Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

В -ГЛЮКОЗИДАЗЫ ГРИБА GEETRIOHWIS CAADIDNE ЗС

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "В -ГЛЮКОЗИДАЗЫ ГРИБА GEETRIOHWIS CAADIDNE ЗС"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ШОХЩЩ им. А.Н.БАХА

" J2é V¿9 На оравах рукописи

КОЗЛОВСКАЯ Дамара Николаевне

6 -Г.ШСОЗЙДАЗЫ ТРИБА Geotriohuns candidas УС

оиедиальвссть 03.00.04 - йиологкчэсяаи химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата Зкологичеоких наук

Москва - 1980

Работа выполнена в лаборатории ферментных препаратов Института биохимии им. А.П.Баха АН СССР.

Научные руководители: д.tí.к., профессор А.М.Безбородсв

Официальные оппоненты:

д.б.н., профессор Л.Г.Логинова д.б.н., ст.н.с. Н.Б.Ливанова

Ведущее учреждение: Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт Глаямияройиопроиа СССР

Защита диссертации состоится q г. в

Хг° чао» на заседании специализированного совета (К 002.96.0! по присуждении ученой степени кандидата наук в Институте йио-хнмйи ии. А.Н.Баха АН СССР

(II707I, Москва, Ленинские проспект» 33, sope. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке бЯОЯОГЕ-чеспой литературы АН СССР (Ленинский проспект, 33, корп. I).

К.Й.н., СТ.Н.С. Н.А.Родионова

1980 г.

Хченый ^ г" ггретарь

спецу,.

; . -. • , "оо;

совета

И.И.ИолчаноЕ

ОЕЩЯ ХйРАКТЕВїСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблему ♦ Проблема ферментативного расцепления цвллшоэы в настоящее время является весьма важной я связи о возможностью использования целлгаозы отходов промышленности и сельского хозяйства с целью получения глюкозы, микробного бедка, некоторых химических сое,;инений и энергии.

Во многих странах интенсивно ведутся работа по изучению механизма действия целлшолитической системы формантов ки«ро--организмов и разработке технологии прошишенного псахаривания целлюлозы с применением всех ферментов, участвующих в процессе превращения цаллшозы в глюкозу.

В последнее время значительно возрос интероо исследователей к множественным формам 0 -глшозвдази (К.О. 3.2.1.21) и особенно к цаллсбиазам целлкяолптических грибов, так лак от их содержания в препаратах целлюлазы существенно зависит интенсивность и степень расщепления целлюлоза. Известно, что в резуль- ' тате совиестного действия эндо-1,4- р -глюханаз в вкзоцеллобио-гвдролаз образуется целлобиоза, которая является ингибитором .9 тих ферментов. 0,щако действие некоторых эндо-1,4- р -глша-наз стимулируется в присутствии це&добиозы.

Было показано, что путей усиления биосинтеза £-глюкоэи-дазы (целлобиазы) можно увеличить цагшололитическую активность ферментного препарата. Таяиы, сбр&зом,. целлобиазц в настоящее время рассматривав? как своеобразные регуляторы процесса ферментативного ос&харздания целлюлоза. В связи с втіш важно иметь представление о количественной содержании (5—глюкозндаз а промышленном ферментном препарате, а также о физико-химических и каталитических свойствах £ -глшозидаэ.

Цель и задачи исследоганая. Цель» настоящей роботи явилось изучение множественных форм 0 -глшозидазы в промышленной ферментном препарате "Целлокаадин Г Юх", полученной из фильтрата культурадьной жидкости цедлшозоразрушащвго гриба с«о-їгісЬиа оапзійиа ЗС.

В связи с втиы перед нами стояла следушае задачи: - изучить состав множественных форы £-глвлозидаэи в промышленном ферментном препарате "Целлокандин Г 10хя, подученном из фильтрата яудьтуральаоЗ кидзооти грШа беоігісішп оая-

Иаучузя йй'.-втг» I &>ся. опд, Лі^ка езкшз. { «и. на, К-^Тккриеч |

йісіит ЗС;

— изучить изменение состава множественных фори £ -глпкоззда- . эы в фильтрате кульіуральной жидкости грийа Саоігісіїшв оадіїїаиві

в процессе его роста;

— выделять индивидуальную р —глюкозпдазу в гомогенной состоянии;

— изучить физико-химические и каталитические свойства виде** ленноЗ р-глюкозидазы.

Научная.новизна работы. Изучен состав и некоторые свойства множественных форы р -глшозвдазы в промышленном ферментной препарате "Целлоншушн Г ІОі1", полученной из фильтрата культу-ральной жидкости деллщозораэрушающего гриба, сеоггюьшп сап-иійшв ЭС. ■

Было показано, что состав и соотношение множественных форм Р -гдюкозидазы изменяются в др одессорос та гриба. Получена ян- . дивидуальная р-глюнозидаэа в гомогенном состоянии. Изучены физико-химические свойства отого фермента; определена ыолекуляр-, шй вес, коэффициент седиментация, радаус Стокса, изоэлектри- ! : чесная точка, аминокислотный состав, содержание углеводов в мо- і лекула фермента, состав углеводного компонента молекулы, Изуче- і ш также каталитические свойства выделенной £ -гдюкозидазы: определены Ку цо отношение к целлобиозе, п-китрофенил-0 - О - І гдюкопираяознду и Гснтиобиозе; определены величини констант ин- ; гибировакші гомогенной ■ р -глюяоэвдазн Ь-глснопситктоном ! и глюкозой; изучено действие Э-глвкозщцзы на цаялоолигосаха-риды различной степени полимеризации, дисахарядын гликозиды с і разними типами связи. Обнаружена способность выделенной 0 -глюкозидазы к трансгдикозшшрованию.

Практическое значение работы. Результаты исследования соо-тава множественных форм /Э -глюкозидазы в промышленном ферментной препарата "Неллокандин Г Юх" из гриба ввоігіоьит оввйііиїв І ЗС, изучения изменения состава множественных фори 0 -глшозида-&ы в процессе развития культуры ітиба, а также результаты исследования фкзико-хшвческих и каталитических свойств выделенное 0 -глпяоэиДаэы помогут расширить представления о механизме действия всей целлшазнои оиствуа, а также «017т быть полезны при разработке тромышленного процесса ферментативного осахаривания целяшозы. Выделенная нами /5 -глюкозидаза может быть попользована дня изучения строения гликозидов и других

соедаквяха.

