Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Варианты штамма Escherichia coli М17, перспективные для получения эубиотиков

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Варианты штамма Escherichia coli М17, перспективные для получения эубиотиков"

С -4

■'О

4 W^1 На правах рукописи

ъ

ЧЕСНОКОВА Вероника Леонидовна

ВАРИАНТЫ ШТАММА Escherichia coli М17, ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭУБИОТИКОВ

03.00.07- микробиология 03.00.15-генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1998

Работа выполнена на кафедре микробиологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов, на кафедре анатомии и неиробиологии Университета штата Теннесси, Мемфис; США, и в лаборатории генетики молочнокислых бактерий'Государственного института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научные руководители:

кандидат биологических наук, доцент-

кандидат медицинских наук

В. А. Лившиц Е. В. Сокурен'ко

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

академик РАМН и РАЕН,

доктор медицинских наук, профессор

Ю. В. Ананьина

И. В. Домарадский

Ведущая организация:

Институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова

Зашита диссертации состоится < ¿¿и'ДУ»-/1998 г в ^^ час, на заседании диссертационного совета К 053.22.16 в Российском университете дружбы народов по адресу; 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.

Автореферат разослан (У 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

О. Б. Гигани

ОШЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Препараты иормофлоры (зубиогики) используются для профилактики и лечения дисбактериозов и других расстройств желудочно-кишечного тракта Они создаются на основе живых культур специально отобранных штаммов-симбионтов, которые являются представш елями нормальной микрофлоры человека и имеют ряд полезных свойств Колибактерин является представителем этой группы лекарственных средств; его основой служит штамм-продуцент Escherichia coli Ml 7, который был выделен из немецкого препарата Mutaflor, впервые разработанного А. Ниссле (Перетц Л.Г., 1955). По результатам многочисленных исследований колибактерин эффективен для лечения дисбактериозов. при вирусных диар-реях. в комплексном лечения острой дизентерии, постдизентерийного колита, затяжных и хронических форм колитов, энтероколитов, неспецифических язвенных колитов и др К сожалению, за годы эксплуатации штамм E.coli М17 утратил некоторые полезные свойства, в том числе колициногенную активность.

Помимо штамма М17 и его вариантов при производстве колибактерина в 60-е годы стали использовать новый продуцент, входящий в состав препарата, называемого Simbioflor (Германия). Сравнительные исследования трех вышеприведенных штаммов-продуцентов ранее не проводились

В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что явление адгезии бактериальных клеток к поверхностным рецепторам играет важную роль во взаимодействии микроорганизма с макроорганизмом. Наиболее распространенным типом адгезивных органелл являются пили первого типа. Собственно адгезином служит белок FimH, кодирующийся геном fimH, входящим в состав fim кластра. Вариации в гене адгезина определяют фенотипическую гетерогенность связывания разных б астерий с субстратом. Преимущественное связывание микроорганизма со специфичными субстратными молекулами определяется его принадлежностью к конкретному адгезивному подклассу и отражается как на выборе им жизненного пути в макроорганизме,так и на способности успешно колонизировать разные экологические ниши и вызывать патологический процесс.

Исследование адгезивной активности штамма-продуцента препарата колибагге-рин проводилось, однако без определения типа образуемых пилей и соответствующего анализа адгезивного фенотипа.

Цель я задачи исследования.

Целью настоящих исследований явилось получение усовершенствованных вариантов продуцента для препарата колибактерин на основе штамма E.coli М17 с учетом особенностей его адгезивной активности, а также специфики применения препарата на практике.

В связи с этим ставились следующие задачи исследования: сравнительное изучение адгезивной активности трех штаммов-продуцентов препаратов колибактерин, Mutaflor и Simbioflor, исследование функциональных характеристик ML и Мн адгезивных фенотипов пилей первого типа с использованием изопенных штаммов, в том числе сравнительное изучение связывания с различными субстратами и клетками, определение механизма различий в рецептор-связывающен способности; разработка техники получения модельных штаммов с "выключенным" геном адгезина различными методами; изучение возможности транс-комплементации fimH генов; получение на основании разработанных методик рекомбинантного варианта производственного штамма E.coli М17 с "выключенным" геном адгезина и оценка его адгезивных свойств; получе-

ние вариантов производственного штамма E.coh MI7 с повышенной антагонистической активностью (колициногенностью) и устойчивых к антибиотикам и изучение свойств полученных штаммов.

Научная новизна. Впервые проведен анализ адгезивных свойств пилей первого типа производственного штамма колибактерина E.coli М17 в сравнении с штаммами-продуцентами эубиотических препаратов Mutaflor и Simbioflor. Проведенные исследования механизма адгезии позволили установить корреляцию между адгезивным фенотипом и поведением микроорганизма в макроорганизме и определить наиболее благоприятный для колонизации кишечника бактериальный адгезивный фенотип. На основании этих данных, а также специфики практического применения эубиотического препарата были определены возможные пути совершенствования штамма-пролуцента колибактерина, а именно: модификация адгезивного фенотипа, придание антибиотико-устойчивости и колициногенности. Впервые был получен рекомбинантный штамм E.coli М17Д/?ш/У/рСо1ар, устойчивый к ампициллину и канамицнну, продуцирующий колицин El и имеющий дефектный ген адгезина. Все полученные свойства не транс-миссибельны. С помощью транс-комплементации штамму может быть придан любой желательный адгезивный фенотип.

Положения, выносимые па защиту.

1. Производственный штамм E.coli М17 имеет м" адгезивный фенотип, аналогичный фенотипу родственного штамма продуцента препарата Mutaflor, но отличный от фенотипа продуцента препарата Simbioflor.

2. Имеется по крайней мере два механизма связывания, осуществляемого FimH лекти-нами (адгезинами). Дня первого характерно высокое связывание с моно-маннозидными структурами (типа МанБСА, маннана и т. д.), широкий спектр распознаваемых рецепторов и сниженная устойчивость к действию растворенных ингибиторов. Второй определяется низким уровнем связывания с моно-маннозидам и, намного более узким спектром рецепторов и низкой чувствительностью к ннгиби-рованию.

