Вариабельность ДНК-маркеров (RAPD, ISSR) при сомаклональной изменчивости у кукурузы

Осипова, Екатерина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Вариабельность ДНК-маркеров (RAPD, ISSR) при сомаклональной изменчивости у кукурузы
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Вариабельность ДНК-маркеров (RAPD, ISSR) при сомаклональной изменчивости у кукурузы"

На правах рукописи

Осипова Екатерина Сергеевна

Вариабельность ДНК-маркеров (ЫАРО, КБИ) при сомаклональной изменчивости у кукурузы

Специальность: 03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН в лаборатории генетики культивируемых клеток.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева. Защита состоится "28" октября 2003 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета К 002.210.01 при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: 07(095)9778018.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. КА. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан "27"еекгабря 2003 г.

Доктор биологических наук, профессор

Шамина Злата Борисовна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Хавкин Эмиль Ефимович Хадеева Наталья Васильевна

Ученый секретарь

Диссертационного совета, А

кандидат биологических наук М.И. Азаркович

(4 6fg

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Феномен сомаклональной изменчивости растений представляет собой резкое повышение наследственной вариабельности культивируемых клеток и тканей, выявляемой в потомстве регенерантов (Murashige and Nakano, 1966; Бутенко и др., 1967; Sacristan and Melchers, 1969).

Изучение сомаклональной изменчивости может быть интересно как в фундаментальных исследованиях в качестве модели дивергенции генов в популяции, так и в практической селекции, как доступный источник генетического разнообразия. В том случае, когда целью служит получение однородного материала, сомаклональную вариабельность желательно свести к минимуму, если требуется дополнительная генетическая изменчивость, необходимо усилить степень вариабельности. Однако для того, чтобы управлять сомаклональной вариабельностью, важно понять причины ее возникновения и размах. С этой целью используют комплексный подход, включающий различные методы и анализы.

При морфологическом анализе регенерантов можно обнаружить лишь те изменения, которые имеют фенотипическое проявление, кроме того, неизвестно, обусловлены ли данные отличия генетическими модификациями или носят эпигенетический характер.

Появление различных фенотипических вариантов может быть связано с грубыми кариотипическими изменениями и хромосомными перестройками, которые позволяет установить кариологический анализ, однако, данный метод не выявляет менее заметные мутации, например, точковые.

На сегодняшний день одним из наиболее доступных и быстрых способов обнаружить вариабельность, а затем выяснить природу сомаклональной изменчивости является создание молекулярных маркеров, отличающих сомаклоны от исходного генотипа, в частности с помощью полимеразной цепной реакции, или ПЦР.

Цель н задачи работы. В связи с вышеизложенным целью данной работы стало выявление полиморфизма ДНК среди ранее полученных и исследованных сомаклонов кукурузы и выяснение природы сомаклональной изменчивости на молекулярном уровне с помощью RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) и ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) методов, основанных на ПЦР.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие

задачи:

1. Модифицировать методику постановки RAPD- и ISSR-анализов: определить подходящие условия реакции, подобрать праймеры для работы с образцами ДНК кукурузы.

2. Выявить RAPD и ISSR маркеры, отличающие сомаклоны от исходной линии. »

3. Клонировать полиморфные фрагменты, секвенироватъ концевые участки данных фрагментов для создания SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) маркеров.

4. С помощью SCAR-праймеров подтвердить полиморфность фрагментов, проследить их наследуемость в поколениях R2, R3, R4, полученных при самоопылении, а также в поколениях Fb F2, полученных в результате возвратного скрещивания с исходной линией А188, и в случае успеха секвенироватъ фрагмент целиком.

5. Полученные нуклеотидные последовательности сравнить с имеющейся базой данных. По результатам сравнения сделать предположения о характере сомаклональной изменчивости.

Научная новизна. Впервые получены молекулярные SCAR-маркеры, характеризующие исследуемые сомаклоны кукурузы и исходную линию А188. Расшифрованы нуклеотидные последовательности данных маркеров. Показано, что все сомаклоны отличаются от исходной линии А188 делецией с 490 по 944 позицию. При сравнении нуклеотидных последовательностей участка

*. i s " 4

гена анодной пероксидазы кукурузы ZmApl с 165 по 1043 п.н. у сомаклона R11 и исходной линии Al 88 обнаружены точковые мутации.

Научно-практическое значение. Полученные данные по молекулярной характеристике сомаклоиальных вариантов позволяют рекомендовать SCAR-маркеры для оценки генетической изменчивости в культурах тканей растений. Полученные результаты могут быть использованы в программе курса: «Генетика культивируемых клеток и биотехнология» для обучения студентов биологических ВУЗов.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке", Брянск, 1999; Конференции молодых ученых "Горизонта физико-химической биологии", Пущино, 2000; II Международной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", Москва, 2000; Конференции молодых ученых, ИФР РАН, Москва, 2003.

Публикации. По материалам диссертации' опубликовано 10 печатных

работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Объекты и методы исследований, Результаты и их обсуждение, Выводы, Список литературы. Работа изложена на /30 страницах машинописного текста, включает /2 рисунков, / О таблицы. Список литературы включает 2U наименований.

Работа была выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 01-04-48080).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объектами исследования служили исходная линия кукурузы Al 88 и две группы сомакпонов, независимо полученные из каллуса данной линии после двух (Rll, R14, R27 и R54) и восьми (R105, R106, R107, R119) месяцев

культивирования in vitro. Регенераты первой группы отличались от исходных растений по ряду количественных признаков, таких, как высота, размер и число веточек метелки и число рядов зерновок на початке. Сомаклоны из второй группы наряду с изменением количественных признаков имели отличия от линии Al 88 по срокам цветения, окраске зерновок и способности формировать эмбриогенный каллус в культуре in vitro (Долгих и др., 1992).

Наследование выявленных сомаклональных вариаций было прослежено на протяжении 2-4 поколений. Исследованы также гибриды наиболее вариабельных в группе сомаклонов R27 и R105 с линией А188 Fj и F2.

Выделение ДНК для ПЦР-анализа. Семена инбредной линии кукурузы (Zea mays L.) Al 88 и восьми полученных из нее сомаклонов проращивали на агаризованной среде, содержащей половинную норму солей по Murashige-Skoog (Murashige and Skoog, 1962). ДНК из двухнедельных проростков выделяли методом, описанным Moller et al, 1992.

Амплификация ДНК. Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 67 мМ трис-HCl (рН 8,6); 16,6 мМ (NH4)2S04; 2,5 мМ MgCl2; 0,0025% Tween-20; 0,0025% Np40; 0,0125% Крезоловый Красный; 6,25% глицерина; 0,2 мМ каждого dNTP; 0,25 мМ праймера; 2 ед. термостабильной Taq-ДНК-полимеразы (НПАО "СИЛЕКС М", Москва), 30 нг выделенной ДНК. На реакционную смесь наслаивали 20 мкл минерального масла.

В результате проведенной оптимизации были выбраны следующие условия амплификации: денатурация 94°С/2 мин; 5 циклов: денатурация 94°С/20 с, отжиг t°C/10 с, элонгация 72°С/10 с; 35 циклов: денатурация 94°С/5 с, отжиг t°C/5 с, элонгация 72°С/5; 1 цикл: элонгация 2мин 00 с; t°C - температура отжига для RAPD-праймеров составляла 37°С, для ISSR-праймеров - 45-60°С, для SCAR-праймеров - 54-5 8°С. Амплификацию проводили в программируемом термоциклере "МС2" (ЗАО "ДНК-Технология", Москва). Уменьшить образование неспецифических продуктов амплификации позволило применение технологии

"горячего старта" (Bassam and Caetano-Anolles, 1993).

Для проверки чистоты реактивов в качестве отрицательного контроля (К") в реакционную смесь вместо исследуемой ДНК добавляли 5 мкл воды. Опыты повторяли трижды.

Электрофорез. Продукты реакции (10 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле с бромистым этидием в ТВЕ-буфере. Для определения длины фрагментов использовали маркеры Ml (1 kb DNA Ladder), M2 (100 bp DNA Ladder) и МЗ (123 bpDNA Ladder) "GIBCO BRL".

Качественная и количественная оценка полиморфизма. Для количественной оценки ДНК полиморфизма и определения уровня дивергенции между сомаклонами, данные были представлены в виде матрицы бинарных признаков, в которой наличие или отсутствие в RAPD- и ISSR-спектрах одинаковых по размеру ампликонов соответствовало значениям 1 или 0. По матрицам состояний были рассчитаны матрицы различий. При этом использовали генетические расстояния (Ней и Ли, 1979).

Для построения генеалогической дендрмраммы по данным RAPD- и ISSR-анализа использовали компьютерную программу Treecon (Van de Peer and De Wächter, 1994) с применением 100 реплик бутстрепа (Felsenshtein, 1985).

Выделение фрагмента из геля. Фрагмент ДНК препаративно выделяли из 2% агарозного геля и очищали с использованием набора "QIAquik Gel Extrcaiion Kit" (QIAGEN). Концентрацию и качество выделения фрагмента оценивали в 1% агарозном геле.

Клонирование фрагмента. Выделенный и очищенный фрагмент клонировали в "Т-векгоре" с использованием набора "pGEM-T Vector System" (Promega). Фрагмент ДНК лигировали с вектором pGEM-5Zf{+), рестрицированным EcoRV в полилинкере с достройкой ТТФ на З'-концах. Трансформацию E.coli JM109 проводили в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Клоны, содержащие вставку, отбирали на селективной среде в присутствии IPTG и X-Gal.

Выделение плазмиды из E.coli JM109 осуществляли с помощью набора

реактивов "Wizard Plus Minipreps DNA Purification System" (Promega). Наличие в плазмидах нужной вставки проверяли реакцией амплификации с исходным RAPD- или ISSR-праймером.

Секвестрование концевых участков фрагментов проводили с использованием набора "finol DNA Cycle Sequencing System" в камере фирмы "BIO RAD" с источником питания POWER/PAC 3000 (Чемерис и др., 1999). В этом случае размер прочитанного фрагмента составлял 200-300 нуклеотидов. Окончательное секвенирование вставки проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-AVANT. В этом случае размер прочитанного фрагмента составлял 500-600 нуклеотидов.

Подбор и амплификация SCAR-праймеров. Праймеры для SCAR-анализа сконструировали при использовании компьютерной программы Oligo (Rychlik, 1995) на основе определения структуры ДНК концевых участков RAPD-и ISSR- фрагментов в результате секвенирования. Температуру отжига каждой пары праймеров оптимизировали в серии экспериментов.

Синтез праймеров. Синтез ISSR-праймеров осуществляли: "MWG-OLIGO" (Германия); SCAR-праймеров: НПФ "ЛИТЕХ" (Россия). RAPD-праймеры были синтезированы Быстровым Н.С. (ИБХ РАН).

Выделение ДНК для блот-гибридизации по Саузерну осуществляли по методике Saghai-Maroof et al.,1984.

Блот-гибридизация по Саузерну. 4 мкг тотальной ДНК каждого образца ' обработали рестрикгазами EcoRI, EcoRV, Xbal (MBI Fermentas) в количестве 15U каждого фермента. Рестрицированные образцы разгоняли в 0,7% геле с бромистым этидиём в ТАЕ-буфере. Образцы переносили на нейлоновую мембрану Hybond-N+ ("Amersham") в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. В качестве зонда использовали специфический фрагмент, амплифицированный со SCAR-праймерами. Предгибридизацию, гибридизацию и отмывку выполняли по методике, рекомендованной фирмой "Amersham". Радиоавтографию проводили на рентгеновской пленке KodaK X-Omat AR с

использованием усиливающих экранов при I -70°С в течение ночи.