Адробадия раОпта. Результата нсследованзя долохеш ва Все-соязном симпозиуме "Наддзддази, ях esolCTsá в применение" (Цосква, 1977), на Кевдународноы сихпазЕууе по йиопревращеншэ аЕДДВлазР-содррхасаг материалов о эссргэт), хныжческяе соедененгя в шкроО-еыЗ бегок. (Леет, 1977). на Втором Всесоюзной соаеяаядга do ферментам изгрооргвнигнов (Мгнся, 1978), на Всесоюзной сшшозиуыа "Метода подлегая шссзоотаг;ениых ферментов" (Вггьавс, 1Э73), на Сзнпсзиумд когодц тчегнх "Энергетика к углеводяаа оймен у мшгроорганизмов" (itea, 1979), на Третьей Всесосзной яоаференгсп "Метода получения а аяасгза Сисхиагчесгз! реаятЕтов" (Слайде, 1979), на Втор о л Каздупарсдаом cavxoaayiíe so Сзоарезраденги а бгсхшшчеоаой зЕгзагриг <Делз. IS8Q).

gycLTzragr^. Со получением результатам яооаеяоэааая опуйая-ковено 9 раб«.

Со^етшяие а иобт.ем работы. Дассертасяоняая работа включает ггегеаае, ойзop датерстури, описание ¡¿атердмов в ыетодов исследования, взлохсназ пссзгсензнх результатов.а шс обсуждение, вывода в ссазск цитируемой лдтература {I5S ссилон), Работа издсжека на 143 странзсгх иашшгсшсЕО!^) текста, ажлтаает 9 тайлга я 37

pECyBSCB« V -

ЗШЕРИИ ЗНТАДНЦЗ ЧАСТЬ Материалы д метода исследования

В работе аспахьзгвадп? ферыентныа препарат "ЦеллокЕндзш Г IQx", подучеян^й а заводсяжх условиях путей, осаздения этанолои фильтрата яультуральноа жадности ipatía Geotrtcbum oeadidun ЭС (4 r/r ) /5еШ£ЯОС£а я Др., 1973/. Гриб üeotricímncandldurajJC зырс^явазя тахже а яалбаг е& качаляе ера сдорссти вргцения начадил 180 od/юн при 30° а теченсс 40, 72, 96 часов. Для выра-ocasszs гриба гспользогалгсь среда, содержащая свекловичша хоы 2i. оешшше OTpytís Кз2яо3 - O.I5Í, С»н4)г304 - 0,15$, E22Í04 - 0,1?, MSS04'7 Нг0 - 0,05$.

В работе использовалась сяедухпде субстраты: цадлобдоза, с'.» oí -трегалоэа, рутин, феннд- ß - D -глшопиранозкд, катил-oí - в -гсдактолираноэид, с-нитрофенцл- ß - в -юткодяраяозкд ( Cheeapol, Чехословакия); гептаобаоэа ( Ferak, Berlin); мальтоза ( Ibe cole&m Bell Co., Jíorwood,ÜSA); Лактоза ( Sage¿a ¿.с,,

Berlin) ; салицин ( Cahlbaum, Свгвьау ); софороза, D-глюноно- ; -(I —5)-лактон, 2-0-ыетил-oi - D -ксилозид - любезно предоставлены А.И,Усовым (Институт органической химия им. Н.Д.Зелин-сжого АН СССР); ланинариСяоза - любезно прелоставлена В.А.Тиуво-зог ii И.В.Зайкиной {Институт бЕсгаааш им. ¿.Н.Баха АН СССР) j фенил— р — D -цедлобиоэвд е фвнид-атил- fi — D -глюкопиравозид и дельтознд любезно предоставлен» А «Р. Гусевой и В.А.Пасешютенко' (Изститут биохимии им. A.H.Eaia АН СССР); п-нитрофеккл- oi-D -глхяоаирааозид ( Koch-Xtgbt Laboratories, LTD, Coinbroolc, Воска, Англия); п-явтрофеиия- р - D-ксююзид, п-игтрофекжд- £ - D -га<-лаятопиравоздд, п-нитрофенп- р — D -арайиноэид, и-кятрофрЯЕд-р -L -арабЕНОЗИД, п-нжтрофенвл- р - L-фУКОЗИД, П-ЕИТрофеЕЕЛ-Р -D -кгокуронвд, Е-Нятрофеыил- о< -ь -арабивозвд, п-нитрофв-ндл-oi - l-рашозид, п-нитрофеннд-d - ь-галактоачранозид, п-нвтрофевил- d -D -данноэид - любезно ej здоставлена Г.Я.Влдер-п&Йном (Институт медицинской в СиологтескоЙ химик АМН СССР). Цеглосявгосагарвди получали по методу Киллера /ЮНег» i960/. Арабоглскурсноксилан я ламинарии били получены на кафедре орга-нлческоЗ xauzz Одесского Технологического института пнцевоЗ npi>-шадепиостж км. М.В.Лононосова, возглавляемся проф. V С.Дудкя-еыи; Пбктовая кислота - среоарат Ол айнского взвода хкмреажти^ов; jrp&xwE растворима - препарат Заопенского завода; натриевая соль карбокскыетилпеллпхозы - коммерческий препарат фермы Кось-Light Laboratories, LTD, Cainbrook, Англья,

Активность целлобиазы определяла по расцеплению 0,2^-ного раствора целдойиозы в ОД И ацетатной буфере рИ 4,7 за 30 мин при 40° /Родионова а др., 1971/. Активность арал- j5 -глюкозидазы определяли по расщеплению 0,001 U раствора п-штрофення- f - в -глпноцграяовада s 0,i U ацетатном буфере рН 4,7 ва 10 мин при 40° /кмЪу et »1., 1953/. За едвнипу.активности сеххоАиазы а арал- ^ -глюдоэядазн принимали количество фермента, которое расщепляет I ккН субстрата за I ьзтуту при 40°. Активность Cj фермента (К.Ф. 3.2.1.91} определяли по расцеплению 50 кг обезво— ценного хлопкового волокна в 0,1 U ацетатном буфере рН 4,7 на I час при 40° /Фениксова в др., 1975/. За единицу активности Cj фермента принимали количество £*ериента-, которое образует X иг глжоаы в реактт-БОЭ сиеси за I юн при 40°. Активность »ндо— 1,4- р -глшаиазы (К.Ф. 3.2.1.21) определял* вискозяметрнчеегнм методом по ешкешт обратной велгчнна относительной вязкости