3. Аллельные варианты FimH обладают селективным разнообразием и по-разному приспособлены к заселению кишечной палочкой первичной интестинальной и вторичных ниш в организме человека. При этом лектины второго типа связывания оптимально адаптированы к обеспечению E.coli успешного заселения первичной ниши, в то время как адгезины первой группы плохо подходят для этой роли и преобладают среди бактерий, заселяющих вторичные ниши. При этом такая функциональная "ненормальность" аллели может быть фактором, усиливающим вирулентность бактерии.

4. Используя суицидальную плазмиду рСНЮЗ можно получать штаммы с дефектом в хромосомном гене адгезина fimH, которые утрачивают исходный адгезивный фенотип и способны приобретать новый при введении в клетку нормальной копии fimH.

5. Сконструированная плазмида pColap пригодна для использования в качестве фактора, придающего штамму E.coli — продуценту колибактерина устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда и способность к продукции колицина El.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научно-практических конференциях НПО "Биомедицинские технологии" (Москва, 1995, 1997 и 1998 гг.), на 3-м международном молодежном медицинском конгрессе (Катовицы, Польша, 1997 г.), на 6-м международном молодежном медицинском конгрессе (Каир, Египет, 1998 г.) и на заседаниях и семинарах кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН (Москва, 1996 и ! 997 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на/¿/стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающегср^Лсточника. Работа иллюстрирована¿fC1 рисунками и/и^габлицамн.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали штаммы E.coli СШ, MJW, РСЗ1, КВМ, НВ101, MG1655, полученные из коллекции Е. Сокуренко (UT Memphis, USA), штаммы Mutaflor, Simbioflor, M17, полученные из коллекции НИЛ БМТ (Москва) и штаммы С600, TG1, S17-1, W3350 полученные из музея ГНИИгенетика (Москва), а также плазмиды ColEl, pUC19, рАСYC184 (ГНИИ ГиСПМ, Москва), рСНЮЗ, pPKL9 (91), pPKL114, pPKL4, pGïiM (коллекция E. Сокуренко, UT Memphis, USA) и фаг plv/'r (ГНИИгенетика, Москва).

Исследование адгезивной активности бактерий осуществляли с помощью методов агрегации дрожжей, агглютинации эритроцитов, "исследования роста" (ИР), радио-нуклеотидного метода оценки адгезии, инвертированного исследования адгезии к клеткам буккального эпителия (ИИА; Inverted Adhesion Assay, Sokurenko and Hasty, 1995) и уроэпителиальным клеткам (Sokurenko et al., 1992,1994, 1995).

Выделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора mini-QIAGENE (Германия-США); рестрикцию, лигирование, трансформацию ДНК проводили по стандартным методикам (Sambrook J., Е. F. Fritsch and T. Maniatis, 1989); очистку плазмидной ДНК проводили с помощью набора GENECLEAN Kit П (США). Коньюга-ционные скрещивания, получение лизатов фага pl vir и транедукцию этим фагом проводили по описанным Оманом методикам (Ohman, D. Е., 1988). Электропорацию ДНК осуществляли на приборе Gene Pulser (BioRAD, США).

Оценку продукции колицнна El и чувствительности к нему штаммов E.coli проводили по описанным Миллером методикам (Дж. Миллер, 1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение в сравнение профилей адгезивностн производственного штамма колнбаетернна £сой'М17 ■ штаммов-продуцентов Mutaflor н Simbioflor

Для определения наличия в исследуемых штаммах пилей 1-го типа провели исследование агрегации дрожжей с использованием а-метил-маннопиранозида (аММП) в качестве ингибитора. Результаты исследования свидетельствуют, что все три штамма E.coli обладают маинозо-чувствительным (МЧ) типом адгезии, обуславливаемым пилями 1-го типа.

Для определения адгезивного фенотипа провели ИР всех трех штаммов, предварительно обогащенных пилями 1-го типа с помощью введения в штаммы плазмиды pPKL9, содержащей ген fmB, положительно регулирующий экспрессию пилей. Оценивали способность связывания бактериальных клеток с маннаном (МН), РНКа-зой В (РН) и фибронектином (ФН) в присутствии аММП в качестве ингибитора и при его отсутствии (см. таблицу 1). Результаты исследования показали, что М17 и

Mutaflor имеют сходный высокоадгезивный Ми фенотип, а Simbioflor - низкоадгезивный ML фенотип.

Таблица 1.

Определение адгезивного фенотипа штаммов-продуцентов

Исследуемые штаммы Е. coli Связывание с РН Связываниес МН Связывание с ФН Фенотипический субкласс

М 17 мм 1 I I 1 - Мн

Mutaflor 1 И 1 мм - Мн

Simbioflor +4++ + - ML

Многочисленные исследования показали, что для успешного заселения микроорганизмом слизистого слоя кишечника синтез пилен должен быть Ьыключен (Р. Cohen et al., 1989, 1991, 1993; L. Poulsen et al.T 1994, 1995; P. OmdorfT-et al., 1990) Интенсивная экспрессия пилей имеет место лишь в дистальном и проксимальном отделах желудочно-кишечного тракта, то есть в ротоглоточной и прямокишечной областях (Bloch, С., et al., 1990). С другой стороны известно, что для большинства нормальных изолятов кишечника характерен ML фенотип, а для изолятов инфекций мочевыводящих путей и внутрибольничной пневмонии - высокоадгезивный Мн или даже MF (высокое связывание с фибронектином) (Е. Sokurenko, et al., 1995). Поэтому мы можем предположить (и в дальнейшем постараемся это доказать), что наличие Мн фенотипа у производственного интестинального штамма E.coli М17 является неблагоприятным.

