты, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы. Библиография включает 34 отечественных и 114 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

В период с января 2010 по январь 2012 года проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 523 новорожденных. Все исследования проводились в соответствии с правилами проведения микробиологического мониторинга в ОРИТ ФГБУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова» МЗ РФ.

Всего было выполнено 3951 посевов клинического материала, в том числе 3378 - со слизистых оболочек ЖКТ (мазок из зева, кал) и 573 - из очагов инфекций (кровь, моча, эндотрахеальный аспират и т.д.). Кроме того, исследовано 109 образцов аутопсийного материала от 26 погибших новорожденных. В результате исследования выделено и протестировано на чувствительность к АМП 2888 изолятов УПМ, из них 1259 изолятов СоШ, из которых 669 идентифицированы до вида.

Бактериологический посев материала осуществляли на 5% кровяной агар, среду Эндо и Сабуро (ФГУН«ГИЦПМиБ» г.Оболенск). В качестве среды накопления использовали 1% сахарный бульон. Культивирование на чашках Петри проводили по стандартной методике. Наличие или отсутствие роста микроорганизмов оценивали в течение трех суток. Для посевов крови, ликвора, асцитической и плевральной жидкости использовали флаконы с питательной средой для культивирования в

автоматическом гематологическом анализаторе Bact/alert (BioMerieux, США). Идентификацию выделенных микроорганизмов производили с помощью автоматического бактериологического анализатора Vitec2Compact (BioMerieux) и на масс-спектрометре AutoflexIII MALDITOF MS (Bruker Daltonics, Германия).

Чувствительность УПМ к АМП определяли диско-диффузионным методом в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1890-04 от 04.03.2004 года на агаре Мюллера-Хинтон (производство HiMedia, Индия) и методом серийных разведений с помощью автоматического анализатора Vitec2Compact, интерпретацию результатов проводили в соответствии с рекомендациями CLSI 2008 года.

Молекулярно-генетический анализ и изучение генетических маркеров антибиотикорезистентности и факторов вирулентности 70 штаммов CoNS включал:

- определение гена тесА для подтверждения устойчивости к оксациллину;

- определение присутствия известных генов вирулентности в геномной ДНК.

Выполнено мультилокусное (МЬ5Т)-типирование 69 изолятов CoNS (41 -S.haemolyticiis и 28 - S.epidermidis).

Проведение ПЦР. Для выделения геномной ДНК стафилококков использовали набор «ДНК-экспресс» (ООО НПФ Литех, Россия) в соответствии с прилагаемыми инструкциями. С помощью специально подобранных олигонуклеотидных праймеров, были амплифицированы по стандартному протоколу фрагменты гена тесА, генов токсинов МЛ, hlgA, hlgB, MgC, sea, seb, sed, see, seg, seh, sei, sej, tsst, факторов адгезии и колонизации clfA, clfB, cita, fnbA, fnbB ,icaA, icaB, icaC, icaD.

MLS типирование штаммов S.haemolyticus проводили в соответствии с методикой О.Л.Ворониной (2011 г), штаммов S.epidermidis - в соответствии со схемой, представленной на сайте http://sepidermidis.mlst.net/. Анализ последовательностей и выравнивание выполняли с помощью программного обеспечения VECTOR NTI v. 9.0. Для филогенетического анализа использовали программу MEGA v. 4.0 (http://www.megasoftware.net).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием относительных величин показателей в процентах. Оценку точности и надежности - с помощью расчета 95% доверительного интервала. Оценку значимости различий для независимых величин - сопоставлением доверительных интервалов с использованием t-критерия Стъюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В зависимости от массы тела при рождении новорожденные были разделены на три группы I группа - 131 ребенок с ОНМТ и ЭНМТ. менее ISOOr; II группа - 160 детей с массой тела I50l-2500r; III группа - 114 детей с массой тела более 2500г.

Частота выделения различных видов УПМ. колонизирующих ЖКТ новорожденных в ОРИТ представлены на рисунке №1. Чаще всего в трех группах ЖКТ новорожденных колонизировали CoS'S - от 33,0 до 38,5%. в то время как S. aureus встречался во всех группах новорожденных с частотой не более 1% Различие в трех группах статистически не значимо (р>0,05).

Значительно реже (р<0.001) при колонизации ЖКТ обнаруживали представителей семейства Enterobacieriaceae — частота выделения в трех группах была на уровне 20% без статистически значимых различий между группами (р> 0,05).

Рисунок

Частота выделения различных видов УПМ, колонншрующнх ЖКТ

новорожденных

Streptococcus spp ■ Staph aurei* Enterococcia

40

30 20 10

■ CcNS

■ CavfcJacpp

■ Неферыенщрующие граы-

rpyma 1 группа 2 груша 3

Преобладали три рода семейства Enterobacteriaceae: Enterobacter (основной вид • Enterobacter cloacae\ Escherichia (основной вид - E.coli) и Klebsiella (основной вид - Klebsiella pneumoniae). При том в группах недоношенных детей (I н II группа) превалировали Enterobacter spp. (53,5% и 58% соответственно), тогда как в III группе высеваемость -штеро бактерий трех основных родов была сопоставима: Klebsiella spp - 37%: Enterobacter spp. - 24%; Escherichia spp - 33%.

Третье место по частоте колонизации ЖКТ в I группе занимали дрожжевые грибы рода Candida (9,35%). тогда как в двух других группах этот показатель не превышал 3.5%. Энтерококки (E./aecalis. Efatcium. Edurans. E.casseliflavus), альфа-гемолитические стрептококки и неферментируюшие грамнегативные бактерии (Acinetobacter spp. Stenotrophomonas malt ophtha. Chryseobacterium indologenes. Pseudomonas aeruginosa) чаше колонизировали зев и кашечннк доношенных новорожденных (III группа). Частота выделения дрожжевых грибов во II и III группах составляла только 3,5% и 2,2%, соответственно. Различие в частоте выделения дрожжевых грибов у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ по сравнению с двумя другими группами было высоко статистически значимо (р<0.001). Между II и III группами не было статистически достоверных различий в частоте выделения Candida spp (р>0.05) (рис.2).