0,3^-аого растает® натриево! с ста гарб^ксиметшщалдшозы з 0,1 U ацетатной буфере рН 4.7 за Ь хш грк 40°. За еданлцу аятшшостк эндо-1,4- £ -гл ланазн npzHKisa-si такое Еоличесгво фериезта, которое шзвзаат возрастала« odparsc2 залатана отяссатальной вяз-яоегн Hi* еданяцу sa I »си грл 40ч /Родионова з др., I96S/. При огреятдеяг... ¿ерюэзтетиЕно^. едтааноети по отаошеннг в араболчику-pea©itc!ucas7, лакжнарнау, дентовой яссдоте, pacwcpstMowy ярахш-натргевой ссда яарбохсг !етагцшиш:огн реапионная с^всь содержала I из 15-еопз расторг, субстрата, I кг 0,02 У гцзтатаого буфера рЯ 4,7 И 0,1 us 0,025^-його раствора фермента, Инкубашо. сроводаля а те^еяав 67 часов пря 40°» Содергзкие Еосстаиаыгавав-яаг Сахаров 2 реакционной сиеса определяла перед началом инкубация z сссде дрсгеденгя ишсу^апЕЛ го истоку Шокодь!»-Иеда.сока / Sclsoa, IS44; scmogyl, 1945; Soaogyi, 1352/. СнуэдеЛЯП rasze ^йравататаЕыур активность со способности снахать вязкость КйрйогежгстлщдаЕлези. Дгз шаыакзк фернеят&тюноё ак-a oTH.aeazz Е^ддосдзгосазарадсэ гнк/баяиоаная сиеоь со-I t.* раствора фермента в 0,1 М ацетатной буфере рН 4,7 (2 х 1СГ3 кг фермента на йегяу) я I ыл 4 я Н раствора су Утрата е 0,1 1! csct&thou буфера рН 4,7- ИагуСашв срогодагд в кчеиаз 30 кгн ара 40°. Содержаess гдхзок: в ре акцношюй ембел oej-se&jj-хг глгяоэ с cztt-дазныя иет^чем /Еербу за а др., 1970/ * Агтгвность фермента Ei^arsJn; s иг образовавшейся гжскоси за юнуту на иг йедха £ер«езта. •

■ Ери ссределенпа: фера^нтатланой аятавности по откогензю к дгеахь^вдаа анкубап^ощая сь'есь о одержала I 0,0002%-тто раствора $epireHi2t I мт 1£-ного раствора субстрата (0,35#-кого р£Стзора лаигнарайаозк) z 0,5 их 0,25 К ацетатного буфера рЯ 4,7. Ияяубгцкю проэодгля прь 40° в течение 30 Содерхазгс глгзозы определяясь глисозеокидазням методом /Цербузш а др., 1970/.

Определение ажтавпостз ой отнояевнюг гмяатрофенад- 0 - D -гахяозвдам, — /J - L -гяягсозедам, -oi — d -гхакозвдам, — at — ь - . гдняозндам дроводаяд следа men образои» Реакционная смесь содержала 0,285 о Ы субстрата ж 2 х IO"3 ыг исследуемого ферментного пр»сарата s 0,1 И ацетатном €уфере рЯ 4,7. Иакубацаю срозодкдя в теченге Ю liZKyT при 40°. Количество образовавшегося п-чатро- . фещэяа определяла по калибровочное графику /Satj et al., 1553/.

Ера определении ферментативної агтавносгв пэ отношешоз х метаж-oí- и-галактошранозиду, 2-о-Метві-OÍ - D-Есагеваду, рутину, сашпдану, фения- d-нтвопарааозик?» Фєевї- d-пелдобиоэиду. фенил-этил- £ - d-гдвкошранозгду реакционная сыест. содержала 7.5 mil субстрата, 2 х 10"^ кг фераента в 2,5 кх Q,I U ацетатного буфера рН 4,7* Содержание глюкоза определяли гсажозоовськазшм «етодом /ЩерОухен а др., 1870/. Алгжвеость фермента во всех случаях трахеита в ккіі расцепленного субстрата за 1 ига npz 40°.

Продукти гидролиза стероидного гднвоэида - дельтозида оцре-ДЄЖ2ГН методом тоняослойяой хроматографии на пдастакжаї с скдж-яагелем is 5/40 (Cheoapol, Чехословаквя) /Васешнвчевдо, Гусева, 1975/.

- Ире выделении ^-ппшозЕдаз аз ферментного препарата "Целлокавдзш Г IGx" ірийа G. oaaaidoa зс жстользсвата метода: осавденве етан одо«, гєль-фильтраідая, жонообменная хроматография, изоалеятрлчееяое фокусирование. 30 г ферментного препарата "Целлолащда Г 10 х" растворяла л .300 их дясишшровваной золи я проводили осаадениэ зтанолок, охгвжденаш до -20°. Гелъ-фальтралет провішиш через сефадекс G-50 (5,2 х 38 си) (РЬат-: maeie. Fine Checioale, Вветая), Ионообменную хроматографию проводи* аа еефадексах SP с-50 (5,2 X 44 см), ДЕ1В А-50 (5,2 х 40 см), ДЕЛЕ А-50 (3 х 25 см) (Pharmacia Flue СЬешіе., Швеция), Гедъ-хроиагографав проводами э колонке с се$адексом о-гоо {1,2 х 75 с»)' (fbarsaal» Pine Chocleáis, Евеякя). Изоаяектрїчесное фокусирование проводили в интервалах jfl 3-5, 4-6, 5-7 s акалиТанеевой всаовха oóieatou ЮТ мх ( Ц£в 8І00-І) в в црепарагпваой колонке объемом 440 кл ( lkb 8І00-І). КоЕцектраякз аифохипов -Ií- В качестве стабилизирующей среда кеподьзовахж гредиеят длот-востн сахароза от О до 40%,

При нзучешее изменения состава р -гпжогвдаэ в фильтратах * культуралъной ищяоетк гриба c«otncbus caadidme зс в течение 49, 72 и 9S часов изоалектрнчвекое фокусдрованве проводили в интервалах рН 3,5-9,5 ва шіавтзиках о аярыексои р 10 (200 кеш) ( Re ел al у Венгрия), В приборе МульТНфОр (ííultipbor«, leb, (Швеция).