2. Функциональная характеристика ML и Мн адгезивных фенотипов пилен 1-го типа.с.использованнем ногенных штаммов

2-1. Оценка связывания ML и Мн адгезивных фенотипов с различными субстратами (иммобилизованными гликопротеинами)

Существуют значительные качественные различия в адгезии штаммов, экс-прессирующих различные fimH гены (Е. Sokurenko et al., 1995). Для более детального изучения этих отличий для М фенотипа мы провели сравнительный анализ адгезивных профилей двух изогенных штаммов - К.В91 (ML) и К.В54 (Мн), различающихся по адгезии к иммобилизованному маннану примерно в 10 раз. Исследование адгезии проводили с помощью стандартного ИР. Все субстраты имели конечную концентрацию 20 мкг/мл. Одновременно получали данные для построения калибровочной кривой. Сравнивая экспериментальные и калибровочные значения оптической плотности путем экстраполяции определяли абсолютное число связавшихся бактерий. Результаты исследования представлены на рис.1.

Как мы и ожидали, оба штамма М- фенотипа действительно не связываются с AT, а-ГП или БМК, поскольку данные субстраты либо вообще не имеют маннозид-ных остатков, либо не несут их в терминальном положении. Штамм КВ54 хорошо связывается со всеми остальными субстратами, характеризующимися наличием концевых маннозидных остатков. Штамм КВ91 напротив имеет относительно низкий общий уровень адгезии, однако профиль связывания с субстратами варьируется в 20-кратном диапазоне. Данные, приведенные на рис. 1, позволяют выделить три группы рецепторов: 1) рецепторы, обеспечивающие низкое связывание, аналогичное адгезии к маннану (БТХ, сМЦ и иМЦ); 2) рецепторы, обеспечивающие более высокое

связывание, но все еще не сравнимое с адгезином Мн класса (ТГ. ОвА, ЛМ, ГТХ, м^Лк); 3) рецепторы, обеспечивающие практически эквивалентное связывание обоих штаммов (ЛФ, ч1§А, РНКаза В).

□ КВ54 ОКВ91

Б б

о

н -> о

с 4

5

£ * ^ ^

Рис. 1. Связывание КВ54 и КВ91 с иммобилизованными гликопротеи-нами. МН - дрожжевой маннан, БМК - бычий молочный казеин, АТ - сывороточный апо-трансферрин человека, аГП - а-кислый глнкопротеин, мАЬ - мышиный 1§АХ., нМЦ - интестинальный муцин, сМЦ - слюнный муцин, БТХ - белок Тамма-Хорсфолла, ЛМ - человеческий ламинин, ОвА - цыплячий яичный альбумин, мАК -мышиный IgAк, ПХ - пероксидаза хрена, ТГ - свинский тироглобулин, чА - человеческий IgA, ЛФ - бычий лактоферрин, РН - бычья РНКазаВ.

9

Открытие отдаленных фенотипических классов ПтН лектинов Е.соН было сделано относительно недавно (Б. Зокигепко е( а1., 1992, 1994, 1995). Проведенное исследование позволяет высказать гипотезу, что характерные для Мн и FiшH ад-гезинов отличия в адгезивной активности обуславливаются различиями в способности специфически распознавать определенные формы экспозированных маннозид-ных остатков. Профиль связывания с гликопротеиновыми субстратами продемонстрировал, что адгезия к маннану отражает способность пилей 1-го типа Е.соН взаимодействовать с определенным спектром рецепторов. Результаты данного исследования показали также, что Мь фенотип не является абсолютно низкоадгезивным, но может обеспечивать и высокий уровень связывания к другой группе субстратов, наиболее очевидными представителями которой являются 1§А, лактоферрин и бычья РНКазаВ.

2-2. Исследование механизма различий в рецептор-связывающей способности Мы провели сравнительный анализ связывания тех же изо генных штаммов КВ91 и КВ54 с маннаном и РНКазойВ, используя координаты Скэтчарда (рис. 2).

Из графиков видно, что для каждого штамма на иммобилизованном маннане имеются как низко-, так и высокоаффинные рецепторные структуры. Так, при насыщении для штамма КВ54 характерно использование ~ 4,4х106 мест связывания с константой ассоциации К, - 6,1x10"* и ~ 22,5х106 мест связывания с К,- 5,0х10"5; для

штамма К.В91 также имеются два типа мест связывания, один из которых обеспечивает относительно высокоаффинную адгезию с Ка~ 1,1x10"7 при ограниченном числе сайтов - 1,0х106, а другой - низкоаффинное связывание ~ 4,1х106 сайтов с Ка~7,1х10"5. То есть, существует высокоаффинный рецептор для связывания, проводимого М1* адгезином (Ми-р1ГпН), однако на иммобилизованном маннане для связывания доступно лишь небольшое количество таких рецепторов.

к к а.

■Е

л ю

0,25 \

0,2 \ V

0,15 р *

*

0,1 .- П'

0,05 1 \

о

ОКВ91 • КВ54

10

15

20

б

кол-во связавошхся бактерий х 10

3

со 1Я

0,4

0,3

0,2

0,1

«2

ОКВ91 • КВ54

в. о

О

10

15

количество связавшихся бактерии х 106

Рис. 2. График Скэтчарда зависимости бактериальной адгезии от начальной концентрации микроорганизмов. Слева - связывание с маннаном, справа - с РНКазой В.

0

При анализе адгезии исследуемых штаммов к РНКазеВ видно, что аффинность и число сайтов связывания, используемых при адгезии обоих штаммов, практически одинаковы, 15x10е сайтов на лунку с Ка~ 5x10"*.

Таким образом, одновременные измерения показали, что параметры адгезт штаммов КВ54 и КВ91 к маннану довольно сильно различаются, в то время в случа( с РНКазой они практически одинаковы. Это позволяет сделать предположение, чт* такие качественные различия в адгезии к разным субстратам являются проявление?* разных механизмов лиганд - рецепторного взаимодействия при связывании, в дан ном случае, с маннаном и РНКазой.