Анализ сиквенса специфических вСАЯ-фрагментов. Для семи специфических фрагментов были сделаны следующие процедуры: поиск гомологов по базам данных СепВапк и Р1ашСБВ, поиск известных повторов с помощью программы КереаНЛаэкег; в случаях, когда фрагмент оказывался гомологичным какому-нибудь кодирующему участку, был проведен более подробный анализ наличия в данном фрагменте гена или псевдогена. Для анализа последовательностей участка гена анодной пероксидазы кукурузы 2тАр1 у исходной линии А188 и сомаклона Ш1 использовали базу данных Ро1уРЬеп.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ RAPD- и ISSR-анализ: Для выявления ДНК полиморфизма среди сомаклонов и поиска отличий их от исходной линии А188 использовали 45 RAPD- и 10 ISSR-праймеров. Так как линия А188 является высокоинбредной, необходимо было проверить, будут ли амплифицироваться одинаковые спектры при анализе индивидуальных растений. Ни один из 55 праймеров не выявлял отличий в спектрах ампликонов индивидуальных растений линии А188, что подтверждает высокую степень инбредности линии и надежность метода (рис.1).

12 3456 78 С- M

344

А188 II 14 27 54 105 106 107 119 M

_400 300

Рис.1. RAPD-спектры индивидуальных Рис.2. RAPD-спекгры линии А188 и растений ( 1 -8) линии А188, (праймер 11). сомаклонов (11-119), (праймер QR-1 ). С- отрицательный контроль, M маркер молекулярного веса

При анализе ДНК растений Я] все праймеры амплифицировали ЯАРО-спектры. Количество амплифицируемых фрагментов в зависимости от праймера колебалось от 2 до 17, их размеры варьировали от 200 до 2000 пн.; 35 из 55 праймеров выявлял или специфические фрагменты. По характеру спектров амплифицируемых фрагментов все используемые в эксперименте праймеры можно разделить на несколько групп. Одни из них выявляли отличия каждого сомаклона от исходной линии (рис.2), другие амплифицировали специфические фрагменты, характерные для групп сомаклонов (рис.3), третьи обнаруживали уникальные фрагменты у индивидуальных регенерантов (рис.4) (табл.1).

Табл.1. Характеристика ЯАРП- и ГБвК-праймеров.

Полиморфизм Праймеры

Все сомаклоны QR-1, QR-2, QR-3, Е-16, Б-4, Б-4, М-10,11

I группа сомаклонов (R11, R14, R27, R54) QR-5, ОРА-04, Б-1, Б-5, М-2, М-14,10,318

П группа сомаклонов (R105, R106, R107, R119) Ag-1, АН-30, Leb, М-6, М-07, М-12, NO-15, ОРС-09, Q-20, QR-4, V-03, Б-3,450

Индивидуальные регенераты АЕ-13, АН-29, G-l, М-1, М-9, 340

Отсутствие полиморфизма А-12, AD-04, АЕ-07, М-06, М-7, М-8, М-11, М-13,0-07,474 ОРА-02, Q-09, R-03, R-06, R-11, R-12, Х-01, Х-15, V-20, Б-6

В результате проделанной работы была доказана надежность ИАРО- и ¡БЭЛ-методов по отсутствию различий в спектрах индивидуальных растений А188, а также выявлены полиморфизм среди сомаклонов и отличия их от исходной линии А188 на молекулярном уровне.

А188 11 14 27 54 105 106 107 119 М

А188 II 14 27 54 105 106 107 119 М К-

Рис.3. КАРБ-спектры линии А188 и сомаклонов, (праймер <311-5). К- отрицательный контроль, М маркер молекулярного веса Стрелками отмечены специфические фрагменты

Рис.4 ЛАРО-спектры линии А188 и сомаклонов (11-119), (праймер ОРС-09).

Количественная оценка ИАРБ- н 1$$Я-полнморфнзм1. Чтобы количественно сравнить степень полиморфизма и определить уровень дивергенции между сомаклонами, данные были представлены в виде матрицы бинарных признаков, в которой наличие или отсутствие в КАРБ- и КвЯ-спектрах > одинаковых по размеру ампликонов рассматривалось соответственно как

состояние 1 или 0. По матрицам состояний были рассчитаны матрицы различий (табл.2).

Табл.2. Генетические расстояния по Ней и Ли (в %) между инбредной линией кукурузы А188 и полученными из нее сомаклонами.

А188 Й11 И 4 1*27 И54 И105 Я106 Ш07

Ы.1 9.6

М.4 6.5 5.8

Л27 7.6 6.1 2.1

Я54 7.2 5.7 1.7 2.1

11105 23.1 21.1 22.6 21.0 22.3

11106 14.1 17.9 16.9 16.1 15.8 11.8

Ю.07 18.8 19.4 18.3 16.7 18.0 5.2 9.2

М.19 15.7 14.8 14.4 14.5 14.2 8.5 7.7 5.7

Как видно из табл.2 степень отличия сомаклонов от исходной линии варьировала от 7 до 23%. Внутри первой группы сомаклонов (семьи Rll, R14, R27, R54), обнаружено значительное сходство: доля различающихся продуктов амплификации не превышала 6%. Степень различия между сомаклонами второй группы (семьи R105, R106, R107, R119) составляла - 6-12%.

Чтобы наглядно представить уровень дивергенции между сомаклонами, исходя из матрицы различий, была построена дендрограмма методом ближайшего связывания (neighbour-joining, NJ) по генетическим расстояниям (Gd) Ней и Ли. В качестве корня в NJ-дендрограмме использована исходная линия А188 (рис.5).

0,1 Gd

— R54 RI4 -R27

-Rll

-Al 88

-RIOS J

Рис.5. Дендрограмма различий исходной линии А188 и полученных из нее сомаклонов

I и II - выявленные кластеры

Числа оценивают значение бутстрэпа (в %)

Gd - расстояние Жаккарда

На' дендрограмме можно выделить два кластера сомаклонов, один из которых соответствовал первой группе регенерантов, другой же кластер содержал генотипы, образующие вторую группу. Растения R105-R119 на дендрограмме характеризовались большей удаленностью друг от друга, чем сомаклоны первой группы. Полученные результаты как количественные, так и качественные полностью соответствуют морфологическим данным, согласно которым, сомаклоны второй группы, регенерированные после более продолжительного культивирования каллусов, характеризовались большим разнообразием количественных признаков (Dolgikh et al., 1991; Долгих и др., 1992).

SCAR-анализ. Для создания специфических ДНК-маркеров возникла необходимость перехода к классическому ПЦР - методу с использованием пары длинных праймеров, комплементарных определенной последовательности, или к SCAR-маркерам (Paran and Michel more, 1993). Были отобраны шесть полиморфных фрагментов; пята RAPD- и один IS SR. С праймером QR-2 амплифицировался фрагмент, характерный для всех регенерантов и отсутствующий у линии А188, с праймером MIO - общий фрагмент для сомаклонов первой группы и с праймером Q-20 - фрагмент, выделяющий вторую группу регенерантов. Праймеры ОРС-09, NO-15 и Leb выявляли ампликоны, характерные для индивиду альльяых сомаклонов. Названия фрагментов соответствуют обозначениям праймеров. Затем фрагменты клонировали в плазмиде pGem-T и частично секвенировали. После секвенирования концевых участков фрагментов для каждого из них подобрали SCAR-праймеры длиной 2030 оснований (табл.3).

Табл.3. Характеристика SCAR-праЙмеров.

Название праймера Последовательность (5'-3') Генотипы с полиморфн. фрагментами Размер полим. фрагм. t°C Отжига

QR-2 5'-CGG-CCA-CTG-TCT-AGT-GCT-AA-3' 5'-CGG-CCA-CTG-TAC-CTA-GAT-TTT-3' А188 RU-R119 [все сомаклоны) 1428 1018 54/55

М-10 5'-CAA-AAT-CAG-AGC-AAC-AAT-ACG-CAC-ACA-AGT-3' 5'-CAC-ACA-GGT-TCA-CAT-TAA-TAT-AAA-T-3* R11.R14, R27.R54 (I группа) 806 54/55

Q-20 5-TGT-TCC-AAG-AAA-AAG-GAA-TCG-AAC-TGC-TTG-3' 5'-AAC-GGA-TGC-GCT-AAC-GTT-TTC-CTC-TTG-CAG-3' RIOS, R106, R107, R119 (П группа) 796 56/57

ОРС-09 5'-CTC-ACC-GTC-CAA-ATC-AAG-GG-3' 5'-CTC-ACC-GTC-CCA-GTG-CAC-T-3' А188, R106 640 58

N0-15 5-ACC-TTC-CAT-GAT-TCA-TTC-CAT-TGC-TTC-TAG-3' 5'-ACT-ATT-CTT-ATA-TTT-GAA-ATT-TGA-A-3' RIOS, R107 204 54/55

Leb 5-TGT-ATA-GAC-TCA-TCA-AAA-GCC-TGG-ACC-CAT-3' 5'-CAG-AGT-GGT-CCC-GAT-GCA-TGG-GTC-TCC-GAG-3' А188 R11-R119 [все сомаклоны) 937 58

Пять SCAR-маркеров из шести подтвердили полиморфизм соответствующих RAPD-фрагментов (рис.5). SCAR-маркер, полученный из RAPD-фрагмента Leb, характерного только для сомаклона R105, амплифицировался со SCAR-праймерами у всех регенерантов и исходной линии А188 (рис.5е). Попытки сконструировать другие пары праймеров, которые были бы уникальными для сомаклона R105, не привели к положительным результатам. Подобные примеры - не редкость для методов, основанных на выявлении различий с помощью "случайных" праймеров (Paran and Michel more, 1993). Возможно, одна из причин подобных неудач заключается в высокой чувствительности RAPD-метода. На эффективность амплификации короткого праймера значительное влияние оказывает отсутствие комплементарности хотя бы одного основания на З'-конце (Кокаева и др., 1998). Однако подобные точковые мутации почти не влияют на отжиг длинных комплементарных SCAR-праймеров, а, следовательно, и на амплификацию SCAR-фрагмента (Hernandez et aL, 1999).

Рис.5. Соответствие ЯАРО- и вСЛЛ-спектров. 5а) <311-2 (ЯАРО-спекгр) 56) 0Я-2 (БСАЯ-спектр)

А188 11 14 27 5410$ 106 107119 М Л188 11 14 27 84 105 106 107 119 К+ М

ПНШ1Г

5в) <2-20 (КАРО-спеетр)

А188 И 14 27 54 105106107119 М

5г) 0-20 (ЯСАЯ-спектр)

А188 И 14 27 54 105 106 107 119 К+ М

5д) ЬеЬ (ЛАРО-спектр)

А188 11 14 27 54 105 106 107 119 М

5е) ЬеЬ (вСАЯ-спекгр) А188 11 14 27 54 105106107 119 К+ М

К+ положительный контроль - плазмида рвЕМ-Т со вставкой фрагмента.

М - маркер молекулярного веса

Стрелками обозначены специфические фрагменты

А188 исходная линия

11-119 сомаклоны

Наследование SCAR-маркеров. После получения SCAR-маркеров как для групп сомаклонов, так и для индивидуальных регенерантов, можно проследить их наследование при самоопылении и при гибридизационном анализе. С парой SCAR-праймеров QR-2 помимо ожидаемого фрагмента, характерного только для сомаклонов, был обнаружен более тяжелый ампликон у линии А188. При изучении наследования этого маркера оказалось, что регенераты RH, R14, R27, R54, R105, R107 в двух поколениях обнаруживают только легкий фрагмент, а у сомаклонов R106 и R119 в Ri наблюдается расщепление (табл.4). Сегрегация также показана для гибридов в F2, причем, наличие растений с двумя фрагментами и их соотношение в F2 1:2:1 предполагает кодоминантное наследование маркера QR-2 (рис.6).