Рисунок 2.

Частота выделения дрожжевых грибов рода Candida н соотношения albicans и поп - albicans видов в трех группах новорожденных

■ СагкИп поп Лясага СяпЛЛя dbeflns

в 4

2 О

■ доим 1 груши 2 грут Э

Среди Candida spp. »ысеваемость Candida non-albicans в группе детей с ОНМТ и ЭНМТ (1 группа) была наивысшей и составила 83%; во II группе этот показатель равнялся 64%; в III - 47%. Разница в выссваемостн non-albicans видов статистически достоверна между I и дкумя другими группами (р<0.05), в то время как. различие между II и III гру ппами не было значимым (р>0.05). Примечательно, что в I группе 60% штаммов грибов были представлены видом Candida famala устойчивым к флюконазолу.

Частота выделения УПМ из очагов инфекции составила 27% - в 1 группе, 19.35% - во II и 43,8% - в III группе. В видовой структуре возбудителей отмечена лидирующая роль Со№ во всех группах новорожденных - 61%. 70.8%, 39% соответственно без статистически достоверных различий (р>0.05) (рнс.З).

Высеваемость различных видов УIIM нз очагов ннфекини у наблюдаемых

Значительно реже ло сравнению с СоЛ'5 (р<0,001) из очагов инфекций у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ выделяли дрожжевые грибы рода Candida (16,5%) и энтеробактерии (12%) (р>0,05). Дрожжевые грибы в 100% слу чаев принадлежали к видам non-albicans: С. famala (64%). C.glabraia (28.5%). С sake (7.5%).

Во II группе по высеваемости из очагов инфекций абсолютно доминировали CoNS (70.8%). другие бактерии обнаруживали значительно реже (12% и менее), а дрожжевые грибы отсутствовали.

Рисунок ЛИ,

новорожденных.

Футин 1 rpyma 2 rpyire 3

В III группе одинаково часто (39-41%) из очагов инфекций выделяли CoNS и неферментирукмцие грамнегативные бактерии. Значительно реже (9%) встречались энтерококки и энтеробактерии. Дрожжевые грибы обнаружены не были.

Обращало на себя внимание, что хотя энтеробактерии при колонизации были второй по частоте встречаемости группой УПМ и обладали множественной устойчивостью к АМП, их роль в развитии ГИ не была столь значимой как CoNS (рис.3).

Результаты исследования аутопсийного материала были включены в анализ посевов из очагов инфекции. Из 26 погибших новорожденных инфекционный диагноз клинический с патологоанатомическим подтверждением был поставлен у 16 детей (61,5%), все они были глубоко недоношенными. Сроки пребывания их в ОРИТ превышали 72 часа. Основными нозологическими формами были пневмония и сепсис. В 9 из 16 случаев (56%) в аутопсийном материале (кровь, ткань печени, легких) обнаружены госпитальные штаммы микроорганизмов: в 7 случаях MRCoNS (77%), в 1 случае полирезистентный штамм Enterobacter cloacae, в 1 случае — Candida famata. Таким образом, основными возбудителями инфекций с летальным исходом у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ были CoNS. Видовое типировяние CoNS.

CoNS наиболее часто выделялись как со слизистых ЖКТ, так и из очагов инфекций. Их видовой состав был представлен шестью видами, из которых преобладали три: S.epidermidis, S.haemolyticus и S.hominis. Реже встречались другие виды - S.warneri, S.pasteuri, S.saprophyticus.

Сравнение видового состава CoNS, выделенных при колонизации слизистых ЖКТ и из очагов инфекций, показало, что в обоих случаях преобладал S.epidermidis, высеваемость которого была выше при "инфекциях" (74%), чем при "колонизации" (57%) (р<0,05). S.haemolyticus составили 35,5% среди штаммов, выделенных из кала и зева и 15% - из очагов инфекций (р<0,05). Для S.hominis эти показатели составили

6,8% и 10% соответственно.

У 70 изолятов CoNS (38 - S.haemolyticus; 25 - S.epidermidis; 4 - S.hominis; 3 -S.warneri) определяли наличие генов следующих токсинов: гемолизинов а и у. энтеротоксинов А, В, D, Е, G, Н, I, J и токсина токсического шока.

Гены гемолизина а обнаружены у 19 изолятов CoNS (27,1%), ген токсического шока - у 7 (10%), энтеротоксинов — у 25 (35,7%). Чаще других среди генов энтеротоксинов встречался ген sed (10/70;14,3%).

У изолятов S.epidermidis отмечен более разнообразный набор генов токсинов (42 гена на 25 изолятов), в то время как среди 38 клинических изолятов S.haemolyticus выявлено только 7 генов, кодирующих токсины.

Среди факторов патогенности CoNS только гены энтеротоксинов обнаружены чаще у изолятов, выделенных из очагов инфекции в сравнении с изолятами «колонизации» (р<0,05). По другим генам патогенности статистически значимых различий не обнаружено (р>0,05).

Для определения способности штаммов CoNS к образованию биопленок были детектированы гены основных факторов адгезии и колонизации elf А, clfB, спа, fnbA, fnbB, icaA, icaB, icaC, icaD. Генами ica оперона обладали S.haemolyticus, S.epidermidis и S.hominis. По полученным нами данным гены ica присутствуют у многих клинических изолятов CoNS (57/70;81,4%). Гены фибронектинсвязывающего белка fnbA, fnbB редко встречались у клинических изолятов S.haemolyticus и S.epidermidis: fnbA- 2(2,8%) и fnbB- 2(2,8%) соответственно. Ген коллаген-связывающего белка спа не был найден среди тестированных изолятов CoNS. Результаты мультилокусного секвенирования.