100 -

§ 80 -

§

л 60

ю

Е 40

X

3? 20 -

0 -

0,001 0,01 0,1

1

10

Рис. 3. Исследование зависимости инги бирования адгезии а-метил-маннопира нозидом._

Мы исследовали ингибировани! связывания штаммов КВ54 и КВ91 с те ми же субстратами, используя бактери альные суспензии, меченные Н3 тимидином. Результаты исследования выраженные в процентах ингибирова ния адгезии, представлены на рис. 3. Пр: этом в качестве контроля используете

концентрация а-ммп, %

Как ожидалось, адгезивная активность обоих штаммов была чувствительна к присутствию маннозы. Однако, концентрация добавленного мономаннозида, необходимого для 50 %-го ингибирования связывания (15о), сильно варьировала для каждого случая. 150 аММП для штамма КВ54 при связывании с РНКазой бьша в 45 раз выше, чем при связывании с маннаном. Для штамма КВ91 Ьо при адгезии к РНКазе была в 22 раза выше, чем при адгезии к маннану. При этом, адгезивная активность бактерий штамма КВ91 по отношению к штамму КВ54 была в 5 раза менее чувствительна к действию ингибитора при связывании с маннаном и в 2,5 раза менее чувствительна при связывании с РНКазой. При использовании в качестве ингибитора Д-маннозы и трех ароматических а-гликозидов маннозы (а именно, октил-, фенил- и нитрофенил-маннопиранози-дов) получили результат, аналогичный аММП: связывание с РНКазой намного менее чувствительно к ингибированию, чем с МН, а адгезия штамма КВ91 к обоим субстратам значительно менее чувствительна к присутствию ингибитора, чем штамма КВ54. Этот эксперимент подтверждает выдвинутую нами'в предыдущем разделе гипотезу о существовании различных механизмов взаимодействия адгезинов с рецепторными структурами и дает возможность предположить, что адгезия к МН обусловлена связыванием с одиночным концевым манно-зидным остатком, в то время как адгезия к РНКазе имеет более сложный механизм.

<

О из я

з и

к о

2 ^

•5 I

54 КВ96

О 2 4 6

связывание с маннаном (кое хЮ6)

<

У

СП

1? сЗ

и. «

я

7 п

«и с

о 5 и

К.В96 КВ54 •

О КВ92

о

КВ21

4 5 6 7

адгезия к РНКазе (кое [Х-4] хЮ6)

Рис. 4. Сравнительный анализ адгезии штаммов Е.соИ разных фенотипов к парам субстратов: МанБСА и МН (слева) и (Ман)зБСА и РНКаза В (справа).

Для подтверждения высказанной гипотезы мы провели сравнительное исследование адгезии 7 рекомбинантых штаммов основных адгезивных фенотипов, используя в качестве иммобилизованных рецепторов моно-маннозиды и три-маннозиды, связанные с БСА [МанБСА и (Ман)зБСА (а1-3, а1-6 маннотриозо-БСА]. Мы обнаружили строгую корреляцию между способностью штаммов связываться с МН и МанБСА (рис. 4, справа, г5=0.98, р>0.995) с одной стороны и связываться с РНКазой и (Ман)зБСА (рис. 4, слева, г5=0.77, р>0.95) с другой.

При этом корреляция между адгезией к МН и (Ман)зБСА отсутствовала, также как и между адгезией к РНКазе и МанБСА. При сравнении штаммов КВ54 и КВ91 связывание первого с МанБСА было в 12 раз выше, в то время как с (Ман)зБСА оба

g

связывание первого с МанБСА было в 12 развышс, в то время как с (Ман)3БСА оба штамма связывались одинаково. Ингибирование моно-маннозидами адгезии к МанБСА и (МанБСА также проходило аналогично ингибированию связывания с МП и РНКазой соответственно. Учитывая эти данные, можно заключить, что взаимодействие E.coli с маннаном похоже на взаимодействие с МанБСА, а реакция E.coli с РНКазойВ сходна с реакцией на (Ман)зБСА, то есть Мн адгезины способны эффективно связываться с моно-маннозидными остатками, а ML адгезины нет, в то время как оба типа показывают четкую способность к адгезии к триманнозидным остаткам.

Ранее высказывалось предположение (N. Sharon et al., 1987), что сайт связывания лектина пилей 1-го типа представляет собой сложный карман на поверхности лектина, соответствующий по форме трисахариду, также рядом находятся три субсайта, каждый из которых вмещает один остаток трисахарида. Это позволяет высказать предположение, что способность Мн адгезина связываться с мономаннозидами (например, с МанБСА и обработанной маннозидазой РНКазойВ) обеспечивается способностью одиночного гипотетического суб-сайта взаимодействовать с необходимой и достаточной для образования прочной связи аффинностью, в то время как суб-сайты ML адгезина такой способностью не обладают. Наши исследования процессов адгезии и ингибирования подтверждают эту гипотезу, предполагая также, что суб-сайты лектина не идентичны.

2-3. Исследование способности адгезинов ML и Мн фенотипов адгезировать к различным клеткам.

Таблица 2.

Сравнение показателей адгезивной активности E.coli с различными FimH.

Тип Аггл. МРМ А-498 J82 MDCK бук- эц ЭЦ эц эц

FimH дрож клет- клетки клет- клетки кальные морск. ба- лоша- чело-

жей ки ки клетки свинки рана ди века

ML 1:16 2±2 4+2 5±2 5±2 0,9±0,1 1:2 0 0 0

Мн 1:16 11±2 41±5 42±4 24±4 1,4±0,1 1:16 1:1 1:4 1:1

MF 1:16 60±5 130±8 80+7 39±5 н/о 1:32 1:8 1.8 1:8

MFP 1:4 48±6 63±8 55±4 29±5 1,2±0,2 1:16 1:4 1:4 1:2

н/о — не определялись.