Частоту препарата £-глшозндазы контролировали методом електрофореза в полнакрвкекаднои геле (ШАГ) в щелочной среде

дра pH 6,9 / Darla, 1964f Ornetela, 1Э64/, à Tarse О црисутст- ' sua додешлсульфата натрия ( SDS ) и ß -меряаптоэтанола / ъеЬвг, Osbom, 1969/, методом седиментации в ультрацевтрафуге splnco модель Е ( Вескшаа, США)снабяенной Shllren -оптическое системо!}; методом галь-хроматографии на сефэдексе с-гоо и методой изоалектричесяого фокусирования и интервале pH 5-7. Молекулярный sec выделелноЗ 0-гдюкозидазц определяли методами гель-фпльтра-цяа через сефздекс G-асю / Andrew», 1964; Детериан, 1970/,■ седиментадаонного равновесия л ультракентрифуге /Боувн, 1973/, алектрофореэа э ПААГ в присутствии sus и ß -мериаитоэтанола. Молекулярный вес также рассчитывали на основании данных аминокислотного состава, определенного ка ашиокислотноы анализаторе фирми BitасЫ EL A3 (Япония). / Moore, Stein, 1954/. Содержание триптофана определяли спектрофотома трическим методой /меавіпво,. Uuowra, 1972/. Радиус Стокса молекули ß-глюко-зидазы определяли по методу Эккерса / Acker», 1970/. Восстанавливающие сахара определяли по метод? Шомодьи-Нельсоно. / 1944; Soiwfijri» 1945; soraogyl» 1952/. Содержание глюкозы определяли глшоэооксидаэвим методом /Щэрбухин и др., 1970/. Содержание углеводов в иодекуле ^-глвиозидазы определяли онтро-яовым методом /Roe, 1951/. Белок определяли по методу ¿оурз /Lowxy et «а., п сссятр-^итиетрсчеока, иэнорян погло-

щение при 280 1ш,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССШОЕАІШ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучдн^е состава '„-.локестаеннцх форм ß-глюкозидазн ГРиДа Ceotrlchuo caodidttin ЛС

Показано, что о екстрацеллшярной ферментной система гриба a. eaaâiâua ЗС содержится несколько мкожествешшх форм р -глюяоэидазы, различающихся по физико-химическим свойствам ж субстратной специфичности. Эта данные вполне согласуется С фактами, иввестны^га аз литературы / Legier, ISS7; tJmezurüe, І97І;ща1в, Becker, 1973; Budlok(Elbeln, I973¡Bershen, retter-

eeon, 1974; Deephaad« et el., 1978; нігауляа et «Д., 1979{ Родионова н др., 1976/. Множественные формы ß-глшовидазы 0шш обнаружены при фраквд оішров аняи ферментного препарата "Цедлокандин Г 10х" по йредставленкой схемо» -

flçeua видаленая Р-ргеиоэаца? различной сдуниДячнодтя

Препарат rpsöa Oestrlehttm oandldutn ЗС (Цаямйандин Г 10 х")

Се<$едево * a -SO.

Сефадеко

Экдо-1,4- ß -глюкаяазн • ß -глюдоэидаэы (алютя всхояшш буфером)

-fe* Изоалектричос5ое фокусирование в интервале pH 5-7

Сефадекс й-200

$ -гладо^Зидам! С^фер-о pi от 5 до 7 ^мент

Cj феуиент X в-глькоэи-дазы (влшия 0,2 МАШ я исходном буфере)

І

Изо$локтряческое фокусирование в интервалах pß 3-6, 4-в

I

Сефадекс Q-200

Р-глшозидаэн о р! от 3 до 6

Ст-фер-Аменты

Р-глЕкоэидаэа с pi от 4 до б

Фракционирование но данной схеке, • вклотаздой методи голь-фгшьтрацкх черев сефадекс в-БО, ионообменной іроуатограіет на оефадеяов ДЕАЕ А-50, кзоолєктркческого форусяровация в интервалах р0 3-6, 4-6» 6-7 а гель-хреи&тографет черев сефадвко а-200, дозволяло вшшигь ß -глшозидази о пэозлектрнчеоквыи точками в интервале pH от 3 до 7, йи определен водевуляршй вео выделенных ^-глюяовтааэ* Реаультата изучения востава traoxscr-венвмх форы ß -глжоэвдаеи в ферментном препарате "Цедяокан-двн Г ІОх" гриба овоtriohne caedіdun зс , & такає шх суб. отратной специфичности спндзтодьотвт»? о том, что в ферповтнам

препарате "Цеддоявядин Г ІОі" содержатся несколько & —глехозя-даз, различаг^ется по ігохесуляркону весу« жзззлектуическЕм точка». Наряду о -іхгасЗЕдазамя» сяособпзиі гждролязоэать как даллобиоэу, так а п-штрофенил- 0 ~ D -глхяоахранэзкд, Скла выявлена ¡9 -глвкозкдаза, способная расщеплять только днсахарддн (целлобиоэу, гентпобиозу, лііпшаркбнозу с £-1,4-, ¿3-1,6-, •/З —1,3—связями, соответственно), а также & -глгаозддаэа, гид-рояизуюсая только п-іштрофевгл- 0 - D -глюкопираяозжд.