I 2 3 4 $ б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 K-AI88K+

22 23 24 25 26 2 7 28 29 30 31 32 33 34 35 K-AI88K+

Рис.6. Специфический фрагмент, амплифицируемый со ЭСАК-праймерами (^-2 у гибридов И*2 ^105хА188) и исходной линии. 1-35 индивидуальные растения ¥2

К+ положительный контроль - плазмида рйЕМ-Т с фрагментом (^-2. К- отрицательный контроль

Табл.4. Наследование SCAR-фрагментов у исходной линии кукурузы А188 и сомаклонов.

Колич с фра без ф эство растений гментом: рагмента

Маркеры Q-20 М-10 ОРС-09 N0-15 Leb QR-2 легки м QR-2 тяжелым QR-2 двумя

исх. линия регенеранты гибриды

А188 0:8 0:8 8:0 0:8 8:0 0:8 8:0 0:8

Ri 11 0:4 4:0 0:4 0:4 2:2 4:0 0:4 0:4

R2 11 0:20 20:0 0:20 0:20 16:4 20:0 0:20 0:20

Ri 14 0:8 8:0 0:8 0:8 6:2 8:0 0:8 0:8

R2 14 0:12 12:0 0:12 0:12 0:12 12:0 0:12 0:12

Ri 27 0:20 20:0 0:20 0:20 17:3 20:0 0:20 0:20

R2 27 0:21 21:0 0:21 0:21 8:13 21:0 0:21 0:21

R3 27 0:14 14:0 0:14 0:14 5:9 14:0 0:14 0:14

R4 27 0:21 21:0 0:21 0:21 0:21 21:0 0:21 0:21

Fx 27x188 0:19 19:0 19:0 0:19 9:10 2:17 0:19 17:2

F2 27x188 0:35 29:6 27:8 0:35 14:21 7:28 8:27 20:15

Ri 54 0:4 4:0 0:4 0:4 3:1 4:0 0:4 0:4

R2 54 0:20 20:0 0:20 0:20 0:20 20:0 0:20 0:20

Ri 105 7:0 0:7 7:0 3:4 2:5 7:0 7:0 7:0

R2 105 20:0 0:20 0:20 16:4 15:5 20:0 0:20 0:20

Fi 105x188 4:0 0:4 4:0 4:0 4:0 1:3 0:4 3:1

F2 105x188 35:0 0:35 29:6 27:8 29:6 8:27 8:27 19:16

Ri 106 8:0 0:8 3:5 0:8 4:4 5:3 0:8 3:5

R2 106 19:0 0:19 14:5 0:19 18:1 3:16 1:18 15:4

R3 106 20:0 0:20 9:11 0:20 15:5 10:10 1:19 9:11

R4 106 20:0 0:20 16:4 0:20 18:2 6:14 5:15 8:12

Ri 107 15:0 0:15 0:15 12:3 12:3 15:0 0:15 0:15

R2 107 20:0 0:20 0:20 15:5 14:6 20:0 0:20 0:20

Ri 119 18:0 0:18 2:16 0:18 16:2 16:2 0:18 2:16

R2 119 21:0 0:21 0:21 0:21 7:14 21:0 0:21 0:21

Тяжелый ампликон, характерный для А188 с прайм ером QR-2, назвали QR-A и клонировали для последующего секвенирования. После сравнения полных нуклеотидных последовательностей QR-2 и QR-A фрагментов выяснили, что в результате сомаклональной изменчивости в геноме исходной линии А188 произошла делеция в исследуемом локусе.

При изучении наследования SCAR Leb установили, что данный фрагмент присутствует у всех исследованных растений линии А188, тогда как у сомаклонов в R|, R2 и в Fi, F2 наблюдали сегрегацию, а в некоторых случаях (R2I4, R254)

потерю маркера. Таким образом, SCAR Leb не является уникальным для R105, как это предполагалось вначале, но обнаруживает полиморфносгь в потомстве растений регенерантов.

Наследование остальных SCAR-фрагментов было проверено в поколениях Ri - R) всех сомаклонов, а также у гибридов R27xA188 и R105xA188 в Fi и F2. Фрагменты наследовались преимущественно доминантно (табл.4).

Как правило, сомаклональные изменения исходного генотипа происходят в одном из аллелей, то есть регенерированные растения поколения Ro гетерозиготны и при самоопылении наблюдается сегрегация. Подобные результаты получены с маркерами ОРС-09, N0-15, Leb: в поколениях R1-R4 обнаружено расщепление в обычных менделевских соотношениях доминантных и рецессивных форм. Отсутствие расщепления по SCAR-маркерам Q-20, М-10, QR-2 в потомстве от самоопыления сомаклонов может быть связано с появлением у исходных регенератов Ro мутаций в гомозиготной форме. Расщепление наблюдали только в F2, и это расщепление соответствовало доминантному характеру наследования данных SCAR-маркеров. Подобные гомозиготные сомаклональные варианты описаны у пшеницы (Larkin, 1984) и у риса (Оопо, 1985). В этих случаях стабильное наследование гомозиготных мутаций прослежено на протяжении шести поколений.

Анализ иуклеотидных последовательностей SCAR-маркеров. При

анализе нуклеотидных последовательностей SCAR-маркеров наиболее

интересные результаты были получены для фрагмента М-10. Данный маркер

содержит известный ретротранспозон Opie-1 5' LTR и часть гена,

соответствующего первому экзону рибосомального белка кукурузы L26 mRNA. В

последовательности М-10, гомологичной белку, обнаружена делеция в размере 23

нуклеотидов, которая приводит к сдвигу рамки считывания, кроме того, отмечено

несоответствие последовательностей фрагмента и белка в конце кодирующего

участка. Таким образом, можно предположить, что подобные деструктивные

изменения в данном гене были вызваны в процессе культивирования в результате

сомаклональной изменчивости (табл.5).

Табл.5. Анализ нуклеотидных последовательностей SCAR-маркеров.

Название фрагмента Гомологии по BLAST (NCBI) Повторы по (гереаНпазкег) заключение

М-10 (806 п.н.) регротранспозон Opie-1 5' LTR и часть гена, соответствующего рибосомальному белку L26 raRNA повтор(2-236 п.н.), характерный для злаков Известный повтор и псевдоген. Сдвиг рамки считывания в экзоне.

Leb (937п.н.) два гомолога в Z.mays в неаннотированных участках Повтор (63-761 п.н.), характерный для злаков, неаннотирован Возможны 2 новых повтора или ген

ОРС-09 (640 п.н.) два гомолога в Z.mays, оба в неаннотированных участках Не обнаружены Возможны 2 новых повтора или разрушенный ген Gag/pol, характерный для ретротранспозонов.

QR-2 (1018 п.н.) Гомологий не найдено Не обнаружены Возможен новый повтор

QR-A (1428 пл.) Гомологий не найдено Не обнаружены Возможен новый повтор

Q-20 (796 п.н.) Гомологий не найдено Не обнаружены Нет данных

NO-15 (204 п.н.) Гомологий не найдено Не обнаружены Нет данных

При анализе маркера Leb выяснили, что данный маркер может содержать либо два неохаракгеризованных повтора или участок, гомологичный неизвестному гену риса. В исследуемой последовательности Leb на границах выровненного сегмента находятся предположительные акцепторный и донорный сайты. Возможно, этот фрагмент имеет гомологию и с аналогичными генами у кукурузы, которые еще не секвенированы.

Фрагмент ОРС-09 содержит либо 2 неизвестных повтора, либо последовательность, гомологичную гену риса Gag/pol, характерному для

кодирующих областей ретротранспозонов.

В маркерах (ЗЯ-А и <ЗЯ-2 также обнаружены повторяющиеся последовательности, что соответствует литературным данным, согласно которым сомаклональные изменения чаще происходят в некодирующих участках генома (Во§апу й а1., 2001). Фрагмент <ЗЯ-А, характерный для исходной линии, отличается от <311-2, характерного для сомаклонов делецией с 490 по 944 позицию, которая, вероятно, является результатом сомаклональной изменчивости.

Для маркеров N0-15 и С>-20 гомологий обнаружено не было, что предполагает специфичность данных фрагментов для исследуемых сомаклонов. Для выяснения природы маркера <3-20, а также распределения его в геноме, провели гибридизационный анализ. Гибридизация зонда <3-20, характерного для второй группы, выявляла один мажорный" фрагмент размером 550 п.н. у сомаклонов ^ 105, Я, 106, Я, 107 и Я, 119.

Наличие единичного сигнала предполагает отсутствие в последовательности данного фрагмента повторов, что характерно для функциональной части генома.

Секвенирование участка гена гшАр1. Чтобы выяснить произошли ли в результате сомаклональной изменчивости мутации в функциональной последовательности определенного гена, провели секвенирование гена пероксидазы кукурузы на участке 165-1043 п.н. у исходной линии А188 и сомаклона Я11. В результате секвенирования в кодирующих областях у регенеранта по сравнению с исходной линией были обнаружены точковые мутации которые могли повлиять на функциональность гена. Изменение аминокислотного состава могло привести к изменению заряда молекулы и, соответственно, к изменению изоферментного спектра, что было показано ранее на том же самом сомаклоне Хавкиным и Забродиной, 1994 (рис.7).

Рис.7. Сравнение аминокислотных последовательностей ZmApI у Rl 1 и ZmAply А188. Несинонимичные замены между ZmApl R11 и ZmApl А188 выделены темным фоном.

Score - 348 bits (893), Expect(3) - e-151 Identities = 174/179 (97%), Positives - 175/179 (97%)

Frame - +2

Rll: 548 SGGPFFEVPLGRRDGLAPASSDLVGTLPAPFFDVPTLIESFKNRSLDKADLVALSGAHTV 727

SGGPFFEVPLGRRDGLAPASSDLVGTLPAPFFDVPTLIESFKNRSLDKADLVALSGAHTV

А188: 145 SGGPFFEVPLGRRDGLAPASSDLVGTLPAPFFDVPTLIESFKNRSLDKADLVALSGAHTV 204

Rll: 728 GRGHCVSFSDRLSPNADDGTMDPAFRQRLTAKCASDPRGNVVTQVLDVRTPNAFDNKHYS 907

GRGHCVSFSDRL PNADDGTMDPAFRQRLTAKCASDP GNWTQVLDVRTPNAFDNK+Y

А188: 205 GRGHCVSFSDRLPPNADDGTMDPAFRQRLTAKCASDPSGNWTQVLDVRTPNAFDNKYYF 264

Rll: 908 DLIAKQGLFKSDQGLINHPDTKRAATRCALNQAAFFDQFARSMVKMSQMDILTGSAGEI 1084

DLIAKQGLFKSDQGLINHPDTKRAATR ALNQAAFFDQFARSMVKMSQMDILTGSAGEI

A188 : 265 DLIAKQGLFKS DQGLINHPDTKRAATRPALNQAAFFDQFARSMVKMSQMDILTGSAGEI 323

Score = 120 bits (301), Expect(3) - e-151 Identities - 61/63 (96%), Positives - 62/63 (98%) Frame = +3

Rll: 24 9 QGCDASVLLSGSNSEQIEVPNRTLKLEALKLIDDIRAAVHAVCGPTVSCADITTLATRDA 428

QGCDASVLLSGSNSEQIEVPN+TLR EALKLIDDIRAAVHAVCGPTVSCADITTLATRDA A188: 82 QGCDASVLLSGSNSEQIEVPNQTLRPEALKLIDDIRAAVHAVCGPTVSCADITTLATRDA 141

Rll: 429 WA 437 WA

A188: 142 WA 144

Score - 112 bits (279), Expect(3) = e-151 Identities - 51/51 (100%), Positives - 51/51 (100%) Frame » +1