Проведено MLS типирование 28 изолятов S.epidermidis, выделенных у 19 новорожденных, из которых двое были доношенными, остальные - недоношенными (89,5%), в том числе 11 (65%) были с ОНМТ и ЭНМТ. На основании MLST-схемы изоляты были отнесены к 7 различным сиквенс-типам (ST). Наиболее часто были

представлены сиквенс-типы: БТ2 (14,2%), 8Т22 (43%), БТ59 (21,4%).

Сиквенс-тип 22 был выделен от доношенных новорожденных без клинических признаков инфекции. Клинические проявления инфекции, ассоциированной с Я.ер'иктисИъ, были у трех недоношенных детей (конъюнктивит, пневмония и сепсис). При конъюнктивите Б.ерШегт1сИз был отнесен к БТ59; из ткани легких выделен 8Т2; в третьем случае при аутопсии из крови выделен 8Т22.

Сиквенс-типы 2 и 22 являются близкородственными и составляют доминирующий кластер в наблюдаемом стационаре — 57,2%. Эти сиквенс-типы вместе с 8Т59 входят в состав единого клонального комплекса, имеющего лидирующие позиции в стационарах других стран. Таким образом, 78,6% штаммов 5. ер1с1епшсИз, циркулирующих в ОРИТ новорожденных Центра, относятся к единому клональному комплексу, имеющему госпитальную природу.

По результатам МЬ8Т типирования среди 41 изолята Я. каето1уЧси5, выделенных от 26 новорожденных, выявлено 5 различных сиквенс-типов. Чаще других встречались 8Т5 и 8Т19: 48% и 44% соответственно.

Из 26 новорожденных, двое были доношенными, остальные - недоношенными (92%), среди которых - 16 (66%) были с ОНМТ и ЭНМТ. У доношенных новорожденных был обнаружен 8Т19, при отсутствии клинических признаков ГИ. В то же время три глубоконедоношенных ребенка имели клинические признаки инфекции, ассоциированной с Б.каетоЦ'Чсш (2 - сепсис; 1-конъюнктивит). При конъюнктивите был обнаружен 8Т19, при СоШ-сепсисе - 8Т5. При построении филогенетического древа штаммов Б.Иаето1у11си$, на основании нуклеотидных последовательностей семи локусов, входящих в состав схемы \1LST, видно, что наиболее часто представленный кластер (95%), образован близкородственными штаммами, входящими в сиквенс-типы 5, 19, 20.

Таким образом, большинство штаммов СоЫБ, циркулирующих в ОРИТ, были близкородственными и имели госпитальное происхождение. Несмотря на то, что

генетически однородные СоМ!» выделяли у всех новорожденных, проявления инфекций (пневмония и сепсис) отмечены только у глубоконедоношенных детей. Показана способность к длительной персистенции популяции СоИБ в условиях стационара: штаммы, относящиеся к основным сиквенс-типам, встречались с постоянной частотой на протяжении всего периода наблюдений. Антибиотикотерапия у глубоконедоношенных новорожденных.

Все новорожденные с ОНМТ и ЭНМТ (п=144) в ОРИТ получали антимикробную терапию. У 95% новорожденных для стартовой терапии применяли бета-лактамные антибиотики: пенициллины (амоксициллин/клавуланат или ампициллин) в комбинации с аминогликозидами. Последующую терапию получали 68% (п=98) детей, которым проведено 340 курсов различной антибиотикотерапии, что в среднем составило по 3,5 дополнительных курса. Наиболее часто применяли ванкомицин (101 курс у 79 новорожденных, 101/79), линезолид (56/56), карбапенемы — меронем и тиенам (67/66). Ванкомицин использовали у 80% (79/98) новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ, 25% из которых (20/79) получили 2 или 3 курса.

Частота назначения карбапенемов (67%; 66/98) была сопоставима с частотой назначения ванкомицина и линезолида, но повторные курсы карбапенемов проводили крайне редко. В большинстве случаев карбапенемы комбинировали с ванкомицином(54/66) или линезолидом (2/66). Цефалоспорины 3-4 поколения использовали у 21,5% новорожденных, антианаэробные препараты и макролиды назначали в 25,5% и 9% случаев соответственно. Назначение сульфаниламидов, фторхинолонов, полимиксина и фузидиевой кислоты, было связано с особенностями чувствительности выделенных из биоматериала УПМ. Таким образом, 66,7% курсов последующей антимикробной терапии пришлось на препараты глубокого резерва (карбапенемы, гликопептиды, оксазолидиноны).

Широкое применение бета-лактамных антибиотиков (пенициллинов и карбапенемов) для стартовой и для последующей терапии, создает селективный фон

для появления MRCoNS, результатом чего стало их абсолютное преобладание - более 90% (1171/1259). MRCoNS обнаруживали у всех новорожденных независимо от массы тела, начиная со вторых суток жизни. Метициллин-резистентность подтверждена наличием гена тесА у 96% (67/70) генотипированных изолятов CoNS. Среди штаммов S.aureus метициллин-резистентных не было.

Более широкое применение карбапенемов по сравнению с цефалоспоринами в I группе новорожденных (ОНМТ и ЭНМТ), с нашей точки зрения, оправдано, поскольку количество полирезистентных штаммов энтеробактерий в этой группе превышало таковое в двух других группах: 72% - в I группе, 54% - во II и 40% - в III группе (р<0,001). Следует отметить, что различие высеваемости полирезистентных штаммов энтеробактерий во II и III группе также было статистически значимым. Таким образом, чем ниже вес детей при рождении, тем чаще они колонизируются полирезистентными штаммами энтеробактерий. Недоношенные дети - своеобразное поле для селекции госпитальных штаммов посредством многократных пассажей через восприимчивый организм, что приводит к отбору штаммов с повышенной вирулентностью именно для этого контингента новорожденных.