Било изучено изменение состава каожественшх форы 0 -где-когидаз в процессе развития культуры гриба G»otrlcboe «endlduo при помосд метода Езоэлектрического фокусирования ва пластинках в гриборе Цультафор. Показане, что состав в относительное содержание кеожєствєнеях форм . ^ -глюкозидазн а Еультурагьной сидкоо-тн гргба изменяются в зависхкост* от продолжнтельвостш его вирь-смагм. - Так, если £ -глюкозидаза с pl 3,9 преобладала в фильтратах культурихьнса жидгзстз гриба при 48- к 72-часо: он кір сдавайся, то после іарг^двеяия гриба в течекже 93 чассв этот фер-«знт э иультур&йьпва жидкости ае обнаруживали. & -глюкозЕдзза с pl 5,9 присутствовала во всех фш>т?атзх кульгуралькой жидкости аезазисиыо о? фазы роста культуры грхба.

Вяделеаке g-глгкозгдзз» ж исследование гомогенности

В таблице I представлена результаты очистки Э-глгжозидагы о pl 5,9..Э-алы очистки еглзч&эт оссхденае этадалом, охлаздеэ-шш до -20°,' гелЪ'-фальтрадзт через сефадекс SP с-50 . (гнгере-сущая нас Р-гдюзэзЕдаза элщравалась в условиях градиента рН: 0,01 М босфатзг-шп^а-нЕй буфер рН 4,25 - в смесителе я 0,01 И фосфатно-цкзр^ткнг буфер рН 5,8 - в резервуаре) (ржо. I); ионообменную хроматографе» на сеіадекее ДЕ1ВА.-50, причем глскоэкдаза с pl 5,9 элшрозагаеъ при помощи градиента гоино2 сели: 0,1 ы ацетатный буфер рН 4,7,содержаний 0,2 к я*с1 - в резервуаре, и 0,1 Ü ацетатный буфер рЯ 4,7 - в сыесжгеле; гедь-фгагьтраци» через сефадекс &-200 .

В таблице I представлены результате очисти но цедлобжаз-иог z прпл- /3 -глюлоаидазной активностям. Удельная активность шсояо очищенного препарата £ —гшжоаидазн по сравнению с исходной активностью возросла примерно в 64 раза. Выход фермента составил около 9SE по активности и 0,ЇЗ% по белку. Относительно . нкзкча процент выхоДа 0 -глхяозядазы объясняется те«, что г

Tatagua I

Результата отаотка 0 -глисозвдші ijadaoaadidua зс

Активдосїь /ищь Уд. активность Отепень очистки Bui од ^-глскоэи-

козндава (едЛ Э -глшозидазч fi -мвкозидаэн даэц в % от исход-

Этащ Обцкй (ед/иг <іема) по активности в нов активности в

очисига ' белой' 1 ' отношении отношении.

(«г) Г-Г*' ЩФГ""' г-г ЩГ Г-Г ШФГ Г-Г Ш4Г

IfcyóHll препарат (ЗОг/ 300 мл) 4800 5000 II900 1,22 2,48 I I 100 100

Осаждение этанолом х V/T ) 1700 4080 8300 2І4І . 4,9 1,98 1,97 69,7 69,9

Сефадеко 0-50 1500 3900 ■ 7380 2,6 4,92 2,13 1,98 66,6 62,2

Сефадбяс ЗР- С-50 градиент рН во 1850 4460 28,5 60,5 23,75 27,40 31,9 37,6

Сефадвяс дшГа-so 1>радиент ионной силы 11,2 . 650 1467 58.0 130,67 48,33 52,36 И,1 12,3

СеФадекс С-200 5,9 454 1060 75,6 159,6 61,96 63,44 7,0 8,9

- п -

Номера Додеідеї

РЯо. ,1. Ионообменная гротатоірафиа ва сефедексе S? с-50.

Размеры колонки; 5,2 і 44 cu. Объем фракшга -15 ш. (—)логлочензе цри 260 ни; (---) цедлобиазная активность; С-—-) активность С^ фермента; (-*-*-) активность энд0-1,4-/3 -глгканазы; (•*•*) активность арая- ß -гагкозгдазы; (-х-х-х-) градієнт pH; фракции, которые сливали, обозначаларимскими цифрами.

фор^зятвои препарате гриба, кая обнаружено в результате изучения его со отава, содержится несколько 0-хзткозадаэ, а ш изу-4BJ3Œ1 ОДВ} S3 EZ^t

Показано, что выделенная ß -пшгозидаза бала гоиогенпой црн электрофорезе в ПААГ прн pH 6,9, при электрофорезе в ШАГ в присутствии ses и ß -меркалтоэтанала (рис. 2), при узирецентрифугировапяа (рис. 3), црн гель-фоьтрадии и изо-адентраческом фокусировании в интервале рП 5-7» Подученный ферментний препарат ß -глюкозидазы не обнаруживал ферментативную активность в отношензн лакинарнка, арабоглюкур оноксилаяа, пектовой кислоты, натриевой соли карбоясжетЕлцйляадоэы^краййала.

Pzc., 2. Электрофорез в ПШ* Рей. 3. Седи*г*нтогремва Лвысокоочвденной ß - високоочищєекзі

■ глгкозилазы в прнсут— ■ £ -глхЕозЕдаза

ctbzz sds.

•-у■¿изиго-х^вачвагее сзгйства р-гожсаядазн с рТ 5,9

' Цмекул£рші2 вес выделенной камг ß -глюяоггдазы, определенный методом г&ть-фигьтрадяи через сефадеяс С—г 00 , соста-вгг 2000000, разеус Стенса, огтрсделеной истодом ежкераа, соста-вгд '49. ¿^'значение колекуля^нэго reaa ß -глмгозгдазы, определенное' методом седзггнтационного анализа, coctsez-o 203 OOQ, коэффижент седЁмеаташи - 9,8 s . По дгннна ультрадестрифуга--роваггя в присутствен 1% ' sds . колегудярный вес ß -гяшозяда-SH равен 114 ООО, э 6 M іуаишшн-хлориде - 109 ООО, в 8 M мочевх не 48 ООО. Зііаіекае -гголегу^ярного веса ß —гкшозидазы со электрофореза в ПЛАТ в присутствии sas - IIS ООО. E«z раствор гомогенного препарата Э-глекозедезы каходкея в теч-гае 3—4 недель при 4°, то при повторной геяь-фиьтрадки через сефа-делс G—200 кроме основного лига ß -ггккозядазы (мод. вео 200 ООО).обнаруживали з отдельный пик ß -гяжозкдазы, которому соответствовал молекулярный вес 100 ООО.