A188: 1 PIANGLSWSFYDVSCPSVEGIVRWHVAEALRRDIGIAAGLIRIFFHDCFPQ 153

PIANGLSWSFYDVSCPSVEGIVRWHVAEALRRDIGIAAGLIRIFFHDCFPQ Sbjct: 32 PIANGLSWSFYDVSCPSVEGIVRWHVAEALRRDIGIAAGLIRIFFHDCFPQ 82

Аминокислотные замены оценили по базе данных PolyPhen, согласно которой: P->S замена может быть несущественна S->R замена может быть деструктивна Y->H замена может быть деструктивна F->S замена может быть деструктивна F->C замена может быть деструктивна Q->R замена может быть несущественна P->L замена может быть деструктивна

Таким образом, точковые мутации, возникшие в результате сомаклональной изменчивости в последовательности гена ZmApl у сомаклона Rl 1 могли повлиять на функциональность данного гена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Анализ изменчивости ДНК-маркеров выявил многочисленные отличия всех проанализированных регенератов or исходной линии кукурузы AI 88. При изучении сомаклонов с помощью морфологического и биохимического анализов было показано, что некоторые признаки подвергаются сомаююнальной изменчивости у всех растений (Долгих и др., 1992; Хавкин и Забродина, 1994). С помощью молекулярного анализа также обнаружили маркер QR-2 (1018 п.н.), характерный для всех сомаклонов. Наличие общих признаков, характерных для независимо полученных групп сомаклонов и регистрируемых различными методами, позволяет предположить, что в процессе сомаююнальной изменчивости уже на ранних этапах культивирования происходят сходные генетические преобразования, способствующие адаптации растительной клетки к •

условиям жизни in vitro. С другой стороны, возможен отбор клеток, имеющих преимущества при культивировании, которые и дают затем начало регенерантам.

сомаклонов внутри группы (Q-20 и М-10) вероятно связано с общностью их происхождения. Кроме того, были найдены праймеры, выявляющие >

специфические ампликоны у отдельных сомаклонов второй группы (NO-15 и Leb), что может свидетельствовать о накоплении изменений ДНК на более позднем этапе культивирования.

RAPD- и ISSR-анализы подтвердили закономерности сомаююнальной изменчивости, показанные другими методами, а также мутационную природу вариаций.

На основании определения последовательностей нуклеотидов SCAR-маркеров можно сказать, что наиболее вариабельными являются повторяющиеся

последовательности. Обнаружение ретротранспозона в одном из фрагментов (М-10) соответствует предположению о возможной активизации мобильных элементов в культуре in vitro как одной из причин возникновения генетических изменений (Swarncar et al., 1986).

Итак, в результате проделанной работы показано, что RAPD- и ISSR-методы могут служить быстрым и достаточно надежным способом выявления на молекулярном уровне генетических различий между исходной линией кукурузы и регенерантами, полученными из каллусных культур, а также позволяют проследить динамику возникновения данных различий. Обнаружение специфических RAPD- и ISSR-фрагментов, характерных для сомаклонов в целом, каждой из групп сомаклонов, отдельных регенератов, преобразование их в SCAR-маркеры и секвенирование способствуют, по нашему мнению, лучшему пониманию молекулярной природы сомаклональной изменчивости.

выводы.

1) Отработаны методы применения молекулярных маркеров дня изучения сомаклональной изменчивости у кукурузы. Выявлен высокий уровень ДНК-полиморфизма сомаклонов.

2) Показано, что сомаклональные варианты отличались от исходной линии на молекулярном уровне. Выявлены ДНК-маркеры, характерные как для индивидуальных растений, так и для групп сомаклонов.

3) Исходя из степени генетических различий, полученных по результатам анализа ЛАРБ- и КЗЯ-данных, сомаклоны разделялись на 2 кластера. Распределение сомаклонов по кластерам соответствовало их происхождению. Регенераты, полученные после более продолжительного культивирования, отличались большим уровнем дивергенции от исходной линии, а также большим разнообразием внутри самого кластера.

4) Выявленные у регенератов изменения наследуются при самоопылении и гибридизации их с исходной линией по доминантному и кодоминантному типам наследования.

5) На основании специфичных фрагментов были созданы БСАЯ-маркеры, которые дают возможность идентификации сомаклонов и исходной линии. Проведенное секвенирование ЭСАЛ-маркеров и сравнение их нуклеотидных последовательностей с имеющейся базой данных показало наличие в данных фрагментах повторяющихся последовательностей.

6) При сравнении фрагментов СЖ-А, характерного для исходной линии, и <311-2, характерного для сомаклонов, в последовательности <ЗЯ-А обнаружена делеция с 490 по 944 позицию, которая, вероятно, является результатом сомаклональной изменчивости.

7) На основании сиквенса гена пероксидазы гтАр1 на участке 165-1043 п.н. в геноме регенерата Ш1, по сравнению с исходной линией А188 обнаружили точковые мутации, которые являются результатом сомаклональной изменчивости.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Osipova E.S., Gostimskij SA.., Shamina Z.B. RAPD markers variability in maize somaclonees produced from inbred A188 // Maize Genetics Cooperation Newsletter. 2000. V. 74. P. 52-53.

2. Осипова Б.С. Выявление полиморфизма сомаклонов кукурузы с помощью RAPD-метода // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». Брянск.1999. С. 14-15.

3. Осипова Е.С., Троицкий А.В., Долгих Ю.И., Шамина З.Б., Гостимский С.А. Молекулярно-генетический анализ сомаклонов кукурузы // Тезисы конференции «Горизонты физико-химической биологии». Пущино. 2000. С. 132.

4. Осипова Е.С., Кокаева З.Г., Троицкий А .В., Долгих Ю.И., Шамина З.Б., Гостимский С.А. Количественная оценка генетического разнообразия сомаклонов кукурузы, полученная с помощью RAPD-метода // Тезисы II Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва. 2000. С. 107-108.

5. Осипова Е.С., Кокаева З.Г., Троицкий А.В., Долгих Ю.И., Шамина З.Б., Гостимский СЛ. RAPD-анализ сомаклонов кукурузы // Генетика. 2001. Т. 37. №. 1.С. 91-96.

6. Ковеза О.В., Кокаева З.Г., Гостимский С.А., Петрова Т.В., Осипова Е.С. Создание SCAR-маркера у гороха (Pisum sativum L.) на основании RAPD-анализа И Генетика. 2001. Т. 37. №. 4. С. 574-576.

7. Danilova S.A., Osipova E.S., Lyapkova N.S., Kibardin A. Agrobacterium tumefaciens -mediated genetic transformation of maize // Maize Genetics Cooperation Newsletter. 2002. V.76. P. 76.

8. Danilova S.A., Osipova E.S., Lyapkova N.S. The development of methods of Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize // Intern. Symposium "Biotechnological approaches for exploitation and preservation of plant resources" Yalta. Ukraine. 2002. P. 70-71.

9. Osipova E.S., Troitskij A.V., Dolgikh Yu.I., Shamîna Z.B., Gostimskij SA. SCAR-marker creation for maize somaclones using some specific RAPD and ISSR fragments // Maize Genetics Cooperation Newsletter. 2003. V. 77. P. 53-55.

10. Осипова E.C., Ковеза O.B., Троицкий AJB., Долгих ЮЛ., Шамина З.Б., Гостимский СЛ. Выявление специфических RAPD- и ISSR-фрагментов у сомаклонов кукурузы (Zea mays L.) и создание на их основе SCAR-маркеров // Генетика. 2003. № 12.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает благодарность за поддержку, советы и участие в работе Алексеевскому А., Быстрову Н.С., Иванову Д., Калининой О., Карпову В .А., Полтараусу А.Б., Розову Ф., Спирину С.А., Троицкому А.В.

Гарнитура Times. Формат 60V90/16. Бумага офсетная 80 г. Печать офсетная. Уч .-изд. л 1,0 Усл.печ.л 1,5. Тираж 100 экз. Отпечатано с готового Оригинал-макета в ООО "Знаменка".

№14698

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Осипова, Екатерина Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Сомаклональная изменчивость.

1.1.1. Причины сомаклональной изменчивости.

1.1.2. Факторы, влияющие на сомаклональную изменчивость.

1.1.3. Возможные механизмы сомаклональной изменчивости.

1.1.4. Изменения, возникающие в процессе сомаклональной изменчивости.

1.1.5. Практическое использование сомаклональной изменчивости.

1.2. Молекулярные маркеры, применяемые для изучения сомаклональной изменчивости.

1.2.1. Белковые маркеры.

1.2.2. RFLP-маркеры.

1.2.3. PCR-маркеры.

1.2.3.1. МААР-маркеры.

1.2.3.1.1. МААР-маркеры с праймерами произвольной последовательности.

1.2.3.1.2. МААР-маркеры с праймером, комплементарным микросателлитному повтору.

1.2.3.2. STS-маркеры.

1.2.3.2.1. STS-маркеры, основанные на полиморфизме микросателлитов.

1.2.3.2.2. STS-маркеры, созданные на основе МААР.

1.2.3.2.3. STS-маркеры, основанные на выявлении точковых мутаций при введении нуклеотидных замен в прайм еры.

1.2.3.3. REMAP-маркеры.

1.2.3.4. Маркеры, сочетающие рестрикцию, гибридизацию и PCR-методы.

1.2.3.4.1. Использование в качестве мишени ПЦР-продукта.

1.2.3.4.2. Использование рестрицированной геномной ДНК в качестве основы для ПЦР.

1.2.3.4.3. FISH (зонды могут быть получены спомощью ПЦР).

1.2.3.5. Комплексный подход к анализу сомаклональной изменчивости с помощью молекулярных маркеров.

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Исходный материал.

2.2 Выделение ДНК для PCR-анализа.

2.3. Амплификация ДНК.

2.4. Проведение электрофореза в агарозном геле.

2.5. Качественная и количественная оценка полиморфизма.

2.6. Выделение фрагмента из геля.

2.7. Клонирование фрагмента.

2.8. Выделение плазмиды.

2.9. Секвенирование.

2.10. Подбор SCAR-праймеров и амплификация с ними.

2.11. Синтез праймеров.

2.12. Выделение ДНК для блотт-гибридизации по Саузерну.

2.13. Блот-гибридизация по Саузерну.

2.14. Анализ последовательностей специфических SCAR-фрагментов.

Глава Э. Результаты и обсуждение

3.1. Характеристика сомаклонов.

3.2. RAPD-анализ: первая серия опытов.

3.3. Воспроизводимость RAPD- и ISSR-спектров.

3.4. RAPD- и ISSR-анализ: вторая серия опытов.

3.5. Количественная оценка RAPD- и ISSR-полиморфизма.

3.6. SCAR-анализ.

3.7. Наследование SCAR-маркеров.

3.8. Анализ нуклеотидных последовательностей SCAR-маркеров.

3.9. Блот-гибридизация.

3.10. Секвенирование участка гена анодной пероксидазы кукурузы (ZmApl).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Вариабельность ДНК-маркеров (RAPD, ISSR) при сомаклональной изменчивости у кукурузы"

Изучение сомаклональной изменчивости может быть интересно как в фундаментальных исследованиях в качестве модели эволюции и дивергенции генов в популяции, так и в практической селекции, как доступный источник генетического разнообразия. В том случае, когда целью служит получение однородного материала, сомаклональную вариабельность желательно свести к минимуму, если требуется дополнительная генетическая изменчивость, необходимо усилить степень вариабельности. Однако для того, чтобы управлять сомаклональной вариабельностью, важно понять причины ее возникновения и размах. С этой целью используют комплексный подход, включающий различные методы и анализы.

