Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Векторы, содержащие энхансер трансляции, для экспрессии искусственных генов в E. coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Векторы, содержащие энхансер трансляции, для экспрессии искусственных генов в E. coli"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА И ЮА.ОВЧИННИКОВА

Р Г Б ОД На правах рукописи

БИРИХ Клара Рудольфовна

ВЕКТОРЫ,

СОДЕРЖАЩИЕ ЭНХАНСЕР ТРАНСЛЯЦИИ, ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ИСКУССТВЕННЫХ ГЕНОВ В Е.соП

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Ю. А. Берлин

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

И. Н. Шатский

доктор химических наук, профессор А. И. Гуревич

Ведущая организация Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита состоится " октября 1994 г. в 1000 на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической хими им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу 117871, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан " ^ 2 " сентября 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

В. А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Совершенствование методологии рекомбинантных ДНК поразительно засширило возможности направленного биосинтеза белка. Среди различных :истем экспрессии генетических детерминант, в том числе экспрессии ■етерологической, значительное место занимают прокариотические системы, бактериальные суперпродуценты позволяют получать значительные количества зысокоочищенных рекомбинантных белков для использования в медико-эиологических и сельскохозяйственных целях.

Поскольку нативный эукариотический ген из-за мозаичности своей структуры не может быть непосредственно использован в такой системе, один 43 наиболее распространенных генноинженерных подходов к синтезу эукариотических белков состоит в конструировании безын^ронного гена делевого белка и введении его в бактериальный вектор, содержащий

эегуляторные элементы, необходимые для экспрессии гена. -8-_ашй.

1оследовательнас1м--е©бытт в - наименьшей-степ^ТОГТЗбёспечен рациональной зоновой- Заключительный этап синтеза белка - трансляция, особенно ее инициация. Хотя о молекулярной природе детерминантов трансляции у прокариот известно многое, именно исход трансляции наименее предсказуем, гак что создание новых эффективных генноинженерных конструкций не только позволяет получать нужный белок, но и вносит вклад в изучение механизма трансляции у прокариот.

Цель работы

Целью работы было создание эффективных векторов для экспрессии синтетических генов в Е.соН и получение на их основе штаммое продуцентов зрелого интерлейкина-1а человека и его рецепторного антагониста.

I

Научная новизна и практическая ценность работы

Развитие методов генной инженерии сделало возможным синтез природных и модифицированных белков и пептидов в разнообразных прокариотических и эукариотических системах. Вместе с тем даорей* на пути исследований подобного рода возникают проблемы, решение которых требует новых генноинженерных конструкций. Нередко эти проблемы связаны с

эффективностью трансляции, прежде всего, ее инициации. В ходе синтеза и изучения экспрессии генов некоторых цитокинов человека мы сконструировали экспрессирующие векторы, различающиеся областью связывания рибосом (рис.1); в их основе лежит плазмида pGEM1, которая по существу предназначена для транскрипции in vitro, но, будучи снабженной участком связывания рибосом, способна также функционировать в системе белкового синтеза. Полученные векторы были использованы нами, в частности, для экспрессии гена зрелого интерлейкина-1а человека, которой не удавалось добиться в ряде стандартных векторов. Новый экспрессирующий вектор pGEN, содержащий в области связывания рибосом энхансер трансляции из гена 10 фага Т7, позволил получить интерлейкин-1а с выходом около 10% от суммарного клеточного белка. Еще более высокого уровня экспрессии - более 30% - удалось достичь в случае вектора pGMCE, в котором целевой ген составляет вторую часть двуцистронной конструкции, а энхансер трансляции и последовательность Шайна-Дальгарно для целевого гена введены в кодирующую часть первого, короткого искусственного гена (миницистрона). В этом же векторе был клонирован ген рецепторного антагониста интерлейкина-1, доля которого в суммарном клеточном белке составила 13%. Эффективность сконструированных участков инициации трансляции проанализирована не только in vivo, но и in vitro.

Структура работы

Диссертация, изложенная на Hi страницах, включая Збрисунков, содержит три главы - обзор литературы, посвященный оптимизации трансляции в прокариотических системах экспрессии генов, обсуждение полученных результатов, описание материалов и методов, использованных в работе, а также список цитируемой литературы ссылок).

Презентация материала

Материал, представленный в диссертации, опубликован в трех статьях, а также доложен на VI конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1994) и на XI Международном круглом столе "Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологическое применение" (Левен, 1994).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспрессирующие конструкции с геном интерлейкинэ-1а на основе стандартных векторов

Ранее в группе генетической инженерии интерлейкинов был синтезирован ген зрелого интерлейкина-1а (lL1a) человека (Lebedenko et al., 1991), одного из наиболее плейотропных белковых факторов, играющих важную роль в протекании многих клеточных процессов (Dinarello, 1991).

Предпринятые попытки экспрессии этого гена в стандартном плазмидном векторе pDR540 (Pharmacia) под контролем IPTG-индуцируемого (ас-промотора в клетках Ecoli TG1 оказались безуспешными, хотя полученная конструкция pDIL1 (рис.1) содержала основные необходимые для транскрипции и трансляции структурные предпосылки.

Поэтому мы решили использовать другую систему экспрессии - более эффективную в отношении транскрипции систему Студиера (Studier & Moffatt, 1986), в которой транскрипция контролируется конститутивным поздним промотором фага Т7 перед целевым геном в составе плазмиды и IPTG-индуцируемым 1ас-11У5-промотором, предшествующим гену Т7-РНК-полимеразы в составе бактериальной хромосомы. При добавлении IPTG в клетках начинает синтезироваться мощная фаговая РНК-полимераза, которая в свою очередь обеспечивает высокий уровень специфической транскрипции целевого гена с фагового промотора.

В настоящей работе в качестве одного из компонентов системы экспрессии мы использовали плазмиду pGEM1 (Promega), которая содержит поздний Т7-промотор и предназначена для транскрипции in vitro, однако, будучи снабженной сигналами инициации трансляции, может функционировать в студиеровской системе белкового синтеза.

Источником гена IL1 а для клонирования в pGEM1 служила упомянутая выше рекомбинантная плазмида, сконструированная на основе pDR540 (pDIL1), которая содержит этот ген, снабженный прокариотическим участком связывания рибосом. Для извлечения этого сегмента из плазмиды мы провели амплификацию in vitro в сочетании с направленным мутагенезом, используя в качестве прямого и обратного праймеров олигонуклеотиды (I) и (II) (рис.2). Введение во фланкирующие области гена дополнительных рестриктных сайтов Крп\ и Hindill расширило возможности манипуляций с геном, которые ранее были ограничены из-за отсутствия в плазмиде pDR540 полилинкера (эта плазмида содержит только один пригодный для клонирования сайт, SamHI).