Вопрос о том, состоит св молекула, Евдглепно£ нами ß-глокозкдазіі с pi 5,9 z молекулярным весом 200 ООО из двух яли .четырех судьединац (с молекулярным весом 100 ООО или 50 ООО

- ІЗ -

каждая), недостаточно яоен, Однако мояно предполагать, что ß-глпкоэидаза триба ово tnchuoi eandiduu ic является шгагомеріша (Золкой как Я ß-глюковидаэа Botrjodlpltrillü tbeebroma« / Ои»еа-rik*t I97S/ в 0-ксидозидаза из шШш ршпііця / cl«js-eeaest al., 197?/»

Анадиз аминокислотного соотаза виделенноі ^-гльаозадозы вз ферментного препарата гриба Oeotriobua caadidua позгодзд виявить незначительное преобладание кислых аминокислот, шшд > глицина, что такие характерно для аминокислотного состава дру~-ГШС ß -Гдюноавдаз /bergbeo» Fetter scon, I3?4| Cosphenda et al ., 1978} Eixejama it al., 1979/. Преобладание кислых аминокислот а мсдедуле ß -глскогидаза, как правило, коррелирует с изо-електричеокой точкой, о о отв втству пц ей pH < 7, а также, по-вгллмо~ К7, обусловливает на»чае карбоксильной группы в активном центре фермойта, что в свою очередь определяет суСстратнуп специфичность 0-гящоаидаэ /legist, 1976; Legier, 1977; Legier,І970* №»*ит1)се, 1979/*

Виделепная ß -гллкозидаэа является гдикопротешои. Содержание углеводов в кол акуле ß -гливозидаэа ооставляло около . По предварятвлькым данным в состав углеводного компонента молекулі ß -гяпкоэкдаэи входят гдгаозя, майнова с, по-ввдшоыу, глввоаашшн.

Некоторые каталитические свойства ß -глсрозидазы о pi 5.9

Дія выделенной ß -глишзидаїш о модекудяршлм весом 200000 были определены значения Км по отношению к л-вятрофенил- ß -D -гижопиравозиду, «ехпобиозе и гентяобноэе - 0,34 mil, 2 ™>5 л 2,8 toll, соответственно. Шла определены величины К в до отнопеан» к н-еитрофвнзи- ß - D-гдш опирано эиду н цедлобиозе (0,25 »8 я 0,5 n Li, соответствен») для каталитически актьвмов формы р-гдюкозадаэн о молекулярний песси 100 ООО, которая бала пожучена прн гад-ь-фкльтрядиа через оефадекс 0-200 после предварительного хранения гомогенного древарата Э-глшоэидааы с мої* ввоон 200 ООО при 4° в точение 3-4 ведень. ß-гавяоавда-за о молекулярснм весом 100 000« по-видимому, образуется в рэ-»ультато диссоциация ß -гдвкоэвдазц а иалекулцртш весои 200 ООО. Такие кав н я случао ß-глюкозадав« us Achntina ьо-bfttlAR / Uaezurlt«, 1976/ no uepe умзвьшегаш ОДОШІООТЯ молекулы ß -глшозадова Oeotriebuo candlüun 1С иозрссгаот

сродство фермента к субстрату»

Еио также показано, что- D -гл!жоно-(1 —т б)-дакток явля^ егсясильным кою^урентшвд ингибитором (Kjel.SxIcrSl), тогда как глюкоза является неконкурентным ингибитором ß -глюкозадазы (Kj= 6х10~3М).^Пси!у11енные наш данные находятся в соответствии с фактами/ установленными другими исследователями /Etaert, Brown,1977;' X,«gler, ; I977;Brwcbmann, 1978; Herr et al .1978; Umesur ik«, 1979/.

Сведения, ииепкиеся в литературе относительно субстратной сиецифгшоотн ß -глшозидаз, свидетельствуют о том, что наряду о ß "Гдшозидазши, характеризующимися широк ой специфичностью, встречаются ß-глюкозадазы с относлтодьно строгой субстратной специфичностью.Существуют ß -глюкозидаэы, которые кроме ß-глюкозидазной активности способны проявлять другие активности, например, ' ß -галактозидазнув, ß -ксшюзвдазну» а др. /ве вхи-л»е et'el., I976;Grorer, cuehlej, ; 1977; Дпанов и др.,1977/. Обнаружены также ß -глюиоэидазы, которые расщепляют таяысо ди~ сахариды и гликозида, содержащие р-о-глюкопиршозил / Bndlok, Б1Ъ«1л, -1975; Родионова и др., 1977/, а также выявлены ß -гаюкозадазы со строго субстратной специфичностью: целлобиава и арил- ß -глюкозидазы, расцепляющие или только цаллобиоэу или п-нитрофенжл-ß - в -глвкощраиозгд /маьайеуыа, Eberh&rt, 1964; Bucht, Eriksson, 1969; shuag et al., 1977; Родионова я др., 1977; Рабинович, 1977{Румянцева, 1978/. Нами была изучена субстратная специфичность ^-глюкозидазы гриба eootriohun oendi-&ив.эс о pl 5,9 и молекулярнкм весом 200 ООО. Еияо установлено, что 1фп действии выделенной ß-глвжозидаза на цедяоадигосахарн-ды скорость расщепления возрастает о уменьшением длины цепи субстрата (табл.-2), цри втом глюкоза бшга основным продуктом реал-

НИИ* . Л

- . Исследована способность ß-глюкозидаэы о pl 5,9 рас-чеалять дисахариды с разным типом связи. Результаты исследования цредотЕВлеаывтайяицэЗ.

Цри изучения действия ß-глюкозидазы на дисахариды (табл. 3} было установдено, что фермент расщеплял педлобиозу ( ß -1,4), софорозу ( ß -1,2), лаыинарябяоэу ( ß -1,3), гентиобиозу ( ß -1,6), причем легче всего расщеплялась связь ß -1,4, несколько медленнее расщедляиись связи ß -1,3 л 0-1,6 и труднее всего

Табстпа 2

Действве fi —юткозидавя ка Geotriihua ceadldu* на падло— одхгосохкрвдв

Субстрат Степень пода-ыеризади ■ Относительная скорость расвепдеявя '

Целлобаоза C-tG; (2) IOO

йсдлотрвоза G-4G-V0; О) 33,3

Дедлотетраоза (fc) 33, б

Пеллогексаоза &-ÍG; О) 23,6

Скорость расщеокекия цеддобиозы, шрвхеину» s иг образоьвь-ще&ся глвкоза за mzh на кг белка фермента дрштемали sa 100.