На сегодняшний день одним из наиболее доступных и быстрых способов обнаружить вариабельность, а затем выяснить природу сомаклональной изменчивости является применение молекулярных методов, основанных на полимеразной цепной реакции (П1ДР) и создание с их помощью маркеров ДНК, отличающих сомаклоны от исходного генотипа.

Цель и задачи работы. В связи с вышеизложенным целью данной работы стало выявление полиморфизма ДНК среди ранее полученных и исследованных сомаклонов кукурузы и выяснение природы сомаклональной изменчивости на молекулярном уровне с помощью RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) и ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) методов, основанных на ПЦР.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

2. Выявить RAPD и ISSR маркеры, отличающие сомаклоны от исходной линии.

3. Клонировать полиморфные фрагменты, секвенировать концевые участки данных фрагментов для создания SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) маркеров.

4. С помощью SCAR-праймеров подтвердить полиморфность фрагментов, проследить их наследуемость в поколениях R2, R3, R4, полученных при самоопылении, а также в поколениях Fi, F2, полученных в результате возвратного скрещивания с исходной линией А188, и в случае успеха секвенировать фрагмент целиком.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Осипова, Екатерина Сергеевна

выводы.

1) Отработаны методы применения молекулярных маркеров для изучения сомаклональной изменчивости у кукурузы. Выявлен высокий уровень ДНК-полиморфизма сомаклонов.

3) Исходя из степени генетических различий, полученных по результатам анализа RAPD- и ISSR-данных, сомаклоны разделялись на 2 кластера. Распределение сомаклонов по кластерам соответствовало их происхождению. Регенеранты, полученные после более продолжительного культивирования, отличались большим уровнем дивергенции от исходной линии, а также большим разнообразием внутри самого кластера.

4) Выявленные у регенерантов изменения наследуются при самоопылении и гибридизации их с исходной линией по доминантному и кодоминантному типам наследования.

5) На основании специфичных фрагментов были созданы SCAR-маркеры, которые дают возможность идентификации сомаклонов и исходной линии. Проведенное секвенирование SCAR-маркеров и сравнение их нуклеотидных последовательностей с имеющейся базой данных показало наличие в данных фрагментах повторяющихся последовательностей.

6) При сравнении фрагментов QR-A, характерного для исходной линии, и QR-2, характерного для сомаклонов, в последовательности QR-A обнаружена делеция с 490 по 944 позицию, которая, вероятно, является результатом сомаклональной изменчивости.

7) На основании сиквенса гена пероксидазы ZmApl на участке 165-1043 п.н. в геноме регенеранта R11, по сравнению с исходной линией А188 обнаружили точковые мутации, которые являются результатом сомаклональной изменчивости.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Анализ изменчивости ДНК-маркеров выявил многочисленные отличия всех проанализированных регенерантов от исходной линии кукурузы А188. При изучении сомаклонов с помощью морфологического и биохимического анализов было показано, что некоторые признаки подвергаются сомаклональной изменчивости у всех растений (Долгих и др., 1992; Хавкин и Забродина, 1994). С помощью молекулярного анализа также обнаружили маркер QR-2 (1018 п.н.), характерный для всех сомаклонов. Наличие общих признаков, характерных для независимо полученных групп сомаклонов и регистрируемых различными методами, позволяет предположить, что в процессе сомаклональной изменчивости уже на ранних этапах культивирования происходят сходные генетические преобразования, способствующие адаптации растительной клетки к условиям жизни in vitro. С другой стороны, возможен отбор клеток, имеющих преимущества при культивировании, которые и дают затем начало регенерантам.

По ряду других морфологических признаков разные по происхождению группы сомаклонов различались. Среди используемых праймеров некоторые также выделяли две анализируемые группы. Сомаклоны второй группы, регенерированные после более продолжительного культивирования каллусов, характеризовались большим полиморфизмом фрагментов ДНК, что полностью соответствуют морфологическим данным. Наличие общих фрагментов у сомаклонов внутри группы (Q-20 и М-10) вероятно, связано с общностью их происхождения. Кроме того, были найдены праймеры, выявляющие специфические ампликоны у отдельных сомаклонов второй группы (NO-15 и Leb), что может свидетельствовать о накоплении изменений ДНК на более позднем этапе культивирования.

RAPD- и ISSR-анализы подтвердили закономерности сомаклональной изменчивости, показанные другими методами, а также мутационную природу вариаций.

На основании определения последовательностей нуклеотидов SCAR-маркеров можно сказать, что наиболее вариабельными являются повторяющиеся последовательности. Обнаружение ретротранспозона в одном из фрагментов (М-10) соответствует предположению о возможной активизации мобильных элементов в культуре in vitro как одной из причин возникновения генетических изменений (Swarncar et al., 1986).

Итак, в результате проделанной работы показано, что RAPD- и ISSR-методы могут служить быстрым и достаточно надежным способом выявления на молекулярном уровне генетических различий между исходной линией кукурузы и регенерантами, полученными из каллусных культур, а также позволяют проследить динамику возникновения данных различий. Обнаружение специфических RAPD- и ISSR-фрагментов, характерных для сомаклонов в целом, каждой из групп сомаклонов, отдельных регенерантов, преобразование их в SCAR-маркеры и секвенирование способствуют, по нашему мнению, лучшему пониманию молекулярной природы сомаклональной изменчивости.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Осипова, Екатерина Сергеевна, Москва

1. Атаева Д.М, Долгих Ю.И., Дубровина М.В., Хавкин Э.Е., Шамина З.Б. Хромосомный и изоферментный анализ сомаклональных вариантов инбредной линии кукурузы А188 // Докл. ВАСХНИЛ. 1991. № 5. С. 2-5.

2. Атаева Д.М, Дубровина М.В., Долгих Ю.И., Шамина З.Б. Изменчивость гетерохроматических районов хромосом первого семенного поколения растений-регенерантов кукурузы // Цитология и генетика. 1994. Т. 28. № 1. С. 15-20.

3. Бабаева С.А., Петрова Т.Ф., Гапоненко Л.К. Полиплоидия и политения в культивируемых in vitro клетках злаков // Генетика. 1995. Т. 31. С. 678-683.

4. Баева В.М., Боброва В.К., Троицкий А.В., Антонов А.С. RAPD-анализ ДНК рода манжетка // Фармация. 1998. № 2. С. 38-41.

5. Бутенко Р.Г., Шамина З.Б., Фролова Н.В. Индуцированный органогенез и характеристика растений, полученных в культуре тканей табака. // Генетика. 1967. Т. 3. №3. С. 29-33.

6. Глазко В.И., Созинов И.А. Генетика изоферментов животных и растений. Киев, "Урожай". 1993.

7. Долгих Ю.И. Генетическая изменчивость по признаку чувствительности в культуре клеток женьшеня. Автореф. дис. канд. биол. наук. М. ИФР. 1986. С. 1-18.

8. Долгих Ю.И., Шамина З.Б. Современные представления о причинах и механизмах сомаклональной изменчивости. В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов. М. "Наука". 1991. С. 123-127.

9. Долежел Й., Новак Ф.Й. Кариологичсские изменения в ходе дедифференцировки клеток чеснока. // В кн.: Культура клеток растений и биотехнология. М. "Наука". 1986. С. 20-25.

10. Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Реунова Г.Д., Илюшко М.В. ДНК-типирование дольневосточных видов рода Iris L. с помощью метода RAPD-PCR // Генетика. 1998. Т. 34. № 3. С. 368-372.

11. Захленюк О.В., Алексеева И.В., Чернецкий В.П., Кунах В.А, Влияние кинетина и глиацидина на культуру тканей табака // В кн.: Культура клеток растений и биотехнология. М. "Наука". 1986. С. 37-41.

12. Захленюк О.В., Кунах В.А. Цитофизиологические и цитогенетические эффекты производных аденина и культуре тканей Haplopappus gracilis // Физиология растений. 1987. Т. 34. С. 584-594.

13. Кацы Е.И. Участие ауксинов в регуляции экспрессии генов бактерий и растений // Генетика. 1997. Т.ЗЗ. С. 565-576.

14. Ковальская B.C., Сидорова Н.В. Характер метилирования генов рДНК в каллусной ткани озимой пшеницы. // Проблемы теоретической и прикладной генетики в Казахстане: Матер. Респ. конф. (Алма-Ата, 18-22 ноября 1990). Алма-Ата. 1990. С. 62-63.

15. Ковеза О.В. Идентификация, клонирование и исследование молекулярных маркеров генома гороха. Дис. канд. биол. наук. М. ИОГЕН. 2003. С. 116-118.

16. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Лауве Л.С., Журавлев Е.В., Реунова Г.Д. Генетическая изменчивость каллусных линий женьшеня {Panax Ginseng). 11 Биотехнология. 2001. №1. С. 19-26.

17. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Вальехо-Роман К.М., Гостимский С.А., Троицкий А.В. RAPD-анализ сомаклональной и межсортовой изменчивости гороха // Докл. Рос. акад. наук. 1997. Т. 355. № 1. С. 134-136.

18. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Петрова Т.В., Гостимский С.А., Троицкий А.В. Генетический полиморфизм сортов, линий и мутантов гороха по данным RAPD-анализа // Генетика 1998. Т. 34. № 6. С. 771-777.

19. Корзун В.Н., Плашке И., Бернер А., Картель НА. II Генетика. 1995. Т. 31. С. 12821286.

20. Корочкнн Л.И., Серов О.Л., Пудовкин А.И. и др. Генетика изоферментов. Наука, М„ 1977.

21. Кунах В. Jl. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 1. Изменчивость в онтогенезе. // Биополимеры и клетка. 1994. Т. 10. С. 5-35.

22. Кунах В. А. Геномная изменчивость соматических клеток растении. 3. Каллусообразование in vitro. 11 Биополимеры и клетка. 1997. Т. 13. С. 362-371.

23. Кунах В. А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 4. Изменчивость при дедифференцировке и каллусообразовании in vitro. // Биополимеры и клетка. 1998. Т. 14. С. 298-319.

24. Кунах В.А. Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировке и каллусообразовании. // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 6. С. 919-929.

25. Кунах В.А., Алпатова Л.К. Роль фитогормопов в изменчивости числа хромосом в культуре тканей Haplopappus gracilis //ДАН СССР. 1979. Т. 245. С. 967-970.

26. Кунах В.А., Захленюк О.В. Диплоизация культуры тканей растений с помощью 5-урацил-тиоуреидоглюкозы (тиацила). // Докл. АН СССР. 1984. Т. 279. №5. С. 1241-1244.

27. Кунах В.А., Зосимович В.П. Влияние кинетина на уровень и типы аберраций хромосом в культуре тканей Haplopappus gracilis II Генетика. 1977. Т. 13. С.1355-1365.

28. Кучеренко Л.А. Индуцированный морфогенез в культуре тканей риса и их использование для создания исходного селекционного материала. В кн.: Культура клеток растений и биотехнология. М. "Наука". 1986. С. 211-213.

29. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И. Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике. В кн.: Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М. "Агропромнздат". 1990. С. 202-208.

30. Осипова Е.С., Кокаева З.Г., Троицкий А.В., Долгих Ю.И., Шамина З.Б., Гостимский С.А. RAPD-анализ сомаклонов кукурузы // Генетика. 2001. Т. 37. № 1. С. 91-96.

31. Павлова М.К., Тимохша Н.Т., П1вень М.М., Шупта Л.В., Малюк B.I., Мариновська Л.В. Репродукция in vitro клгган Beta vilgaris L. при спланованих модифжащях поживного середовища // Укр. ботан. журн. 1977. Т. 34. С. 252-256.