Полученный модифицированный ген был клонирован в вектор pGEM1/Sa/T7HI,H/ndlll под контроль Т7-промотора. с образованием плазмиды PGIL1 (рис. 3). Далее мы пытались провести экспрессию гена IL1a в составе . этой плазмиды после трансформации ею штамма E.coli BL21(DE3) (Novagen), в котором ген Т7-РНК-полимеразы встроен в бактериальную хромосому под контролем lac-UV5 промотора. Однако в лизатах клеток этого штамма мы не

pDENILI

ENH IL 1a

exBamKt I ßa

pDEN -1-B-

ENH

SamHi BamHI

e.ori fl1a hi.mii pGMCILI MC (¡Lira) (pGMCILra)

MCE

•xBarnHl Kpnl Hlndlll

ENH

¡LI а

riEr

ч 11——

pGMC

pGENtl.1

pGEN

ENH

BamHI Hinölll

. Kpnl n. BamHI

-j—bp r- ipöih

eosm SD 'i-'a, 1

Рис.1. Экспрессирующие плазмиды (производные pDR540 и pGEM1), сконструированные в настоящей работе. SD - последовательность Шайна-Дальгарно, ENH - энхансерный олигонуклеотид, MC - миницистрон.

BamHI so КРП|

Б' CüSATCC^GGflAACAGGTACCATG'tG 3' ]

•• Start

BamHI Hlndlll ir

6' cST3Ä7rat'ÄSCTlACUCGCC7GGTTTCC 3' 11 stop

E»P3I ) „,

Б* CCSTJTTZTCMTGT CÄT CAC CT T T TAG G T T С 3' Ш Start

E»p3t 1 ...

6'cC3r5T2iMATGCQACCCTCTGGGACAAA 3' IV

»Till

BamHI Hlndlll в- свЗЯТСШЗгГГАСТСОТССТССТевААС 3' V

sTop

Рис.2. Олигодезоксирибонукг.еотиды, использованные в качестве ПЦР-праймеров для извлечения модифицированных генов lL1a и ILlra из ллазмид. Курсивом выделены свисающие (некомплементзрные матрице) концы прэймеров. Терминирующий кодом представлен в обратных прайма-рах в виде комплементарной последовательности. Зачерненными кружками обозначены некомплементарные матрице нуклеотидные звенья в праймере (I), инициирующие мутагенез с превращением ßamHI- в Крп!-сайт. Стрелки указывают места расщепления нуклеотидной цепи эндонуклеазой рестрикции £sp3l.

ПЦР с

праймерами I и II

ВатН1 Крп! Н1пс1Ш ВатН1

Ьд/^Т 1 ч:1'"

лигирование с риС19/5та1,С1Р

клонирование ВатН1/Н!лсШ1-фрагминта в РСЕМ1

ВатН!

Крп1

3. Экспрессирующие конструкции с геном зрелого 111 а человека на ова векторов рйВ540 и рСЕМ1 (схема конструирования плазмиды И).

сгартл

5" ррэДАШСиСЛЗСгОдиЛАСА "" АСДДС. .3'

исиСд и

■л дс и-» с-с с-с

и и и и,

„с С

А С

с-с

с-с Я? с-с с-с

5" рррСССАСА седис ДССААиС.

А-и

с-с с-с

А-и ■С-С,

II Г X

и

2-е

А-и

.4. Энергетически наиболее выгодные (по данным компьютерного иза) вторичные структуры 5'-концевой области мРНК, синтезируемых о 1ромотора плазмиды рЭШ (А) и с Т7-промотора плазмиды рОИ (Б).

обнаружили продукта экспрессии синтетического гена.

Одна из возможных причин отсутствия экспрессии гена IL1a в обеих системах (pDR540 в TG1 и pGEM1 в BL21(DE3)) следует из рассмотрения термодинамически наиболее выгодных вторичных структур 5'-концов соответствующих мРНК (р:<с.4): в обоих случаях SD-последовательность оказывается целиком включенной в шестизвенный дуплекс, что может препятствовать ее комплементарному взаимодействию с 16S РНК и тем самым ингибировзть инициацию трансляции (Hall et al., 1982).

Одноцистронныс экспрессирующие конструкции с энхансером трансляции перед целевым геном (¡На)

Пытаясь обойти эти трудности, обусловленные особенностями вторичной структуры участка инициации трансляции, мы решили модифицировать участок связывания рибосом в наших конструкциях, дополнив его еще одним регуляторным элементом - энхансером трансляции из лидерной мРНК гена 10 (g10i) бактериофага Т7. Ранее было показано, что роль энхансера в этой лидерной r.iPHK играет 9-звенный сегмент 5'UUAACUUUA, предположительно взаимодействующий с участком 458-466 16S рРНК E.coli, причем расположение этого сегмента перед структурным геном может повышать уровень его экспрессии на 1-2 порядка (Olins & Rangwala, 1989).

Чтобы проверить эффективность подобной модификации в нашем случае, мы сконструировали на основе плазмид pGEM1 и pDR540 два экспрессирующих вектора - pGEN и pDEN, содержащих описанный выше энхансер. Для этого по ВлтН1-сайту каждой из плазмид мы встроили синтетический 34-звенный дуплекс (рис.5), отбирая рекомбинантные плазмиды, в которых устранен проксимальный В<з/??Н1-сайт.

Далее в оба этих вектора по Крл1/Вая)Н1-сайтам мы встроили ген IL1o из плазмиды pG!L1, в результате чего были получены плазмиды pDENIL.1 и pGENILI (рис 6). Как показывает рассмотрение наиболее вероятных вторичных структур транскриптов с Т7-промотора этих плазмид (рис.7), в области инициации трансляции оба они должны содержать слабую шпильку, в стебель которой не совлечены ни SD-последовательность, ни кодон ATG , так что в этих случаях

ВотН! с-п

-12- Крл! I

5' САТССТТДДСТТТАСТААССАТАТССТАССАС ЕЫН

СААТТСАААТСАТТССТАТАССАТССТССТАС - -------' | ВатН!