Все новорожденные с ОНМТ и ЭНМТ - с целью профилактики грибковых инфекций получали флюконазол. При наличии признаков системного микоза или выделении дрожжевых грибов, устойчивых к флюконазолу, проводили смену антимикотика на вориконазол или эхинокандины. На фоне широкого профилактического применения флюконазола новорожденным с ОНМТ и ЭНМТ отмечено доминирование в видовой структуре выделенных грибов флюконазол-устойчивых штаммов non-albicans видов (C.famata - 62%), в то время, как в двух других группах преобладали флюконазол -чувствительные штаммы С.albicans и non-albicans: C.glabrata, С.parapsilosis (рис.4).

Рисунок Xt4.

Видовой спектр грибов роля Candida в трех группах новорожденных

группа 1 группа 2 гругтп 3

В ОРИТ новорожденных наблюдаемого стационара смену стартовой терапии на ванкомицнн проводили при ухудшении общего состояния н при обнаружении в плановых посевах кала н из зева госпитальных штаммов ЛУ/?('о.\'5, то есть проводилась терапия по подозрению на инфекцию. Новорожденным с ОНМТ и ЭНМТ был проведен 81 курс терапии ванкомнцином по подозрению (при обнаружении \1RCoNS в зеве и кале), терапия подтвержденной инфекции - 10 курсов (при выделении \fRCoNS из крови и эндотрахеального аспирата), 10 курсов ванкомицина было проведено для лечения инфекций другой этиологии.

Была оценена микробиологическая эффективность 91 ку рса ванкомицина (10 — при подтвержденной инфекции и 81 — по подозрению на инфекцию) в группе новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ. В 29.7% случаев (27 курсов) терапия по подозрению была оценена как микробиологически эффективная: в посевах из кала и зева отмечена элиминация или значительное снижение титра Со№, или СоЛК оставались на постоянно низком уровне. В 70,3% случаев (64 курса) терапию по подозрению оценили как неэффективную, т.к. тнтр СоЛ'5 в кале и зеве во время терапии возрастал или оставался на высоком уровне (92%;59/64). в некоторых случаях — на фоне терапии был выделен СоКБ из крови, трахеи или появлялись локальные проявления инфекционного процесса: конъюнктивит, поражения кожных покровов (8%; 5/64). Из 10 случаев терапии ванкомнцином подтвержденной Со.\'5 —

инфекции в одном случае элиминации возбудителя не произошло. Вызывает особый интерес, что у 3 погибших детей, лечившихся ванкомицином, в аутопсийном материале (ткань легких, кровь) были обнаружены MRCoNS.

У 115 штаммов MRCoNS была определена МПК ванкомицина: у 93% штаммов МПК составила 1-2 мкг/мл, у 6% штаммов - 0,5 мкг/мл и у 1% - более 2 мкг/мл.

Мы полагаем, что отсутствие в некоторых случаях эффекта от применения ванкомицина возможно связано с доминированием в госпитальной среде MRCoNS с повышенным уровнем МПК (более 1 мкг/мл). Учитывая, что ванкомицин обладает относительно низкой способностью проникать в ткани, в очаге инфекции не создаются необходимые терапевтические концентрации. Полученные данные заставляют более осторожно подходить к назначению ванкомицина только на основании плановых посевов по контролю контаминации ЖКТ новорожденного. Не вызывает сомнений, что при клиническом ухудшении состояния ребенка или повышением уровня маркеров воспаления (ЦРБ, ПКТ, лейкоцитоз) колонизация кала и зева может трактоваться как повод к назначению ванкомицина.

Карбапенемы назначали в основном по подозрению на инфекцию. У 80% (53/66) новорожденных в посевах из кала, зева, а также из очагов инфекций до начала лечения карбапенемами грамнегативные бактерии не были обнаружены. Лишь у 20% (13/66) новорожденных, причиной назначения карбапенемов было обнаружение в кале, зеве или в очагах инфекции энтеробактерий — продуцентов бета-лактамазы расширенного действия (БЛРС). На фоне терапии карбапенемами у 12 детей (22%) в кале и зеве появились энтеробактерии (в т.ч. продуценты БЛРС), реже - неферментирующие грам негативные палочки (как чувствительные, так и устойчивые к данной группе антибиотиков), у 3 новорожденных энтеробактерии — продуценты БЛРС появились в очагах инфекций. В процессе лечения карбапенемами титр энтеробактерий хотя и снизился, однако не происходило их элиминации из кишечника и зева, а в некоторых случаях (2/13) и из

эндотрахеального аспирата. Целесообразность профилактического применения карбапенемов сомнительна, поскольку не защищает новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ от колонизации полирезистентными штаммами УПМ (22%) и в то же время повышает риск неудач при терапии ГИ.

Смена антимикотиков при выделении флюконазол-устойчивого C.famata была произведена у 17 (12%) глубоконедоношенных новорожденных, при этом у 4 детей смена происходила дважды, а у одного ребенка — трижды. Таким образом, в 30% случаев инфекции, ассоциированные с C.famata, трудно поддавались терапии, требовали значительных финансовых затрат и увеличивали длительность пребывания в новорожденных в ОРИТ.

ВЫВОДЫ:

1. Ведущими условно-патогенными микроорганизмами при колонизации слизистых оболочек ЖКТ у новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела являются метициллин-резистентные коагулазонегативные стафилококки (37,0±3%), полирезистентные представители семейства Enterobacteriaceae (20,6±2%) и дрожжевые грибы Candida non-albicans (935 ± 1,4%).

