Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

В-А переход ДНК в растворе

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "В-А переход ДНК в растворе"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

Институт молекулярной оиологии им. Б.А.Энгельгардта

. -------------?

На правах рукописи

УДК 577.323.7

Крылов Дмитрия Юрьевич

В-А переход ДНК в растворе

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат на.соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии АН СССР им. В.А.Энгельгардта

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук,

профессор В.И.Иванов

доктор физико-математических наук В.И.Полтев

кандидат химичесих наук А.Г.Габибов

1 Ведущая организация

Институт молекулярной генетики АН СССР

Зашита состоится "2* ¿V" я я 1 г. в ^ ^ час. на заседании специализированного совета Д.002.79.01 Института молекулярной биологии АН СССР им. В.А.Энгельгардта по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова, д.32 Автореферат разослан "2_з_" 991 г.

Ученый секретарь специализированного,

кандидат химических наук 1 А—Мт^ИЦЫН

ОБИАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы иссследования. Молекулы нуклеиновых кислот играют ключевую роль в сохранении, воспроизводстве и реализации генетической программы. При этом их функции не сводятся к роли пассивного информационного носителя. Способность ДНК и РНК менять конформацию, а, следовательно, и физико-химические свойства под действием внешних факторов - одна из составляющих механизма регуляции генетических процессов.

Обратимся к ДНК. Многообразие конформационных возможностей этой молекулы включает как близкие к регулярным двуспиральные структуры I А- и В-формы), так и неканонические формы, возникающие на участках с неслучайными последовательностями - тройные и четверные спирали, кресты, Н-форма и т.д. Список нерегулярных конформаций постоянно растет, растет и интерес к возможной регу-ляторной роли этих форм. Появляются и новые данные о свойствах А-и В-конформаций. Так сделанное несколько лет назад открытие равновесных изгибов В-ДНК в растворе породило целое направление, которое изучает роль таких изгибов в регуляторных механизмах. Что касается А-формы, то ее возможное участие в регуляции пока остается всего лишь предположением, однако совсем недавно появились работы, позволяющих утверждать, что одна из возможных биологических функции А-формы - это "консервация" генетической информации. Дело в том, что А-ДНК оказалась значительно устойчивее к действию УФ-облучения по сравнению с В-формой. На примере ВАсШиг зиМЛИг было показано, как природа использует это свойство. В спорах этих бактерий в больших количествах содержится белок, который переводит ДНК в А-форму и, в результате, существенно повышает устойчивость ДНК к УФ-повреждениям.

Приведенный пример наглядно показывает, сколь необходимы дальнейшие исследования физико-химических свойств ДНК и, в частности, А-формы для понимания работы генетического аппарата.

Отметим, что сведения о поведении А-ЛНК в растворе достаточно скудны. Отчасти это связано с тем, что для изучения В-ДНК в растворе широко использовали ферментативные методы. Поскольку А-форму можно получить лишь в растворах с низкой активностью воды (например, водно-спиртовых), где применение таких методов невозможно, то ее исследования можно проводить только физико-

химически. Новые подходы к изучению А-ДНК, предложенные в настоящей работе позволили ответить на ряд важных вопросов, касающихся структуры и термодинамики А-формы.

Целью настоящей работы было изучение структуры ДНК при Б-А переходе в раствора. Используя свойства сверхспиральных ДНК можно связать основной параметр двойной спирали - угол спирального вращения - с пространственной формой молекулы. Именно этот принцип был положен в основу прямого измерения угла спирального вращения A-ДНК в растворе. Другой физический подход был разработан для определения параметра кооперативности Е-А перехода: метод фазовых диаграмм. Из анализа фазовых диаграмм ряда ДНК и полинуклеотидов удалось не только определить параметр кооперативности В-А перехода, но и показать, что существует четкая корреляцию между сродством ДНК к A-форме и ее последовательностью основании.

Полученные результаты позволяют сопоставить структуру ДНК в конденсированном состоянии и в растворе, а также предсказать некоторые биофизические свойства А-ДНК.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые получено значение угла спирального вращения A-формы ДНК в растворе. Независимым способом определен параметр кооперативности В-А перехода. Методическая ценность работы заключается в разработке 1 >. метода определения угла спирального вращения ДНК в нестандартных условиях и 2).метода изучения кооперативных переходов по фазовым диаграммам.