Рис.5. Синтетический 34-звенный ДНК-дуплекс (Е(МН), содержащий ДНК-¡.чалош энхансера трансляции из лидерной мРНК гена 10 фага Т7 и БО-1!.)следо1:ателыюсти, а также Крп 1-сайт (стрелками указаны места Крп\-р.1сщепления) для последующего сочленения с целевым геном. Один из фланки;'/ищи* полусатсв модифицирован, чтобы при клонировании >,ЧаЛИ!Ь соотвсюшующий Ь'лтНЬсайг.

Ват НI

модиф.

В а т Н I ЕЫН

Кр п I

_ Ее о Я I рг? / ,ВатН1 'ЖпсЯП

рйЕМ!

ВатН! С1Р

Ват Н I

ДНК-лига^а

Крп1 к/ В а т Н I

■ /(/ н I п а 111

ДНК-лигаза

Крл1, ВатШ (большой фрагмент)

Крп|, Н(Пс!111 (большой фрагмент)

Крп1, ВатН1 (малый фрагмент

с геном И1а)

^ еЛ*,Крп|

ВатН!

Рис.6. Схема конструирования плазмид рЭЕЫШ и рСЕМИ.

С ТСС Г

и-А '-С

и и и с

сер 5О

с-с

5' ргрС'-,СдСАС~°СОАиС(

ЗйДиССииДА'. ии^дсиддссдид ссчииидг.сии

старт ^

с с с и

А С и-А

с и

энтнеер 50 ц ¡а

^ьддсииидсиАдаг.дчА ссиичмдссии

Рис.7. 5'-Концевые области мРНК, синтезируемых с Iас-промотора плазмиды рРЕЫШ (А) и Т7-промотора плазмиды рСЕЫ11_1 (Б) (см. также подпись к рис. 4).

г. А

А С

-111ft

кДа

30.0 -

21.5 -14.3

-IL1a

12 5 4

12 3 4

Рис.в. Электрофорез лизатов клеток Eco// BL21(DE3), содержащих рекомбинантные плазмиды с геном IL1a, полученные на основе векторов pDR540 (А) и pGEM1 (Б): 1 - маркеры молекулярных весов, 2 - конструкции с знхансером без индукции IPÏG (контроль), 3 - конструкции без энхансера с индукцией IPTG, 4 - конструкции с энхансером с индукцией IPTG.

вторичная структура мРНК, по-видимому, не должна препятствовать инициации трансляции. Действительно, в штаммах Eco// BL21(DE3) и TG1, трансформированных соответственно плазмидами pGENILI и pDENILI, экспрессия целевого гена наконец-то состоялась (рис.8). В случае плазмиды на основе pDR540 выход белка был заметно ни>:;е, чем в производном pGEM1, и хуже воспроизводился. Поэтому мы предпочли конструкцию pGENILI, для которой, по данным лазерного денситометрирования окрашенного геля доля )L1o в суммарном белке в составе культурального лизата составила 10%, и в дальнейшей работе ориентировались именно на производные плазмиды pGEM1.

Иммуноблотинг полученных лизатов клеток с поликлональными кроличьими и моноклональными мышиными антителами к IL1a показал, что появляющаяся при индукции интенсивная полоса в электрофорезе действительно соответствует этому белку (материал приведен в диссертации).

Нельзя исключить возможность того, что переход от безрезультатных попыток добиться экспрессии гена IL1a в составе плазмид pDR540 и pGEM1 к функционирующим конструкциям pDENILI и pGENIL.1 был обусловлен не столько введением энхансера трансляции как специфического регуляторного элемента, сколько изменением неблагоприятной для трансляции вторичной структуры

соответствующего транскрипта вследствие модификации нуклеотидной последовательности регуляторной части гена. Впрочем, в любом случае ясно, что последовательность проксимальной части экспрессируемого гена служит существенным фактором в образовании благоприятной или неблагоприятной для трансляции вторичной структуры мРНК, так что эффективность конструкции такого рода - при сохранениии ее регуляторной части - может меняться от гена к гену.

Двуцмстронная зкслрессирующая конструкция

Чтобы экспрессирующий вектор был пригоден для широкого круга генов, требуется консервативная последовательность участка инициации трансляции, которая не образует элементов вторичной структуры, препятствующих инициации. Выполнить это внутренне противоречивое условие можно, используя гибридные конструкции, в которых проксимальная часть постоянна, а дистальная часть, кодирующая целевой полипептид в виде С-терминальной части химерного белка, варьирует. Этот подход связан с необходимостью вырезания целевого полипептида, что нередко сопряжено со значительными проблемами. Привлекательную альтернативу составляет принцип двуцистронной конструкции, приводящей к сопряженной трансляции. В составе такой конструкции терминирующий кодон первого цистрона и инициирующий кодон второго цистрона сближены настолько, что рибосома, достигнув терминирующего кодона, не отделяется от мРНК, а почти сразу начинает трансляцию второго гена. Таким образом, если первый цистрон транслируется эффективно, то повышается и уровень трансляции второго цистрона; к тому же в процессе элонгации продукта трансляции первого цистрона рибосома разрушает вторичную структуру в области инициации трансляции второго цистрона, тем самым облегчая реинициацию. Поскольку упоминавшийся выше энхансер, по-видимому, способен стимулировать трансляцию, располагаясь не только до, но и после иницирующего кодона (Olins & Ranwala, 1989), мы решили поместить этот энхансер в кодирующую часть первого цистрона, рассчитывая на то, что в этой позиции он повысит эффективность инициации трансляции как первого, так и второго цистрона.

Планируя первичную структуру первого цистрона, мы не связывали себя какой-либо определенной аминокислотной последовательностью и лишь комбинировали наиболее часто встречающиеся у E.coli кодоны, основываясь на данных о том, что именно с такими кодонами трансляция протекает с высокой эффективностью. При этом предпочтение отдавалось А/Т-богатым кодонам, которые особенно хороши в области инициации трансляции (Sung et al., 1991), в данном случае - инициации трансляции второго цистрона. В то же время, возможность комбинировать распространенные кодоны была ограничена' необходимостью разместить в составе этого цистрона энхансер и SD-последовательность, отделенную участком стандартного размера (в данном

старт ЭНХАНСЕР SD стоп

ÄTG.AAA.TAT.CGC.ATT.AAC.TTT.ATC.GAG.GAG.TAT.AAA.TAA Lys Туг Arg ILe Thr Phe lie Glu Glu Туг Lys 38.7 13.421.5 23.9 25.2 15.6 23.9 19.0 19.013.438.7

Рис.9. Нуклеотидная последовательность синтетического миницистрона (MC) и кодируемая ею аминокислотная последовательность. Указаны частоты встречаемости соответствующих кодонов у Eco//.