2. В этиологии госпитальных инфекций у новорожденных с очень низкой и экстремалльно низкой массой тела лидируют метициллин-резистентные коагулазонегативные стафилококки (61±10,5%). Значительно реже встречаются дрожжевые грибы Candida non-albicans (16,5%, доверительный интервал 7,2% -39,5%) и энтеробактерии (12% доверительный интервал 6% -31%).

3. В видовой структуре коагулазонегативных стафилококков, циркулирующих в ОРИТ новорожденных, преобладают виды: S.epidermidis и S.haemolyticus. Большинство штаммов этих видов формируют единые клональные комплексы, а метициллин-резистентные коагулазонегативные стафилококки, выделенные из очагов инфекции, обладают повышенным токсиногенным потенциалом.

4. Применение бета-лактамных антибиотиков в стартовой терапии

глубоконедоношенных детей создает предпосылки для селекции МЯСоИБ. Последующее назначение ванкомицина в 75% случаев не приводит к снижению титра метициллин-резистентных коагулазонегативных стафилококков в кишечнике и зеве новорожденных. 5. Профилактическое применение флюконазола у новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела приводит к перераспределению видового состава дрожжевых грибов и превалированию среди возбудителей госпитальных инфекций Сапс1к1а поп-а1Ысат, устойчивых к флюконазолу. Практические рекомендации:

Микробиологический мониторинг в ОРИТ новорожденных перинатальных центров является неотъемлемой частью инфекционного контроля и должен стать повседневной практикой в перинатальных центрах, поскольку отражает особенности этиологии ГИ в конкретном стационаре. Микробиологический мониторинг включает плановое слежение за колонизацией слизистых ЖКТ новорожденных (мазки из зева, кал). Кратность проведения обследования зависит от наличия факторов риска по развитию ГИ у конкретных пациентов: для новорожденных с наличием факторов риска микробиологический мониторинг следует проводить 2 раза в неделю, при отсутствии таковых — 1 раз в неделю. При подозрении на развитие системного воспалительного процесса следует производить этиологическую диагностику, которая включает микробиологическое исследование патологического материала, взятого из предполагаемого очага инфекции, а также посев крови в обязательном порядке. Недопустимо в рутинной практике планово (в рамках микробиологического мониторинга) проводить посевы крови, мочи или исследование других биоматериалов, требующих проведения инвазивных процедур, поскольку это создает дополнительные факторы риска для развития ГИ.

Стартовая антибактериальная терапия у новорожденных из группы риска в ОРИТ должна быть направлена на элиминацию основных возбудителей ВУИ, в

первую очередь Streptococcus agalactiae и E.coli. Наиболее рациональным с точки зрения эффективности и безопасности в данном случае является применение защищенных пенициллинов, как альтернатива может быть использована комбинация ампициллина с аминогликозидом.

Для оптимизации антибактериальной терапии в ОРИТ новорожденных наблюдаемого стационара целесообразно сузить показания к использованию антибактериальных препаратов в профилактических целях. В первую очередь это касается бета-лактамных антибиотиков (пенициллинов и карбапенемов), которые создают селективное давление для отбора метициллин-резистентных стафилококков.

Широкое использование ванкомицина приводит к селекции штаммов CoNS с повышенным уровнем МПК (>=2 мкг/мл), что может быть причиной клинической не эффективности лечения.

Профилактическое применение флюконазола у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ нуждается в конкретных показаниях, поскольку селекция штаммов Candida non-albicans, устойчивых к флюконазолу, приводит к увеличению случаев ГИ, вызванных этими грибами и формирует дополнительные трудности при выхаживании глубоко недоношенных новорожденных.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Анкирская А.С, Муравьева В.В., Миронова Т.Г., Королева Т.Е., Любасовская Л.А., Карапетян Т.Э., Байрамова Г.Р. «Генитальный кандидоз в структуре оппортунистических инфекций влагалища. Принципы лабораторной диагностики и значение мониторинга чувствительности грибов к антимикотикам» //Акушерство и гинекология, 2009, №5, с.31-37.

2. Кудашов Н.И., Анкирская A.C., Александровский A.B., Любасовская Л.А. «Клиническая значимость микробиологического мониторинга бактериальных агентов в условиях отделения патологии новорожденных» // Детские

инфекции, 2009, №1, с.24-29.

3. Воронина O.JL, Кунда М.С., Дмитренко О.А., Ковалишина О.В., Попов Д.А., Лунин В.Г., Любасовская Л.А. «Оценка видового разнообразия коагулазоотрицательных стафилококков, выделенных в стационарах Российской Федерации в 2009-2010гг» // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2011, №1, с.3-8.

4. Анкирская А.С., Припутневич Т.В., Муравьева В.В., Завьялова М.Г., Любасовская Л.А., Королева Т.Е., Миронова Т.Г., Писарницкая В.Л. «Использование масс-спектрометрии для идентификации клинических изолятов дрожжевых грибов» // XIV Кашкинские чтения.-Тезисы докладов,-Санкт-Петербург.-22-23 июня,- 2011г (Проблемы медицинской микологии), 2011, Том 13, №2, с.61-62.

5. О. Dmitrenko, О. Voronina, М. Kunda, A. Ankirskaya, L. Lubasovskaya, D. Popov, A. Gintsburg «Molecular characterisation of methicillin-resistant coagulas-negative staphylococci isolated from patients of cardiovascular and neonatal centres in Moscow» // Special Issue: Abstracts of the 22nd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, London, United Kingdom, 7-10 May 2011, Abstract P.2384, S712.