В этом эксперименте тестировались пары диких и рекомбинантных штаммов четырех определенных на данный момент адгезивных фенотипов: Мн, Мь , МР (высокое связывание с МН и ФН) и МБР (высокое связывание с МН, ФН и пептидной частью ФН). Сравнивалась способность различных фенотипов обеспечивать адгезию штаммов Е.соП к клеткам МОСК. (клетки Мадин-Дарби почки собаки), А-498 (почка человека), 182 (мочевой пузырь человека), БК (буккальный эпителий человека) и МРМ (перитонеальные макрофаги мыши), а также сравнивались титры гемагглюти-нации с эритроцитами разного видового происхождения и агглютинации дрожжевых клеток. Результаты представлены в таблице 2.

Из таблицы данных видно, что адгезивная активность М штаммов заметно ниже активности Мн, МБ или МРР штаммов во всех экспериментах, кроме адгезии к БК и агглютинации дрожжевых клеток. В двух последних активности были пример-

но одинаковы. Существование таких отличий в адгезии к нескольким типам клеток подтверждает идею, что вариабельность рецепторной специфичности разных типов ЬЧтН адгезнна может привести к резким различиям в тропизме микроорганизмов к тканям Это, в свою очередь, может иметь глубокие биологические последствия для взаимодействия микроорганизма с хозяином

Сравнительный анализ адгезивной активности семи М1* и Мн рекомбинантых штаммов показал, что существует строгая корреляция между уровнем бактериальной адгезии к эпителиальным клеткам мочевого пузыря человека (Л82) и способностью связываться с моно-маннозидными рецепторами (МН и МанБСА) (г5=0,98, р>0,995). Такие же данные были получены при использовании эпителиальных клеток человеческой почки (А498) (г5=1,0, р>0,995). Такая корреляция объясняет наличие у штаммов Е.соИ, вызывающих инфекции мочевыводящих путей, предпочтительно Мн адгезивного фенотипа. При аналогичном сравнении бактериальной адгезии к эпителиальным клеткам и связывании с три-маннозидными рецепторными структурами никакой корреляции не наблюдалось (г5=0,025-0,08).

ш

300 1

I

250 -|

200

150

о

е

100 -

50

ПКВ91 ПКВ54

□ без микробов

Рис. 5. Исследование ингиби-рования адгезии изогенных штаммов к БК с помощью аММП.

0,002 0,01 0,02 0,05 0,1 концентрации а-ммп, %

При исследовании адгезии двух изогенных штаммов (КВ91 - Ми и КВ54 - Мн) к клеткам буккального эпителия человека (БК) (рис.5) мы обнаружили, что М адгезия оказалась значительно более устойчивой к добавлению ингибитора в среду, чем Мн связывание (150 для штамма Е.соП КВ9! по меньшей мере в 9 раз выше, чем для КВ54). При использовании в качестве ингибитора бРНКазы В и МН этот параметр был равен примерно 10. В случае использования лактоферрина и муцина разница между 150 для КВ91 и КВ54 была 20 и 4 раза соответствен но.

В совокупности с остальными эти данные проливают свет на некоторые преимущества М1* фенотипа бактерий. С одной стороны, наличие такого фенотипа сужает спектр веществ, способных служить субстратом для бактериальной адгезии. Это позволяет Мь-Е.соИ связываться специфически с теми участками, которые физиологически важны для колонизации этими организмами, одновременно избегая неблагоприятных типов взаимодействий (например, лектино-фагоцитоза). С другой стороны, преимуществом для М1* фенотипа является также более низкая чувствительность к ингибированию маннозо-содержащими гликопротеинами в нормальной среде обитания. В случае ротоглоточной области, источником таких веществ (ингибиторов) будут в основном компоненты слюны, представляющие собой либо продукты секреции слюнных желез, либо компоненты пищи.

Мы провели также исследование адгезии штаммов 1СВ91 и КВ54 к БК с использованием слюны в качестве ингибитора. Мь-адгезия была в 5 раз менее чувст-

вительна к ингибированию, чем Мн. В присутствии неразведенной слюны абсолютный уровень адгезии ML-штамма был в 4 раза выше, чем Мн -штамма (при разведении слюны разница уменьшалась). В природных условиях это может обеспечить селективное преимущество для ML фенотипа, увеличивая шансы бактерий на адгезию к орофарингеальным клеткам на начальных?этапах колонизации в присутствии компонентов слюны и/или уменьшая вероятность дальнейшего существования в Fim+ фазе, которая неблагоприятна для кишечной колонизации. Следует также отметить, способность БК взаимодействовать с E.coli по МЧ механизму, а также способность слюны ингибировать такое взаимодействие, варьировали в зависимости от источника слюны и/или БК (было исследовано 5 здоровых доноров). Природа таких различий должна быть всесторонне исследована.

Основываясь на представленных данных, мы пришли к выводу, что различные варианты FimH не обладают селективным единообразием и по-разному приспособлены к колонизации первичной нормальной и вторичной патологической ниш Е. coli человека. Мы полагаем, что слабо связывающий М1 (моно-маннозиды) FimH фенотип функционально оптимален для выполнения физиологической роли пилей 1-го типа, а именно: колонизации рото-глоточной области, "ворот" в организм, для обеспечения высокого уровня заселения нового хозяина (С. Bloch et al., 1992). Хорошо же связывающий Ml FimH фенотип, мы полагаем, наоборот, меньше подходит для выполнения этой функции и, поэтому, потерян для комменсапьной популяции Е. coli, потому что этот фенотип а) достаточно редко встречается среди ингести-нальных Е. coli', б) является результатом структурных мутаций гена; и в) плохо приспособлен к проведению бактериальной адгезии в присутствии природных ингибиторов. Вполне вероятно, одним из факторов, поддерживающим существование полиморфизма FimH, является повышенная вирулентность штаммов Е. coli по отношению к мочевыделительной системе, обеспечиваемая наличием хорошо связывающих Ml FimH аллелей. Тогда можно сказать, что функциональная "ненормальность" аллели может служить фактором, увеличивающим вирулентность бактерии.