случае - 9 нт) от инициирующего кодона второго цистрона. С учетом ряда данных об оптимизации трансляции (Stormo et al., 1986) мы стремились также поместить последовательность ТТАА в область 4-5-го кодонов первого цистрона и звено А в положение "-3" относительно второго цистрона, т. е. в дистальную часть первого цистрона. Сформулированная нами комбинация всех этих структурных элементов гипотетического первого цистрона представлена на рис.9. Искусственный цистрон содержит всего 11 триплетов (не считая инициирующего и терминирующего) и, несомненно, заслуживает названия миницистрона. Этот миницистрон был включен в ДНК-дуплекс (МСЕ), собранный из четырех синтетических олигонуклеотидов МС1-МС4 (рис.10) и клонированный в плазмиду pGEM1 по EcoRI/SamHI-сайтам под контролем Т7-промотора с образованием вектора pGMCE (рис.1). Проксимальная часть дуплекса МСЕ кодирует 5'-нетранслируемую область, которая была ранее использована в одной из двуцистронных конструкций (Schoner et al., 1986) в качестве эффективного участка связывания рибосом, принадлежащего одному из наиболее высокоэкспрессирующихся генов - гену белка клеточной стенки E.coli (/рр). В то же время дистальная часть МСЕ содержит структурные предпосылки для со членения миницистрона с целевым геном (см. ниже).

MC 1

мсз

EcoRI

SD

старт

5' aattcaggatccttaataatgaaatatcgca

3' gtcctaggaattattactttatagcgt МС2

энхансер

SD

Л£^гЕсо311

ttaactttaJtcgaggagtataaataatgc сасассо

aattgaaatogctcctcatatttattacg CWTCGCCTAG

—Г "3

MC4

BamHI

MCE

Рис.10. Синтетический ДНК-дуплекс (МСЕ), содержащий первый цистрон (миницистрон), для модификации экспрессирующего вектора. МС1-МС4 -олигонуклеотидные сегменты; стрелками отмечены положения фосфодиэфирных связей, возникающих при лигировании.

Проблему стыковки двух цистронов с небольшим расстоянием между терминирующим кодоном первого цистрона и инициирующим кодоном целевого гена в получаемой конструкции можно решать с помощью рестриктаз, участок узнавания которых содержит триплет ATG (ЛШ CA'TATG, Nccft C'CATGG). В нашей конструкции {дуплекс МСЕ) терминирующий и инициирующий кодоны не просто сближены, а даже частично перекрывают друг друга с образованием последовательности TAATG на стыке двух цистронов, что успешно использовалось для экспрессии искусственных генов в двуцистронных конструкциях (Makoff & Smallwood, 1990; см. также Mashko et а!.. 1990). Из-за непалиндромности такой стыковки для ее осуществления использовались не эндонуклеазы рестрикции, а направленный мутагенез или химический синтез; мы же рассчитывали на SDL-метод (см. ниже).

Для этого в дистальный конец дуплекса МСЕ был введен участок узнавания Есо311, эндонуклеазы рестрикции класса IIS, узнающей в.составе двуцепочечной ДНК непалиндромный шестичленник 5'GAGACC/3'CTCTGG и расщепляющей ДНК слева от него на расстоянии пяти и одного звеньев соответственно по верхней и нижней цепям с образованием четырехзвенного 5'-»выступающего •конца (рис.11). Первичная структура этого конца определяется нуклеотидной последовательностью, смежной с участкоти узнавания, и потому может быть задана в ходе конструирования этой области. Как видно из рис. 11, аналогично в составе другого дуплекса (в данном случае - второго цистрона) может быть сконструирован комплементарный выступающий конец, что позволяет затем провести по этим двум концам направленное лигирование с образованием единого полинуклеотидного дуплекса (см. ниже). Мы фланкировали £со311-сайт в смысловой цепи первого цистрона последовательностью 5'TAATGC, включающей планируемое сочленение двух цистронов. Это означает, что при обработке Есо311 должен образоваться - в составе нижней цепи - выступающий конец 5'САТТ.

Структурные предпосылки для сочленения гена )L1a с миницистроном были созданы следующим образом. В проксимальную часть этого гена, клонированного в плазмиде pUC19, мы ввели в составе праймера для ПЦР (111) (рис.2) участок узнавания (5'CGTCTC/3'GCAGAG) еще одной рестриктазы "ласса IIS - Esp3l, расщепляющей ДНК справа' от этой последовательности на расстоянии одного и пяти звеньев соответственно по верхней и нижней цепям с образованием четырехзвенного 5'-выступающего конца. При этом сегмент, фланкирующий этот сайт с той стороны, с которой происходит расщепление, был сконструирован так, чтобы при Егр31-обработке продукта ПЦР образовался выступающий конец 5'AATG, комплементарный ЕсоЗИ-концу 5'САТТ вектора (см. выше), что делает возможным лигазную сшивку по этим двум концам. (Использование в данном случае вместо Есо311 рестриктазы Esp3\ вызвано тем, что ген IL1a содержит эндогенный Есо311-сайт.) В качестве обратного праймера для этой модификации мы использовали (II) (рис.2), применявшийся нами ранее при клонировании гена IL1a в плазмиде pGEM1. Полученный в результате ПЦР модифицированный ген был клонирован по сайтам Esp3l и Hind\\\ в

первый | цистрон -

...... ,1 taatgcgagaccgc -

attacgctctggcc-экспрессируюший • ' вектор

Eco31l

[ЕсоЗ1I

Esp3l

ПЦР-фрогмент I.

CGTCTCCAATCTCAT

ccagaggttacagta—— f целевая ген

I EspJI

5' ■ 3'-

-д^яяжа™ АТТАС

aatgt 1 а"

ДНК-лигаэа

Рис.11. Схема стыковки первого цистрона с целевым геном методам сплайсинга ДНК путем направленного лигирования (SDL) с образованием перекрывающихся терминирующего кодона первого цистрона и ! инициирующего кодона второго цистрона.

экспрессирующий вектор pGMCE (рис.12). Именно на этой стадии встретились и воссоединились комплементарные £со311-конец 5'САТТ вектора и EspSI-конец 5'AATG гена (конструкция pGMCIL.1) с образованием комбинации частично перекрывающихся терминирующего и инициирующего кодонов TAATG.