6. Припутневич T.B., Любасовская Л.А., Ионов O.B., Никитина И.В., Приходько Н.А. «Особенности микробной колонизации новорожденных, госпитализированных в отделение реанимации и интенсивной терапии» // Материалы V Научно - образовательном конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии», Москва, 27-30 ноября 2012, с. 107-109.

7. Lyubasovskaya L.A., Ankirskaya A.S., Priputnevich T.V., Zavyalova M.G., Rumina 1.1., Zubkov V.V. «Nonfermenting Bacteria Colonization of Newborn Infants Hospitalized in the Department of Pathology of Neonatal Perinatal Centre» // 13th Asia-Pacific Congress of Clinical Microbiology and Infection, Beijing,China,

October 25-28 2012, PS2-075, p.253.

8. Корниенко М.А., Ильина Е.Н., Любасовская Л.А., Припутневич Т.В., Говорун В.М. «Молекулярно-генетическая характеристика клинических изолятов Staphylococcus haemolyticus по данным MLST и анализа масс-спектров» // Материалы III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Казань, 22-24 ноября 2012, с.163-164.

9. Припутневич Т.В., Любасовская Л.А., Анкирская А.С., Рюмина И.И., Зубков В.В. «Колонизация неферментирующими бактериями детей, госпитализированных в отделение патологии новорожденных перинатального центра 3 уровня» // Тезисы XIV Международного конгресса МАКМАХ.-Москва.-23-25 мая - 2012г (Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия), Том 14, №2, с. 43-44.

10.Любасовская Л.А., Припутневич Т.В., Ильина Е.Н., Корниенко М.А. «Роль коагулазонегативных стафилококков в этиологии госпитальных инфекций у новорожденных ОРИТ» // Тезисы XV Международного конгресса МАКМАХ.-Москва.-22-24 мая - 2013г (Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия), Том 15, №2, с.27-28.

11 .Любасовская Л.А., Припутневич Т.В., Анкирская А.С., Дегтярев Д.Н., Антонов А.Г., Ионов О.В., Никитина И.В., Приходько Н.А. «Особенности микробной колонизации новорожденных в отделении реанимации и интенсивной терапии» // Российский вестник иеринатологии и педиатрии.-2013, №3, с.87-91.

12.Любасовская Л.А., Корниенко М.А., Припутневич Т.В., Ильина Е.Н., Щеголев А.И. «Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика коагулазонегативных стафилококков, выделенных у новорожденных отделения

реанимации и интенсивной терапии» // Антибиотики и химиотерапия, 2013, Том 58, № 3-4, с.26-33.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

УПМ — условно-патогенный микроорганизм

ЭНМТ — экстремально низкая масса тела

ОНМТ очень низкая масса тела

I и госпитальная инфекция

III П' — полимеразная цепная реакция

CoNS — коагулазонегативные стафилококки

MRCoNS — метициллинрезистентные коагулазонегативные стафилококки

БЛРС бета лактамаза расширенного спектра

(LSI — Clinical and Laboratory Standards Institute

ЦРБ С-реактивный белок

II KT — прокальцитонин

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Любасовская, Людмила Анатольевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ И ПЕРИНАТОЛОГИИ ИМ.В.И. КУЛАКОВА МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ»

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

/ плл / I л л п

!ЭОЧ117

Любасовская Людмила Анатольевна

Видовой состав госпитальных штаммов условно-патогенных микроорганизмов и их роль в развитии инфекции у новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела

(03.02.03 - микробиология)

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители: кандидат медицинских наук Т.В. Припутневич доктор биологических наук, доцент E.H. Ильина

МОСКВА

2013

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.........................................5

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................6

ГЛАВА 1. Современные представления о госпитальных инфекциях у новорожденных, находящихся на выхаживании в ОРИТ (обзор литературы)......................................................................................................12

1.1 Понятие о госпитальных инфекциях.........................................................12

1.2 Инфекции у новорожденных, классификация и особенности у детей с ОНМТиЭНМТ..................................................................................................16

1.3 Факторы вирулентности Са/УХ..................................................................26

1.4 Чувствительность к антибактериальным препаратам наиболее часто выделяемых госпитальных штаммов микроорганизмов к антимикробным препаратам и механизмы ее развития...........................................................31

1.5 Современные принципы антибиотикотерапии госпитальных инфекций у новорожденных...............................................................................................34

1.6 Микробиологический мониторинг в системе инфекционного

контроля..............................................................................................................38

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.................................41

2.1 Общий объем проведенных исследований...............................................42

2.2 Клинический материал...............................................................................45

2.3 Микробиологические методы....................................................................46

2.4 Протеомные методы...................................................................................52

2.5 Молекулярно-генетические методы исследования штаммов СоЖ...................................................................................................................53

2.6 Особенности проводимой в отделении антибактериальной терапии...............................................................................................................56

2.7 Статистическая обработка полученных результатов...............................57

ГЛАВА 3. Особенности этиологической структуры инфекций новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ...............................................................59

3.1 Анализ результатов микробиологических исследований у новорожденных в первые сутки жизни..............................................59

3.2 Результаты микробиологического обследования слизистых ЖКТ новорожденных, находящихся на лечении в ОРИТ........................................60

3.3 Результаты микробиологического обследования очагов инфекций новорожденных, находящихся на лечении в ОРИТ........................................66

3.4 Результаты анализа микробиологического исследования аутопсийного материала новорожденных...............................................................................70

3.5 Видовое типирование изолятов СоЛФ.......................................................73

ГЛАВА 4. Генетическое исследование СоМБ..............................................76

4.1 Исследование факторов патогенности СоМ>.........................................76

4.2 Результаты мультилокусного секвенирования Б^ер1с1егт1сИз.................79

4.3 Результаты мультилокусного секвенирования Иаето1уасш................81

4.4 Изучение способности основных сиквенс-типов СоЛ/51 к длительной

персистенции.....................................................................................................83