Таблица 3

Расдепленяв дисадарддов 0 -гахЕОЭЩсазой вз граба »«triol«* ошДзДпк ЭС

Субстрат Связь в да-сахарвде Hzif раскепляеиого субстрата в шсв

Софороэа 0,022

Ладоварабхоза р ,1 — 3 ОД 06

Пехсобвоаа - Ь Д —• < С, 144

Гектвобхоаа 3 Д — S . 0,056

oí» c¿ -TPereJtosa Ы ,1 I 0

Ывльтоза oí Д — 4 0

larrosa Э д — * 0

расяешилась связь 0 **Х,2. 0 -гльворкдаза не расцепляла ei, с( -трегалову ( oí-1,1), мальтозу ( oí-1,4) * лактозу ( -1,4), я состав которой нходит гдгкоза и галздтоза. Подученные данные свидетельствуют о высокой специфичности выделенной 0 -гдто-видаза по ■откоюепип к 0 — D -хзоавопвраноаижу.

При расщеплении 0—глввозвдазой разлячшгх глвкозкхов с J5-D-, В- ь-, ot- D-, oí-L -пшамж евявя (табл. 4) бало установлено, что фермент распводях тсдько те гявкозкдв, в о состав которад входил ь —гдисоинраяозпл в не расцеплял п-шгг-рофенлл- Э ** в -галадтопираиозид, -арабиногвд, —глакуронад.

;V'\ , - 16 -

ß -Ешгоаздгва галсе se расцепляла гджнсзндз с D -, ь-\ ß-ъ -таи,?« сгтен. .

ТаДдяка 4

Гидралдз ічшхзйіов ß~rxnjoззсазcfi rpzda Caotrichwa c*adJ-îum зс

Сїйе-иа- ■ расцепляемого

J суОстратг в »сіну ту

Руткя '■'■■. О

Салгцгн 0,021

Оенпл- ß - D 0,060

ФЄЕИ- S - Il -CSSrOÛSÛBZS 0,024

îeExz-orrr- g - D -гт-асгзргззггд о, ста .

n-SETÇO$eEKt- ß - D '-ГДЇИОПгрнЕОЗЯЯ 0,259

п-ЕїТрофегяз:- ß — D -есїлоьяд 0

с-г-трсфг;^'- ß - D -гадшхтспграпогд^ с

п-^трс-'СГаЯ- ß - L -арайгаозэд " 0

2-ЕЕТрЬуЄЯЗї:- ß -З -ГЛЕЯгрОІїаД 0

п-тгтго^егад- ß — L -гра.бЕг:сггд 0

П-ЛЯТрсфЄ32Л- ß - Ъ -фтяозед 0

IMSCrpoi^lUz- ci - L -peiTSO злг 0

д-интрс^епад- ci - L -йраігнскаа 0

д-кхтрофеапд- OÎ-D '45J!3SZ1I о :

E-ESTp офсавд- ci - ь -галадтосзренозяд 0

л-н2їрофенал- (Я - а -иезноэдд 0

д.- еттрофенз,!- ci - d -глхя-дщреягзад 0

п-иепя- с' — D -галалтопзраногтд 0

«¿-Ч)-метзд- ci — Е -ЕСллоазд 0

ß -ГзгЕСодаза о ОогьзеА скорсалш васведдяла а-кгтрофенлд-ß - D-Езгкоіщралозвд, чем другзе гогкоэида, в состав яоторах вдсдат: ß - о —глгзощраяози*. Фе іл-зтел- ß - в -глзакопирано-зид а фекЕл- ß -ъ -глшошгренозьл расцеплялись ß -гллгозида-зо£ примерно с одкзадсаой скорость«, тогда sax феенл- ß -а -гдекогзфваоэад расяеїшяся с йсдкио2 скорость», чей фенвд- ß -d -ЦгЛЛОЙЕОЗЯД.

Со отношении s длсахарндаы ß -глоиозвдэзе проявляла меньшее сродство, чаї но отношения к а-Еитрофенад- ß - D-глюкодк-раноэгду.

В результате «учения субстратной специфичности £ -гяхи« ггдазы било установлено, что фермент хараятердзовался CTpoi-oi спепи^ячкостью но отчоиенн» к в -глчжопираноаи-у. Qo отчо-оениа R аглигсновой част* субстрата р-глшозддаза не »йиару-хгваха строгой спецкфгшости, проявляя способность расаеплл*-дссахаридн,' дедло мнгооахарюш в различнае глшояедн.

Обнаружена способность выделенной р -глюкоэидазы о pl 5,9 » трансгхжяозыироваяхв (pie, 4),

Г Г-Г ~ 3 а "

А ^ —

Ркс. 4* Хроматограшга продуктов, ий-равугаксся при расщеплении ввдязой ЦС-аого растврра целлвйаозы. Г - глюкоза; г - Г - цвллобжоэа; 3,4 - параллельные пробы.

Кал видао на представленной лроматоциише, при раеченлэчжк 0 -глюкозидазoJt Х2-аого раствора цедлобкозы в реающоЕкой. . cueca кроме основного продукта - пвкоза, содержалась продукты, характеризуишеся более внеодой степенью полимеризации, чех субстрат - пеллобиоза.

ошошне вывода

1. Показано, что s дроштаенном ферыентзск препарате "Цед-лаиадша Г 10х" гриба Oaotriohua candidas ЗС оодергЕТся пять ¥зожест2баЕ»г фора ß -кшЕОзпдаза, разлжчаготхся но фвзако-хх-ихческиы сзо£стваа я субстратной спецгфзчности. Установлено, что в процессе роста культуре гряба Geotrlcfana eocdidua зс прозе— ходят ззйсяеазе состава я относительного содерхаззя «Еолзсгэен-ннгферв. ß -кпскозягаса.