Следует отметить, что в плазмиде pGEM1 в составе гена Ыа имеется эндогенный Есо311-сайт, однако благодаря способности рестриктаз этого класса давать не стандартные самокомплементарные, а уникальные выступающие концы последующее шгирование восстанавливает структуру вектора, так что дополнительный Есо311-сайт не мешает направленному встраиванию второго цистрона.

Транскрипт двуцистронной конструкции с геном IL1q, по данным компьютерного анализа, дрлжен иметь вторичную структуру, благоприятную для трансляции (рис.13): участок инициации трансляции первого цистрона оказывается доступным для посадки рибосом; что же касается инициирующего кодона второго цистрона, то хотя формально он вовлечен в шпильку, она настолько мало устойчива (AG = -1 ккал/моль), что едва ли может препятствовать инициации. К тому- же, находясь в транслируемой области первого цистрона, она должна легко расплетаться рибосомой в ходе трансляции этой части конструкции.

Действительно, с полученной плазмидой pGMCIL.1 в системе Студиера мы получили высокий уровень экспрессии целевого гена (рис.14): по данным денситометрии после прокрашивания белкового геля доля целевого белка

Ваш HI Esp3l^Es,p3[ Kpnl

Hindlll 'BamHI

_ EcoRI Pt7 / .BamHI

1. ПЦРс

праймерами II и III

2. Клонирование в pUC19/Smal, CIP

BamHI

EcoRI, BamHI (большой фрагмент)

EcoRI

Esp3l EsP31 Es p 31

Esp3l, Hindlll (малый фрагмент с геном IL1d)

IL loi

AATGII

BamHI Hindlll

^ о fi

Eco31l, Hindlll (смесь больших фрагментов)

ДНК-лигаэа

Hindlll

EcoRI Pt7 Luc

Рис.12. Схема конструирования плазми-ды pGMCILI.

Рис.13. Вторичная структура 5'-концевой области мРНК, синтезируемой с Т7-промотора плазмиды pGMCILI (ом. также подпись к рис.4).

энхансер

S0

cgag ga\

/ u g4,

/а u

u а

U U

u а

Чрд « А

a-u' u-a

старт

S0 f—► ЫС

5' ррр gggagaccggaauucaggauccuuaauaaugaaauaucg"

А P-G,

с торт Га

'ucaucacc..

U-AT i-У ♦ IL

lL1a-

1 2 3 4 5

Рис.14. Электрофорез лизатов клеток Е.соН 8121 (ОЕЗ), содержащих плаз-миду: 1 - рвЕМИ (с индукцией 1РТС), 2 - рвМСШ (с индукцией 1РТС), 3 -рвШ (с индукцией 1РТв), 4 - рБЕМ1 (без индукции 1РТС); 5 - маркеры молекулярных весов.

составила 33%, что заметно выше, чем при использовании описанной одноцистронной конструкции pGENILI (10%).

Высокая эффективность дистального участка инициации трансляции в двуцистронной конструкции

Оставалось неясным, в какой степени повышение выхода белка в двуцистронной конструкции pGMCILI по сравнению с одноцистронной pGENILI связано с аффективной трансляцией первого цистрона и протеканием сопряженной трансляции, а не просто с оптимизацией второго участка инициации трансляции, в частности, с удлинением SD- и лидерной последовательности. Чтобы выяснить это, мы проанализировали эффективность образования инициаторного комплекса трансляции (mphk-30s-tphkfmet) с помощью метода тоулринта (Hartz et al., 1988) (рис.15). Для этого была проведена траскрипция in vitro с Т7-промотора линеаризованных с помощью рестриктазы H/ndlll плазмид pGENILI и pGMCIL.1 (Я/лсШ1-сайт находится на дистальном конце гена IL1a, ограничивая таким образом участок линеаризованной ДНК, транскрибируемый с Т7-промотора, примерно 600 нт в зависимости от конструкции). Полученные транскрипты после удаления ДНК-матрицы с помощью ДНКазы отжигали с 5'-32р_меченым олигонуклеотидным праймером ILlseq, который гибридизуется с участком 116-133 мРНК, соответствующим звеньям 50-67 смысловой цепи структурного гена IL1a. Этот

начало Pf7 транскрипции

5'

SD1 AUG1

транскрипция in vitro

SD2 AUG2

ДНК

Hindlll

мРНК

1. отжиг праймера, меченного по 5'-концу

2. образование инициаторного

комплекса

fMet

fMet

i

.iF'HK

5: _л ■ а

SD1 Auai '15 SD2 AUG2 + 15 " *

30S 30S

| обратная транскрипция

полноразмерныи транскрипт

тоупринт 2

-* 5'

тоупринт 1

-* 5'

-* 5'

Рис.15. Тоупринт-анализ двуцистронной конструкции (общая схема).

дуплекс инкубировали в смеси, содержащей 30S субчастицы рибосом и TPHKfMet E.coli, которые образуют с мРНК довольно устойчивый аналог инициаторного комплекса, после чего проводили обратную транскрипцию с гибридизованного праймера. На матрицах, связанных с 30S субчастицей, элонгация прекращается, достигнув рибосомы (положения +15 и +16 по отношению к инициирующему кодону, где А считается нулевым звеном), тогда как на свободной матрице она продолжается вплоть до 5'-конца мРНК. В качестве маркеров при гель-электрофоретическом анализе мы использовали продукты секвенирования по Сенгеру соответствующей плазмидной ДНК с тем же праймером, который использовался для обратной транскрипции.

в

полный транскрмлт

А0(1) -154

А (2)

вАТС 12 3 4

в АТС 12 3 4

1 2 3 йАТС

Рис.16. Тоупринт-анализ (радиоавтограммы 10% ПААГ) экспрессирующих конструкций с раститроакой по ЗОЭ-субьединице рибосом при постоянном количестве мРНК (-1 пмол/проба). В качестве маркеров длины фрагментов нанесены продукты секвенирования по Сенгеру соответствующих ппазмид с тем же 5'-32р_меченым праймером, который использовался для тоупринт-анализа.

А - Двуцистронная конструкция рвМСШ; пробы 1-4 содержат соответственно 0 (контроль), 8, 12 и 16 пмоль ЗОв субъединицы. Б - Моноцистронная конструкция с энхансером рСЕМШ; пробы аналогично опыту А.

В - Моноцистронная конструкция без энхансера р&1.1; количество ЗОБ субъединиц рибосом в пробах: 1 - 16 пмоль, 2-12 пмоль, 3-0 (отрицательный контроль).