32. Патрушев Л.И., Зыкова Е.С., Каюшин А.Л., Коростелева М.Д., Мирошников А.И. Новая система ДНК-диагностики, позволяющая обнаруживать и идентифицировать гомозиготные и гетерозиготные точковые мутации. // Биоорганическая химия. 1998. Т. 24. №3. С. 194-200.

33. Патрушев Л.И. ДНК-диагностика и ДНК-типирование. В кн.: Экспрессия генов. М. "Наука". 2000. С. 452-477.

34. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Соматическая гибридизация пасленовых. Киев: "Наук, думка". 1985. С. 130.

35. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев: "Наук. Думка". 1990. С. 280.

36. Сидоров В. А., Сидорова Н.В. Сомаклональная изменчивость источник генетического разнообразия у растений. // Цитология и генетика. 1987. Т. 21. № 3. С. 230-234.

37. Скаукрофт У.Р. Сомаклональная изменчивость: миф о клональном единообразии. Мобильность генома растений. М "Агропромиздат". 1990. С. 228255.

38. Хавкин Э.Е., Забродина М.В. Наследуемые изменения в спектрах пероксидаз и эстераз у сомаклонов кукурузы // Физиология растений. 1994. Т.41. N.6. С. 859-867.

39. Хромова JI.M., Седнина Г.В., Бутенко Р.Г. Возможности методов культуры тканей для выявления вариабельности генотипов картофеля // Докл. ВАСХНИЛ. 1983. № 10. С. 21-23.

40. Хуссейн И.А., Кочиева Е.З., Хадеева Н.В. Изменение спектров пероксидаз у регенерантов Stachys sieboldii (Miq.) в результате гормональных и мутагенных воздействий // Генетика. 2000. Т. 36. № 8. С. 1093-1099.

41. Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК. М.: "Наука". 1999.

42. Шамина З.Б. Генетическая изменчивость в популяциях соматических клеток растений в культуре: Дис. . докт. биол. наук. J1.1988. С. 34.

43. Шибата К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов. В кн.: Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М. "Мир". ~ 1999. С.395-427.

44. Ali S., Muller C.R., Epplen J.T., DNA fingerprinting by oligonucleotide probes specific for simple repeats // Hum. Genet 1986. V. 74. P. 239-243.

45. Annil D., Noel E.T.H. Deleted forms of plastid DNA in abbino plants from cereal anther culture. // Curr. Genet. 1985. V. 9. № 8. P. 671-678.

46. Anderson S., Lewis-Smith A.C., Smith S.M. Methylation of Ribosomal RNA Genes in Petunia Hybrid Plants, Callus Cultures and Regenerated Shoots // Plant Cell Repts. 1990. V. 8. P. 554-557.

47. Ammirato P.V. Embryogenesis // Handbook of plant cell culture. New York. London: Macmillan. 1983.V. 1. P. 82-123.

48. Bardini M., Labra M., Winfield M., Sala F. Antibiotic-induced DNA methylation changes in calluses of Arabidopsis thaliana II Plant Cell Tissue Organ Cult. 2003. V. 72. № 2. P. 157-162.

49. Bassam BJ., Caetano-Anolles G. Automated "Hot Start" PCR using mineral oil and paraffin wax // Biotechniques. 1993. V. 14. № 1. P. 30-34.

50. Bayliss M.W. Chromasomal variation in plant tissues in culture // Int. Rev. Cytol. 1980. V.11 A. P. 113-114.

51. Beavis W.D., Grant D., Albertsen M., Fincher R. Quantitative trait loci for plant height in four maize populations and their associations with qualitative genetic loci II Theor. Appl. Genet. 1991. V. 83. P. 141-145.

52. Becker J., Heun M. Mapping of digested and undigested random amplified microsatellite polymorphisms in barley. // Genome. 1995. V. 38. P. 991-998.

53. Beckmann. J.S., Seller M. Towards unified approach to the genetic mapping of eukaryotes based on sequence tagged microsatellite sites. // Bio/Technology. 1990. V. 8. P. 930-932.

54. Bennici A., Cuffaro L. Karyological Behavior during the first phases of differentiation and habituation in Nicoliaiiti bigelovii//Protoplasma. 1985. V. 124.

55. Bil'danova L.L., Salina E.A., Pershina L.A. Study of the backcross progeny of barley-wheat hybrids by the RAPD and RAMPO methods // Genetika. 2002. V. 38. № 3. P. 332339.

56. Bogani P., Simoni A., Lio P., Scialpi A., Buiatti M. Genome flux in tomato cell clones cultured in vitro in different physiological equilibria. П. A RAPD analysis of variability // Genome. 1996. V. 39. P. 846-853.

57. Bogani P., Simoni A., Lio P., Germinario A., A., Buiatti M. Molecular variation in plant cell populations evolving in vitro in different physiological contexts // Genome. 2001. V. 44. P. 549-558.

58. Borgo L., Serani В., Conti S. Molecular profiling of GM-maize lines as related to the issue of essential derivation // Proceedings of the XLVI Italian Society of Agricultural Genetics SIGA Annual Congress Giardini Naxos. Italy. 18/21 September. 2002.

59. Brown P.T.H., Gobel E., Lorz H. RFLP analysis of Zea mays callus cultures and their regenerented plants // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 81. P. 227-232.

60. Bush S.R., Earle E.D., Langhans R.W. Plantlets from petal epidermis and shoot tips ofpericlinal chimera Chrysanthemum moriloium // Indianapolis, 1976, vol. 63, p. 729-737.

61. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers // Bio/Technology. 1991. V. 9. P. 553-557.

62. Carninci P., Kvam C., Kitamura A., Ohsumi T. et al. High-Efficiency Full-Length cDNA Cloning by Biotinylated CAP Trapper // Genomics. 1996. V. 37. P. 327-336.

63. Casa A.M., Brouwer C., Nagel A., Wang L., Zhang Q., Kresovich S., Wessler S.R. The MITE family Heartbreaker (Hbr): Molecular markers in maize // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 18. P. 10083-10089.

64. Changtragoon S., Szmidt A.E., Wang X. The use of molecular markers in the study of genetic diversity in rattan: preliminary results. // Molecular genetic techniques for plant genetic resources. 1997. P. 39-43.

65. Chen W.H., Chen T.M., Fu Y.M., Hsieh R.M., Chen W.S. Studies on somaclonal variation in Phalaenopsis ) // Plant Cell Reports. 1998. V. 18. № 1/2. P. 7-13.

66. Chen X., Mariappan S.V., Moyzis R.K., Bradbury E.M., Gupta, G. Hairpin induced slippage and hyper-methylation of the fragile X DNA triplets // J. Biomol. Struct. Dyn. 1998. V. 15. P. 745-756.

67. Cifarelli R.A., Gallitelli M., Cellini F. Random amplified hybridization microsatellites (RAHM): isolation of a new class of microsatellite-containing DNA clones // Nucleic Acids Res. 1995.V. 23. № 18. P. 3802-3803.

68. Chowdhury M.K.U., Vasil V., Vasil I.K. Molecular analysis of plants regenerated from embryogenic cultures of wheat (Triticum aestivum L.) //Theor. Appl. Genet. 1994. V. 87. №7. P. 821-828.

69. Chriqui D., Bercetche J. Faclure Hormonaux et Phenomenes Amitotiques dans les Explants Vegetaux Cultives in vilro II Bull. Soc. Bot. Fr. Actual. Bot. 1985. V. 132. P.152.

70. Cullis C.A., Cleary W. DNA Variation in Flax Tissue Culture // Can. J. Genet. Cytol. 1986. V. 28. P. 247-251.

71. Dahleen L.S. Molecular marker analysis of hypoploid regenerants from cultures of barley x Canada wild rye // Genome. 1996. V. 39. № 2. P. 367-372.

72. Dale P.J. Protoplast culture and plant regeneration of cereals and other recalcitrant crops //Protoplast. 1983. Lecture Proceedings. Basel: Birkhauser. 1983. P. 31-42.

73. D' Amato F. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Ed. J. Reinert and Y.S. Bajcy. Berlin: Springer Verlag. 1977. P. 343-357.

74. D' Amato F. Chromosom number variation in cultured ceiis and regenerated plants // Frontiers of plant tissue culture. 1978. Calgary: IAPTC. 1978. P. 287-295.

75. Davis T.M., Yu H. Haigis K.M., McGowan P.J. Template mixing: A method of enhancing detection and interpretation of codominant RAPD markers // Theor. Appl. Genet. 1995. V. 91. P. 582-588.

76. Day A., Ellis Т. H. N. Chloroplast DNA deletions associated with wheat plant regenerated from pollen: possible basis for maternal inheritance of chloroplasts. // Cell. 1984. V. 63. №39. P. 359-368.

77. Devos KM., Atkinson M.D., Chinoy C.N., Francis H.A., Harcourt R.J., Koebner R.M.D., Liu C. J., Masojc P., Xie D.X. Gale MD. Chromosomal rearrangements in the rye genome relative to that of wheat // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 85. P. 673-680.

78. Diwan N., Cregan P.B. Automated sizing of fluorescentlabeled simple sequence repeat (SSR) markers to assay genetic variation in soybean. // TAG. 1997. V. 95. P. 723-733.

79. Dolgikh Yu.l., Larina S.N., Shamina Z.B. Genetic variability on maize callus culture //

80. Abstr. 39th Ann. ETCS Meeting. Kracow, 1991. P. 36.

81. Edallo S., Zucchinali, M. Perenzin, F. Salamini. Chromosomal variation and freqency of spontaneous mutation associated with in vitro culture and plant regeneration in maize. // Maydica. 1981. V. 26. № 1. P. 39-56.

82. Edwards A., Civitello A., Hanimond H.A., Caskey C.T. DNA typing and genetic mapping with trinieric and tetrameric tandem repeats. // 1991.Am. J. Hum. Genet. 49: 746-756.

83. Ender A., Schwenk K., Stadler Т., Streit В., Schierwater B. RAPD identification of microsatellites inDaphnia// Mol. Ecol. 1996. V. 5. № 3. P. 437-41.

84. Evans D.A., Gamborg O.L. Chromosome stability of cell suspension cultures of Nicotiana spp. // Plant and Cell Rep. 1982. V. 1. № 1. P. 104-107.

85. Felsenstein J. Confidence Limits on Phylogenies: An Approach Using the Bootstrap // Evolution. 1985. V.38. P.783-791.

86. Frolova L.V., Shamina Z.B.,Ponert J. Artificial reducion on the chromosome number improvement: Proc. Int. Symp. (Olomouc. 24-29 Sept. 1984) // Eds. Novak F.T., Havel L., Dolezel F. Prague. 1984. P. 315-316.

87. Gaponenko A.K., Shayachmetov I.F., Babayeva S.A., Ochrimenko G.N. Analysis of esterases, ADH, GDH and GOT isozymes of regenerants of Triticum aestivum L and T durum DESFИ Genetika. 1993. V. 29. № 2. P. 323-328.

88. Gautheret R.J. La culture des tissus vegetaux. // Masson et C. Paris. 1959. P. 665-669.

89. Ghosh P.K., Chaterjee A. En vitro Induction and Maintenance of Epicotyl Derived Callus Culture of Jute // Indian Biol. 1990. V. 22. P. 38-39.

90. Gianfranceschi L., Seglias N., Tarchini R., Komjanc M., Gessler C. Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple. // Teor. Appl. Genet. 1998. V. 96. P. 1069-1076.

91. Gill G.P., Harvey C.F., Gardner R.C., Fraser L.G. Development of sex-linked PCR markers for gender identification in Actinidia. // Teor. Appl. Genet. 1998. V. 97. P. 439445.

92. Godwin I.D., Sangduen N., Kunanuvatchaidach R., Piperidis G., Adkins S.W. RAPD polymorphisms among variant and phenotypically normal Rice (Oryza sativa Var Indica) somaclonal progenies // Plant Cell Reports. 1997. V. 16. № 5. P. 320-324.