ГЛАВА 5. Изучение чувствительности основных групп УПМ и особенностей антимикробной химиотерапии у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ................................................................................................85

5.1 Антибиотикотерапия у глубоконедоношенных новорожденных............85

5.2 Анализ чувствительности, выделенных микроорганизмов к АМП.......88

5.3 Изучение микробиологической эффективности наиболее часто применяемых АМП в отношении этиологически значимых

микроорганизмов у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ.................................93

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................95

ВЫВОДЫ........................................................................................................109

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.....................................................110

ПРИЛОЖЕНИЯ.............................................................................................114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................127

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ОРИТ - отделение реанимации и интенсивной терапии

ГИ - госпитальная инфекция

ВАП - вентилятор - ассоциированная пневмония

ОНМТ - очень низкая масса тела

ЭНМТ - экстремально низкая масса тела

ПКТ - прокальцитонин

АМП - антимикробные препараты

МПК - минимальная подавляющая концентрация

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СоNS - Coagulase-Negative staphylococci (коагулазонегативные

стафилококки)

MRCoNS - Метициллин - резистентные CoNS

MS - Метициллин-чувствительные

SCCmec - staphylococcal chromosome cassette mec

MLST - Multilocus Sequence Typing

CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute (Институт no

клиническим лабораторным стандартам)

НЭК - некротизирующий энтероколит

грам «-» - грамотрицательные микроорганизмы

грам «+» - грамположительные микроорганизмы

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ГНТ - гиперчувствительность немедленного типа

СТШ - синдром токсического шока

ЦВК - центральный венозный катетер

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Выхаживание глубоконедоношенных детей в последние годы стало приоритетным направлением деятельности отделений реанимации новорожденных. С 1 января 2012 года Россия перешла на рекомендуемую ВОЗ регистрацию детей с массой тела при рождении от 500 г с включением в государственную статистику [25]. Благодаря научно-техническому прогрессу в медицине появилась возможность выхаживать недоношенных детей, начиная с 22 недель гестации и массой тела от 500г. Однако усилия, затраченные на выхаживание таких новорожденных, могут оказаться тщетными при развитии госпитальных инфекций (ГИ), риск развития которых в этой группе пациентов чрезвычайно высок. Отсутствие сформировавшегося иммунитета и нормальной микрофлоры у столь недоношенных детей делает процесс их адаптации к вне утробному существованию проблематичным со многих точек зрения, в том числе и с микробиологических позиций. Отсутствие естественного процесса приобретения нормальной микрофлоры (от матери), а также массивная антибактериальная терапия, которую получают все маленькие пациенты, влекут за собой колонизацию и инфицирование госпитальными штаммами условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), которые часто (у 25-30% недоношенных детей) становятся причиной развития инфекционных осложнений госпитального происхождения [28]. Такие нозологические формы, как конъюнктивиты, омфалиты, катетер-ассоциированная бактериемия, вентилятор-ассоциированная пневмония, некротизирующий энтероколит (НЭК), сепсис сопровождаются высокой летальностью. По данным Национального комитета по внутрибольничным инфекциям (NN18, США) за 2001 год поздний неонатальный сепсис встречается у 50% новорожденных с весом при рождении менее 1500г [110]. При этом увеличивается длительность пребывания в стационаре до 79 дней, а

летальность в этой группе детей возрастает до 18% (против 7% с отсутствием сепсиса), особенно если возбудитель — грам «-» микроорганизмы (36%) и грибы (32%) [133,134].

Проведение рациональной антимикробной терапии ГИ невозможно без современных знаний об этиологической структуре инфекционных заболеваний и1 антибиотикорезистентности возбудителей. В этом плане актуальным представляется регулярное слежение за изменениями видового разнообразия госпитальных штаммов микроорганизмов, циркулирующих в родовспомогательном учреждении, а также изучение их антибиотикорезистентности.

Структура ГИ, с одной стороны, конкретна для каждого стационара, что обусловлено множеством факторов, таких, как техническая оснащенность отделения, квалификация персонала, контингент больных, проводимая в стационаре антибиотикополитика и т.д. С другой стороны, общие закономерности, по которым развивается эпидемический процесс, приводят к появлению общих черт в формировании «эпидемических вариантов в популяциях госпитальных штаммов УПМ.

В современных эпидемиологических исследованиях при изучении этиологической структуры неонатальных инфекций часто используется термин «микробиологический мониторинг», под которым подразумевают плановые микробиологические обследования госпитальной среды и по клиническим показаниям — новорожденных [30]. При таком «мониторинге» получают исходные данные для ретроспективного анализа этиологической структуры уже состоявшихся ГИ и оценки эпидемиологической ситуации в отделении в целом. В современных условиях выхаживания маловесных новорожденных центр внимания переключается с госпитальной среды на пациента — слежение за этапами микробной колонизации. В режиме поп stop с двух-трех дневным интервалом проводят культуральное исследование мазков со слизистых

оболочек ЖКТ, что позволяет оперативно реагировать на ситуации патологической колонизации и предупреждать развитие ГИ как у конкретного пациента, так и неблагоприятной эпидемиологической ситуации в целом [1]. Микробиологические исследования, проводимые с диагностической целью не должны рассматриваться как микробиологический мониторинг (поскольку изучение этиологии ГИ не является профилактическим мероприятием). Цель настоящего исследования:

Выявить особенности этиологической структуры ГИ у новорожденных с очень низкой и экстремально-низкой массой тела при рождении (ОНМТ и ЭНМТ) и усовершенствовать качество микробиологического мониторинга в современных условиях перинатального Центра.

Для достижения поставленной цели были определены следующие Задачи:

1. Выявить особенности колонизации условно-патогенных микроорганизмов новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении в условиях отделения реанимации.