Результаты радиоавтографии аналитического геля (рис.16) позволяют судить о том, какая часть мРНК в растворе вовлечена в образование инициаторного комплекса. При использовании стандартных условий тоупринт-анализа (примерно 10-кратный избыток рибосом по отношению к матрице) оказалось, что в двуцистронной конструкции р6МС11_1 практически вся мРНК связывается с рибосомами по второму участку инициации трансляции, относящемуся к целевому гену (рис.16А). В одноцистронной конструкции с энхансером рвЕМИ также наблюдалось эффективное ■ образование инициаторного комплекса, однако существенная часть мРНК оставалась при этом несвязанной (рис.16Б). В конструкции рС1Ь1, не содержащей энхансера, тоупринт-сигнап вообще отсутствовал (рис.16В), что подтвердило предполагаемую причину отсутствия экспрессии гена в составе этой конструкции - ингибирование трансляции элементами вторичной структуры мРНК.

Полученные данные свидетельствуют о том, что сайт инициации трансляции целевого гена в двуцистронной конструкции значительно более эффективен, чем аналогичный сайт в одноцистронной конструкции с энхансером. Однако, чтобы судить о наличии или отсутствии сопряженной трансляции, этих данных недостаточно. В самом деле; два инициирующих кодона в двуцистронной мРНК отстоят друг от друга на 40 нт, что допускает независимое связывание рибосом с этими сайтами и их экранирование (Gold, 198G) (рис.15). Если при отом экранирование второго (дистального) сайта протекает с еысокой эффективностью, то именно на этом сайте обратная транскрипция при тоупринт-анализе обрывается и детекция связывания рибосомы по первому (проксимальному) сайту оказывается невозможной.

Чтобы уменьшить эффективность связывания рибосом со вторым сзйтом и все же попытаться обнаружить связывание с проксимальным участком инициации трансляции, мы провели с двуцистронной конструкцией pGMCILi опыт по тоупринтингу, аналогичный описанному выше, снизив концентрацию рибосомных субчастиц до уровня концентрации матрицы. Оказалось, что в с>тж условиях реакционная смесь содержит существенное количестве свободной мРНК (ей соответствует полоса полноразыерного обратного транскрипта на радиоавтографе), однако заметного тоупринт-сигнапа, соотеетствующого первому старту трансляции, мы так и не обнаружили, тогда как по второму сайту связывание с рибосомами по-прежнему шло эффективно (рис.17). Таким образом, этот участок намного более активен, чем проксимальный, т.о. достигнутая высокая степень экспрессии целевого гена обусловлена а основном прямой высокоэффективной трансляцией второго цистрсна.

А 11)"

А (2)

полный транскрипт

— тоупринт

GATC 12 3 4

Рис.17. Тоупринт-анализ двуцистронной конструкции рЭМОИ (см. подпись к рисунку 16); пробы 1-4 содержат соответственно 0 (контроль), 1, 0,5 и 0,1 пмоль ЗОЭ субъединицы.

Попы I Kii дальнейшего усовершенствования системы экспрессии

Наблюдавшаяся активность второго инициаторного сайта трансляций оказалась настолько высокой, что существенное повышение выхода белка при дальнейшей оптимизации этого сайта представляется маловероятным. В то же время в принципе существует возможность повысить вклад первого сайта инициации в общий уровень трансляции. В связи с этим мы решили модифицированть SD-последовательность в этом сайте (AGGA), увеличив ее размер до шести нуклеотидов (AGGAGG).

Такую маленькую - динуклеотидную - вставку можно было бы ввести с помощью обычного сайт-направленного мутагенеза. Однако в данном случае предпочтительным представлялось использование ВатН1-сайта, который перекрывается с первой SD-последовательностью в двуцистронной конструкции pGMCILI. Разумеется, при таком подходе размер вставки двумя нуклеотидами не ограничить. Поэтому мы решили в ходе планируемого синтетического преобразования расширить круг модификаций, потенциально благоприятных для экспрессии целевого гена, в частности, попытаться увеличить стабильность транскрипта, которая наряду с эффективностью промотора определяет уровень мРНК в клетке.

Известно (Emory et al., 1992), что наиболее стабильные мРНК E.coli содержат на 5'-конце шпилечные структуры, служащие универсальным средством защиты мРНК от эндонуклеаз, а при введении в проксимальную часть транскрипта протяженной шпильки, стебель которой представляет собой совершенный дуплекс, включающий 5'-конец мРНК, эта мРНК становится долгоживущей.

Чтобы таким образом модифицировать изучаемые нами транскрипты, мы спроектировали двуцепочечный 33-звенный олигодезоксинуклеотид STAB, фланкированный ВатН]- и модифицированным EccRI-сайтом (рис.18А). Его 14-звенный концевой участок представляет собой инвертированный повтор по отношению к участку плазмиды pGEMI, отделяющему ЕсоRl-сайт полилинкера от точки начала транскрипции с Т7-промотора. Поэтому при встраивании этого олигонуклеотида по EcoRI/ßa/nHI-сайтам в полилинкер pGEMI на 5'-конце соответствующего Т7-транскрипта должна возникнуть шпилька, стебель которой представляет собой собершенный дуплекс, включающий в себя 5'-конец транскрипта (рис.18Б). Другой конец 33-членника содержит модифицированную SD-последовательность, которая перекрывается с 5а/лН1-полусайтом и отделена от шпилечного 14-членника 10-звенным АД-богатым спейсером, с тем чтобы эта шпилька в составе транскрипта стерически не препятствовала связыванию рибосомы с SD-последовательностью.

При встраивании дуплекса STAB в плазмиду pGEMI Есо Rl-сайт, по которому происходит встраивание, устраняется, но вместо него появляется такой же сайт за пределами инвертированного повтора в составе 10-звенного спейсера, так что этот повтор становится неотъемлемой частью нового вектора.

А начало

транскрипции

/ EcoRI

5'...CGACTCACTATAGGGAGACCGGAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCCTCTAGA.

BamHI

3'...GCTGAGTGTAATCCCTCTGGCCTTAAGCTCGAGCGGGCCCCTAGGAGATCT..

pGEM1

A

U At U-A A-U A-U G-C G-C C-G C-G A-U G-C A-U G-C G-C

exEcoRI EcoRI BamHI

5' AATTAAATTCCGGTCTCCCG AATTCTTTAGGAG

TTTAAGGCCAG AGGGCT JAAG AAATCCTCCTAG

STAB

SD

SD

pppG-CGAAUUCUUUAGGAGGAUCCUCUAGAGUCGACCUG 3.