2. Разработал метод шделенил ß —глхкодэдаза яз дреюа-леяяяго. фериентпою препарата ■Целлокандзп Г ХОх", позволяете; пелзгтать шаогензз! препарат ^-гзгкоэадиза {р! 5,9) со степенью счлстта 63"* киодом со актзгностз около 9%. Колзкуляр-кнЛ вес ß -Едггозяддзн но дзттам гелъ-хроигтсгра4зЕ0н седлисг-тздяонеогз аяалгза разев 200 ООО, радаус Сtosca - 49

фшхаент. сквггятагтя - 9, В s . В ыазегуле ß -глакозьгазы со-' дергптся osdxo 9£ утлаводоэ (гдгаоэа, маннсэа я, по-зк^зеюыу, . гдддоз.уиттп) • -

3. Результаты осредаленгл могекуллрногс веса Д-глено-видеза иетодои электрофореза в HAÍT в присутствия sus

(115 ООО), негоден седелелтасзоЕяого рагновесля в драсутстзгз 1% sds (1X4 GC0), в 6 У гуанаетп-хлор^до (IIS ООО), в 8 а иочеггне (43 500) даает основания полагать, что ß -гдпзозжда-- -за является олггоиррпш белком.

: < 4. Выделеннн4 фермент является таязглой ß -где-. озддаз о£: фермент ве рЕССеплпд полисахарид! (араЗоглхзуронйксидяа, ярах-мал, септовуз кислоту, даыянарин, яарбсксаметаяаелзагозу); скорость расдеяденся ß -глскозгдазоа целлоолагосахарадов уменьшалась со мере увеличения дланн цеси субстрата; ß -гхско-зидаса характеризовалась трансглгкозглазной активность»; Б -гасконо-(1 —«- 5)-яактск является сальным конкуреагикц етгнба-торои. ; ß -таткозвдаза <Kj«I,9xI0~^U), тогда как глюкоза zrais • ется веконкуреятнывг ингкбяторо« (Kj^exIO"3!!).

5. В результате изучения действия ß-глвкозлдазн на дааяойдигоеахарвда,дисахарида и глдиозадн с о(т D oí-L -, - ß —- и p - l -танеаа связи было установлено, что феркзнт расяеплаг только те субстрата, в состав которых входит ß - D -глшоЕИранозял, что' свидетельствует о строгой специфичности

выделенноа ß —ГЛЕК ОЗіІД аЭЫ ПО отношению К ß ~ D -ГЛчК опирал СИ-зилу и od отсутствии такой же строгой специфичности по отношению к агликоновой части субстрата.

. 6. ß -Глюкозвдаза с молекулярным весом 200 ООО и р! 5,9 обнаруживала большое сродство со отношение к п-ниїрофендк- ß — D -глюкошракозиду <Е^а "О«34 шМ), чем до отношению к 'др«їа-харидам: целлобиозе (К m =2 юИ) и гентиобиоэо (К а =2,5 ml").

Основное содержание диссеотагми изложено в слез.уютлх оцубликовазшнх в к^-ідти работах:

1. Родионова H.A., Румянцева Г.Н., Тиунова H.A., Мартино-вичЛ.Я., Бахтадзе Л.Н. ß -Гкюкозидазы из гриба Geo^rlohura саа-

dldum зс . - Есохииия, 1977, v. 42, # I, с, 43-49.

2. Rodionога Я,A., UartinoYiah L.I., Bacht&dzeL.ti., Ru- : mjantseva G.H,, Celluloljtio engines fron GeotricLum candidua. Aba tracts of Int. Sупр. on Bio о Oliver s loa о f Celluloale substances Into energy, chejnlcala and microbial protein. Ed. Т.Е. Ghoee. Delhi, 19771 Fot>. 21-23.

3. Родионова H.A., Бахтадзе Л.Н.» Нэртинович Л.И., Румянцева Г.Н., Тиунова H.A., Целлшолигическио ферменти гриба Geotri-chu« Candidus. Втероо Бсесоэзн, cobtq. jo ферментам і*лкроорганизмов. - Минск, 1978, октябрь, тез, докл., с. 76.

4. Родионова H.A., Румянцева Г.П., Бахтядзо Д.Н., Безборо-дов A.M. Очистка и характеристика ß -глшозлдаз из гриба

- Geotrichum candldum . Всесоюзн, спмкоз. "Метода получения ш-сокоочащепких ферментов". - Вильнюс, 1973, тез, аОкл,, с.94-95.

5. Козловская Я.Н. - ß -Глюкозвдаза цедлплазной сисїєш гриба Oeotrlohum aand1dum . Симпоз. колодах ученых "Энергетика s углеводный обмен у иикрооргаяиэиов". - Рига, 1979, ноябрь, тез. докл., с. 42,

6. Родконова H.A., Козловская Л.Н, Способ получения препаратов ß-глшозидаз. Ш Всесошн. гонф. "Ыетоды получений в анализа биохимических реактивов", - Олайне, 1979, декабрь, тезисы докл., о. 98-99.

7. Козловская Д.И., Родионова H.A., Акпаров D.X., Пасешни-ченко В.А., Безбородое A.M. Выделение и характеристика ß -

_ глюкоаидаз гриба Ceotricbum oandidua зс. — Прикл. биохвд. и

мнкробиол,, 1960. sud. і, о. 46-55.

.'.' 0. Козловокая Л.Н., Родионова H.A.. Безбородов A.M. Свойства ß-глюкоаидазы гриба- Seotrlehum oaudldiua 3Cr Прикл. биожш. н мииробиол., I960, вин. 4, о. 536-546,

9. Rodlonora H.A., llar tin от i oh L.I,, Smlrnora H.I., loTekaja L.M.fFraotlonatlen Bnd oharaoteriEatlon of cellulate •óoaponeats from the fungue a* caudldu« 3C. - Abstr♦ of II Int. Sjap. оті Віоооптвгвіоп And Biochenloal Engineering. DBRC II T-Delhi, I960, March 3-6, Session 3(b), p. 29-30.

ЗАКк 45 2 ТИР, 150 ВЦ ВНИИКСе. т - 1181т.0т 11.ой. ірєог.