3. Исследование возможности получения штаммов-рекомбвнантов с &fimH (fimH::ttpí) путем конъюгации

Для оценки влияния на адгезию различий в других генах fim кластера мы попытались сконструировать из филогенетически не родственных штаммов E.coli FimH- мутанты, чтобы в них затем экспрессировать различные подклассы FimH. Для этого мы использовали плазм иду рСНЮЗ, которая не кодирует белок инициации репликации pir, поддерживается только в штаммах типа SM10(Ä.pir) и не может размножаться в диких штаммах (Herrero, М. et al., 1990, Schembri, М.А. et al., 1997). Плазмида содержит ген устойчивости к ампициллину, область mob (RP4), детерминирующую способность плазмиды к мобилизации, и fimH ген, инактивированный вставкой по Kprtl сайту гена неомицин фосфзтазы, обеспечивающей устойчивость к канамицину (пр!) При введении этой плазмиды в клетки Е. coli с последующим высевом на селективную среду колонии, устойчивые к ампицилину и канамицину, будут появляться при прохождении одного рекомбинационного события. Появление колоний, устойчивых только к канамицину, означает, что произошел двойной кроссинге вер, при этом ген fimH в бактериальном геноме будет инактивирован (см. схему на рис. 6).

При попытке введения плазмидной ДНК рСНЮЗ в дикие штаммы возникли некоторые трудности. Ни классический'вариант трансформации бактерий (Т. Maniatis, 1989), пи использование различных модификаций метода с варьированием времени

теплового шока, условий полготовки компетентных клеток и других параметров не привели к изоляции искомых рекомбинантных штаммов. То же имело место при использовании электропорации для введения плазмидной ДНК в клетку.

mobRP4

oriR6

fimD

клетку

введение плазмиды в бактериальную

В Е А 1 С

п п.ИЯЯЕТЯ

D

F G H GntP A В R itagg я a a га

fim

uxu

бактериальная хромосома

fimH

двойная рекомбинация ДНК плазмиды и

гомологичных участков бактериальной хромосомы

В Е А I С D F G H' npt H' GntP A В R m p g*7mg*ir. f".j.ui.'jfmrfwt г в кг и и га

бактериальная хромосома с инактивированным геном адгезина fimH

Рис. 6. Схема получения рекомбинантного штамма Е. coli с дефектом в гене адгезина с использованием pir - зависимой плазмиды рСН 103.

Для некоторых штаммов оказалось успешным применение метода коньюгатив-ной мобилизации с помощью ira генов плазмиды RP4, где селективными условиями были минимальная среда для донора (SM 10 не растет на минимальной среде) и устойчивость к канамицину для реципиента. Полученные KmR колонии проверялись затем на чувствительность к Ар (как указано выше). Таким путем удалось получить дфтН (fimHr.npt) варианты штаммов СИО, РС31, MJ35. Частота одного рекомбннационно-го события для этих штаммов была примерно 10"2 - 10"3, двух - примерно 10"5 - 10"6.

4. Исследование возможности трапс-комплемевтацяи fimH гепов

s s о

Ê

g

£

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

v<5>

лм

□ БСА ПФН

омн |арн

cCLM, сПп.

Рис. 7. Исследование адгезивной активности исходного штамма Е.соИ С110, рекомбинантного штамма С110#9 и его вариантов, содержащих рС!В... плазмиды с генами У1тН различного происхождения.

Проведенные исследования адгезии подтвердили отсутствие у полученных штаммов маннозо-чувствительной адгезии. Затем полученные рекомбннантные штаммы были трансформированы плазмидами, производными pGB2-24, несущими fimH гены различного происхождения и обуславливающими различный адгезивный фенотип, а также содержащими ген fimB, регулирующий включение синтеза фим-брий 1-го типа. С полученными трансформантами были проведены исследования адгезивности (см. рис. 7), показавшие, что все рекомбинантные штаммы экспресси-руют феногип соответствующий введенному варианту адгезина FimH. Эти данные являются дополнительным доказательством того, что именно FimH адгезия обеспечивает адгезивный фенотип пилей 1-го типа. В результате мы получили устойчивые конструкции из диких изолятов E.coli, для которых с помощью транс-комплементации можно производить смену адгезивного фенотипа. Такие штаммы можно использовать для создания достоверных моделей в экспериментах на животных при исследовании поведения различных микроорганизмов в макроорганизме и для других самых разнообразных целей.

5. Получение и исследование штамма М17ДfimH (ßmH::npt)

При работе со штаммом М17 методика, приведенная выше, не дала положительного результата. По-видимому, это может быть связано с активной рестрикцией вводимой в клетку ДНК. Поэтому была сконструирована гибридная плазмида рСНАС2 путем встраивания в рСНЮЗ по сайту рестрикции Sal I вектора pACYC184. Такой гибрид наряду с pir - зависимым ori имеет обычный участок начала репликации от pACYC184. Действительно, плазмида рСНАС2, выделенная непосредственно из штамма М17, трансформировала тот же цггамм с частотой примерно на три порядка выше, чем выделенная из других штаммов. Произвели рестрикцию такой плазмидной ДНК эндонуклеа-зой Sal I, получив два фрагмента, один из которых (~10 kb), соответствующий плазмиде рСНЮЗ, был лигирован и снова введен в штамм М17 путем элеюропорации. В результате получили Km , Aps, Cms колонию, обозначенную M17ÄfimH.

Полученный штамм не содержит плазмидной ДНК. Был выполнен ряд стандартных исследований его адгезивной активности (как для Firn" вариантов штаммов CI10, MJ35, РС31, см. раздел 4), которые подтвердили, что он обладает аналогичными свойствами, а именно: и интактная, и обогащенная трансформацией pPKL91 культура проявляет нулевую адгезивную активность пилей 1-го типа; трансформация плазмида pGB17-9 приводит к транс- комплементационному эффекту, придавая штамму ML фенотип, обуславливаемый содержащимся в плазмиде fimH геном E.coli Fl 8 (см. рис. 8).