3

Рис.18. Схема модификации 5'-конца мРНК для повышения устойчивости Т7-транскрипта в клетках E.coli и удлинения SD-последоватег, гчости. А: STAB - синтетический дуплекс для модификации вектора pGEM1, содержащий элемент инвертированного повтора (подчеркнут стрелков, направленной влево) по отношению к фрагменту pGEM1, кодирующему 5'-концевую область мРНК (подчеркнут встречной стрелкой); Б: 5'-концевая область Т7-транскрипта плазмиды pGS.

Далее в этом векторе по ßamHI/Wndlll-сайтам была клонирована двуцистронная конструкция с геном IL1q из плазмиды pGMCILI (рис.19). Полученную в результате плззмиду pGSMCIL! мы использовали для транскрипции in vitro с Т7-промотора и тоупринт-анализа транскрипта (радиоавтограф приведен в диссертации). Оказалось, что в этой конструкции эффективность образования инициаторного комплекса по второму (дистальному) сайту несколько снижена, о чем свидетельствует появление существенного количества полного транскрипта

Рис.19. Схема конструирования плазмиды pGSMCILI.

EcoRI Рт7 J , Ват Hl 'Hinälll

RI

г» i

EcoRI

модиф.

EcoRI BamHI Рг7 /Ас

EcoRI

ВатН1, №п(2111 (малый фрагмент)

BamHI

ZET

STAB

EcoRI, BamHI (большой фрагмент

ДНК-лигаэа

о EcoRI pTT -.. BamHI '—►"-•'.//Hindm STAB<„ г.

ВатН1, НииШ1 (большой фрагмент)

I ДНК-лига за

EcoRIBamHI

-Hindlll

даже при значительном избытке ЗОЭ субчастиц по отношению к матрице, зато возникает заметный тоупринт-сигнал в области первого сайта.

Проведенные модификации вектора, несмотря на некоторое снижение эффективности инициации трансляции с дистального Аив-кодона, не привели к уменьшению выхода целевого белка, что свидетельствует о значительном запасе возможностей инициаторных сайтов. По-видимому, в сконструированной системе экспрессии синтез белка лимитируется не эффективностью трансляции мРНК целевого гена, а биосинтетическими ресурсами бактериальной клетки

(количеством рибосом и т.д.). Однако и в этой системе увеличение стабильности мРНК и/или повышение эффективности инициации трансляции ' , может оправдать вложенные усилия, позволяя снизить необходимую для индукции концентрацию IPTG, поскольку для достижения высокого уровня синтеза белка достаточно будет меньшего количества транскрипта.

Оказалось, что в случае бактериальных культур, несущих плазмиды pGMCILI и pGSMCtLI, уменьшение концентрации IPTG в 5 и 10 раз относительно стандартной концентрации 10"3 М не снижало синтеза белка ни для одной из конструкций. При дальнейшем уменьшении концентрации индуктора - до 10*5 и ю-б М - полоса на белковом форезе, соответствующая целевому белку, значительно ослабевала, но ее интенсивность оставалась одинаковой у обеих культур (рис.20А), откуда следует, что оба транскрипта одинаково устойчивы.

Уровень целевого транскрипта в исследуемых конструкциях мы сравнили с помощью дот-гибридизации суммарной РНК, выделенной из клеток с плазмидами pGMCILI и pGSMCILI после часовой индукции IPTG. Учитывая сравнительно высокий уровень целевого транскрипта в клетках,« мы упростили •стандартный подход к выделению РНК, исключив ДНКазную обработку; это позволило пренебречь многими предосторожностями, обычно необходимыми при работе с РНК, и снизило вероятность неконтролируемого распада целевой мРНК в процессе выделения. Суммарный препарат нуклеиновых кислот, выделенный с помощью кислой фенольной экстракции и осаждения спиртом, иммобилизовали на нитроцеллюлозной мембране. Гибридизацию с праймером IL5D, который комплементарен смысловой цепи ДНК, т.е. способен гибридизоваться как с плазмидной ДНК, так и с целевой мРНК, проводили без денатурации матрицы, чтобы уменьшить вклад плазмидной ДНК в суммарный сигнал (рис.20Б). Этот вклад, определенный по гибридизации идентичного фильтра с праймером IL5U, гомологичным смысловой цепи ДНК, т.е не гибридизующимся с целевым транскриптом, оказался в данных условиях пренебрежимо малым. Такую же контрольную гибридизацию проводили с щелочной денатурацией препаратов на фильтре (рис.20В). Одинаковый уровень сигнала во всех пятнах на этом фильтре означает, что количество плазм идной ДНК было примерно одинаково во всех препаратах и разница ь суммарном ' сигнале гибридизации обусловлена разным уровнем мРНК в клонах.

В результате проведенной гибридизации мы обнаружили, что вместо ожидаемого повышения уровня мРНК в конструкции pGSMCILI наблюдается " даже некоторое снижение этого уровня по сравнению с плазмидой pGMCILI. Полученные результаты ставят под сомнение представление о том, что любая совершенная шпилька на 5'-конце мРНК стабилизирует транскрипт. Более достоверные выводы можно будет сделать, располагая результатами прямого, определения времени жизни Т7-транскриптов в изучаемых конструкциях; такое " определение представляет собой самостоятельную проблему, выходящую за рамки данной работы. • ". -i;

IL1c<-

кДа

-30.0

-21.5

-14.3

В

Рис.20. Сравнительный анализ экспрессии гена 1И<» в составе ппаз-мид рвМСШ (дорожки 1-3) и рСвМСШ (дорожки 4-6) в клетках Е.соЦ ВЬ21(ОЕЗ), индуцированных различными кон-центрациями 1РТС: 10*3 од . д0р0ЖКц 1 и 4, М - до-

рожки 2 и 5, 10*® М - дорожки 3 и 6; дорожка 7 - молекулярные стандарты.

А - электрофорез лизатов клеток после 3 ч индукции 1РТС; Б - дот-гибридизация неденатури-рованных препаратоз нуклеиновых кислот, выделенных из соответствующих клонов после часовой индукции 1РТЭ, с праймером 1150, комплементарным смысловой цепи гена Ша В - дот-гибридизация тех же препаратов, денатурированных на фильтре, с праймером И511, гомологичным смысловой цепи гена 11_1а.