Апробация работы. Результаты, полученные в настоящей, работе доложены на I Биофизическом съезде i Москва,1982 ), на III конференции по биомолекулярной стереодинамике (Олбани, США, 1983), на шестом симпозиуме по информационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1985), на симпозиуме "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и в клетках" (Пушино, 19651, на Конференции молодых ученых ИМБ (1969 1, на 6-ой конференции по биомолекулярной стреодинамике (Олбани, 1969 1

Структура и об ем работы■ Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на страницах, содержит рисунков и список литературы, насчитывающий 60 наименований.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В этой главе приведены основные сведения о геометрии А- и В-ДНК в волокнах и кристаллах и результаты исследований В-А перехода в растворе. Обсуждаются результаты статистического анализа В-А перехода в рамках модели двух состоянии и тройного равновесия В-спираль<+А-спираль«*Клубок в рамках модели трех состояний. Кроме того, рассмотрены основные методы определения угла спирального вращения ДНК.

ГЛАВА 2. В-А ПЕРЕХОД В ЛИНЕЙНОЙ ДНК

ДНК принимает А-конформаци» в растворах с пониженной активностью воды, например, при высокой кониентраииии спирта. В настоящей работе мы изучали В-А равновесие в растворах трифторэтанол-вода, в которых молекулы ДНК не так легко агрегируют, как этанольно-водных растворах. Имеющиеся экспериментальные данные свидетельствуют в пользу того, что свободная энергия В-А перехода линейно зависит от активности воды в широком диапазоне концентрация трифторэтанола.

Как отмечалось в Гл. 1, В-А переход происходит кооперативно, Оез промежуточных состоянии. Исходя из этого мы будем трактовать все данные в рамках модели двух состоянии. В этой модели кривая перехода для гомополимера определяется тремя параметрами: точкой перехода (а ), длиной кооперативности (v =е' ', где Fs -

свободная энергия образования двух В/А границ! и производной разности свободных энергии В- и A-формы по активности воды. Последнюю условились представлять в виде параметра 0:

RT/Q |а=гч ( 1 .

Поскольку отношение Q/v0 определяет ширину кривой перехода Да: 4a=4Q/vo и может быть легко измерено, то для определения vb небходимо независимое экспериментальное измерение Q. Покажем, что это можно сделать, построив экспериментальную диаграмму состояний (В-спираль,А-спираль,Клубок !.

Отвлечемся на время от кооперативного характера переходов. Тогда в пространстве двух переменных (активность воды,температура ) должны существовать три области, отвечающие A-спирали, В-спирали и клубку. Границы между этими состояниями определяются

уравнениями FAía,T> - FcIа,Т) = О

F8(a,T)

Fc(a,T) = О

F {а,Т) - F la.T) = О, л в

(2 ) (3 ) (4 )

Видно, что последнее уравнение является разностью двух первых. Это позволяет связать термодинамические параметры В-А перехода и перехода спираль-клубок.

В тройной точке, определяемой уравнением Рд(ао,Т<>) = Р (а^Т.) = Рс(ао,То), можно разложить разности свободных энергий в ряд по активности воды и температуре, ограничившись линейными членами.Тогда уравнения 2 и 3 примут вид

(5)

(6)

F (а,Т) - F (а,Т) = RTia,(T-T >+В <а-а ) )= О

А С А ' А •

F (а,Т) в

Fcla,T) = RTlaB(T-To )+Вв(а-а> ) 1= О

Очевидно, что наклоны ветвей спираль-клубок (бТ/ба) для А- и

5Т

В-форм различны: — 6а

А-

Клубох

6Т

■ 0в/ав

(7 1

в-

Клувок

Это означает, что на зависимости Tffl(al должен наблюдаться скачок производной при активности воды, отвечающей тройной точке 1см. рис 1I

Вычитая уравнение 6) из 5) получим уравнение для ветви В-А равновесия в линейном приближении

F (a,T)-F <а,Т) = RT< ta -а )(Т-Т ЫВ.-В Ма-а ) 0 {6)

А В А В « А В •

Температура

Клубок

<5Т \

А— СПирОАь/

8— спираль

Рис.1 Теоретическая диаграмма состояний (В-ДНК, А-ДНК, Клубок). С а0,Т ) - тройная точка

АктиЬность Ьо&ы

Сравнивая его с i! мы видим, что

0=1 / I ВД"6В 1 ■ О)