2 S

о

0,3

0,2

0,1

■ БСА □ МН НРН

М17 FimH-

pPKL91 pGB17-9

Рис. 8. Данные теста "исследование

роста". М17 - интактный штамм, ПлТ- М 17ДЯтН, рРКЬ91 и рСВ17-

9 - М 17ДЯтН, трансформированный соответствующими плазмидами.

Таким образом, удалось получить штамм Е.соИ, в котором в результате рекомбинации произошла замена исходною/тН гена на кассету с геном устойчивости к канамицину.

Методика получения таких штаммов обеспечивает минимальные изменения в генетическом аппарате клетки: однозначно локализовано местонахождение затронутого гена, промоторы близлежащих генов направлены к нему, так что не происходит нарушения в работе этих структур. При этом решаются и прикладные задачи: полученные таким образом штаммы можно использовать при изучении адгезии как таковой и ее роли при стабилизации бактерий в качестве сочленов нормальной микрофлоры человека или инфекционного агента; промышленный штамм М17, используемый при производстве препарата колибактерина, не просто утрачивает свой адгезивный фенотип, но приобретает способность к смене последнего на практически любой интересующий исследователя тип адгезивной активности.

6. Получение гибридной плазмяды pCofap, введение ее в штамм ELcoli М17 и исследование полученного варианта

Для решения задачи усиления антагонистической активности и придания штамму E.coli М17 устойчивости к ампициллину была сконструирована плазмида pColap на основе плазмиды CoIEI (рис. 8). При решении проблемы придания штамму - продуценту устойчивости к антибиотикам необходимо было учитывать следующие условия:

- плазмида должна иметь полностью изученную генетическую структуру;

- она не должна быть коньюгативной или мобилизуемой;

- она должна обладать узким кругом хозяев (желательно, только кишечная палочка),

- она должна стабильно наследоваться клетками Е. coir,

- она не должна существенно влиять на физиологию клетки - хозяина.

I BspLull.l (1240)

i| ColEl

рестрикция BspLull.l

фрагмент 4231 п.о.

on

cer BspLull.l (3655) ■BspHl (1526)

bla

лнгнрованне -v

и введение в 2 ^^ -

бактериальную клетку

рестрикция BspHl ^ f

—фрагмент 1008 п.о.

lacZ

4-BspHl (2534)

BspHl (2639) Рис. 9. Схема получения плазмиды pColap

Плазмида Со1Е1 хорошо изучена, она содержит колицнновый оперон и продуцирует колицин Е1, активно подавляющий рост многих энтеробактерий. Также она

имеет область сег, регулирующую стабильное распределение плазмиды в дочерние клетки при клеточных делениях. Недостатком данной плазмиды является ее способность к мобилизации коньюгативными плазмидами (F-фактор, RP4 и др.), что определяется наличием в ее структуре mob области Поэтому с помощью программы "DNA-SUN" был проведен .компьютерный анализ плазмид ColEl и потенциальных доноров гена ß-лактамазы и определена оптимальная схема создания гибридной плазмиды, так чтобы минимально затронуть интересующие нас гены, вырезая при этом всю область мобилизации (см. рис. 9). Полученная химера была названа pColap и введена в исходный штамм Ml7 классическим методом трансформации Е. coli (Т. Maniatis, 1989).

Таблица 3

Результаты исследования устойчивости штаммов Е.соЬ ТС 1, содержащих разные плазмиды (указанные в скобках), к разным концентрациям ампициллина в среде.

Исследуемые штаммы E.coli Концентрация ампициллина ( мкг / мл )

0 50 75 100 125 150 200 250

TGl/ColEl + - - - - - - -

TG1/pBR322 + + + + + + + +

TGl/pUC19 + + + + + + + +

TGI/pColap + + + + уменьшение диаметра колоний + уменьшение диаметра колоний + ме-кие колонии

Примечание: + - бактериальный рост; - - отсутствие роста.

Новый вариант штамма проявляет отчетливую антагонистическую активность и устойчив к ампициллину. Следует отметить, что уровень устойчивости к данному антибиотику заметно ниже, чем у клеток, несущих исходный вектор риС19 (см. таблицу 3). По-видимому, это связано с ухудшением экспрессии гена Р-лактамазы из-за нарушений в промоторной области гена (боксе Гильберта), произошедших в результате генетических манипуляций в процессе конструирования рекомбинантной плазмиды. Однако такую чувствительность штамма к повышенным концентрациям антибиотика можно считать преимуществом, так как устойчивость, детерминируемая рСо1ар, лежит как раз в диапазоне средних терапевтических доз антибиотиков пени-циллинового ряда, применяемых в нормальных условиях при лечении кишечных заболеваний. С другой стороны, если по каким-либо причинам присутствие штамма с рСо1ар в кишечнике пациента становится нежелательным, либо в результате какого-либо исключительного события плазмида переносится в другой штамм Е.соИ, то все клетки, ее содержащие, можно легко элиминировать из организма, применив более высокие концентрации антибиотика.

Исследовали стабильность поддержания плазмиды рСо1ар в бактериальной культуре при выращивании микробов на протяжении 100 генераций в среде, не содержащей селективного маркера. 100 % проверенных клеток несли признаки, детерминируемые исходной плазмидой. Эта высокая стабильность полученного штамма является его важной технологической характеристикой.