1 2 3 4 5 6 7

о о © о.

Универсальность вектора pGMCE (клонирование гена ILIra)

В принципе на основе вектора pGMCE можно получить аналогичную описанной выше двуцистронную систему экспрессии для любого безынтронного гена или его фрагмента. Для этого необходимо лишь, чтобы этот ген в проксимальной части был фланкирован 5'-выступающим концом 5'AATG (его можно получить с помощью любой эндонуклеазы рестрикции класса (IS, дающей четырехзвенные 5'-выступающие концы, или же синтетически). Этот конец включает в себя из кодирующей части гена лишь инициирующий кодон, не накладывая никаких ограничений на остальную нуклеотидную последовательность. Дистальный конец гена должен представлять собой полусайт одной из рестрикгаз, соответствующих оставшейся части полилинкера PGEM1: ВатИ), Xba\, Accl, Sal\, Psti, HindW.

Так, в векторе pGMCE мы клонировали ранее синтезированный (Лебеденко и Берлин, 1993) ген рецепторного антагониста IL1 (IL1 га). Этот ген, клонированный в плазмиде p(JC19, был амплифицирован in vitro с праймерами IV и V (рис.2), в результате чего в его проксимальном конце появился £sp31-сайт. Далее ген сочленили с миницистроном s составе вектора pGMCE, как описано выше (для гена 11.1 а). Его экспрессия в штамме BL21 (DE3) составила 13% суммарного клеточного белка (рис.21). Этот довольно высокий уровень экспрессии был получен, несмотря на весьма устойчивую шпильку (AG = -5,2 ккал/моль) в области инициации трансляции второго цистрона (рис,22).

При тоупринт-анализе этого транскрипта было выявлено связывание рибосом по обоим сайтам инициации трансляции (данные приведены в

кОа «Г^ Рис.21. Электрофорез (ПААГ-вОЭ) лизатов клеток В.соН

В1_21(ОЕЗ), содержащих плазмиду рСМС1Ига: 1 - маркеры 5 - " молекулярных весов; 2 - клетки, не индуцированные !РЮ; 3-46.0—«л —. клетки, индуцированные 1РТС.

>«- ^¡з Рис.22. Вторичная структура 5'-концевой области

30.0-te.il ^ Т7-транскрипта плазмиды рСМС!1_1 га (см. также

подпись к рис. 4).

SO

14.3-СЭ~ -

1 2 з „::-г "орт

SO f—V UC C_G 'Lira

5' ррр GGGAGACCGGAAUUCAGGAUCCUUAAUAAUGAAAUAU-ACCCTCTGGG...

диссертации). При этом эффективность связывания по второму сайту заметно снижена по сравнению с транскриптом pGMCILI (рис.16А), где этот сайт играет решающую роль в обеспечении высокого выхода белка. Более того, по соотношению связанного и свободного транскрипта, иллюстрирующему активность сайтов инициации трансляции, конструкция pGMCILI га значительно уступает даже моноцистронной конструкции pGENILI (рис.1бБ), где выход белка ниже, чем не только у pGMCILI, но и у самой pGMCILra. Это свидетельствует о том, что в конструкции pGMCILra довольно высокий уровень трансляции обусловлен активацией дистального сайта благодаря разрушению его вторичной структуры в ходе сопряженной трансляции с проксимального сайта.

Заключение

Как показывает эффективная экспрессия обоих генов (///а и /У 1га), клонированных в векторе pGMCE, сконструированная нами двуцистронная система не слишком чувствительна к первичной структуре целевого гена, что позволяет рассчитывать на ее универсальность. Решающая роль в обеспечении высокого выхода рекомбинантного белка в этой системе принадлежит дистальному сайту инициации трансляции. Если же эффективность этого сайта снижена из-за особенностей его вторичной структуры, начальный этап инициации трансляции перемещается на проксимальный сайт, для которого инактивирующее влияние целевого гена менее вероятно из-за их • разобщенности. При этом проксимальный сайт инициирует сопряженную трансляцию и, реактивируя дистальный сайт, поддерживает высокий уровень трансляции целевого гена.

выводы

1. Сконструированы векторы pGEN и pGMC'c, содержащие энхансер трансляции, для экспрессии искусственных генов в составе одно- и двуцистронной прокариотических систем.

2. Достигнут высокий уровень экспрессии синтетических генов зрелого интерлейкина-1а человека и его рецепторного антагониста в составе сконструированных векторов, особенно в двуцистронной конструкции.

3. С помощью анализа инициаторных комплексов трансляции методом тоу-принта показано, что в двуцистронной конструкции pGMClLI участок связывания рибосом, предшествующий второму (целевому) гену, чрезвычайно активен и высокий уровень экспрессии гена обеспечивается прямой трансляцией с этого сайта. Возникновение в этой области стабильных элементов вторичной структуры (конструкция pGMCILra), по-видимому, приводит к сопряженной трансляции с проксимального сайта инициации, в процессе которой в результате разрушения вторичной структуры дистального участка связывания рибосрм происходит реактивация этого участка.

4. Показано, что модификация проксимального сайта инициации трансляции в двуцистронной конструкции pGMCIL.1 (удлинение SD-сайта и введение стабильной шпильки в 5'-нетранслируемую область мРНК) не сказывается на выходе целевого белка.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

Lebedenko E.N., Birikh K.R., Plutalov O.V., Berlin Yu.A. Method of artificial DNA splicing by directed ligation (SDL). Nucleic Acids Res., 1991, 19, No.24, 6757-6761.

Бирих K.P., Лебеденко E.H., Берлин Ю.А. Плазмидный вектор, содержащий энхансер трансляции, для экспрессии генов в прокариотической двуцистронной системе. Биоорганическая химия, 1993, 19, № 12, 1234-1238.

Birikh K.R., Lebedenko E.N., Berlin Yu.A. Construction of a translation enhancer-containing vector for gene expression in a prokaryotic two-cistron system. Nucleosides and Nucleotides, 1994, 13, Nos 1-3, 599-605.

Бирих K.P., Берлин Ю.А. Векторы, содержащие энхансер трансляции для прокариотической экспрессии искусственных генов. VI конференция Российской Федерации "Новые направления биотехнологии", Пущино, 1994. Тезисы докладов, с. 69.

Birikh K.R., Lebedenko E.N., Berlin Yu.A. Synthesis and expression of genes for some human cytokines. Eleventh International Round Table "Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications", Leuven, 1994. Abstracts, p.