Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Увеличение разрешающей способности фотометрического метода регистрации агглютинации эритроцитов человека in vitro

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Увеличение разрешающей способности фотометрического метода регистрации агглютинации эритроцитов человека in vitro"

На правах рукописи

ДВОРЕЦКИЙ КОНСТАНТИН НИКОЛАЕВИЧ

УВЕЛИЧЕНИЕ РАЗРЕШАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА РЕГИСТРАЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO

ОЗ.ОО.О2.-БИОФИЗИКА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Саратов2005

Работа выполнена в Саратовском государственном медицинском университете

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук, доцент Дубровский Валерий Александрович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, доцент Синичкин Юрий Петрович

Ведущая организация: Российский противочумный научно-исследовательский институт "Микроб" (г. Саратов)

Защита состоится 4 марта 2005 г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 212.243.05 при Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская 83.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Саратовского государственного университета.

Автореферат разослан «_»_2005 г.

доктор медицинских наук, профессор Брилль Григорий Ефимович

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук, п фессор

о в В.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Одной из важных медицинских проблем является повышение надежности диагностических методов, основанных на явлении специфического взаимодействия антигенов и антител. Как известно, широкое распространение в практической иммунологии получили методы, основанные на контакте препаратов антител и антигенов, и наблюдение тем или иным способом образовавшихся комплексов антиген-антитело. Однако традиционные методы обнаружения иммунологических реакций зачастую требуют значительного времени, большого расхода исходных компонентов или требуют сложной методики пробоподго-товки.

Агглютинация (склеивание) клеток in vitro (в пробирке), как результат иммунного процесса по принципу "антиген-антитело", лежит в основе многих медицинских диагностических методик и биологических исследовательских тестов. Среди методов регистрации процесса агглютинации наиболее информативными и часто используемыми на практике являются оптические. Такие как, например, фотометрический, нефелометрический и флуоресцентный методы. По сравнению с другими классическими методами регистрации процессов агглютинации клеток (например: центрифугационные, седиментационные и вис-козиметрические методы), оптические методы обладают рядом преимуществ:

1; высокая абсолютная чувствительность:

2. при измерении не требуется сложная методика пробоподготовки;

3. позволяет получать информацию без воздействия, приводящего к изменению образца;

4. оптическая аппаратура малоинерционна и удобна для непрерывной регистрации как in vivo (в организме), так и in vitro, что позволяет следить за изменением состояния биологических суспензий, происходящим за короткие промежутки времени.

Иногда, в патологических случаях, наблюдаемое специфическое взаимодействие антигенов и антител может идти со слабой агглютинационной способностью реагентов. В этом случае уровень разрешающей способности большинства методов может оказаться недостаточным для уверенной регистрации агглюти-национного процесса.

Поэтому повышение чувствительности методов анализа иммунного процесса, сокращение времени проведения диагностического теста являются актуальными задачами, как с биомедицинской точки зрения, так и аппаратурной.

Настоящая диссертационная работа посвящена повышению чувствительности, разрешающей способности (отношение величины отклика фотоприемника

при специфической реакции агглютинации к величине отклика при спонтанной реакции агглютинации) фотометрического метода регистрации процесса агглютинации клеток усиленного с помощью ультразвукового излучения

В качестве экспериментального материала выбраны нормальные эритроциты четовека и изогемоаплютинируюшая сыворотка крови человека (агглютинины системы АВО групповой принадлежности крови) так как доступность этих материалов летают их удобным объектом для изучения

Целью настоящей диссертационной работы является увеличение разре шающей способности оптических методов регистрации процессов агпютина ции эритроцитов человека с агглютининами системы АВО групповой принадлежности крови in vitro усиленных в поле стоячей ультразвуковой волны

Задачи решаемые в работе:

Экспериментальный анализ возможности увеличения разрешающей способности фотометрического и нефелометрического метода регистрации процессов агглютинации эритроцитов человека in vitio с помощью стоячей ультра звуковой волны,

Оптимизация параметров выбранной оптической схемы методики пробо-подготовки и методики проведения реакции агглютинации эритроцитов in vitio с целью увеличения разрешающей спосооности метода

- Построение для интерпретации полученных экспериментальных данных теоретической модели которая позволяет моделировать экспериментально peгистрируемые величины отклика фотоприемника в зависимости от скоро сти расслоения суспензии клеток в поле стоячей УЗ волны кинетики образования как спонтанных так и вынужденных эритроцитарных комплексов седиментационных процессов за время инкубации (после окончания УЗ воз действия)

Научные рез> тьгаты и положения выносимые на защиту:

- При воздействии на реакционную смесь поля стоячей утьтразвуковой вотны создаются условия значительно ускоряющие агыютинационые процессы в суспензии форменных злементов крови Эго приводит к увеличению разре шающеи способности фотометрического и нефетометрического методов регистрации реакции агпютинации эритроцитов на несколько порядков

Расчет кинетики спонтанного и индуцированною комплексообразования в хоте реакции агпютинации эритроцитов in vitro учитывающий влияние на динамику распределения эритроцитарных комплексов поля стоячей ультра звуковой волны поливалентности реагентов и их агпютинационной способности

- Комплекс алгоритмов и программ позволяющии моделировагь эксперимен

тально регистрируемые величины отклика фотоприемника, при регистрации процессов агглютинации эритроцитов in vitro фотометрическими и нефело-метрическими методами, с учетом времени ультразвукового воздействия, процессов седиментации, глубины процесса комплексообразования.

Научная новизна и практическая значимость работы:

- экспериментально показано, что, в случае слабовыраженной агглютинаци-онной способности крови, такие стандартные методы регистрации реакции агглютинации эритроцитов человека in vitro как фотометричесские и нефе-лометрические дают уровень разрешающей способности недостаточный для уверенной регистрации этого процесса;

- впервые применен на практике и теоретически описан механизм усиления процессов агглютинации эритроцитов человека in vitro в поле стоячей ультразвуковой волны с последующей их регистрацией фотометрическим методом;

- экспериментально подобраны оптимальные параметры оптических схем регистрации, методики пробогюдготовки и методики проведения теста по наблюдению за процессом агглютинации эритроцитов человека in vitro, усиленного с помощью ультразвукового воздействия, с целью получения максимальной разрешающей способности; экспериментально показано, что полученного выигрыша в разрешающей способности метода вполне достаточно для уверенной регистрации слабо выраженной реакции агглютинации (на примере специфического взаимодействия эритроцитов человека и агглютининов системы АВО групповой принадлежности крови in vitro), где чувствительности большинства стандартных методов явно не хватает;

- адаптирован алгоритм кинетики консекутивно - конкурентных реакций к расчету динамики комплексообразования в ходе агглютинационных процессов эритроцитов человека in vitro с учетом воздействия на реакционную смесь поля стоячей ультразвуковой волны; это позволяет вычислять динамику распределения по размерам эритроцитарных комплексов во времени с учетом поливалентности реагентов и их агглютинационной способности, что, в свою очередь, позволяет обладая данными о валентности и агглюти-национной способности реагентов (в данной диссертационной работе эю нормальные эритроциты человека и агглютинины системы АВО групповой принадлежности крови) оптимизировать подбор исходных концентраций реагентов для получения максимальной разрешающей способности метода регистрации процесса агглютинации и сокращения времени теста;

- разработан комплекс алгоритмов и программ для моделирования экспериментально регистрируемых величин отклика фотоприемника при регистрации процессов агглютинации эритроцитов in vitro фотометрическими и не-

фелометрическими методами с учетом воздействия на реакционную смесь поля стоячей ультразвуковой волны

Апробация работы:

Материалы, изложенные в диссертации, докладывались на следующих конференциях и симпозиумах

6th International Conference on Laser Application in Life Sciences Jena, Germany 1996

Международная конференция Проблемы и перспективы прецизионной механики и управления в машиностроении Саратов, Россия 1997 Nitem Biomedical Optics'98 Nonlinear Dynamics and Structures in Biology and Medicine Optical and I aser Technologies San Jose, USA 1996

Biomedical Optics'98 Coherence domain optical methods in biomedica! science and clinical application II San Jose, USA 1998

Biomedical Optics'99 Coherence Domain Optical Methods in Biomcdical Science and Clinical Applications III San Jose, USA 1999

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 14 paбот 4 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах, 3 статьи в межвузовских научных сборниках 3 статьи в сборниках трудов научных конференций и 4 тезисов докладов

Структура и объем работы:

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка использованной литературы из 120 наименований Основная часть работы изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунка, 4 таблицы

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность темы диссертационной работы, формулируется цель, научная новизна и практическая значимость полученных результатов, дается краткое содержание глав работы