7. Получение штамма M17AfimII/pColap

Сконструированную плазмиду pColap ввели в рекомбинантный штамм M17AfluiH iiyieM трансформации по Маниатису (Т. Maniatis, 1989). Полученный штамм ожсчает всем заданным свойствам, а именно: обладает устойчивостью к канамицину и ампициллину в нужном диапазоне концентраций, способен к продукции колицина El, утратил исходный адгезивный фенотип. Свойства не трансмиссибельны, стабильно наследуемы даже в неселективных условиях. Штамму можно придавать любой адгезивный фенотип путем введения в клетки комплементарных генов адгезинов. Полученный штамм, также как и переходные варианты, может быть использован как основа для создания вариантов пробнотического препарата колибактерин.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ адгезивных фенотипов трех промышленных штаммов E.coli - -продуцентов дпя препаратов «Колибактерин» (Россия), "Mutaflor" и "Simbioflor" (Германия) показал, что адгезия всех трех штаммов обусловлена наличием пилей 1-го типа, при этом штамм E.coli Simbioflor имеет ML фенотип, штаммы E.coli М17 и Mutaflor обладают сходным м" фенотипом, однако различаются по уровню пилии-рования бактерий.

2. Исследование связывания ML и М" адгезивных фенотипов пилей 1-го типа с иммобилизованными гликопротеинами показало, что адгезия к маннану (МН) отражает способность пилей 1-го типа E.coli взаимодействовать с определенным типом рецепторов, при этом ML фенотип не является абсолютно низкоадгезивным, но может обеспечивать и высокий уровень связывания с другими субстратами.

3. Сравнительный анализ связывания изогенных штаммов М и Мн адгезивных фенотипов с модельными субстратами МН и РНКазой В показал, что для каждого штамма на иммобилизованном МН имеются два типа рецепторных структур, различающихся по аффинности и количеству мест связывания, в то время как параметры связывания с РНКазойВ практически одинаковы для штаммов обоих фенотипов.

4. Исследование ингибирования адгезии ML и Мн штаммов к тем же субстратам показало, что связывание E.coli с РНКазой В намного менее чувствительно к присутствию ингибитора а-метил-маннопиранозида, чем с МН (в 22 и 45 раз соответственно), а адгезия ML штамма к МН и РНКазе значительно менее чувствительна, чем адгезия Мн штамма (в 5 и 2.5 раза соответственно).

5. Обнаружена строгая корреляция между способностью штаммов разных адгезивных фенотипов связываться с МН и МанБСА (rs=0.98, р>0.995) с одной стороны и РНКазойВ и (МанБСА (rs=0.77, р>0.95) с другой. Учитывая все это, можно заключить, что Мн адгезины способны эффективно связываться с мономаннозид-ными (М1) остатками, а ML адгезины нет, в то время как оба типа показывают четкую способность к адгезии к триманнозидным остаткам.

6. Исследования показали, что способность к взаимодействию FimH адгезинов с моио-маннозидными остатками коррелирует с способностью соответствующих штаммов E.coli связываться с уроэпителиальными клетками.

7. Оценка ингибирования различными веществами бактериальной адгезии к клеткам буккального эпителия показала, что хорошо связывающие М1 лектины (Мн типа) обеспечивают намного более чувствительное к действию растворенных ингибиторов связывание, чем FimH ML типа

8. Совокупность полученных данных подтверждает наличие селективного разнообразия среди вариантов FimH и функциональной адаптации разных вариантов к различным нишам обитания в организме человека. При этом исходный FimH M1' типа соответствует интестинальному пути микроорганизма, в то время как хорошо связывающий Ml вариант адгезина придает клеткам способность к колонизации необычных ниш и может служить фактором, повышающим вирулентность бактерии.

9. С помощью плазмиды рСНЮЗ получены FimH- варианты разных штаммов E.coli. При введении в клетки таких штаммов нормальных копий fimH генов разного типа они приобретают адгезивный фенотип, характерный для источника данной копни гена, и .соответственно, могут использоваться как модели для дальнейшего изучения как механизмов адгезии, так и ее роли при колонизации бактериями макроорганизма и развитии патологических состояний.

10. Получен вариант промышленного штамма E.coli М17 - MI7A/w¡//, утративший исходный адгезивный фенотип, который может быть теперь заменен с помощью транс-комплементации на любой тип связывания.

11. На базе известной плазмиды ColEl сконструирована гибридная плазмида pColap, несущая детерминанту устойчивости к ампициллину, а также локус сег, способствующий стабильному наследованию плазмиды, утратившая гены, контролирующие коньюгативную мобилизацию плазмиды, но сохранившая детерминанты синтеза, высвобождения колицина El и иммунности к нему.

12. Получены штаммы E.coli, производные промышленного штамма E.coli М17 и его варианта MllAfimH, несущие плазмиду pColap. Показано, что эти штаммы обладают повышенной антагонистической активностью и устойчивостью к ампициллину при концентрациях последнего до 150 мкг/мл. Штамм M17Д/гтл#/рСо1ар обладает также низким уровнем адгезивной активности и устойчивостью к канамицину при концентрациях последнего до 100 мкг/мл.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

1. Evgeni V. Sokurenko, Veronika Chesnokova, Ron J. Doyle, and David L. Hasty. Diversity of the Escherichia coli Type 1 Fimbrial Lectin // J. of Biological Chemistry. - 1997. - Vol. 272. -No. 77. -P. 17880-17886.

2. Чеснокова В. Л, Лившиц В. А., Сокуренко Е. В., Кравцов Э. Г. Генно-инженерные подходы к совершенствованию продуцента колибактерина. // Биомедицинские технологии. -1997. - Вып. 8.-С. 19-27.

3. Сокуренко Е. В., Чеснокова В. J1. Способ модификации адгезивного фенотипа диких изолятов E.coli в применении к штаммам - продуцентам препарата колибактерина. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1997.-Т. 124.-С. 334-338.

4. Chesnokova V., Yermolaev A., Trinchina Е. Methods of genetic engeneering in eubiotic E. coli strain modification. // 3rd International Medical Students' Congress Book. - 1997. - Katowice, Poland. - P. 35.

5. Chesnokova V., Trinchina E. et al. The role of adhesiveness of E. coli M17 - the producing strain for an eubiotic preparation "Kolibacterin" - in bacterial colonization. // 6th Annual International Ain Shams Medical Students' Congress Book - Cairo, Egypt. -1998.