2. Определить этиологию инфекций у новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела на основании результатов микробиологического исследования патологического материала из очагов инфекций.

3. С помощью масс-спектрометрического анализа определить видовую принадлежность коагуазонегативных стафилококков (СоА^Х), циркулирующих в отделении реанимации новорожденных. Используя молекулярно-генетические методы, изучить сиквенс-типы и факторы вирулентности СоЫБ.

4. Сопоставить данные чувствительности к антимикробным

препаратам этиологически значимых условно-патогенных микроорганизмов in vitro с данными микробиологической эффективности в процессе этиотропной терапии новорожденных.

5. Определить влияние антимикробной терапии на колонизацию госпитальными штаммами УПМ новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ.

Научная новизна работы:

■Изучены особенности колонизации и инфицирования госпитальными штаммами УПМ новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ в условиях перинатального Центра.

■Получена комплексная микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика госпитальных штаммов CoNS и показана роль штаммов с определенным генетическим профилем в развитии инфекционного процесса у новорожденных.

■Показана роль антимикробной терапии в формировании микроценоза слизистых оболочек ЖКТ у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ, а также ее влияние на этиологическую структуру ГИ у пациентов этих групп.

Практическая значимость:

На основании проведенного комплексного клинического и молекулярно-генетического анализа даны рекомендации по оптимизации микробиологического мониторинга и эмпирической терапии инфекций у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ при рождении. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Метициллин-резистентные коагулазонегативные стафилокококки (MRCoNS), полирезистентные штаммы энтеробактерий {Enterobacter cloacae) и дрожжевые грибы видов Candida non-albicans играют ведущую роль в этиологической структуре госпитальных инфекций у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ.

2. Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus haemolyticus преобладают в

видовой структуре среди CoNS. Каждый из этих видов принадлежит к ограниченному числу сиквенс-типов. Они являются близкородственными, относятся к единому клональному комплексу. Основное их свойство - способность к длительной циркуляции в стационаре.

3. Распространение MRCoNS, несущих ген тесА и увеличение доли дрожжевых грибов Candida non-albicans, устойчивых к флюконазолу, в значительной мере является результатом селективного давления антимикробных препаратов (АМП). Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения:

Усовершенствованный алгоритм микробиологического мониторинга в ОРИТ новорожденных используется в практической работе Отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова» МЗ РФ; рекомендации по оптимизации антимикробной терапии у новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ внедрены в работу Отдела неонатологии Центра. Материалы диссертации используются в лекционном материале при обучении на курсах повышения квалификации врачей, обучении клинических ординаторов и аспирантов, на семинарах и конференциях, проводимых в ФГБУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова» МЗ РФ. Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

• XIV международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии, Москва, май 2012г.

• Ученом совете ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Минздрава РФ, Москва, ноябрь 2012г.

• V Научно - образовательном конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии», Москва, ноябрь 2012г.

• III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Казань, ноябрь 2012г.

• 22nd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, London, United Kingdom, март-апрель 2012.

• 13th Asia-Pacific Congress of Clinical Microbiology and Infection October 25-28, 2012 Beijing, China.

• XV международном конгрессе MAKMAX по антимикробной терапии, Москва, май 2013г.

Обсуждение диссертационной работы состоялось на межклинической конференции сотрудников ФГБУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова» МЗ РФ (01.03.2013), заседании апробационной комиссии (06.05.2013) ФГБУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова» МЗ РФ.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 5 статей в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК РФ и 2 публикации в зарубежных изданиях. Структура и объем диссертации:

Диссертационная работа состоит из введения 5 глав, включающих обзор литературы, собственные исследования и их результаты, заключения, выводы, практические рекомендации, список литературы. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 таблицами, 16 рисунками и 3 фотографиями.

Указатель литературы состоит из 34 отечественных и 114 зарубежных источников.

ГЛАВА 1. Современные представления о госпитальных инфекциях у новорожденных, находящихся на лечении в ОРИТ новорожденных (обзор литературы).

1.1 Понятие о госпитальных инфекциях.

Согласно определению ВОЗ госпитальные инфекции - это любые клинически выраженные заболевания микробного происхождения, поражающие больного в результате его госпитализации или посещения лечебного учреждения с целью лечения, а также больничный персонал в силу осуществления им деятельности, независимо от того, проявляются или не проявляются симптомы этого заболевания во время нахождения данных лиц в стационаре.

ГИ обычно возникают через 48 часов или более после поступления больного в лечебное учреждение, при условии отсутствия клинических проявлений этих инфекций в момент обращения [34]. Несмотря на проводимые противоэпидемические мероприятия, частота возникновения, летальность и стоимость терапии ГИ остается высокой. В большей степени это связано с ростом и распространением штаммов микроорганизмов, резистентных к АМП. Это является серьёзным фактором, влияющим как на клинический исход, так и приводящим к значительному увеличению затрат на лечение инфекций [95]. Более 90% всех ГИ имеет бактериальное происхождение, а вирусные, грибковые возбудители и простейшие встречаются значительно реже [33].

Особенностью ГИ является то, что они могут быть вызваны не только облигатными патогенами (например, М. tuberculosis), но и УПМ, обладающими небольшим набором факторов вирулентности (S.maltophilia, Acinetobacter spp., S.epidermidis и др.), особенно подвержены пациенты с иммунодефицитными состояниями различного происхождения и больные, имеющие тяжелую патологию. Наиболее частыми возбудителями ГИ

являются микроорганизмы, широко распространенные в окружающей среде, устойчивые ко многим внешним факторам и быстро приобретающие резистентность к антибактериальным препаратам. По сравнению с "классическими" возбудителями нозокомиальных инфекций (S.aureus, P.aeruginosa, E.coli, Klebsiella spp.), этиоло