В первой главе дано описание процесса агрегации эритроцитов in vitro, включающее описание механизма их спонтанной агрегации Рассмотрено влияние на этот процесс основных внешних и внутренних факторов Таких как состав плазмы крови форма деформируемость эритроцитов и их концентрация, температура скорость сдвига потока

Также рассмотрен механизм «специфического;) образования комплексов между эритроцитами посредством агглютининов Проанализированы основные

силы взаимодействия между антигенными группами на поверхности эритроцита и агглютининами системы ЛЕЮ групповой принадлежности крови

Дана краткая классификация основных экспериментальных методов для регистрации процесса агрегации эритроцитов

Вторая глава посвящена изучению агрегации эритроцитов in vitro методом упругого светорассеяния Рассмотрены оптические свойства объекта исследования - клеток крови человека Коротко рассмотрены основные методы аппроксимирующие упругое рассеяние света от форменных элементов крови Показано что для описания рассеяния света от форменных элементов крови выгоднее всего использовать приближение Ми с учетом распределения частиц по размерам

Представ 1ено описание гониофотометрической установки использовавшийся для измерения индикатрис однократного и многократного рассеяния исследуемых объектов Дано описание нефепометрических измерений тестовых объектов частиц латекса Показано, что для точной аппроксимации полученных данных необходимо учитывать все искажения в регистрируемой фазовой функции рассеяния связанные с геометрией эксперимента Также дано описание нефелометрических измерении разбавленных суспензий клеток крови и их агрегатов Исследована зависимость индикатрисы рассеянного света от количества форменных элементов крови в единице объема (рис I ) в широком диапазоне концентраций (0 05-3,1 % от цельной крови)

Показано что тля наблюдения за процессами связанными с изменением количества клеток в единице объема (например из-за их осаждения) наиболее выгодными тля наблюдения являются следующие угловые диапазоны от 0° то 10°

IOOO р

0 05% —^ 0 10%

-о- , ю5

г град

Рис 1 Индикатрисы рассеянною свсга от Рис 2 Зависимой! вешчннп рассеянного суспензии эритроцитов раз нпнп\ копией сшла от кониапрацни »ритроцшов по i раз трации ными vrnaMH набпотения

или больше 110 (рис. 2.), что оказало влияние на геометрию эксперимента в следующей главе. Приведено сравнение индикатрис рассеянного света от сильно разбавленных суспензий агрегированных и неагрегированных эритроцитов, которое показало, что на всем угловом диапазоне различие между регистрируемыми оптическими сигналами не превышает 200 %.

Экспериментально показано, что при увеличении времени наблюдения за рассеянным сигналом различие между суспензиями агрегированных и неагрегированных эритроцитов увеличивается (рис. 3). Это связано с тем, что скорости седиментации отдельных клеток крови и их комплексов сильно отличаются. Показана возможность качественного восстановления распределения частиц по размерам с помощью нефелометри-ческих измерений разбавленных суспензий клеток крови и их агрегатов.

Третья глава посвящена усилению агрегации эритроцитов in vitro с помощью поля стоячей ультразвуковой волны.

Экспериментально показано, что отличие между положительной и отрицательной реакциями агглютинации эритроцитов in vitro регистрируемых фотометрическим методом, например, для 10% разведения цельной крови и времени инкубации порядка 10 минут, не превышает 2-3 раза. Этот уровень разрешающей способности метода не может гарантировать уверенного различия между положительной и отрицательной реакциями агглютинации (особенно для случаев слабой агглютинационной способности эритроцитов) При увеличении времени инкубации до 20 - 30 минут данное различие увеличивается до 3 - 4 раз из-за возрастающего влияния седиментационных процессов на уровень регистрируемого сигнала. Этот уровень отличия положительной реакции агглютинации от отрицательной также не может гарантировать их уверенного различия, особенно при слабой агглютинационной способности эритроцитов где он составляет, например, всего 1.5 - 1,7 раза.

При воздействии на реакционную смесь внешней сдвиговой силы (в нашем случае радиационной силы давления стоячей ультразвуковой (УЗ) волны) скорость комплексообразования значительно увеличивается, что приводит к их быстрому осаждению после окончания воздействия на реакционную смесь УЗ полем, что значительно сокращает время проведения геста.

С ™ 1000 ?0М 2ЬОО 3000

Время, сек

Рис. 3Зависимость величины рассеянного под умом 90й свс1а от времени наблюдения для ра!бавпеннои (1 500) суснен'ши 1) агрегированных и 2) меагре! нрованных эритроцитов

Проведен анализ и оптимизация возможных оптических схем для регистрации реакций агглютинации эритроцитов in vitro фотометрическими и нефелометри-ческими методами. Максимальных величин разрешающей способности метода удалось достичь при использовании двухканальной оптической схемы. Однако, в конечном итоге, окончательный выбор пал на более простую одноканальную схему, которая обеспечивает уровень разрешающей способности метода, в случае нормальной агглютинационной способности эритроцитов, на уровне 2-3 порядков, а для случаев со слабой агглютинационной способностью клеток крови 1 - 2 порядка. Этого уровня разрешающей способности метода вполне достаточно для уверенного отличия положительной реакции aгтлютинации от отрицательной даже для образцов крови со слабой агглютинационной активностью.

Проведен подбор оптимальных параметров регистрации и пробопод-готовки для экспериментов по наблюдению за агрегацией эритроцитов человека in vitro. Выполнен анализ нескольких возможных оптических схем для фотометрических и нсфеломегрических измерений агре-тации эритроцитов человека. Показано, что разрешающая способность метода (отличие регистрируемых сигналов от спонтанной и индуцированной реакций агглютинации эритроцитов) может достигать, в лучших случаях, нескольких порядков. Для одноканальной оптической схемы (работающей по фоюметрическому принципу) величина разрешающей способности достигает трех порядков, а в случае двухканальной оптической схемы (в которой один из каналов работает по фотометрическому принцип), а второй фиксирует сигнал, рассеянный под углом 50°) эта величина может достигать, в лучшем случае, шесть порядков. Показано, что для образцов крови, обладающих пониженной агглютинационной способностью, отличие регистрируемых сигналов от спонтанной и индуцированной реакций а[глюгина-ции эритроцитов уменьшается. Также, в этих случаях, уменьшается и различие в разрешаемой способности между одноканальной и двухканальной оптическими схемами регистрации агглютинации эритроцитов человека in vitro Оно составляет приблизительно 300 % Поэтому выбор был сделан в пользу одно-канального варианта, как более простого в конструктивном плане

Анализ исследования оптимальных времен воздействия УЗ поля и степеней разведения цельной крови показывает, что для разных образцов крови эти оптимумы варьируются в достаточно широких пределах и зависят от таких факторов как агглютинационная способность клеток крови и изогемоагглюти-нирующей сыворотки. Однако достаточно часто оптимальным временем воздействия УЗ полем на реакционную смесь оказывается величина равная 70 секунд и оптимальное разведение эритроцитов порядка 2% (рис. 4). Эти величины и были выбраны в качестве оптимальных параметров пробоподготовки.

В четвертой главе для интерпретации полученных экспериментальных данных построена теоретическая модель, позволяющая рассчитывать динамику изменения во времени регистрируемого фотометрического сигнала.

Она позволяет учитывать такие начальные параметры как скорость расслоения суспензии клеток в поле стоячей УЗ волны в зависимости от начального количества эритроцитов в единице объема и структурной вязкости клеточной суспензии; кинетику образования как спонтанных, так и вынужденных эритро-цитарных комплексов в зависимости от начальных концентраций реагентов, констант ассоциации и вязкости среды; седимнтационные процессы за время инкубации (после окончания УЗ воздействия).

Моделирование процесса усиления агрегации эритроцитов в поле стоячей УЗ волны с последующей регистрацией фотометрическим методом проводилось по следующей схеме:

1) расчет движения эритроцитов в ультразвуковом поле и их группировки в узловых зонах стоячей волны позволял определить концентрацию клеток в этих зонах; мгновенной скорость движения частицы в точке отстоящей от узла давления УЗ волны на расстояние Ъ оценивалось по формуле:

где Рт - амплитуда звукового давления: V - объём движущейся частицы: А. -длина УЗ волны; р и р„, - плотности клетки и окружающей с р е (Д - их сжимаемости, г| - вязкость среды:

2) в свою очередь, найденная концентрация эритроцитов являлась начальным условием для расчета кинетики их комплексообразования:

\ max \ max \ max \ max N max Vmax A max \ max

с«;-I Xc; + I Iс кгlollc;),

de:

dt

Г о

/0 ill

/=0 /-0

I де de: / Idl - скорость изменения числа комплексов состоящих из п • I антител

и т-ч антиген;

константа скорости реакции

AlIJ+lAgnH^ , другие сомножители в правой части уравнения приставляют собой концентрации исходных реагентов реакции ( M„Agm и At,4g) в данный момент времени t, каждый из которых включает в себя две суммы первая - уменьшения исходных реагентов в ходе реакций с другими типами комплексов, вторая - их увеличение вследствие слипания более мелких комплексов Nn„ - число, определяющее максимальное количество антител и антиген в комплексе

3) следующий шаг - оценка количества эритроцитов и их комплексов после выключения ультразвука с учетом седиментации клеток и их комплексов, скорость оседания оценивалась по формуле

где V и Ref| объем и эффективный радиус эритроцитов и их комплексов, Н -величина гемагокрита вязкость суспензии эритроцитов плотности

клетки и окружающей среды,

4) знание концентрации отдельных эритроцитов и их комплексов которые не успели седиментировать за время инкубации (3 мин) позволяет определить оптический отклик на исследуемые процессы на основе фотомефического метода анализа

где I и 1о - интенсивности прошедшего и падающего световых потоков; С -концентрация рассеивателей; ста и о5 - их сечения поглощения и рассеяния; d -толщина рассеивающего слоя, a q описывает долю полной мощности, рассеянную в телесный угол приёма от одиночного рассеивателя.

Полученные теоретические данные хорошо совпадают с имеющимися экспериментальными данными (рис 5 и 6), что юворит об адекватности построенного модельного приближения.

В заключении кратко перечислены основные результаты и выводы работы.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Реализован метод кинетики консекутивно-конкурентных реакций агрегации и агглютинации эритроцитов in vitro, позволяющий моделировать динамику изменения распределения эритроцитарных комплексов во времени в ходе указанных выше процессов Необходимыми начальными параметров для реализованного модельного описания процесса комплексообразования являются: а) исходные концентрации реагентов; б) валентности участников комплексообра-зования и в) константы ассоциации. Из всех перечисленных выше исходных данных только константа ассоциации, в силу перечисленных в гл. 1 обстоятельств, является величиной точный расчет которой составляет достаточно трудоемкую задачу и подбирается эмпирически, исходя из конкретных экспериментальных данных.

2. Проведен анализ возможности регистрации реакций спонтанной и индуцированной аплюгиниции эритоцитов in vitro фотометрическими и нефеломег-рическими методами Экспериментально показано, что для широкого диапазона концентраций эритроцитов (0,005 - 10 %) отличие между регистрируемыми оптическими сигналами не превышает, в лучшем случае. 2-3 раза В случае образцов крови со слабой агглютинационной способностью эритроцитов это отличие значительно уменьшается и составляет всего несколько процентов Этой разрешающей способности метода явно не хватает для уверенного отличия процесса спонтанного комплексообразования от индуцированной агглютинации эритроцитов с помощью, например, изогемоагглютинирующей сыворотки

3 Экспериментально показано, что при увеличении времени наблюдения за описанными выше процессами (до 20 - 30) минут различие между спонтанной и индуцированной агглютинацией эритроцитов увеличивается, в лучшем случае, до 3 4 раз Это увеличение разрешающей способности метода объясняется возрастающим влиянием седиментационных процессов (зависимостью ско-

ростей осаждения клеточных комплексов от их размера) на уровень регистрируемого сигнала Этот уровень регистрируемых оптических сигналов для положительной и отрицательной реакции агглютинации не может гарантировать их уверенного различия особенно при слабой агглютинационной способности эритроцитов, где он составляет (в лучшем случае) всего 50 70 %

4 Экспериментально показано что при воздействии на реакционную смесь внешней силой (в нашем случае радиационной силы давления стоячей УЗ волны) отличие между регистрируемыми фотометрическим методом сигналами от процессов спонтанной и индуцированной агглюжнации эритроцитов in vitro увеличивается на 2 - 3 порядка Это связано с тем, что в поле стоячей УЗ волны происходит расслоение клеточной суспензии приводящее, в конечном итоге, к локальному скоплению эритроцитов вблизи узловых плоскостей сгоячей УЗ волны что сильно сказывается на скорости образования эритроцит арных комплексов Посте окончания воздействия УЗ полем на реакционную смесь, крупные эритронитарные комплексы, образованные в ходе огрицательной реакции агглютинации легко распадаются на более мелкие комплексы и одиночные эритроциты и достаточно долго находятся во взвешенном состоянии в зоне наблюдения сильно ослабляя падающий световой поток В случае положительной реакции агглютинации силы склеивающие эритроцит между собой на порядок сильнее чем в случае отрицагетьной реакции и поэтому образовавшиеся крупные комплексы быстро покидают зону наолюдения чю, в свою очередь, приводит к значительному просветлению среды Все это и приводит в конечном итоге к столь значительному отличию (в 2 3 порядка) между регистрируемыми фотометрическим методом сигналами oт положительной и огрица-тельной реакциями агглютинации эритроцитов

5 Проведен анализ и оптимизация нескольких возможных оптических схем для регистрации реакций агглютинации эритроцитов in vitro фотометрическим и нефелометрическим методами Максимальных величин разрешающей способности метода удалось достичь при использовании двухканалыюй оптической схемы (один из каналов измерял прошедший сигнал, другой - регистрировал рассеянный световой поток под углом 50J ) В некоторых тестах она доходила до 6 порядков Однако, для образцов крови со слабой aгглютинационной способностью эта величина составляет всего тишь два порядка и становится сравнимой с разрешением для более простой одноканальной (фотометрической) схемы которая для аналогичной слабой реакции агглютинации дает величину разрешающей способности 1 - 2 порядка а для образцов крови с нор мальной aгглютинационной способностью эта величина достигает 2 3 порядка Поэтом) в конечном итоге окончательный выбор пал на более простую одноканальную схему т к ее уровня разрешающей способности вполне достаточно для уверенного отличия положительной реакции агглютинации от отрицательной даже для образцов крови со слабой агглютинационной способностью

6. Для выбранной оптической схемы регистрации процессов агглютинации эритроцитов in vitro экспериментально был проведен анализ зависимости разрешающей способности метода от таких факторов как время облучения УЗ полем реакционной смеси, концентрация эритроцитов. Было выяснено, что в исследуемом диапазоне концентраций эритроцитов (1 - 8 % от цельной крови) отличие между регистрируемыми фотометрическим методом сигналами от положительной и отрицательной реакций агглютинации зависит от времени облучения реакционной смеси УЗ полем. Эта зависимость носит колоколообразный характер, т.е. для каждой концентрации эритроцитов имеется свой оптимум времени воздействия УЗ полем. Для разных образцов крови положения опти-мумов могут несколько различаться, но с увеличением концентрации эритроцитов увеличивается и время оптимального воздействия на реакционную смесь УЗ полем (для 2 % разведения цельной крови она состовляет примерно 70 секунд, для 3 % - 90 секунд и т.д.). Как показывают теоретические расчеты, это связано с тем, что при увеличении концентрации эритроцитов уменьшается скорость их расслоения в поле стоячей УЗ волны, что связано с зависимостью вязкости суспензии клеток от их концентрации.

7. Проведенный анализ повторяемости полученных экспериментальных данных от различных образцов крови и серий изогемоагглютинирующей сыворотки показал, что огличие между регистрируемыми фотометрическим методом сигналами от положительной и отрицательной реакциями агглютинации эритроцитов in vitro может колебаться в очень широких пределах (например, от 10 до 1800 раз). Такой значительный разброс по величине разрешающей способности метода, естественно, не может быть объяснен погрешностями и ошибками в регистрации сигналов и методике пробоподготовки. Здесь в первую очередь играют роль такие факторы как зависимость скорости процесса образования эритроцитарных комплексов от агглютинационной активности эритроцитов и изогемоагглютинирующей сыворотки для разных образцов.

8. Для интерпретации полученных экспериментальных данных была построена теоретическая модель, позволяющая рассчитывать динамик) изменения во времени регистрируемого фотометрического сигнала. Она позволяет моделировать экспериментально регистрируемые сигналы в зависимости от таких начальных параметров как:

- скорость расслоения суспензии клеток в поле стоячей УЗ волны в зависимости от начального количества эритроцитов в единице объема и структурной вязкости клеточной суспензии, которая в свою очередь тоже зависит от процесса расслоения клеток крови,

- кинетика образования как спонтанных, так и вынужденных эритроцитар-ных комплексов в зависимости от начальных концентраций реагентов, вязкостен среды и т д.:

- учет седимнтационных процессов за время инкубации (после окончания УЗ воздействия) в ходе которых образовавшиеся в результате процесса агглютинации эритроцитарные комлексы разных размеров с разными скоростями (зависящими, естественно в основном от их размеров) оседают что в свою очередь сказывается на регистрируемом оптичесском сигнале

Полученные теоретические данные хорошо совпадают с имеющимися экспериментальными данными, что говорит об адекватности построенного модельного приближения и возможности его использования для интерпретации полученных опытным путем данных

Предложенный в настоящей работе фотометрический метод регистрации процесса агглютинации эритроцитов человека in vitro, усиленной в поле стоячей УЗ во ты является перспективным методом исследования любых агглюти-национных процессов in vitro на клеточном уровне Таких как например, рассмотренная в данной paбoтe агпютинация эритроцитов с помощью агглютининов системы АВО групповой принадлежности крови Высокая чувствительность предложенного метода peгистрации процесса агглютинации позволяет уверенно отличать реакции спонтанной от реакций вынужденной агглютинации эритроцитов in vitro даже в случае образцов крови с очень слабой агглютинаци-онной способностью эритроцитов

С ПИ( OK РАБОТ, 011УБ ШКОВАННЫХ ПО TFMF ДИС СЕРТАЦИИ Статьи:

1 Doubrovski V Л Dvoietski К N Kirichuk V Г Scherbakova I V Computer simulation of immune kmctic processes m vitro and light scatterinc on antiecn antibody reagent mixture // Proc SPII \ ol 3(M \onlincar Dinamics md Structures 111 Bioloev ind Medicine Optical and I aser Technoloue. / Ld VV ruchin 19% P 18 26

2 Дчбровскин В А Дворецкий К H Щербакова И Ii Ко\ип ютерное мотетированис ки нетики и\ш\ но 101 и icckoio процесса in \itro ия с 1Учая о шовалентных анппет// Акту альш ie вопросы научных нес |едованпп / Межвуз науч сб CaparoR 1997 С 41 47

3 Дубровский В Л Дворецким К Н Щербакова И В компьютерное моте трование ки нетики имч>но ioi ичеекого процесса in vitro для бивалентных реагентов / Актуальные вопроси на\ шы\ исс ic юнашш / Межвуз иа\ч сб Сараюв 1997 С 48 Ч

4 Дуброве! ии В А 1ворспкии К Н Щербакова И В Унрмое раесеяние cueia на реак ционнои смеси в процессе иммунологическом реакции in xitro// Актуальные вопросы научных иссчеювашш / Межв) з науч сб Саратов 1997 С 5-> 62

i Doiibrovski V A DyoictskiKN Kirichuk \ F Schcrbakova I V Flastie light scattering on reagent mixture in the immune reaction process in vitio // Pioe SPll Vol УЧ Coherence domain optical methods in biomedical science and clinical application II / (d V V Tuchin 199S P 202 208

( Doubrovxki V \ Dvoietski К IN 1 isht scattering analysis of ultrasonic u ives influence on the RBC agglutination m vitro Proc SPIF Vol >>9S Coherence domain optical methods in biomedical science and cluneal application 111 Id VV Tuchm 1999 P 226 232 7 Дубровский В Л Творецким К Н Щербакова И В Упрмое рассеяние света на реак

от

ционной смеси в процессе иммунологической реакции in vitro // Оптика и спектроскопия 1999 1 86 № 1 С 85-88

8 Дубровский В А Дворецкий К Н Упругое светорассеяние для регистрации инд) циро ванной ультразвуком агглютинации эритроцитов m \itro // Оптика и спектроскопия 2000 Т 89 №1 С 109-113

9 Doubrovski V A Dvoretski К N Ultrasonic wa\e action upon the red blood cell agglutina tionm\itro//Ultrasound in Med andBiol 2000 Vol 26 № 4 P 655-659

10 Дубровский В А Дворецкий К Н Балаев А Э Исследование механизма усиления аг регации эритроцитов ультразвуковым полем // Акуст журн 2004 Т 50 №2 С 184192

Тезисы докладов:

11 Doubrovski V A Dvoretski KIN. Kinchuk V F Scherbakova I V Immune kinetic proc esses in \itro computer simulation // 6th International Conference on Laser Application in Life Sciences Jena Germany 1996 P 2-39

12 Doubro\skiVA Donetskdia E G Dvoretski K.N kinchuk V F Scherbako\a I V Light scattering on reagent mixture antigen-antibody in vitro computer simulation and experiment // 6th International Conference on Laser Application in Life Sciences lena Germanv 1996 P 2-40

13 Д\бровскии В А Дворецкий КН Щербакова ИВ Молелирование ynpvroro свето рассеяния на мотек\ лярной смеси антиген антитело в процессе реакции in vitro // Ma лериалы Между нар конф «Проблемы и перспективы прецизионной механики и vnpae ления в машиностроении» Саратов 1997 С 196

14 Дубровский В А Дворецкий К Н Щербакова И В Рассеяние света на эритроцитах и их комплексах сравните тьный анализ теорий Ми и К С Шифрина // Материалы Меж д\нар конф «Проблемы и перспективы прецизионной механики и управления в маши нослроении» Саратов 1997 С 198

Дворецкий Константин Николаевич

УВЕЛИЧЕНИЕ РАЗРЕШАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА РЕГИСТРАЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO

03 00 02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико математических наук

Подписано в печать 18 01 2005 г Формат 60x84 1/16 Объем 1 печ п Тираж 100 экз Заказ № 2

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Дворецкий, Константин Николаевич

Введение.

1. Агрегация эритроцитов.

1.1. Основные понятия.

1.2. Механизмы агрегации эритроцитов.

1.3. Физические и биологические параметры влияющие на агрегацию.

1.3.1 Внутренние факторы крови.

1.3.2 Внешние факторы действующие на кровь.

1.4. Механизмы агглютинации эритроцитов.

1.4.1 Силы взаимодействия между реагентами иммунологических реакций.

1.5. Экспериментальные методы.

1.5.1 Микроскопические методы.

1.5.2 Седиментационные методы.

1.5.3 Центрифугационные методы.

1.5.4 Вискозиметрические методы.

1.5.5 Оптические и ультразвуковые методы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Увеличение разрешающей способности фотометрического метода регистрации агглютинации эритроцитов человека in vitro"

Актуальность темы

Одной из важных медицинских проблем является повышение надежности диагностических методов, основанных на явлении специфического взаимодействия антигенов и антител. Как известно, широкое распространение в практической иммунологии получили методы, основанные на контакте препаратов антител и антигенов, и наблюдение тем или иным способом образовавшихся комплексов антиген-антитело. Однако традиционные методы обнаружения иммунологических реакций зачастую требуют значительного времени, большого расхода исходных компонентов или требуют сложной методики пробоподготовки [1].

Агглютинация (склеивание) клеток in vitro (в пробирке), как результат иммунного процесса по принципу "антиген-антитело", лежит в основе многих медицинских диагностических методик и биологических исследовательских тестов. Среди методов регистрации процесса агглютинации наиболее информативными и часто используемыми на практике являются оптические. Такие как, например, фотометрический [2-4], нефелометрический [5-7] и флуоресцентный [8-9] методы. По сравнению с другими классическими методами регистрации процессов агглютинации клеток (например: центрифу-гационные, седиментационные и вискозиметрические методы), оптические методы обладают рядом преимуществ:

1. высокая абсолютная чувствительность [10];

2. при измерении не требуется сложная методика пробоподготовки;

3. позволяет получать информацию без воздействия, приводящего к изменению образца;

4. оптическая аппаратура малоинерционна и удобна для непрерывной регистрации как in vivo (в организме), так и in vitro, что позволяет следить за изменением состояния биологических суспензий, происходящим за короткие промежутки времени.

Иногда, в патологических случаях, наблюдаемое специфическое взаимодействие антигенов и антител может идти со слабой агглютинационной способностью реагентов. В этом случае уровень разрешающей способности большинства методов может оказаться недостаточным для уверенной регистрации агглютинационного процесса.

Поэтому повышение чувствительности методов анализа иммунного процесса, сокращение времени проведения диагностического теста являются актуальными задачами, как с биомедицинской точки зрения, так и аппаратурной.

Настоящая диссертационная работа посвящена повышению чувствительности, разрешающей способности (отношение величины отклика фотоприемника при специфической реакции агглютинации к величине отклика при спонтанной реакции агглютинации) фотометрического метода регистрации процесса агглютинации клеток, усиленного с помощью ультразвукового излучения.

В качестве экспериментального материала выбраны нормальные эритроциты человека и изогемоагглютинирующая сыворотка крови человека (агглютинины системы АВО групповой принадлежности крови), так как доступность этих материалов делают их удобным объектом для изучения.

Целью настоящей диссертационной работы является: увеличение разрешающей способности оптических методов регистрации процессов агглютинации эритроцитов человека с агглютининами системы АВО групповой принадлежности крови in vitro усиленных в поле стоячей ультразвуковой волны.

Задачи решаемые в работе:

Экспериментальный анализ возможности увеличения разрешающей способности фотометрического и нефелометрического метода регистрации процессов агглютинации эритроцитов человека in vitro с помощью стоячей ультразвуковой волны;

Оптимизация параметров выбранной оптической схемы, методики пробо-подготовки и методики проведения реакции агглютинации эритроцитов in vitro с целью увеличения разрешающей способности метода;

Построение, для интерпретации полученных экспериментальных данных, теоретической модели, которая позволяет моделировать экспериментально регистрируемые величины отклика фотоприемника в зависимости от:

• скорости расслоения суспензии клеток в поле стоячей УЗ волны (в зависимости от начального количества эритроцитов в единице объема и вязкости клеточной суспензии);

• кинетики образования как спонтанных, так и вынужденных эритроцитар-ных комплексов (в зависимости от начальных концентраций реагентов, вязкости среды);

• седиментационных процессов за время инкубации (после окончания УЗ воздействия).

Научные результаты и положения выносимые на защиту:

• При воздействии на реакционную смесь поля стоячей ультразвуковой волны создаются условия значительно ускоряющие агглютинационые процессы в суспензии форменных элементов крови. Это приводит к увеличению разрешающей способности фотометрического и нефелометриче-ского методов регистрации реакции агглютинации эритроцитов на несколько порядков.

• Расчет кинетики спонтанного и индуцированного комплексообразования в ходе реакции агглютинации эритроцитов in vitro, учитывающий влияние на динамику распределения эритроцитарных комплексов поля стоячей ультразвуковой волны, поливалентности реагентов и их агглютинацион-ной способности.

• Комплекс алгоритмов и программ, позволяющий моделировать экспериментально регистрируемые величины отклика фотоприемника, при регистрации процессов агглютинации эритроцитов in vitro фотометрическими и нефелометрическими методами, с учетом времени ультразвукового воздействия, процессов седиментации, глубины процесса комплексообразо-вания.

Научная новизна и практическая значимость работы:

• экспериментально показано, что, в случае слабовыраженной агглютина-ционной способности крови, такие стандартные методы регистрации реакции агглютинации эритроцитов человека in vitro как фотометричесские и нефелометрические дают уровень разрешающей способности недостаточный для уверенной регистрации этого процесса;

• впервые применен на практике и теоретически описан механизм усиления процессов агглютинации эритроцитов человека in vitro в поле стоячей ультразвуковой волны с последующей их регистрацией фотометрическим методом;

• экспериментально подобраны оптимальные параметры оптических схем регистрации, методики пробоподготовки и методики проведения теста по наблюдению за процессом агглютинации эритроцитов человека in vitro, усиленного с помощью ультразвукового воздействия, с целью получения максимальной разрешающей способности; экспериментально показано, что полученного выигрыша в разрешающей способности метода вполне достаточно для уверенной регистрации слабо выраженной реакции агглютинации (на примере специфического взаимодействия эритроцитов человека и агглютининов системы АВО групповой принадлежности крови in vitro), где чувствительности большинства стандартных методов явно не хватает;

• адаптирован алгоритм кинетики консекутивно - конкурентных реакций к расчету динамики комплексообразования в ходе агглютинационных процессов эритроцитов человека in vitro с учетом воздействия на реакционную смесь поля стоячей ультразвуковой волны; это позволяет вычислять динамику распределения по размерам эритроцитарных комплексов во времени с учетом поливалентности реагентов и их агглютинационной способности, что, в свою очередь, позволяет обладая данными о валентности и агглютинационной способности реагентов (в данной диссертационной работе это нормальные эритроциты человека и агглютинины системы АВО групповой принадлежности крови) оптимизировать подбор исходных концентраций реагентов для получения максимальной разрешающей способности метода регистрации процесса агглютинации и сокращения времени теста;

• разработан комплекс алгоритмов и программ для моделирования экспериментально регистрируемых величин отклика фотоприемника при регистрации процессов агглютинации эритроцитов in vitro фотометрическими и нефелометрическими методами с учетом воздействия на реакционную смесь поля стоячей ультразвуковой волны.

Апробация работы:

Материалы, изложенные в диссертации, докладывались на следующих конференциях и симпозиумах:

• 6th International Conference on Laser Application in Life Sciences. Jena, Germany. 1996.

• Международная конференция: Проблемы и перспективы прецизионной механики и управления в машиностроении. Саратов, Россия. 1997.

• Biomedical Optics'98: Nonlinear Dynamics and Structures in Biology and Medicine: Optical and Laser Technologies. San Jose, USA. 1996.

• Biomedical Optics'98: Coherence domain optical methods in biomedical science and clinical application II. San Jose, USA. 1998.

• Biomedical Optics'99: Coherence Domain Optical Methods in Biomedical Science and Clinical Applications III. San Jose, USA. 1999.

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 14 работ (4 статьи в журналах, 3 статьи в межвузовских научных сборниках, 3 статьи в сборниках трудов научных конференций и 4 тезисов докладов) в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем работы:

Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 4 главы, заключения и списка цитируемой литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Дворецкий, Константин Николаевич

Основные результаты работы заключаются в следующем:

1. Реализован метод кинетики консекутивно-конкурентных реакций агрегации и агглютинации эритроцитов in vitro, позволяющий моделировать динамику изменения распределения эритроцитарных комплексов во времени в ходе указанных выше процессов. Необходимыми начальными параметров для реализованного модельного описания процесса комплексообразования являются: а) исходные концентрации реагентов ; б) валентности участников комплексообразования и в) константы ассоциации. Из всех перечисленных выше исходных данных только константа ассоциации, в силу перечисленных в гл. 1 обстоятельств, является величиной точный расчет которой составляет достаточно трудоемкую задачу и подбирается эмпирически, исходя из конкретных экспериментальных данных.

2. Проведен анализ возможности регистрации реакций спонтанной и индуцированной агглютиниции эритоцитов in vitro фотометрическими и нефе-лометрическими методами. Экспериментально показано, что для широкого диапазона концентраций эритроцитов (0,005 - 10 %) отличие между регистрируемыми оптическими сигналами не превышает, в лучшем случае, 2-3 раза. В случае образцов крови со слабой агглютинационной способностью эритроцитов это отличие значительно уменьшается и составляет всего несколько процентов. Этой разрешающей способности метода явно не хватает для уверенного отличия процесса спонтанного комплексообразования от индуцированной агглютинации эритроцитов с помощью, например, изогемо-агглютинирующей сыворотки.

3. Экспериментально показано, что при увеличении времени наблюдения за описанными выше процессами (до 20 - 30) минут различие между спонтанной и индуцированной агглютинацией эритроцитов увеличивается, в лучшем случае, до 3 - 4 раз. Это увеличение разрешающей способности метода объясняется возрастающим влиянием седиментационных процессов (зависимостью скоростей осаждения клеточных комплексов от их размера) на уровень регистрируемого сигнала. Этот уровень регистрируемых оптических сигналов для положительной и отрицательной реакции агглютинации не может гарантировать их уверенного различия, особенно при слабой агглюти-национной способности эритроцитов, где он составляет (в лучшем случае) всего 50-70 %.

4. Экспериментально показано, что при воздействии на реакционную смесь внешней силой (в нашем случае радиационной силы давления стоячей УЗ волны) отличие между регистрируемыми фотометрическим методом сигналами от процессов спонтанной и индуцированной агглютинации эритроцитов in vitro увеличивается на 2 - 3 порядка. Это связано с тем, что в поле стоячей УЗ волны происходит расслоение клеточной суспензии, приводящее, в конечном итоге, к локальному скоплению эритроцитов вблизи узловых плоскостей стоячей УЗ волны, что сильно сказывается на скорости образования эритроцитарных комплексов. После окончания воздействия УЗ полем на реакционную смесь, крупные эритроцитарные комплексы, образованные в ходе отрицательной реакции агглютинации, легко распадаются на более мелкие комплексы и одиночные эритроциты и достаточно долго находятся во взвешенном состоянии в зоне наблюдения сильно ослабляя падающий световой поток. В случае положительной реакции агглютинации силы "склеивающие" эритроциты между собой на порядок сильнее, чем в случае отрицательной реакции и поэтому образовавшиеся крупные комплексы быстро покидают зону наблюдения, что, в свою очередь, приводит к значительному просветлению среды. Все это и приводит, в конечном итоге, к столь значительному отличию (в 2 - 3 порядка) между регистрируемыми фотометрическим методом сигналами от положительной и отрицательной реакциями агглютинации эритроцитов.

5. Проведен анализ и оптимизация нескольких возможных оптических схем для регистрации реакций агглютинации эритроцитов in vitro фотометрическим и нефелометрическим методами. Максимальных величин разрешающей способности метода удалось достичь при использовании двухка-нальной оптической схемы (один из каналов измерял прошедший сигнал, другой - регистрировал рассеянный световой поток под углом 50° ). В некоторых тестах она доходила до 6 порядков. Однако, для образцов крови со слабой агглютинационной способностью эта величина составляет всего лишь два порядка и становится сравнимой с разрешением для более простой одно-канальной (фотометрической) схемы, которая для аналогичной слабой реакции агглютинации дает величину разрешающей способности 1-2 порядка, а для образцов крови с нормальной агглютинационной способностью эта величина достигает 2-3 порядка. Поэтому, в конечном итоге, окончательный выбор пал на более простую одноканальную схему, т.к. ее уровня разрешающей способности вполне достаточно для уверенного отличия положительной реакции агглютинации от отрицательной даже для образцов крови со слабой агглютинационной способностью.

6. Для выбранной оптической схемы регистрации процессов агглютинации эритроцитов in vitro экспериментально был проведен анализ зависимости разрешающей способности метода от таких факторов как время облучения УЗ полем реакционной смеси, концентрация эритроцитов. Было выяснено, что в исследуемом диапазоне концентраций эритроцитов (1 - 8 % от цельной крови) отличие между регистрируемыми фотометрическим методом сигналами от положительной и отрицательной реакций агглютинации зависит от времени облучения реакционной смеси УЗ полем. Эта зависимость носит ко-локолообразный характер, т.е. для каждой концентрации эритроцитов имеется свой оптимум времени воздействия УЗ полем. Для разных образцов крови положения оптимумов могут несколько различаться, но с увеличением концентрации эритроцитов увеличивается и время оптимального воздействия на реакционную смесь УЗ полем (для 2 % разведения цельной крови она состов-ляет примерно 70 секунд, для 3 % - 90 секунд и т.д.). Как показывают теоретические расчеты, это связано с тем, что при увеличении концентрации эритроцитов уменьшается скорость их расслоения в поле стоячей УЗ волны, что связано с зависимостью вязкости суспензии клеток от их концентрации.

7. Проведенный анализ повторяемости полученных экспериментальных данных от различных образцов крови и серий изогемоагглютинирующей сыворотки показал, что отличие между регистрируемыми фотометрическим методом сигналами от положительной и отрицательной реакциями агглютинации эритроцитов in vitro может колебаться в очень широких пределах (например, от 10 до 1800 раз). Такой значительный разброс по величине разрешающей способности метода, естественно, не может быть объяснен погрешностями и ошибками в регистрации сигналов и методике пробоподготовки. Здесь в первую очередь играют роль такие факторы как зависимость скорости процесса образования эритроцитарных комплексов от агглютинационной активности эритроцитов и изогемоагглютинирующей сыворотки для разных образцов.

8. Для интерпретации полученных экспериментальных данных была построена теоретическая модель, позволяющая рассчитывать динамику изменения во времени регистрируемого фотометрического сигнала. Она позволяет моделировать экспериментально регистрируемые сигналы в зависимости от таких начальных параметров как:

• скорость расслоения суспензии клеток в поле стоячей УЗ волны в зависимости от начального количества эритроцитов в единице объема и структурной вязкости клеточной суспензии, которая в свою очередь тоже зависит от процесса расслоения клеток крови;

• кинетика образования как спонтанных, так и вынужденных эритроцитарных комплексов в зависимости от начальных концентраций реагентов, вязкостей среды и т.д.;

• учет седимнтационных процессов за время инкубации (после окончания УЗ воздействия), в ходе которых образовавшиеся в результате процесса агглютинации эритроцитарные комплексы разных размеров с разными скоростями (зависящими, естественно в основном от их размеров) оседают, что в свою очередь сказывается на регистрируемом оптичесском сигнале. Полученные теоретические данные хорошо совпадают с имеющимися экспериментальными данными, что говорит об адекватности построенного модельного приближения и возможности его использования для интерпретации полученных опытным путем данных.

Предложенный в настоящей работе фотометрический метод регистрации процесса агглютинации эритроцитов человека in vitro, усиленной в поле стоячей УЗ волны, является перспективным методом исследования любых агглютинационных процессов in vitro на клеточном уровне. Таких как, например, рассмотренная в данной работе агглютинация эритроцитов с помощью агглютининов системы АВО групповой принадлежности крови. Высокая чувствительность предложенного метода регистрации процесса агглютинации позволяет уверенно отличать реакции спонтанной от реакций вынужденной агглютинации эритроцитов in vitro даже в случае образцов крови с очень слабой агглютинационной способностью эритроцитов.

Заключение

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Дворецкий, Константин Николаевич, Саратов

1. D. Voak. The status of new methods for the detection of red cell agglutination. // Transfusion. - 1999. - Vol. 39 - P. 1037-1040.

2. E. Muralidharan, N. Tateishi, N. Maeda. A new laser photometric technique for the measurement of erythrocyte aggregation and sedimentation kinetics. // Biorheology. 1994. - Vol. 31, N 3. - P. 277-285.

3. R.J. Rasia, M. Garcia Rosasco, J.R. Valverde de Rasia, P. Foresto. Evaluation of the kinetics of hemagglutination using a simple photometric technic. // Sangre. 1989. - Vol. 34, N 5. - P. 368-370.

4. O.K. Baskurt, H.J. Meuselman, E. Kayar. Measurement of red blood cell aggregation in a plate plate shearing system by analysis of light transmission. // Clinical hemorheology and microcirculation. - 1998. - Vol. 19 - P. 307314.

5. К J. Halbhuber, J. Frober. Quantification of hemagglutination reactions using the microtiter attachment to the spectral colorimeter based on measurement of scattered light. // Z. med. lab. diagn. 1981. - Vol. 22, N 2. - P. 113-116.

6. K.J. Halbhuber, J. Frober. Nephelometric quantification of the intensity of hemagglutination reactions in microliter samples. // Z. med. lab. diagn. -1983. Vol. 24, N 5. - P. 299-303.

7. P. Das, S. Pal, S.C. Pal. Evaluation of the micro enzyme-linked immunosorbent assay, indirect hemagglutination and indirect fluorescence antibody techniques for serodiagnosis of amebiasis. // J. diarrhoeal. dis. 1984. - Vol. 2, N4.-P. 238-242.

8. Z.N. Berneman, D.R. van Bockstaele, W.M. Uyttenbroeck, C. Van Zaelen, J. Cole Dergent, L. Muylle, M.E. Peetermans. Flow-cytometric analysis oferythrocytic blood group a antigen density profile. // Vox. sang. 1991. -Vol. 61,N4.-P. 265-274.

9. P. Latimer. Light scattering vs. microscopy for measuring average cell size and shape. // Biophys. j. 1979. - Vol. 24 - P. 117-126.

10. E.W. Merill, E.R. Gilliland, T.S. Lee, E.W. Salzman. Blood rheology: Effect of fibrinogen deduced by addition. // Circ. res. 1966. - Vol. 18, N 4. - P. 437-446.

11. S. Chien, K.M. Jan. Red cell aggregation by macromolecules: Roles of suface adsorption and electrostatic repulsion. // J. supramol. struc. 1973. - Vol. 1, N4.-P. 385-409.

12. D.E. Brooks. Electrostatic effects in dextran mediated cellular interactions. // J. colloid interface sci. 1973. - Vol. 43 - P. 714-726.

13. A.P. Gast, L. Leibler. Interaction of sterical stabilized particles suspended in a polymer solution. // Macromolecules. 1986. - Vol. 19, N 3. - P. 686-691.

14. E.A. Evans, D. Needham. Scaling theory for adhesion of bilayer membranes induced by equilibrium exclusion of large polymers from the contact zone. // Microvasc. res. 1988. - Vol. 21 - P. 1822-1839.

15. H. Baumler, E. Donath. Does dextran indeed significantly increase the surface potential of human red blood cells? // Studia biophysica. 1987. - Vol. 120 -P. 113-122.

16. E. Simon. Influence of lipoprotein subfractions on dextran- and fibrionogen-induced erythrocyte aggregation. // Clin, hemorheol. 1995. - Vol. 15 - P. 667-676.

17. W.H. Reinhart, A. Singh. Erythrocyte aggregation: the roles of cell deform-ability and geometry. // Eur. j. clin. invest. 1990. - Vol. 20, N 4. - P. 458462.

18. M.W. Rampling, M.J. Pearson. Enzymatic degradation of the red cell surface and its effect on rouleaux formation. // Clin, hemorheol. 1994. - Vol. 14 -P. 531-538.

19. D Lerche et al. Determination of sedimentation, aggregation and packing behaviour of blood and erythrocyte suspensions. In: Advances in physiological fluid dynamics. P. 48-53. Narosa publishing house. - 1995.

20. B.A. Левтов, C.A. Регирер, H.X. Шадрина. Реология крови. Издательство Медицина. -Москва. -1982.

21. J. Juutilainen, T. Lahtinen. Effect of low frequency electric fields on the sedimentation rate of human blood. // J. Biometeorol. 1986. - Vol. 29, N 3. -P. 243-252.

22. M. Singh, E. Muralidharan. Mechanism of erythrocyte aggregate formation in presence of magnetic field and dextrans as analyzed by laser light scattering. // Biorheology. 1988. - Vol. 25, N 1-2. - P. 237-244.

23. V.A. Doubrovski, K.N. Dvoretski. Ultrasonic wave action upon the red blood cell agglutination in vitro. // Ultrasound, med. biol. 2000. - Vol. 26, N 4. -P. 655-669.

24. F.J. Neumann, H. Schmid-Schonbein, H. Ohlenbusch. Temperature-dependence of red cell aggregation. // Pflugers. arch. 1987. - Vol. 408, N 5. -P. 524-530.

25. А. Ройт. Основы иммунологии. Издательство Мир. — Москва. 1991.

26. S. Chien. Force balance at the surfaces aggregating cells. // Bibl. anat. -1973.-Vol. 11 P. 303-309.

27. G.I. Mchedlishvili. Elaborated -"georgian index" of erythrocyte aggregability characterizing the microrheological disorders associated with brain infarct. // Clin, hemorheol. 1995. - Vol. 15 - P. 783-793.

28. S. Chen, В. Gavish, S. Zhang, Y. Mahler, S. Yedgar. Monitoring of erythrocyte aggregate morphology under flow by computerized image analysis. // Biorheol. 1995. - Vol. 32, N 4. - P. 487-496.

29. A. Westergren. Studies of the suspension stability of the blood in pulmonary tuberculosis. // Acta med. scand. 1921. - Vol. 54 - P. 247-282.

30. ICSH. Isch recommendations for measurement of erythrocyte sedimentation rate. // J. clin. pathol. 1993. - Vol. 46, N 3. - P. 198-203.

31. P.T. Тухватулин, B.A. Левтов, B.H. Шуваева, H.X. Шадрина. Агрегация эритроцитов в крови помещенной в макро и микрокюветы. // Физиологический журнал СССР им. И.М. Сеченова. - 1986. - Vol. 72, N 6. - Р. 775-784.

32. Е. Muralidharan. Simultaneous determination of hematocrit, aggregate size and sedimentation velocity by he-ne laser scattering. // Biorheology. 1994. -Vol. 31, N5.-P. 587-599.

33. M. Boynard, J. C. Lelievre. Size determination of red blood cell aggregates induced by dextran using ultrasound backscattering phenomenon. // Biorheol.- 1990. Vol. 27, N 1. - P. 39-46.

34. A.J. Sirs. Automatic recording of the rate of packing of erythrocyte in blood by a centrifuge. // Phys. med. biol. 1969. - Vol. 15, N 1. - P. 9-14.

35. D. Lerche, R. Bilsing. Separation of red blood cells at high volume conentra-tion under low centrifugal accelerations. // Biorheol. 1988. - Vol. 25, N 1-2.- P. 245-252.

36. Fromer et al. Bsg- und hamatokritbestimmung an einer blutprobe innerhalb von zehn minuten. In Vergleich zu Referenzmethoden. Poster auf der 14. Jahrestagung der Deut. Ges. Klin. Mikrozirkulation und Hamorheologie. Berlin. 1995.

37. S. Chien. Shear dependence of effective cell volume as a determinant of blood viscosity. // Science. 1970. - Vol. 168, N 934. - P. 977-979.

38. D. Quemada. A Theological model for studying the hematocrit dependence of red cell-red cell and red cell-protein interactions in blood. // Biorheol. 1981. -Vol. 18,N3-6.-P. 501-516.

39. P. Mills. Etude de la cinetique d'aggregation erythrocytaire dans un ecoule-ment de couette. // Rev. phys. app. 1980. - Vol. 15 - P. 1357-1366.

40. W.G. Zijlstra, S.G. Heeres. The influence of plasma substitutes on the suspension stability of human blood.//Proc. kon. ned. akad. wet. 1965. - Vol. 68-P. 413-422.

41. D. Lerche, H. Baumler. Moderate heat treatment of only red blood cells (rbc) slows down the rate of rbc-rbc aggregation in plasma. // Biorheol. 1984. -Vol. 21, N3.-P. 393-403.

42. A. Gaspar-Rosas, G.B. Thurston. Erythrocyte aggregate rheology by transmitted and reflected light. // Biorheol. 1988. - Vol. 25, N 3. - P. 471-478.

43. H. Schmid-Schonbein et al. Erythrocyte aggregation: causes, consequences and methods of assessment. // Tijdschr nvkc. 1990. - Vol. 15 - P. 88-97.

44. R.E.N. Shehada et al. Aggregation effects in whole blood: influence of time and shear rate measured using ultrasound. // Biorheology. 1994. - Vol. 31, N l.-P. 115-135.

45. E.A. Evans, Y.C. Fung. Improved measurement of the erythrocyte geometry. // Microvasc. res. 1972. - Vol. 4 - P. 335.

46. Д.И. Гольдберг, Е.Д. Гольдберг. Справочник по гематологии. Издательство ТГУ. Томск. - 1980.

47. A.JI. Чижевский. Биофизические механизмы реакции оседания эритроцитов. Издательство Наука. Новосибирск. - 1980.

48. М. Hammer, D. Schweitzer, В. Michel, Е. Thamm, A. Kold. Single scattering by red blood cells. // Applied optics. 1998. - Vol. 37, N 31. - P. 74107418.

49. R. A. Meyer. Light scattering from red blood cell ghosts: sensitivity of angular dependent structure to membrane thickness and refractive index. // Appl. opt.-1977.-Vol. 16-P. 2036-2038.

50. D.H. Tycko, M.H. Metz, Е.А. Epstein, A. Grinbaum. Flow-cytometric light scattering measurement of red blood cell volume and hemoglobin concentration. // Appl. optics. 1986. - Vol. 24, N 9. - P. 1355-1365.

51. R. Barer, S. Joseph. Refractometry of living cells. // Q. j. microsc. sci. — 1954. Vol. 95 - P. 399-406.

52. Г.С. Дубова, А.Я. Хайрулина, С.Ф. Шумилина. Опреоделение спектров поглощения гемоглобина методами светорассеяния. // ЖПС. 1977. -Vol. 27, N5.-Р. 871-878.

53. Г. Ван де Хюлст. Рассеяние света малыми частицами. Иностр. Лит. -Москва. 1961.

54. И.А. Немченко, В.А. Захарова, Ф.Я. Сидько. О применении методов геометрической оптики для определения коэффициентов поглощения частиц биологического происхождения. // Изв. АН СССР. Сер. Биол. Наук. 1971.-Vol. 15, N2.-Р. 158-161.

55. В.Н. Лопатин, Ф.Я. Сидько. Введение в оптику взвесей клеток. Наука. -Новосибирск. -1988.

56. K.N. Frank, М. Kessler, К. Appelbaum, Н.Р. Albrecht, E.D. Mauch. Measurements of angular distribusion of rayleigh and mie scattering events in biological models. // Phys. med. biol. 1989. - Vol. 34, N 12. - P. 1901-1916.

57. E.M. Purcell, Pennypacker C.R. Scattering and absorption of light by non-spherical dielectric grains. // Astrophys. j. 1973. - Vol. 186 - P. 705-714.

58. B.T. Draine, P.J. Flatau. Discrete-dipole approximation for scattering calculations. // J. opt. soc. amer. a. 1994. - Vol. 11, N 4. - P. 1491-1499.

59. S. Zeitz, A. Belmont, C. Nicilini. The influence of plasma substitutes on the suspension stability of human blood. // Cell biophys. 1983. - Vol. 5 - P. 163.

60. П. Уотермен. Матричная формулировка задачи рассеяния. // ТИИЭР. -1965.-Vol. 53, N8.-Р. 925.

61. M.I. Mischenko, L.D. Travis. T-matrix computation of light scatteing by large spheroidal particles. // Opt. commun. 1994. - Vol. 109 - P. 16-21.

62. G. Mie. Beitrage zur optik truber medien, speziell kolloidaler metallosungen. //Ann. d. physik. 1908.-Vol. 25, N 3.-P. 377-445.

63. J. Ulieny. Lorenz-mie light scattering in cellular biology. // Gen. physiol. biophys.- 1992.-Vol. 11-P. 133-151.

64. A. Dunn, R. Richards-Kortum. Three-dimentional computation of light scattering from cells. // Ieee journal of selected topics in quantum electronics. -1996. Vol. 2, N 4. - P. 898-905.

65. L.O. Reynolds, C. Johnson, A. Ishimaru. Diffuse reflectance from a finite blood medium: applications to the modeling of fiber optic catheters. // Appl. opt. 1976. - Vol. 15 - P. 2059-2067.

66. J.M. Steinke, A.P. Shepherd. Comparison of mie theory and the light scattering of red blood cell. // Applied optics. 1988. - Vol. 27, N 19. - P. 40274033.

67. A.G. Borovoi, E.I. Naats. Scattering of light by a red blood cell. // J. biomed. opt. 1998. - Vol. 3 - P. 364-372.

68. G.J. Steekstra, A.G. Hoeksta, E. Nijhof, R.M. Heethaar. Light scattering by red blood cells in ektacytometry: Fraunhofer versus anomalous diffraction. // Applied optics. 1993. - Vol. 32 - P. 2266-2272.

69. K.C. Шифрин. Рассеяние света в мутной среде. Гостехтеоретиздат. Москва. -1951.

70. V. J. Twersky. Absorption and multiple scattering by biological suspension. // Opt. Soc. Amer. 1970. - Vol. 60. - P. 1084.

71. В.А. Дубровский, К.Н. Дворецкий, И.В. Щербакова. Упругое рассеяние света на реакционной смеси в процессе иммунологической реакции in vitro. In Актуальные вопросы научных исследований, Межвуз. науч. сб. — Р. 55-62. Саратов. - 1997. изд. СГТУ.

72. В.А. Дубровский, К.Н. Дворецкий, И.В. Щербакова. Упругое рассеяние света на реакционной смеси в процессе иммунологической реакции in vitro. // Оптика и спектроскопия. 1999. - Vol. 86, N 1. - Р. 85-88.

73. J.A. Nelder, R. Mead. A simplex method for function minimization. // Computer journal. 1965. - Vol. 7 - P. 308-313.

74. В.А. Дубровский, К.Н. Дворецкий, И.В. Щербакова. Компьютерное моделирование кинетики иммунологического процесса in vitro для бивалентных реагентов. В: Актуальные вопросы научных исследований, Межвуз. науч. сб. Р. 48-54. - Саратов. - 1997. изд. СГТУ.

75. O. Syoten. A physical theory of erythrocyte sedimentation. // Biorheology. — 1985.-Vol. 22-P. 315-321.

76. В.А. Дубровский, К.Н. Дворецкий. Упругое светорассеяние для регистрации индуцированной ультразвуком агглютинации эритроцитов in vitro. // Оптика и спектроскопия. 2000. - Vol. 89, N 1. - Р. 109-113.

77. О.Е. Федорова, А.В. Приезжев. Численное моделирование процесса рассеяния света на суспензиях аггрегирующих эритроцитов. // Вестн. Моск. ун-та. Физ. Астрон. 2002. - Vol. 1, N 2. - Р. 43^16.

78. М.И. Леви. Серология как раздел иммунологии, посвященный взаимодействию со специфическими антителами. // Ж. общ. биол. 1979. — Vol. 40 - Р. 423-428.

79. V.K. Stokes. Couple stresses in fluids. // Phys. fluids. 1966. - Vol. 9 - P. 1709-1715.

80. E.C. Everbach, R.E. Apfel. An interferometric technique for b/a measurement. //J. acoust. soc. am.-1995.-Vol. 98-P. 3428.

81. И.Е. Эльпинер. Ультразвук, физико-химическое и биологическое действие. Наука. -Москва. 1963.

82. И.Е. Эльпинер. Биофизика ультразвука. Наука. -Москва. 1963.

83. Л.А. Пирузян. Исследование действия ультразвука на антигенную активность эритроцитов человека. // Биофизика. 1986. - Vol. 31, N 2. - Р. 269-273.

84. В.А. Буц, К.П. Скибенко. Изменение иммуногенности клеток и суперна-танта под воздействием ультразвука. // Биофизика. — 1991. Vol. 36, N 5. -Р. 863-865.

85. S. Pinamonti, Р.Е. Gallenga, V. Mazzeo. Effect of pulsed ultrasound on hu-man-erythrocytes invitro. // Ultrasound in medicine and biology. 1982. -Vol. 8,N6.-P. 631-8.

86. В.А. Буц. Физико-химические основы действия физических факторов на живой организм и его антиокислительные системы. Vol. 78. - Р. 5154. Москва. -1974.

87. В.А. Дубровский, К.Н. Дворецкий, А.Э. Балаев. Исследование механизма усиления агрегации эритроцитов ультразвуковым полем. // Акустический журнал. 2004. - Vol. 50, N 2. - Р. 184-192.

88. Л.Д. Ландау, Е.М. Лифшиц. Механика сплошных сред. Гостехтеориздат. Москва. - 1954.

89. L.V. King. On the acoustic radiation pressure on spheres. // Proc. Roy. Soc. -1932.-Vol. A147.-P.212.

90. K. Yosioka, Y. Kawasima. Acoustic radiation pressure on a compressible sphere.// Accustica. 1955. - Vol. 5. - P. 167-173.

91. Л.П. Горьков. О силах, действующих на малую частицу в акустическом поле в идеальной жидкости.// Доклады Академии наук СССР. 1961. -Т. 140.-С. 88-91.

92. J.J. Hawkes, M.S. Limaye, W.T. Coakley. Filtration of bacteria and yeast by ultrasound-enhenced sedimentation. // J. appl. microb. 1997. - Vol. 82 - P. 39.

93. S.E. Charm and G.S. Kurland. Blood flow and micricirculation. Wiley. -New York. -1974.

94. G.R. Cokelet. Macroscopic rheology and tube of human blood. In: Microcirculation. - New York - London. - 1976.

95. E.T. Nerys, W.T. Coakley. Measurement of antigen concentration by an ultrasound-enhanced latex immunoagglutination assay. // Ultrasound in med. and biol. 1996. - Vol. 22, N 5. - P. 1277.

96. K.K. Shung, B.A. Krisko, J.O. Ballard. Acoustic measurement of erythrocyte compressibility. // J. acoust. soc. am. 1982. - Vol. 72 - P. 1364.

97. V.A. Doubrovski, K.N. Dvoretski, V.F. Kirichuk, I.V. Scherbakova. Immune kinetic processes in vitro computer simulation. In: 6th International Conference on Laser Application in Life Sciences. Vol. 2. - P. 39. - Jena, Germany. - 1996.

98. В.М. Волощук, Ю.С. Седунов. Процессы коагуляции в дисперсных системах. Гидрометеоиздат. Ленинград. - 1975.

99. D. Kernick, A.W.L. Jay, S. Rowlands. Experiments on rouleu formation. // Can. j. physiol. pharmacol. 1973.-Vol. 51,N9.-P. 690.

100. Е.Н. Еремин. Основы химической кинетики. Высшая школа. Москва. - 1976.

101. Г.М. Панченков, В.П. Лебедев. Химическая кинетика и катализ. Химия. -Москва. 1985.

102. Е.Т. Денисов. Кинетика гомогенных химических реакций. Высшая школа. Москва. - 1988.

103. R.J. Goldberg. A theory of antibody-antigen reaction, i. theory for reaction of multivalent antigen with bivalent and univalent antibody. // Journal of the american chemiccal society. 1952. - Vol. 74, N 22. - P. 5715-5725.

104. H. Lamb. Hydrodynamics. Cambridge. 1945. P.604-605.

105. S. Goldstein. The force on a solid body moving through viscous fluid.// Proc. Roy. Soc. 1929. - Vol. A123. - P. 216-235.

106. D. Kernick, A.W.L. Jay, S. Rowlands. Erythrocyte setting.// Can. J. Phsiol. Pharmacol. 1974.-Vol. 52. - P. 1167-1177.

107. H.A. Steinour. Rate of sedimentation. Non-flocculated suspension of uniform spheres.// Ind. Eng. Chem. 1944. - Vol. - 36. - P. 618-624.

108. P.G.W. Hawksley. The effect of concentration on the setting of suspension and flow through porous media. In: Some aspects of fluid flow. Vol. 1. E. Arnold. - London. - 1951.

109. L. Dintenfass. Erythrocyte sedimentation rate: a new correction for anemia. // Biorheology. 1970. Vol. 6. - P. 270.