Если В-А равновесие не зависит от температуры, то

6Т

з =ав=ЛНв/НТ^ и учитывая (7) Q = RTVAHB • ( — А ба

5Т

л- 6а

-1

)

8-

Клубок Клубок

Если же температура влияет на В-А переход, то еще одно

уравнение Судет связывать искомые параметры с наклоном В-А ветви;

оно получается дифференцированием (О) по <1Т: $а

6Т

= RT( а -а )/(0 -В„ ) (10)

в-а а в а в

Как легко убедится, в этом общем случае О выражается через наклоны ветвей фазовой диаграммы следующим образом: 1

■."Ч-- }Ч

8 I бТ А-в 5а А- > 1

6TI бТ

а- > 1 ба|в- 5а

МП)

а- '

0 ьгты, КлуСок Клубок Клусох

где а -АН /ВТ".

В В ь

Кооперативностъ Е-А перехода и плавления ДНК несколько изменяет вид фазовой диаграммы. Спиральные и расплавленные области будут разделены не резкими границами, а зонами причем уравнения 2-4 будут определять середины переходов. Кроме этого вблизи тройной точки следует учесть сосуществование двух различных конформаций ДНК в спиральных областях. Строгий анализ поведения гомополимера вблизи тройной точки, проведенный Г.Чоговадзе и М.Франк-Каменецким (Frank-Kamerietskll M.D., Chogovadze G.I. A Linear biopolymer in the vicinity of the triple point. The homopolymer case. J. Blomol.Struct. Dyn. 1, N 6, 1517-1523 (1984)), показал, что 1. в интервале перехода температура плавления отклоняется от предсказанной без учета кооперативности; максимальное отклонение соответствует тройной точке и составляет aT=RTVАН • ln( 1 М/v= ) I см. рис . 1 I

2. ширина кривой плавления увеличивается в интевале перехода в У? раз.

3. за пределами интервала перехода наклоны ветвей (А,клубок) и (В,клубок) совпадают с теми, которые мы получили без учета кооперативности (см. уравнение 7).

Природа уширения кривых плавления и повышения температуры одна и та же. Она связана с тем, что в интервале В-А перехода молекулы разбиваются на чередующиеся В- и А-спиральные участки. Энтропийный вклад в свободную энергию от смешения таких участков делает несколько более выгодной спиральную конформацию. В сущности В-А границы играют роль своеобразных свободно перераспределяющихся скрепок, связывающихся только со спиральным состоянием. Отметим, что при построении этой теории предполагалось, что длина кооперативности В-А перехода много меньше длины кооперативности плавления. Физически это означает, что спиральные области столь велики, что по отношению к В-А переходу они могут рассматриваться как бесконечно длинные. В противном случае В-А равновесие будет смешаться из-за появления границ спираль-клубок. Как мы увидим ниже, сделанное предположение вполне оправданно.

Таким образом, ход ветвей диаграммы состояний позволяет определить параметры В-А перехода; как это сделать практически показано в следующей главе на примере фазовой диаграммы для по ли I ДАТ).

Температура 'С

«

100

70

75

80

85

90

95

Активность Ьоды (*)

Рис.2 Диаграмма состоянии для полиСйАТ!

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДИАГРАММЫ СОСТОЯНИИ

1. Диаграмма состояний для лолшйЛТ)

Общий вид диаграммы состояний представлен на рис.2. Мы видим, что в интервале В-А перехода наклон ветвей, отвечавших В- и А-форме различен. Чтобы определить точное значение 6Т/5а для каждой ветви мы поступали следующим образом: экстраполировали ветвь В-А равновесия к тройной точке определяли ту часть ветви спираль-клуоок, которая соответствует плавлению ДНК в интервале В-А перехода. Через точки, лежащие вне интервала перехода проводили прямые, пересечение которых давало тройную точку, а тангенсы угла наклона - искомые значения производной бТ/ба Определив производную 8а/бТ для ветви В-А равновесия мы можем вычислить 0 (см. Уравнение 11). Измеренное таким образом значение (3 составляет О « 8% (в единицах активности воды). Учитывая, что ширина кривой В-А перехода в этом полинуклеотиде Да=1,1Ж получим 40/Да » 30. Это соответсвует энергии образования двух В/А границ Р5=4 ккал/моль, что достаточно хорошо согласуется со значением, измеренным ранее при помощи скрепочной теории.

2. Диаграмма состояния для ДНК из С1. реТгШгепз и тимуса теленка.

Представленные на рис 3 и 3' диаграммы состояний для природных ДНК похожи на диаграмму для поликЗАТ). В обоих случаях зависимость Т (а) меняет наклон в интервале В-А перехода и по разности производных В- и А-ветви можно найти параметр 0 (<2=117° для ДНК С1.регГг1пеепз и 0*16* для тимуснои ДНЮ). В-А равновесие для этих ДНК в исследованном диапазоне не зависит от температуры.

В заключение нужно сказать, что предложенный метод определения длины кооперативности В-А перехода не требует никаких предположений, кроме того, что зависимость свободных энергия В- и А-форм от активности воды можно линейно экстраполировать за пределы интервала В-А перехода. Возможность такой экстраполяции можно будет обоснованной в том случае, если разность свободных энергий между В- и А-формой в достаточно широком диапазоне относительной влажности изменяется линейно. Экспериментальное подтверждение последнего было получено В.И.Ивановым с соавт.при изучении перехода в А-форму коротких олигонуклеотидных дуплексов. Оказалось, что ширина кривой перехода в единицах активности воды (равная в случае коротких Фрагментов 40/М, где N - число пар

Температура °С

70 75 80 85 90 95 100

Активность бодь (ж) Рис.Э Диаграмма сосотояния для ДНК из С1. регГггпёепэ

Температура °С

70 75 80 85 90 95 100

Активность Ьоды (я)

Рис.3 Диаграмма состояния для ДНК из тимуса теленка

оснований в дуплексе ) одна и та же для образцов с сильно различа ютится точками перехода ют 70 до 90%). Отсюда следует, что значение Q сохраняется во всем изученном диапазоне.

ГЛАВА 3. Б-А ПЕРЕХОД В ГЕТЕРОПОЛИМЕРЕ: ЗАВИСИМОСТЬ В-А РАВНОВЕСИЯ ОТ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ОСНОВАНИЙ.

Кривые В-А перехода для природных ДНК с различным ГЦ-сояерханием Слизки между собой, что считали доказательством независимости В-А равновесия от последовательности оснований. В то же время, было известно, что полинуклеотид поли( dAI : поли! ÛT ) остается в В-форме (по крайней мере вплоть до 70% отн.влажности, или до 80% ТФЭI. Кроме того, рентгеноструктурные исследования кристаллов олигонуклеотидов указывают на тот факт, что динуклео-тиды ГГ:ЦЦ смещают В-А равновесие в сторону А-конформации, а АА:ТТ - в сторону В-. Эти данные показывают, что В-А равновесие зависит не просто от ГЦ-содержания, а от конкретной последовательности оснований. (Отметим, что эта ситуация принципиально отличается от перехода спираль-клубок, при котором температура плавления фрагмента ДНК с высокой степенью точности определяется ГЦ-содеряаиием). Таким образом влияние последовательности оснований на В-А переход следует рассматривать по крайней мере в рамкак модели ближайших соседей. В рамках такой модели каждый hs 10-ти возможных динуклеотидов должен характеризоваться своей точкой перехода. Задача нахождение этих параметров аналогична определению параметров гетерогенности стэкинга для плавления ДНК. Для конкретных значений параметров и данной последовательности теоретически рассчитывают кривые перехода. Затем подбирают такие параметры гетерогенности стэкинга, при которых достигается наилучшее согласие между рассчитанной и экспериментальной кривыми. Описанный подход корректен лишь в том случае, когда кривые перехода обладают достаточной информативностью, как например при плавлении коротких 1100 - 1000 п.р.) фрагментов ДНК. Из-за небольшой ^оперативности Е-А перехода и не столь выраженного влияния последовательности кривые перехода не имеют необходимой тонкой структуры. Тем не менее, осуществление указанного подхода оказалось возможным в результате появления экспериментальных карт В-А перехода, полученных недавно Беккером и Уонгом (Becker M.M., Wang Z. B-*A transitions wlthln a 5 S RNA gene are hlghly sequen-

се-Брестс. .). В1о1.СЪеш. 264,N7, 4163-4167 (1969)1. Авторам удалось картировать В-А переход в 200-парном фрагменте 5Э РНК гена морского ежа при помощи открытого ими эффекта подавления УФ-модификации ДНК при В-А переходе (рис.4). Теоретические карты перехода мы рассчитывали на основе алгоритма Поланда в рамках простейшей модели, когда лишь АА и ГГ динуклеотиды отличаются от всех остальных по точке перехода. Для расчета были использованы значения О и о полученные в Гл. 2. Наилучшее соответствие экспериментальной и теоретической карт наблюдается при следующих параметрах перехода: аДА=66,6Я, аГр=88,3», а0СТ=61*.

Несмотря на прекрасное согласие расчета с экспериментальной картой, нельзя исключить, что и некоторые другие динуклеотиды могут иметь точки перехода отличные от средней. Для выяснения этого вопроса необходимы дополнительные экспериментальные карты.

Точка перехода (активность Ьоды, х)

Порядковый номер нуклеотиЗноа пары

Рис. 4. Карты В-А перехода фрагмента 5S РНК гена морского ежа, рассчитанные в рамках модели ближайших соседей при следующих значениях параметров:

точки перехода динуклеотида АА/ТТ - 66,6Я, ГГ/ЦЦ- 66,3S, остальных динуклеотидов - 81Я, vAB«30 n.H.,Q=lO£ (Q) - экспериментальные данные Беккера и Уонга.

ГЛАВА 4. В-А ПЕРЕХОД В СВЕРХСПИРАЛЬНЫХ ДНК: ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛА СПИРАЛЬНОГО ВРАЩЕНИЯ А-ФОРМЫ.

Любой конформационный переход в кольцевых ковалентно замкнутых молекулах, если он изменяет угол спирального вращения двойной спирали, будет влиять на сверхспиральную плотность. Соответствующее изменение свободной энергии сверхспиралиэации может заметно облегчить (либо затруднить) переход. Это хорошо известно для переходов в крест и 2-форму. Что касается В-А перехода, то в этом случае изменение угла спирального вращения мало: чтобы заметно изменить плотность сверхвитков, нужно перевести в А-форму значительную часть молекулы. Как было показано в Гл.2, разность свободных энергий В- и А-конформаций меняется при изменении активности воды очень резко 1*0,ЗЙТ на пару на ширине перехода), в то время как энергия сверхспиралиэации, запасенная в кольцевой молекуле с физиологической плотностью сверхвитков (аяг-0,051 составляет всего лишь \\КТаг= 0,02ИТ на пару оснований. Таким образом, вклад свободной энергии сверхспирализа ции в энергетику В-А перехода незначителен. Подтверждено и экспериментально, что В-А переход в ДНК, имеющей физиологическую плотность сверхвитков, практически не смешается по сравнению с линейной ДНК (рис.5).

Доля А—формы

Рис. 5 В-А переход

0.8

0.6

в сверхспираль ноя ДНК. Долю А-формы определяли методом кругового дихроизма

0.4

0.2

О

55

60

70

75

80

Концентраций ТФЭ

С другой стороны, изменение плотности сверхспиралиэации при В-А переходе должно отражать величину изменения среднего угла спирального вращения двойной спирали, что может быть использовано для измерения этого угла в А-форме.

Посмотрим, что будет происходить при В-А переходе с отрицательно сверхспирализованной молекулой. Если угол спирального вращения изменится на величину -г. , то число отрицательных сверхвитков уменьшится. Для тех молекул, которые В-форме имели плотность сверхвитков 0В = -Д1У1В, оно окажется нулевым.Те молекулы, сверхспиральная плотность которых лежала в диапазоне -дтв<св<0. будут релаксировать в интервале В-А перехода. Наблюдать релаксацию можно по какой-либо гидродинамической характеристике. Мы использовали линейный дихроизм (ЛД) ориентированной в потоке ДНК: величина ЛД сверхспирализованной молекулы, как это было ранее обнаружено В.Л.Макаровым, возрастает при релаксации в 2-3 раза (рис 6 )

з

М/А*100

Рис. 6. Релаксация плазмиды риС19 при

титровании бромистым

этидием. Д1- эффективное уменьшение среднего угла спирального вращения в результате интер-каляции. ДА/А - линейный дихроизм

0.5

молекул, ориентиро-рованных в потоке. Линейный дихроизм измеряли при 270 нм.

о

-3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 О

Л1, граа.

СХЕМА' ЭКСПЕРИМЕНТА.

1. Плазмиду рЫС19 обрабатывали топоиэомеразой I в присутствии различных концентрация бромистого этидия с тем, чтобы получить набор кольцевых ЛНК с разной плотностью сверхвитков.

2. Открыто-кольцевая (окДНК) форма этой ллаэмиды была получена обработкой ДНКазой I в присутствии избытка зтидия.

3. Каждый из образцов переводили в А-форму и регистрировали линейный дихроизм во всем интервале Б-А перехода.

На рисунке 7 представлены зависимости ЛД окДНК и сверхспиральных ДНК с различной плотностью сверхвитков от доли А-формы. Эллиптическая форма кривой, соответствующей окДНК, связана с возникновением В/А границ; этот феномен будет рассмотрен ниже. Форма кривых, отвечающих сверхспиральным образцам, однозначно свидетельствует в пользу того, что степень сверхспирализации ДНК при В-А переходе изменяется: молекулы имевшие в В-конформации о=-0,045 полностью сбрасывают сверхвитки в А~форме, а молекулы с -0,045<о<0 релаксируют в интервале В-А перехода.

О 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

Доля А-формы

Рис. 7. Релаксация кольцевых молекул ДНК с различной плотностью сверхвитков при В-А переходе.

М/А+100

2.

1.5

0.5

1.0= о

2. О=-0,006

3. а=-0,012

4. о=-0,20

5. о=-0,034

6. О=-0,045

осСЫА - открыто кольцевая форма ДНК

Такая картина подтверждает предположение о раскручивании двойной спирали при переходе в А-конформацию.

В тех точках точках перехода, где релаксирует какой-либо из образцов 1т. е. его линейный дихроизм возрастает до ЛД окДНК) может быть определена величина угла, на который раскручивается двойная спираль: , где {^-плотность сверхвитков того

образца, который релаксирует в данной точке.

Определенная таким образом зависимость дг=И8) представлена на рис.6.

Д1 , град.

Рис.8 Изменение среднего угла спирального вращения при В-А переходе

О 0.25 0.5 0.75

Доля А-формы

Как следует из рисунка, угол спирального вращения ДНК при переходе в А-форму уменьшается на 1,6±0,2 град/пару. Учитывая известное значение этого угла В-ДНК в растворе (1^=34.2 град/пару), мы можем найти и его значение в А-конформации : 1:^=32.610.2 град/пару, что соответствует спиральному повтору 11=10.9610.06 пар/виток. Заметим, что это значение спирального повтора совпадает со средним значением спирального повтора А-ДНК в волокнах и в кристаллах, что можно рассматривать как еше одно свидетельство в пользу коформационной жесткости А-формы ДНК.

Если бы полное число витков двойной спирали в интервале перехода складывалось только из спирального вращения В- и

-А-участков, то средний угод спирального вращения в интервале перехода оыл бы связан с долей А-формы (9) следующим образом:

г (е)=г -б+г„-(1-е), (12)

О А В

или дк е )=( г -г ) е (13)

В А

гле дг(в) - наблюдаемое среднее уменьшение угла спирального вращения по сравнению с В-ДНК. Из Ур.13 следует линейный характер зависимости Л"Ь=? 16 >. что не подтверждается экспериментально (см. рис.8). Наблюдаемое отклонение экспериментальных точек от прямой может быть объяснено локальным закручиванием ДНК вблизи В-А границы. Действительно, вследствие небольшой длины неоперативности В-А перехода (^=20-30 пар) число границ между участками с разной конформацией в интервале перехода достаточно велико. Так, при 6=1/2 их линейная плотность 1п(в)/Я> достигает максимума

/V . Если вблизи границы возникают искажение угла спирального вращения порядка то в уравнение (13) необходимо включить

слагаемое , пропорциональное числу границ:

Д1=( г -г ) -ш е )/м. < 13 ■ »

А В

Максимальное отклонение такой зависимости от прямой, опре деляемоя уравнением (13) должно наблюдаться при 8=1/2 и иметь величину Как видно из рис.в отклонение экспериментальных

точек от прямой при 8=1/2 составляет 0.25 град/пару, что позволяет легко получить оценку для (11: 0.25 град/пару, или, учитывая известное значение V *20 - 30, получим: сК= 5-6 град. Такое значение дополнительной закрутки на В-А границе согласуется с результатами конформационных рассчетов.

Вернемся к зависимости ЛД(в1 для окДНК (рис.7). Мы предполагаем, что ее вид объясняется падением степени ориентации ДНК в результате появления В/А границ. Согласно конформационным расчетам и рентгеноструктурным данным двойная спираль равновесно изогнута на В/А границе . Наличи? таких стационарных изгибов уменьшает персистентную длину ДНК и следовательно ее ориентируемость в потоке. Аналогичное падение степени ориентации ДНК в интервале В-А перехода наблюдали методом двулучепреломления.

выводы

При помощи ряда физико-химических методов исследован Б-А переход ДНК в растворе; определены некоторые параметры А-ДНК, имеющие важное значение для выяснения биологических функций этой конформации.

1. На основе метода фазовых диаграмм измерена длина кооперативное™ В-А перехода; она составила улв = 20 -30 пар, что соответствует энергии образования двух В/А границ = 4ккал/моль.

2. Влияние последовательности оснований на В-А переход описано в рамках модели ближайших соседей. При этом:

а) все динуклеотиды кроме АА/ТТ и ГГ/ЦЦ имеют одну и ту же точку перехода (а=81%>.

в) АА/ТТ переходит в А-форму лишь при активности воды а=66,1%. с) ГГ/ЦЦ переходит в А-форму при а=йб,ЗЖ.

3. Показано, что двойная спираль раскручивается при переходе в А-форму на угол 1,6 град/пару; средний угол спирального вращения А-формы ДНК в растворе такой же, как и в конденсированном состоянии (т.е. в волокнах и кристаллах).

4. Изменение гидродинамических свойств клубка в интервале В-А перехода указывает на появление равновесных изгибов двойной спирали на каждой В/А границе.

Основные результаты опубликованы в следующих работах:

l.Ivanov V.I, Krylov D.Yu., Mlnyat Е.Б. and Mlnchertkova L.E. /В-А transition in DNA/ (1963) Collected Abstracts: Conversation in Biomolecular stereodynamlcs III, State University of New York at Albany !19Ö3 ), p.37.

2.Д.Ю.Крылов, Э.Е. Минят, В.И. Иванов /Особенности денатурации ДНК и полинуклеотидов в интервале В-А перехода/ Тезисы докладов I Всесоюзного биофизического съезда, Москва 1962, т.1, стр. 51.

3.Иванов В.И., Карапетян А.Т., Крылов Д.Ю., Минят Э.Е. /Фазовые диаграммы дискретных форм двойной спирали ДНК/ Тезисы докладов симпозиума "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и в клетках", Пушно 1965, стр.?В.

4.Шляхтенко Л.С., Крылов Д.Ю., Иванов В.И. /Тонкая структура кривых плавления ДНК в А-форме в спиртовом растворе/ Тезисы

докладов симпозиума "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и в клетках", Пушино 1905, стр.76.

5.Крылов Д.Ю., Иванов В.И., Минят Э.Е. /Диаграмма трех состояний для ДНК/ Тезисы докладов ,6-го симпозиума по конформаиионным изменениям биополимеров в растворах, Тбилиси 1965, стр.85. S.Ivanov V.I, Krylov D.Yu.. Mlnyat E.E., Mlnchenkova L.E, /В-А Transition In DNA/ J. Blomol. Struct, and Dyn.,1, N 2, 453 - 460 11983 )

7.Jvanov V.I, Krylov 0.Yu., Mlnyat E.E. /Three-State Diagram for DNA/ J. Biomo 1. Struct, and Dyn.,3, N 1, 43 - 55 (1985)8. Иванов В.И., Крылов Д.Ю., Минят Э.Е. /Изучение кооперативных переходов в ДНК при помоши фазовых диаграмм/ Мол. Биол.,19, N 2, 390 -399 (1985)

9. Krylov D.Yu., Makarov V.l., Ivanov V.I /Winding Angle оt A-DNA In Solution as Determined with a supertiellcal Plasmid/

Book of Abstracts: 6-th Conversation In Blomolecular Stereodynamlcs , State University of New York at Albany , p.191 (1969)

10.Krylov D.Yu., Makarov V.l., Ivanov V.l. /В-А Transition In SuperheIleal DMA/ Nucleic Acids Res., 18,N 4, 759-761 (1969)

В печать II.03.91 Изд..'." 17п -_оргдт 60X84/16 Уя.-изд.л. 0,87 Печ.л. 1,0 Тираж 100 экз.

Закм Л /(Г-/Д отпечатано ■ НОРМ на ft) листах в ¿¡^экземплярах