93. Goodfellow P.M., Sefton L., Farr C.J. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 1993. V. 339. P. 139-146.

94. Gosch-Wackerle G., Avivi L., Galun E. Induction, culture and differentiation of callus from immature rachises, seeds and embryos of Triticum // Z. Pflanzenphysiol. 1979. V. 91. №3. P. 267-278.

95. Groose R.W., Bingham E.T. Variation in plants regenerated from tissue culture of tetraploid alfalfa heterozygous for several traits. Crop. Sci. 1984.

96. Gubur E.K., Kunakh V.A. C-banding in Zea mays // Biotechnology in Agriculture and Forestry. V. 25. Maize / Ed. Bajaj Y.P.S. Berlin: Heidelberg: Springer. 1994. P. 366-381.

97. Gupta N., Carlson P. S. Preferential grouwth of haploid plant cell in vitro. // Nature New Biol. 1972. V. 239. №1.P. 86.

98. Hallden C, Hansen M., Nilsson N.-O., Hjerdin A., Sail T. Competition as source of errors in RAPD analysis // Theor. Appl. Genet. 1996. V.93. № 1. P. 185-1192.

99. Haluskova J., Cellarova E. RFLP analysis of Hypericum perforatum L somaclones and their progenies // EUPHYTICA. 1997. V. 95. № 2. P. 229-235.

100. Harris H. and Hopkinson D.A. Handbook of Enzyme Electrophoresis in Human Genetics. North-Holland, Amsterdam, 1976.

101. Hayashi M., Nakajima T. Genetic stability in regenerated plants derived from tobacco mesophyll protoplasts through three-step culture // Jap. F. Breed. 1992. V. 34. № 4. P. 409-415.

102. Hashmi G., Huettel R., Meyer R., Krusberg L., Hammerschlag F. RAPD analysis of somaclonal variants derived from embryo callus cultures of peach // Plant Cell Reports 1997. V. 16. P. 624-627.

103. Hernandez P., Martin A., Dorado G., Development of SCARs by direct sequencing of RAPD products: a practical tool for the introgression and marker-assisted selection of wheat // Mol. Breeding. 1999. V.5. P. 245-253.

104. Hodgson J. Making the transition to applied technology // Biotechnol. 1990. V. 8. P. 714.

105. Hosaka K., Matsubayasi M., Kamijima 0. Peroxidase isozyme in various tissues for discrimination of two tuberose Solanum spesies. // Japan. J. Breed. 1985. V. 35. P. 375382.

106. Inze D., Ferreira P., Hemerly A., Montagu V. Control of Cell Division in Plants // Biochem. Soc. Trans. 1991. V. 20. P.80-84.

107. Jaligot E, Beule T, Rival A. Methylation-sensitive RFLPs: characterisation of two oil palm markers showing somaclonal variation-associated polymorphism // Theor. Appl. Genet. 2002. V. 104. № 8. P. 1263-1269.

108. Jha S., Sen S. Induction of Mitosis in Polytene Nuclei and Hormonal Effect on Nuclear Changes during Callus Initiation in Diploid Urginea indica Kunth. (Liliaceae) // Genetica. 1990. V. 80. P. 9-15.

109. Jiang N., Bao Z., Zhang X., Hiroshika H„ Eddy S.R., McCouch S., Wessler S.R. An active DNA transposon family in rice // Naure. 2003. V. 421. P. 163-166.

110. Jones L.H., Scott T.R. Transfer Nucleic Acid Modification and its Relationship to Tumorous and Nontumorous Plant Growth // Plant Physiol. 1981. V. 67. P. 535-538.

111. Kalendar R.T.G., Grob Т., Regina M., Suoniemi A., Schulman A. IRAP and REMAR: two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques // Teor. Appl. Genet. 1999. V. 98. P.704-711.

112. Kaneko K. Karyologieal Studies on Callus Cells of Haplopappus gracilis // Kromosoma. 1974. №95. P.2943-2949.

113. Kaneko К. Karyologieal Studies on Callus Cells from Stem, Anther and Ovule Cultures of Huplopappus gracilis //Bull. FukuokaUniv. Nat. Sci. 1975. V. 25. P. 77-87.

114. Kantety R.V, Zeng X.P, Bennetzen J.L, Zehr B.E. Assessment of genetic diversity in Dent and Popcorn {Zea mays L.) inbred lines using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification. // Mol. Breed. 1995. V. 1. P. 365-373.

115. Karp A. Somaclonal variation as a tool for crop improvement // Euphytiw 85. 1995. P. 295-302. 1995. Kleever Academic Publishers. Printed in the Netherland.

116. Karp A., Maddock S.E., Chromosome variation in wheat plants regenerated from cultured immature embryos. // Theor. Appl. Genet. 1984. V. 67. № 3. P. 249-255.

117. Karp A., Nelson R.S., Thomas E., Bring S.W.I. Chromosome variation in protoplasts derived potato plants // Theor. Appl. Genet. 1982. V. 63. P. 265-272.

118. Kemble R.T., Flavell R.B, Brettell R.I.S., Mitochondrial DNA analysis of fertile and sterile maize plants from tissue culture with the Sexas male sterile citoplasm // Theor. Appl. Genet. 1982. V. 62. P. 213-217.

119. Konieczny A., Ausubel F.M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers // Plant. J. 1993. V. 4. P. 403-410.

120. Kwok S., Kellog D.E., McKinney N., Spasic D., Goda L., Levenson C., Sninsky J.J. Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: Human immunodeficiency virus type 1 model studies. // Nucl. Acids Res. 1990. V.18. P. 9991005.

121. Larkin P.J., Ryan S.A., Brettel R.I.S., Skowcroft W.R. Heritable somaclonal variation in wheat. // Theor. Appl. Genet. 1984. V. 67. P. 443-455.

122. Larkin P.J., Scowcroft W.R. Somaclon variation a novel source of variability from cell culture for plant improvement// Theor. Appl. Genet. 1981. V. 60. № 2. P. 197-214.

123. Laurie D.A., Snape J.W., Gale M.D. II Barley Genetics: Molecular Biology and Biotechnology / Shewry P.R., Ed. Wallingford: CAB International. 1992. P. 115-132.

124. Lee S.H., Ryu J.A., Do G.S., Seo B.B., Рак J.H., Kim I.S., Song S.D. Chromosome Analysis by Fluorescence in-Situ Hybridization of Callus-Derived Regenerants in Allium Cyaneum R II Plant Cell Reports. 1998. V. 18. № 3/4. P. 209-213.

125. Leroy X. J., Leon K., Branchard M. ISSR and somaclonal variation: a new moleculartechnique for an important in vitro phenomenon. 11 Electronic Journal of Biotechnology V. 3. URL: http://www.ejb.Org/content/vol3/issue2/full/2/bip.

126. Litt M., Luty J.A. A hypervariable microsatelliterevealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within cardiac muscle actin gene // Am. J. Hum. Genet. 1989 V. 44. P. 397-401.

127. Lorz H., Scowcroft W.R. Variability among plants and their progeny regenerated from protoplasts of Su/su heterozygotes of Nicotiana tabacum II Theor. Appl. Genet. 1983. V. 66. №4. P. 67-75.

128. Lu H.J., Bernardo R., Ohm H.W. Mapping QTL for popping expansion volume in popcorn with simple sequence repeat markers. // Theor. Appl. Genet. 2003. V. 106. P. 423-427.

129. Manchenko G.P. Handbook of Detection of Enzymes on Electrophoretic Gels. CRC Press. 1994.

130. Mangolin C.A., Prioli A.J., Machado M.F.P.S. Isozyme variability in plants regenerated from Calli of Cereus peruvianus (Cactaceae) // Biochem. Genet. 1997. V. 35. № 5-6. P. 189-204.

131. McClintock B. Chromosome organization and genie expression. // Cold Spr. Harb. Quant. Biol. 16. 1982. P. 13-47.

132. McCoy T.J., Phillips R.L., Chromosome stability in maize (Zea mays) tissue cultures and sectoring in some regenerated plants // Can. J. Genet. Cytol. V. 24. 1982. P. 559-565.

133. McCoy T.J., Phillips R.L., Rines R.L. Cytogenetic analysis of plants regenerated from oat (Avena sativa) tissue cultures: high frequency of partial chromosome loss, mutations in Tradescantia stamen hairs 11 Can. J. Genet. Cytol. 1982. V. 24. P. 37-50.

134. Meijer E.G.M. Keller W.A. Simmonds D.H. Cytological Abnormalities and Aberrant Microtubule Organization during Early Divisions in Mesophly Protoplast Cultures of Medicago sativa and Nicotiana tahacum // Physiol. Plant. 1988. V. 74. P. 233-239.

135. Meins F. Heritable variation in plant cell culture // Ann. Rev. Plant. Physiol. 1983. V. 34. P. 327-346.

136. Melotto M., Afanador L., Kelly J.D. Development of a SCAR marker linked to the 1 gene in common bean. // Genome. 1996. V. 39. P. 1216-1219.

137. Meyer W., Lieckfeldt, E., Kuhls K„ Freedman E. Z., Burner, Т., Mitchell T.G., in: Pena, S. D. J., Chakraborty R., Epplen J. Т., Jeffreys A. J. (Eds.), DNA Fingerprinting: State of the Science, Birkhauser. Basel. 1993. P. 311-320.

138. Michelmore R.W., Kesseli R.V., Francis D.M., Paran I., Fortin M.G., Yang C.-H. // Molecular plant pathology 2. A practical approach / Eds Suit S.J., McPherson M.T., Bowles O.S. Oxford, U.K.: Oxford University Press. 1992. P.233-288.

139. Milbourne D., Meyer R., Bradshaw J.E., Baird E., Bonar N., Provan J., Powell W., Waugh R. Comparison of PCR-based marker systems for the analysis of genetic relationships in cultivated potato. // Molecular Breeding. 1997. V. 3. P. 127-136.

140. Moller E.M., Bahnurg G., Sandermann H., Jeiger H.H. A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentos fungi, fruit bodies and infected plant tissues//Nucl. Acids Res. 1992.V. 20. № 22. P. 6115-6116.

141. Mongkolporn O., Pang E.C.K., Kadkol G.P., Taylor P.W.J. Evaluation of scar markers for shatter resistance in brassicas // "New Horizons for an old crop" Proceedings of the 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Australia. 1999. P. 1-6.

142. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Methods Enzymol. 1987. V. 155. P. 335-350.

143. Munthali M.T., Newbury H.J.,Ford-Lloyd B.V. The detection of somaclonal variants of beet using RAPD // Plant Cell Reports 1996. V. 15. P. 474-478.

144. Murashige Т., Nakano R. Tissue culture as a potential tool in obtaining polyploid plants // J. Hered. 1966. V. 57. P.114-118.

145. Murashige Т., Nakano R. Chromosom complement as a determinant of the morphogenetic potential of tobacco cells // Amer. J. Bot. 1967. V. 54. P. 963-970.

146. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures //Physiol. Plant. 1962. V. 15. № 4. P. 473-497.

147. Nagaraju J., Kathirvel M., Subbaiah E.V., Muthulakshmi M., Kumar L.D. FISSR-PCR: a simple and sensitive assay for highthroughput genotyping and genetic mapping // Mol. Cell Probes. 2002. V. 16. № 1. P. 67-72.

148. Nambisan P., Chopra V.L., Mohapatra T. DNA polymorphism in Cab locus of tomato induced by tissue culture // Indian. J. Exp. Biol. 1992. V. 30. № 3. P. 178-80.

149. Nei M., Li W.-H. Matematical model for studying genetic variation in term of restriction endonucleases // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 5269-5273.

150. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E., Powell S.J., Summers C., Kalsheker N., Smith J.C., Markham A.F. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) //Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. № 7. P. 2503-2516.

151. Nicolosi E., Deng Z.N., Gentile A., La Malta S., Continella G., Tribulato E. Citrus phylogeny and genetic origin of important species as investigated by molecular markers. // Teor. Appl. Genet. 2000. V. 100. P. 1155-1166.

152. Ogihara Y. Tissue culture in Haworthia. // Theor. Appl. Genet. 1981. V. 60. P. 353-363.

153. Oono K. Putative homozygous mutations in regenerated plants of rice. // Mol.Gen.Genet. 1985. V. 198. №3. P. 377-384.

154. Orton T.J. Spontaneous electrophoretic and chromosomal variability in callus cultures and regenerated plants of celery // Theor. Appl. Genet. 1983. V. 67. № 4. P. 17-24.

155. Palombi M.A., Damiano C. Comparison between RAPD and SSR molecular markers in detecting genetic variation in kiwifruit (Actinidia deliciosa A. Chev) II Plant Cell Reports. 2002. V. 20. № 11. P.

156. Paran I., Kesseli R.V., Michelmore R.W. Identification of RFLP and RAPD markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce using near-isogenic lines // Genome. 1991. V. 35. P. 1021-1027.

157. Paran I., Michelmore R.W. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 85. P. 985-993.

158. Patzak J. Assessment of somaclonal variability in hop (.Humulus lupulus L.) in vitro meristem cultures and clones by molecular methods // Euphytica.2003. V. 131. № 3. P. 343-350.

159. Perring Т. M., Cooper A. U., Rodriguez R. J., Farrar C. A., Bellows, T. S. Identification of whitefly species by genomic and behavioural stadies // Science. 1993. V. 259. P. 74-77

160. Peschke V.M., Phillips R.L. Activation of the Maize Transposable Element Suppressor-Mutator (Spm) in Tissue Culture // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 81. P. 90-97.

161. Polanco M.C., Ruiz M.L. AFLP analysis of somaclonal variation in Arabidopsis thaliana regenerated plants. // Plant Sci. 2002. V. 162. № 5. P. 817-824.

162. Procunier J.D., Knox R.E., Bemier A.M. et al. DNA markers linked to T 10 loose smut resistance gene in wheat (Triticum aestivum L.). II Genome. 1997. V. 40. P. 176-179.

163. Qureshi J.A., Hud P., Karma K.K. Is somaclonal variation a reliable tool for spring wheat improvement? // Euphitica, 1982. V. 60. P. 221-228.

164. Rahman M.H., Rajora O.P. genetics and genomics: Microsatellite DNA somaclonal variation in micropropagated trembling aspen (Populus tremuloides). II Plant Cell Reports. 2001. V. 20. P. 531-536.

165. Richards R.I., Sutherland G.R. Dynamic Mutations : A new class of mutations causing human disease // Cell. 1992. V. 70. P.709-712.

166. Richardson B.J., Baverstock P.R. and Adams'M. Allozyme electrophoresis:A Handbook for Animal Systematics and Population Studies. Academic Press, Sydney, 1986.

167. Richardson Т., Cato S., Ramser J. et al. Hybridization of microsatellites to RAPD: a new source of polymorphic markers. //Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. P. 3798-3799.

168. Roth E.F., Weber G., Lark K.G. Use of isopropyl-N(3-chlorophenyl)carbomrate (CIPC) to produce partial haploid cells from suspension culture of soybean (Glicine max). H Plant Cell Rep. 1982. V. 4. № 4. P. 205-208.

169. Rouppe van der Voort J., Wolters P., Folkertsma R., Hutten R., van Zandvoort P. et all. Mapping of the cyst nematode resistance locus Gpa 2 in potato using a strategy based on comigrating AFLP markers. // Teor. Appl. Genet. 1997. V. 95. P. 874-880.

170. Rychlik W. Selection of primers for polymerase chain reaction. // Mol. Biotechnol. 1995. V. 3. P. 129-134.

171. Sacristan M.D. Karyotypic changes in callus cultures from haploid and diploid plants of Crepis capillaris L. // Chromosoma. 1971. V. 33. P. 273-283.

172. Sacristan M.D., Melchers G. The caryological analesis of plants regenerated from tumorous and other callus culture of tobacco // Mol. Gen. Genet. 1969. V. 105. № 4. P. 317-333.

173. Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. V. 81. P. 8014-8018.

174. Saiki R.K., Scharf S„ Faloona F., Mullis K.B., Erlich H.A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. 1985. Y.230. P. 1350.

175. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S„ Schafr S.J., Higuchi R„ Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. V. 239. P. 487-491.

176. Saitou N, Nei M. The neibor-joining method: a new method for reconstructing fhylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 406-425.

177. Schena M., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray // Science. 1995. V. 270. P. 467-470.

178. Schierholt A., Becker H.C., Ecke W. Mapping a high oleic acid mutation in winter oilseed rape (Brassica napus L.). II Teor. Appl. Genet. 2000. V. 101. P. 897-901.

179. Shepard J.F., Bidney D., Shalin E. Potato protoplasts in crop improvement. // Science. 1980. V. 208. P. 17- 24.

180. Singh R., Matthes M., Karp A., Cheah S.-C. Variation in oil palm (Elaeis guineensis jacq.) tissue culture-derived regenerants reveald by AFLPs with methylation-sensitive enzymes // Teor Appl. Genet. 2001. V. 102. № 6/7.

181. Sobir, Ohmori Т., Murata M., Motoyoshi F. Molecular characterization of the SCAR markers tightly linked to the Tm-2 locus of the genus Lycopersicon. // Teor. Appl. Genet.2000. V. 101. P. 64-69.

182. Southern, E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 503-517.

183. Stegemann H., Francksen H., Masco V. Potato proteins: Genetic and physiological changers, evaluated by one- and two-dementional PAA-gel-techniques. // Zeitschrift fur Naturforschung. 1973. V. 23. P. 722-732.

184. Stepansky A., Kovalski I., Perl-Treves R. Intraspecific classification of melons (Cucumis melo L.) in view of their phenotypic and molecular variation. // Plant Syst. and Evol. 1999. V. 217. P. 313-332.

185. Swapna T.S. Esterase as molecular marker for salt tolerance in regenerated plants of rice 0Oryza sativa L.) // Cell Mol. Biol. Lett. 2002. V. 7. № 4. P.l 111-1120.

186. Swarnkar P.L., Bohra S.P., Chandra N. Biochemical Studies on Initiation of Callus in Solarium surattense // Plant Physiol. 1986. V. 126. P. 293-296.

187. Tai Т., Dahlbeck D., Stall R.E., Peleman J., Staskawicz B.J. Hign-resolution genetic and pnysical mapping of the region containing the Bs2 resistance gene of pepper. // Teor. Appl. Genet. 1999. V. 99. P. 1201-1206.

188. Tautz, D. Hypervariability of simple sequences as a general source of polymorphic DNA markers // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 6463-6471.

189. Tiwari K.R., Penner G.A., Warkentin T.D. Identification of coupling and repulsion phase RAPD markers for powdery mildew resistance gene er-1 in pea. // Genome. 1998. V. 41. P. 440-444.

190. Van de Peer Y., De Wachter R. Treecon for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for Microsoft Windows environment // Comput. Appl. Biosci. 1994. V. 10. P. 569-570.

191. Taylor P.W.Y., Eraser T.A., Ко H-T., Henry R.Y. RAPD analysis of sugarcane during tissue culture. // Current Issues in Plant Molec. And Cell Biol., (Terry M., Cella R., Falavigna A., eds) Kluver Acad. Publishers, 1995 Dordrecht et al. P. 241-246.

192. Van den Broeck D., Maes Т., Sauer M.J., De Keukeleire P., D'Hauw M., Van Montagu M., Gerats T. Transposon display identifies individual elements transposable in high copy number lines//Plant J. 1998. V. 13. P. 121-129.

193. Van Harten A.M., Bouter H., Broerties C. In vitro adventicious bud techniques for vegetative propagation and mutation breeding of potato (Solanum tuberosum L.). 2. Significance for mutation breeding // Euphytica. 1981. V. 30. P. 1-8.

194. Vendrame W.A., Kochert G., Wetzstein H.Y. AFLP analysis of variation in pecan somatic embryos. // Plant Cell Reports. 1999. V. 18. P. 853-857.

195. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., Van de Lee Т., Homes M., Frij'ters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. // Nucleic Acids Research. 1995. V. 23. P. 4407-4444.

196. Wakasa K. Variatins in the plants differentiated from tissue culture of pineapple // Jap. J. Breed. 1979. V. 29. P. 13-22.

197. Wang Z. (C-A) and (G-A) anchored simpl sequence repeats (ASSR) generated polymorphism in soybean (Glycine max L. Merr.) II Teor. Appl. Genet. 1998. V. 96. P. 1086-1096.

198. Weber J., Diez J., Selosse M.-A., Tagu D., Le Tacon F. SCAR markers to detect mycorrhizas of an American Laccaria bicolor strain inoculated in European Douglas-fir plantations // Mycorrhiza. 2002. V. 12. P. 19-27.

199. Weber J.L., May P.E. Abundant class of DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am. J. Hum. Genet. 1989. V. 44. P. 388-396.

200. Weeden N.F., Timmerman G.M., Hemmat M., Kneen B.E., Lodhi V.A. Inheritance and reliability of RAPD markers // Applications of RAPD Technology to Plant Breeding. 1993. P. 12-17.

201. Weising K., Kaemmer D., Epplen J.T., Weigand F., Saxena M., Kahl G. DNA fingerprinting of Ascochyta rabieri with synthetic oligodeoxynucleotides // Current Genet 1991. V. 19. P. 483-489.

202. Welsh, J., McClelland M., Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. №. 22. P. 7213-7218.

203. Weng C., Kubisiak T.L., Stine M. SCAR markers in a longleaf pine x slash pine Fi family // Forest Genetics. 1998. V. 5. № 4. P. 239-247.

204. Williams, J.G.K., Kibelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski Y.A., Tingey S.V. DNA Polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res. 1990. V.18. № 22. P. 6531-6535.

205. Williams K.J., Fisher J.M., Langridge P. Identification of RFLP markers linked to the cereal cyst nematode resistance gene (Cre) in wheat.// Theor. Appl. Genet. 1994. V. 89. P. 927-930.

206. Wu K.S., Jones R., Danneberger L., Scolnik P. Detection of microsatellite polymorphisms without cloning. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 3257-3258.

207. Zhang L.H., Ozias-Akins P., Kochert G., Kresovich S., Dean R., Hanna W. Differentiation of bermuda grass (Cynodon spp.) genotypes by AFLP analyses. // Teor. Appl. Genet. 1999. V. 98. P. 895-902.

208. Yang H., Tabei Y., Kamada H., Kayano Т., Takaiwa F. Detection of somaclonal variation in cultured Rice cells using digoxigenin-based Random Amplified Polymorphic DNA // Plant Cell Reports. 1999. V. 18. № 6. P. 520-526.

209. Zacchini M., Marotta A., De Agazio M. Tolerance to salt stress in maize callus lines with different polyamine content // Plant Cell Reports. 1997. V. 17. P. 119-122.

210. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by sequence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification. // Genomics. 1994. V. 20. P. 176183.1. БЛАГОДАРНОСТИ.

211. В заключение автор благодарит Шамину З.Б., Долгих Ю.И. и Гостимского С.А. за научное руководство, поддержку и ценные замечания, высказанные при обсуждении работы.

Информация о работе

Осипова, Екатерина Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.12

Диссертация

Вариабельность ДНК-маркеров (RAPD, ISSR) при сомаклональной изменчивости у кукурузы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы