Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и текучие свойства крови при длительном обезвоживании

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Структура и текучие свойства крови при длительном обезвоживании"

им

Ярославский ордена Трудового Красного Знамени

государственный педагогический университет имени К.Д.Ушинского

на правах рукописи

ТИХОМИРОВА Ирина Александровна

СТРУКТУРА И ТЕКУЧИЕ СВОЙСТВА КРОВИ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ОБЕЗВОЖИВАНИИ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ярославский ордена Трудового Красного Знамени

государственный педагогический университет имени К.Д.Ушинского

на правах рукописи

ТИХОМИРОВА Ирина Александровна

СТРУКТУРА И ТЕКУЧИЕ СВОЙСТВА КРОВИ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ОБЕЗВОЖИВАНИИ

03.00.13 — физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена на кафедре медико — биологических основ спорта Ярославского ордена Трудового Красного Знамени государственного педагогического университета имени К.Д.Ушинского

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор •

кандидат биологических наук, доцент

В.Н.Левин

A.В.Муравьев

B.П.Михайлов А.Д.Викулов

Ведущая организация — научно—исследовательский институт нормальной физиологии Российской АМН (Москва)

Защита состоится " " 1996 г в " " часов

на заседании диссертационного совета К 113.27.03 при Ярославском ордена Трудового Красного Знамени государственном педагогическом университете имени К.Д.Ушинского

(150000, Ярославль, ул. Республиканская, 108)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан " " 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. биол. наук, доцент

Л.Г.Зайцев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Значимость микрогемоциркуляции для . кизнедеятельности организма общепризнана ввиду ее участия — фактически во всех физиологических и патологических процессах у тловека. и животных (В.В.Куприянов и 'др., 1975, А.М.Чернух,1979, Vf.Intaglietta, В.Zweifach, 1987, P.Gaehtgens, 1990). В комплексе актуальных направлений микроциркуляции наиболее важной является троблема изучения реологических свойств крови в микрососудах, где местные изменения кровотока нередко обусловлены нарушениями гекучих свойств крови (S.Chien, 1977, L.Dintenfassr1981r. В.А.Аевтов и ф.,1982, Г.И.Мчедлишвили, 1995).

Исключительно важную роль в изменениях реологических свойств . фови в микрососудах при физиологических и особенно патологи — юских состояниях играют агрегатные свойства крови.

Механизмы возникновения и развития агрегации эритроцитов :ложны и многообразны. Чрезмерное образование агрегатов ведет к гаеличению периферического сопротивления и замедлению крово — ■ока, распространенной ишемии и гипоксии, нарушая функции ор — анов и тканей, является отправной точкой для создания патологи — сеских порочных кругов (Ю.М.Казаков,1981, L.Dintenfass,1981, ".А.Селезнев и Ap.,1985,G.Nash et al.,1990). Выраженная и распро— • храненная агрегация эритроцитов способствует скоплению фор — генных элементов в системе путей микроциркуляции, описанному в лтературе как феномен "секвестрированной крови", что ведет к нижению числа циркулирующих эритроцитов, в результате иаме — [яется характер обмена, повышается удельный вес анаэробных [роцессов и формируется тканевая (Г.М.Покалев, 1978) или капил— ярно—трофическая недостаточность (В.П.Казначеев, А.А.Дзи— инский,1975).

Повышенной агрегации отводится большая роль в патогенезе ромбообразования. Активирующее влияние агрегатов на систему емостаза связывают со вторичными нарушениями гемодинамики и ' шкроциркуляции с развитием локального стаза и гипоксии, спо — обствующих гиперкоагуляции, повреждаемостью в кровотоке аг— егированных эритроцитов с освобождением из них прокоагулянтов M.Knisely et al.,1947, М.И.Лыткин и др.,1980, H.Schmid — Schönbein et 1., 1990).

Феномен внутрисосудистой агрегации эритроцитов в настоящее ■ ремя является предметом многочисленных теоретических и при— ладных исследований (J.Stoltz,1991, S.Chien,LSung, 1987, G:Nash et . 1.,1987,1991, D.Brooks, 1987, A.Chabanel, M.Samama, 1995, T.Maeda et . 1.Д995, G.Tempelholf,L.Heilman,1995). В большинстве проведенных кспериментов внимание в основном акцентировалось на агрегато—

образующих свойствах белков плазмы и различных водорастворимых полимеров — агрегантов (Н.К1озе е1 а1., 1972, Ь.ОпиеМазэ, 1976, N.Maeda е1 а1., 1986,1994, В.А.Галенок и др., 1987, Н.Бспис!- ЗсЬопЬет е1 а1.,1990, С.НаэЬ е1 а!.,1991).

Растущий интерес к изучению влияния клеточных факторов эритроцитов на их способность к агрегации в последнее время вызван работами {С.КабЬ а!., 1987, Я.ВаиегеасЬз е1 а1.,1989, S.Sowemimo — Сокег ег а1.,1989, Р.тШтдвйШ, Н.Ме15е1тап,1991, РЛ\НиШпд81а11 е1 а1.,1994), продемонстрировавшими значительный вклад свойств красных клеток крови в развитие процесса агрегато — образования.

На международном симпозиуме по гемореологии и агрегации эритроцитов (Париж, 1992) оценка влияния белков плазмы и клеточных факторов была выделена в качестве приоритетной задачи, а • также подчеркнута необходимость детального изучения агрегатных • свойств возрастных фракций эритроцитов.

Известно, что старение красных клеток крови сопряжено с целым рядом биохимических превращений и их дегидратацией (Н.А.Федоров, 1976, И.СоЬеп е1 а1., 1976), при этом их способность к образованию агрегатов, как было показано в ряде экспериментов существенно возрастает (С-ИаБЬ е! а!., 1987, И-ВаиегеасЬв е! а1.,1989, РЛ^ЫШпд51а11 е1 а1.,1994). Исследования агрегатных свойств возрастных фракций эритроцитов в основном проводились в норме. Сообщений о влиянии экстремальных воздействий на агрегабель — ность молодых, зрелых и старых клеток нами не встречено.

Выбор модели экспериментальной дегидратации для изучения агрегатных свойств крови обусловлен тем, что выраженный феномен внутрисосудистой агрегации эритроцитов наблюдается при ряде физиологических и патологических состояний, сопровождающихся обезвоживанием различной степени (Е.В1осЬ,1956, Г.Я.Левин и др.,1984, В.А.Галенок и др.,1987, В.Д.Малышев, А.П.Плесков,1992, • В.А.Люсов и др., 1993, Л.Вгап ег а1.,1995, Ь.Багдепк» е1 а1.,1995).

Все вышеизложенное и предопределило тематику настоящего исследования. . .

Цель работы. Комплексное исследование процесса агрегато— образования эритроцитов при алиментарной дегидратации.

Задачи исследования.

— изучить изменения агрегатных свойств крови в динамике'дегидратации организма;

— оценить роль плазменных и клеточных факторов в процессе агрегатообразования на разных этапах водной депривации,-

— проанализировать изменения агрегабельности эритроцитов по мере старения и проследить динамику агрегатных свойств возрастных фракций красных клеток крови в ходе обезвоживания;

— на основе комплексного исследования произвести сравнительный анализ различных методов, используемых в настоящее время 1дя изучения агрегатных свойств крови.

Научная новизна исследования.

Впервые на основе комплекса методов исследования выявлен характер изменений агрегатных свойств крови при дегидратации >рганизма.

Дана оценка влияния плазменных и клеточных факторов на интенсификацию процесса агрегатообразования в зависимости от тепени обезвоживания. .

Получены новые сведения о динамике изменений агрегатных :войств возрастных фракций эритроцитов при эксикозе.

Произведен сравнительный анализ ■ ряда методов изучения [роцесса агрегатообразования с оценкой их информативности и декватности. Усовершенствован комплекс' методов исследования с 1елью повышения их точности и чувствительности.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Теоретическая значимость работы определяется тем, что впервые [роведено комплексное исследование агрегатных, суспензионных, 1иохимических и реологических свойств крови при эксикозе.

Выявлена динамика влияния плазменных и клеточных факторов в оде дегидратации. Обсуждены механизмы объединения эритроцитов агрегаты при обезвоживании различной степени, что может слу— шть основанием для разработки корригирующей терапии.

Дана оценка изменения агрегатных свойств возрастных фракций расных клеток крови в динамике дегидратации.

Результаты исследования позволяют углубить представление о ерестройке системы крови при эксикозе.

Материалы диссертации могут быть использованы при состав— • ении учебных руководств и пособий, для преподавания соответ—- ■ твующих разделов физиологии, а также для дальнейших исследо — аний в данной области.

Апробированные методики можно рекомендовать исследователям медицинским работникам для оценки агрегатных свойств крови.

Положения работы, выносимые на защиту:

1. Обезвоживание организма сопровождается интенсификацией роцесса агрегатообразования эритроцитов. Рост агрегации и ха — актер объединения клеток в конгломераты определяются измене — иями в системе крови и зависят от степени дегидратации.

2. Влияние плазменных и клеточных факторов на процесс arpe — 1тообразования варьирует на различных этапах обезвоживания. По ере усиления дегидратации повышается роль клеточных факторов.

3. Возрастные фракции эритроцитов различаются по способности бъединяться в агрегаты: в норме агрегабельность значительно

увеличивается по мере старения клеток. При эксикозе указанные различия сглаживаются.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции ЯГПУ (Ярославль.1994), Международной научно—практической конференции "Физическая культура и спорт учащейся молодежи в развивающемся мире" .(Шуя, 1994), . Поволжской конференции "Экспериментальные и клинические аспекты адаптации микрогемоциркуляции" (Ярославль, 1995), научной конференции ЯГПУ (Ярославль, 1996).

По теме диссертации опубликованы 3 печатные работы.

Структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием методов исследования, 4 глав с изложением по — ' лученных фактов, обсуждения, выводов, списка литературы. Библиографический указатель включает в себя наименований. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общий план исследования. Работа выполнена на 98 взрослых белых крысах—самцах массой 250—300 г. Состояние обезвоживания моделировали полным исключением воды из рациона животных при свободном доступе к сухому корму. Данная модель апробирована и описана в ряде исследований (В.В.Куприянов и др., 1979, М.А.Магомедов, 1979, А.Н.Тихомиров, Е.А.Соколова, 1984).

Комплекс биохимических, агрегационных, вискозиметрических и ' суспензионных параметров определяли на трех этапах: на 3, б и 10 сутки безводного содержания.

Кровь отбирали венопункцией, в качестве антикоагулянтов .использовали гепарин и цитрат натрия.

Методы исследования.

1. С целью оценки вклада плазменных и клеточных составляющих в процесс агрегатообразования наряду с нативной кровью исследовали взвеси эритроцитов со стандартным показателем гематокрита (№=40) в различных дисперсионных средах (аутологичной плазме и растворе Рингера).

2. Разделение красных клеток крови на возрастные фракции производили по градиенту плотности по методу Л.МигрЬу (1973) центрифугированием при 12 000д в течение 15 мин на центрифуге типа К—24 (Германия).

3. Показатель гематокрита в исследуемых пробах крови и взвесей эритроцитов определяли с помощью микрогематокритной центрифуги • ТН—21 (Германия) при 10 000д в течение 7 минут.

4. Оценка агрегатообразования при микроскопии взвеси клеток в . аутологичной плазме (Ht ==0.5%) включала в себя подсчет числа аг— ■ регатов и неагрегированных эритроцитов в камере Горяева и диф — ференцировку качественных характеристик наблюдаемых агрегатов (И.Я.Ашкинази, 1977) с использованием метода фоторегистрации (р/п №82 по Ярославскому госпедуниверситету от 23.11.95г).

5. Для оценки степени агрегации фотометрическим методом исследуемые образцы крови и взвесей эритроцитов помещали в изл-мерительный блок автоматического агрегометра MA—1 (H.Schmid— Schönbein et al., 1990). Измерения производили в режиме стаза после высокосдвигового вращения (600 с-1) и при низких скоростях сдвига (3 с-1) в двух временных интервалах: 5 и 10с. Для оценки влияния приложенных сдвиговых усилий на развитие процесса агрегации рассчитывали динамические параметры R5 и RIO, равные отношению степеней агрегации в различных сдвиговых условиях для каждого временного интервала.

6. Суспензионную стабильность крови оценивали по высоте столбика форменных элементов при седиментации в капилляре . Панченкова. Регистрацию осуществляли через 15, 30, 45, 60 и 120 минут с последующим построением СОЭ — грамм. Оценку степени ггрегации форменных элементов крови производили по LDintenfass (1962) в виде отношения объема эритроцитов, полученного в результате принудительного осаждения (центрифугирования), к ана— югичному показателю после седиментации в покое.

7. Определение кажущейся вязкости крови, плазмы и взвесей эритроцитов производили на капиллярном ' вискозиметре, разрабо — ганном и изготовленном на кафедре МБОС ЯГПУ (И.Ю.Смирнов, Ш.Сулоев, 1991).

Измерения производили при постоянной температуре t=21°C. Кажущуюся вязкость объектов исследования определяли при трех величинах напряжения сдвига: 0.53Па, 0.21Па, О.ИПа. Полученные шачения вязкости позволили рассчитать относительную вязкость срови (т]о), индекс ригидности Tk (LDintenfass, 1985), показатель :труктурной вязкости а (А.А.Аграненко и др.,1981), реологический созффициент PK (В.А.Шабанов, 1972), коэффициент К, равный от — юшению вязкостей взвесей эритроцитов в аутологичной плазме и ^агрегирующей среде (Л.Н.Катюхин,1995), коэффициент агрегации из значений предельного напряжения сдвига и показателя гема— окрита (Р.А.Григорьянц и др., 1978). Предел текучести т0 определяли 1ри построении кривой течения в координатах т1/2 ~у1/2 (E.Bantoft, ' 959, E.Merril et al., 1967). '

8. Осмоляльность плазмы измеряли с помощью осмометра ОМ 801 ¡зирмы Vogel (Германия).

9. Общее содержание белка в плазме оценивали по методу Лоури, фракционирование осуществляли методом "высаливания" (Й.Тодоров,1961). Уровень фибриногена в плазме определяли по методу Рутберга (И.А.Кассирский, 1970).

10. Статистическую обработку и корреляционный анализ полученных данных производили на компьютере с помощью диалоговой статистической системы STADIA и программы STATIST.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Поскольку содержание воды достигает 2/3 массы тела, состояние обезвоживания организма и степень дегидратации может оцениваться по потерям массы тела (М.А.Магомедов,1979, В.Ф.Жалко — Титаренко,1989). Зафиксированное на 3 сутки безводного содержания (СБС) снижение массы тела животных (8%,Р<0.001) соответствует !! степени дегидратации, дальнейшая потеря массы тела на последующих этапах эксперимента (20% и 29%,Р<0.001) указывает на достижение !!! степени, или так называемой тяжелой дегидратации.

Оценку агрегатных свойств крови в ходе дегидратации производили с использованием комплекса методов и расчетных показателей.

В качестве базового был принят метод фотометрической оценки степени агрегации как один из самых современных и высокочувствительных к изменениям в крови, обусловленным агрегацией эритроцитов (M.Donner, 1989, H.Schmid — Schonbein et al., 1990).

Динамика агрегатных свойств и изменения в системе крови при обезвоживании находились в тесной взаимосвязи.

Одним из демонстративных показателей изменения состояния крови при дегидратации явилась динамика гематокрита (табл. 1). Полученные результаты согласуются с данными Б.В.Петровского (1976), М.А.Магомедова (1979), С.В.Гудимова (1996), выделивших нарастание гематокрита в качестве основного симптома эксикоза и связывающих наблюдаемую гемоконцентрацию с элиминацией воды из сосудистого русла.

В пользу этих предположений может свидетельствовать и динамика изменений осмоляльности плазмы, которая относится к жестким константам организма (АА.Виру, П.К.Кырге, 1983).

Резкое увеличение содержания альбуминовой фракции на начальных этапах дегидратации можно рассматривать как адаптационную реакцию, направленную на удержание жидкости в сосудистом русле, поскольку сдвиги содержания этого белка ответственны за регулирование распределения воды между плазмой и межклеточной жидкостью (С.И.Чёгёр, 1975, R.Schmidt,G.Thews, 1986).

На более поздних этапах дегидратации (10 СБС) при возвращении содержания альбуминовой фракции к контрольным значениям зафиксировано значительное увеличение влияния возросшей кон — центрации фибриногена (г=0.53) и глобулинов (г=0.87) на вариации белкового содержания плазмы. Возможно, что в ходе дегидратации реализуется питательно—пластическая функция альбуминов, поскольку они, как известно, являются резервным белком (И.Г. Андрианова, 1968).

Таблица 1

Изменения составллющих крови в ходе дегидратации (в % по отношению к контролю)

Показатели контроль 3 сутки 6 сутки .10 сутки

% 39.0±0.6 13"* 16"* 22***

зсмол—ть плазмы, яОсм/кг НгО 322 ±3 3" 11"* 13*"

збщий белок, г/л 67.6±0.2 16" 13* 10*

альбумин, г/л 47.8±1.7 15" 9* 3

-лобулины, г/л 23.5±1.1 3 3 8*

фибриноген, г/л 2,87 ±0.29 19 19 46*

Примечание: знаки указывают достоверность различий: *- при РС0.05, **- при РС0.01, *" - при РС0.001.

Поскольку для оценки изменений реологических и, в особенности, нрегатных свойств крови гораздо информативнее и чувствительнее 1спользование соотношений белковых фракций

альбумины/глобулины, альбумины/фибриноген), а не абсолютных (начений их концентраций (Л..От1епГа53,1981), в ходе эксперимента фослежена динамика альбумин—глобулийового (АПК) и альбумин — ¡шбриногенового (АФК) коэффициентов. Отмеченное на начальных >тапах эксперимента некоторое увеличение этих расчетных показа— елей обусловлено, в основном, ростом концентрации альбуминов. -В дальнейшем уменьшение' доли альбуминов и рост концентрации лобулинов привели к снижению этих коэффициентов, наиболее сраженному на 10 СБС (на 2%, Р<0.05 АГК и на 28%, РС0.05 АФК), :огда зафиксировано и максимальное увеличение степени агрегации,

что соответствует выводам ЬБ^ег^азэ (1981); Н.БсЬггис!—БсЬопЬет е1 а1„ (1990), Л.51оН2,(1994).

Значительный рост степени агрегации нативной крови, измеренной фотометрически, свидетельствует о существенной интенсификации процесса агрегатообразования в ходе дегидратации. Наиболее существенный прирост зафиксирован для степени агрегации, измеренной в стазе после высокосдвигового вращения (режим М) (рис.1).

л н

Я &

о с, в

Рис. 1. Динамика степени агрегации крови при обезвожива нии (в% по отношению • к контролю)

3 сут 6 сут 10 сут

Использование нескольких режимов измерений (М и М1)

по мнению разработчиков агрегометра обосновано, поскольку при этом фиксируются различные стороны процесса агрегатообразования. Дополнительные измерения в низкосдвиговом режиме (М1) позволяют практически исключить зависимость степени агрегации от полноты диспергирования агрегатов в ходе предшествующего вы — сокосдвигового вращения и вязкости плазмы, а также рассчитать динамические параметры Я5 и И10, которые могут быть использованы как индикаторы влияния сдвиговых усилий на процесс агрегатообразования (Н.БсЬпис!—БсЬбпЬет е! а1., 1990).

Динамика этих параметров для нативной крови (снижение до 53%, Р<0.05) свидетельствует о том, что по мере усиления дегидратации влияние приложенных сдвиговых усилий на процесс агрегатообразования ослабевает. Эта тенденция наиболее выражена на 10 сутки безводного содержания.

Метод микроскопической оценки степени агрегации с фоторе — гистрацией позволил составить суждение о кинетике процесса агрегатообразования и качественных характеристиках образующихся агрегатов на различных этапах обезвоживания. Установленная линейная корреляция между степенью агрегации и временем измерения (г=0.99) позволила оценить изменения скорости агрегатообразования (а) и начальной степени агрегации (Ь) для всех этапов эксперимента. Самый значительный рост параметра (а) по отношению к контролю зафиксирован на 10 СБС: на 207% (Р<0.05), (Ь)- на б сутки- на 29%

(Р<0.05). По мере усиления дегидратации все большую роль приобретала скорость формирования агрегатов по отношению к на— " чальной степени агрегации. Если учитывать, что при микроскопии процесс агрегации развивается в условиях, сходных с режимом М . при фотометрической агрегометрии (в стазе после интенсивного . перемешивания), то эти результаты полностью подтверждают данные по изменению динамических параметров, полученные с помощью агрегометра: с усилением дегилрятя>шй значительно снижается ■»Н2.*:с::::с Ьпешних сил, способствующих сближению и взаимодействию клеток, несмотря на значительно возросшую вязкость плазмы.

Вклад агрегатообразования в процессы седиментации эритроцитов наглядно демонстрируется самой высокой суспензионной стабильностью взвеси эритроцитов в растворе Рингера (F=99.25±0.08 мм/2ч)(полное отсутствие агрегации), которая практически не изменилась в ходе дегидратации.

Динамика показателя агрегации, рассчитанного из экспериментальных данных суспензионной стабильности крови в целом совпадала с характером изменений показателей фотометрической агрегации (прирост до 23%, Р<£.01). Однако тесная коррелятивная связь отмечена только в группе контроля (г=0.88), при дегидратации линейной корреляции между этими двумя показателями не установлено, . что может служить подтверждением мнению ряда авторов (А.Л.Чижевского,1980, H.Schmid—Schonbein et al.,1990, Л.Н.Катюхина, 1995) о том, что использование теста СОЭ в силу сложности и многофакторности процесса седиментации возможно только в качестве косвенного метода оценки процесса агрегатосзбразования.

Изучение агрегатных свойств крови в условиях течения более приближены к ситуации in vivo, чем при оседании в капилляре, -хотя степень приближения во многом определяется конструкцией прибора (D.Brooks et al.,1970, S.Chien et al., 1984) и условиями течения (C.A.Селезнев и др., 1985, W.Reinke et al., 1987).

Феномен агрегации эритроцитов считается одним из основных механизмов, которыми обусловлены "неньютоновские" свойства крови при вискозиметрии in vitro, когда к целому ряду факторов, влияющих на вязкость крови (температура, геометрия сосуда, химический и клеточный состав) добавляется еще и величина приложенного напряжения сдвига (S.Chien et al., 1967, D.Brooks et al., 1970, H.Schmid—Schonbein et al., 1994, AEhrly et al., 1995). Однако, поскольку агрегатообразование — это далеко не единственный фактор, способствующий повышению вязкости крови при снижении напряжения сдвига, оценка степени агрегации по вискозиметрическим данным осложняется наложением ряда других влияний.

Вязкость плазмы — одна из важнейших составляющих вязкости ■ цельной крови (Н.К.Фуркало и др.,1982, LGustafsson. et al.,1981)-. •

Корреляционный анализ экспериментальных данных показал достаточно выраженную коррелятивную связь между низкосдвиговыми вязкостями крови и плазмы (г=0.42).

Измерения вязкостных характеристик плазмы при различных сдвиговых условиях продемонстрировали- зависимость вязкости плазмы от приложенного напряжения сдвига (различия между высо — ко— и низкосдвиговой вязкостью плазмы в контроле составили 44%, Р<0.01 и сохранились в ходе дегидратации: на 3 сутки— 40%,Р<0.01, на 6 сутки - 49%, РС0.01, на 10 сутки - 45%, Р<0.01).

Аналогичная зависимость отмечена в работах К.Ни1:сЫп50п, Ы-ЕавШат (1977), А.Н.Виноградова (1986). "Неньютоновость" плазмы до сих пор остается спорным вопросом: некоторые исследователи полагают, что плазму следует считать ньютоновской жидкостью (Е.Мегп! е1 а1.,1965, Ь.В^епГаэБ, 1981), другие объясняют возрастание вязкости плазмы с падением скорости сдвига усилением связи между белковыми молекулами (В.А.Левтов и др.,1982, Ь.Сегпу е! а1.,1962).

Известно, что кроме агрегации эритроцитов и вязкости плазмы на ' вязкость крови оказывают существенное влияние показатель гема— токрита и способность клеток к деформации (Ь-ВЫе^аБв, 1981, . Н.ЗсЬпнё-БсЬбпЬет ег а1., 1976).

Влияние гемоконцентрации на снижение.текучести крови можно оценить по изменению реологических характеристик взвеси эритроцитов в аутологичной плазме со стандартным показателем гема — токрита. Рост вязкости ПЭ40 отмечен только на начальных этапах эксперимента (до 27%,Р<0.05), затем текучесть этого объекта повысилась и наиболее существенно — при низкосдвиговом течении (до 21%, Р<0.01). Это свидетельствует о вкладе гемоконцентрации в наблюдаемое повышение вязкости крови при эксикозе, подтверждением чему может служить достаточно тесная коррелятивная связь между этими параметрами (г=0.56). Однако следует иметь в виду, что . значительный рост вязкости плазмы, в том числе и при низких скоростях сдвига (до 27%, Р<0.001), как показано ЬОкиеМазз (1981), по всей видимости, способствовал лучшей передаче сдвигового усилия клеткам, тем самым увеличивая их деформацию и снижая вязкость в целом.

Вискозиметрические методики при стандартном гематокрите и . неагрегируюхцей среде (растворе Рингера — ФЭ40) позволяют выделить отдельно участие клеточной поверхности и внутреннего содержимого в деформируемости эритроцитов. Считается, что при низких сдвиговых течениях тестируется мембранная вязкоэластич— ность, а при высоких сдвиговых скоростях' — цитоплазматическая вязкость (Н.МоЬапбав е1 а1., 1980, Т.БШаП, 1985, Л.Н.Катюхин, 1995). Рост вязкости ФЭ40 при низкосдвиговом течении (23%,Р<0.05 на 10 сутки), по всей вероятности, свидетельствует об изменении реоло —

гических свойств клеточной поверхности. Снижение текучести на 3 сутки (18%,Р<0.05) указывает на уменьшение мембранной вязкоэ — ластичности. О вкладе каждой из составляющих (мембранной вязкости, или динамической ригидности и мембранной эластичности, или статической ригидности) можно косвенно судить по изменению вязкостных характеристик эритроцитов при их инкубации в среде с более низкой осмоляльностью, чем аутологичная плазма. Поскольку значения осмоляльности раствора Рингера и плазмы интактных животных близки, а при обезвоживании отмечен рост осмотического давления плазмы (наиболее существенный на 6 СБС), то помещение эритроцитов в среду с более низкой осмоляльностью, по всей видимости, могло сопровождаться их регидратацией.

Экспериментами е1 а!.{1980) показано, что регидратация

осмотическим набуханием красных клеток крови приводит к нор— . мализации динамической ригидности их мембран, однако не оказы— • вает значительного в влияния на статическую ригидность. Это позволяет предположить, что некоторое снижение вязкости ФЭ40 на 6 сутки (на 11%,Р<0.05 по сравнению с 3 сутками) обусловлено регидратацией эритроцитов и за счет этого нормализацией вязкости их мембран, а, следовательно, на данном этапе обезвоживания существенному изменению подвергается лишь вязкая составляющая мембранной вязкоэластйчности. На 10 сутки, когда различия в осмоляльности плазмы и раствора Рингера все еще сохраняются, однако вязкость ФЭ40 значительно возрастает (на 23%,Р<0.05), ведущее значение, по всей видимости, приобретают изменения статической ригидности (эластичности) мембран эритроцитов, которые не могут компенсироваться инкубацией в' среде с более низкой осмоляльностью. Такие изменения, по мнению С.КавЬ а1.,(1988). связаны с необратимыми перестройками структуры мембран эритроцитов.

Оценка деформируемости эритроцитов с помощью индекса ри— . гидности Тк выявила снижение этого показателя (на 9% —3 СБС, РС0.05, на 7% - 6 СБС, РС0.05 и на 11% - 10 СБС, РС0.01). Такое несоответствие оценок изменения деформируемости эритроцитов мы склонны объяснять тем, что индекс ригидности Тк отражает скорее не деформируемость как собственно клеточное свойство, а степень их деформации под действием внешних сил: повышенной вязкости плазмы, которая способствует передаче деформирующего усилия (Ь-ОЫе^авз, 1981) и показателя гематокрита-.

Таким образом, индекс Тк носит достаточно приближенный характер и применять этот показатель необходимо параллельно ' с другими методами оценки деформируемости.

В вопросе о влиянии деформируемости эритроцитов на их способность образовывать агрегаты единого мнения пока не выработано.

С одной стороны отмечается, что с потерей способности эритроцитов . к деформации снижается и их способность агрегировать друг с другом (Ь.Бниег^аББДЭв!, Н.БсЬпнс!—ЗсЬбпЬет е1 а1., 1990, Л.Н.Катюхин, 1995). С другой стороны в ряде экспериментов получены свидетельства повышенного агрегатообразования при снижении деформируемости красных клеток крови (В.А.Галенок и др., 1987, С.ЫавЬ е1 а!., 1991, РЛУЫШпд81а11 е! а1., 1994).

В работе использован ряд методик, предлагаемых авторами для оценки степени агрегации крови по данным вискозиметрии. Показатель структурной вязкости, который по мнению авторов (В.В.Аграненко,1980, 1981, Р.А.Григорьянц и др.,1978) позволяет исключить влияние объемной концентрации форменных элементов и вязкости плазмы на низкосдвиговую вязкость крови, а, следовательно, может отражать ее агрегационные свойства, в ходе эксперимента изменялся неоднозначно. Показатель структурной вязкости крови при эксикозе возрастал (до 13%,Р<0.05), однако в процентном отношении этот прирост был гораздо менее значительным, чем зафиксированный фотометрически рост агрегатообразования. Для взвеси эритроцитов в аутологичной плазме и вовсе наблюдалась * противоположная тенденция — уменьшение этого показателя (до 26%,Р<0.05), тогда как по данным фотометрии степень агрегации значительно возрастала. Все это дает основание высказать мнение, что использование показателя структурной вязкости для оценки процесса агрегатообразования проблематично для взвесей эритроцитов со стандартным показателем гематокрита, а его применение для цельной крови хотя и отражает действительное направление процесса, однако, чувствительность такой оценки значительно ниже, ■ чем другими методами.

Еще один расчетный показатель — реологический коэффициент, . который по мнению В.А.Шабанова (1972) служит оценкой не— . ньютоновских свойств крови, а, поскольку,. агрегация эритроцитов считается одним из основных механизмов, обуславливающих не — ньютоновость крови (Б.СЫеп е1 а1.,1967, Ь.От1еп?азз,1981)1 то считается оправданным применение этого коэффициента в качестве оценки агрегатообразования. Динамика этого коэффициента в ходе дегидратации также не совпадала с данными фотометрической аг— регометрии: увеличение ' реологического коэффициента отмечено только на 3 сутки (17%,Р<0.01, затем он постепенно .снижался (до 2%,Р<0.05 на 10 сутки). Такое противоречие, возможно, связано со значительным ростом высокосдвиговой вязкости крови при дегид— . ратации, обусловленным гемоконцентрацией и увеличением вязкости плазмы. Наложение этих факторов не позволяет адекватно оценивать изменения, вызванные агрегацией эритроцитов.

Достаточно упрощенным представляется также подход к оценке степени агрегации посредством сравнения вязкости взвесей эритроцитов со стандартным показателем гематокрита в аутологичной плазме и в неагрегирующей среде (Л.Н.Катюхин, 1995). Тенденция к уменьшению этого показателя при дегидратации в противовес значительному росту агрегатообразования, зафиксированному с помощью агрегометра, свидетельствует о недостаточном соответствии такого метода целям изучения агрегации эритроцитов.

Одним из важнейших ограничений использования методов реометрии для оценки агрегации (С.А.Селезнев и др., 1985) выступает тот факт, что феномен внутрисосудистой агрегации не является неизбежным спутником прецедента повышения вязкости крови.

И хотя между показателями кажущейся вязкости при низких напряжениях сдвига и фотометрической степенью агрегации в ходе эксперимента зафиксирована достаточно тесная коррелятивная связь (г=0.59), вряд ли правомочно однозначно связывать рост вязкости при снижении напряжения сдвига и степень агрегации.

Г.И.Мчедлишвили (1995) считает, что вообще некорректно говорить о вязкости крови в микрососудах, поскольку, когда величина клеток крови и диаметр сосудистого просвета в общем сопоставимы, нельзя рассматривать кровь как гомогенную жидкость. В противовес автор выдвигает концепцию структурирования кровотока в микрососудах, где под структурой подразумевается "...своеобразная организация эритроцитов в потоке и создаваемые при этом паттерны их взаимного расположения, которые имеют некоторый общий характер, а также взаимодействие форменных элементов крови при ее перемещении вдоль сосудистого русла".

Согласно классическим представлениям структура среды полностью "разрушается" и начинается течение при достижении предельного напряжения сдвига, что и послужило основанием для использования зтош параметра с определенными поправками применительно к крови для оценки ее агрегатных свойств.

Поскольку предельное напряжение сдвига, как и все реологические параметры, в значительной мере зависит от объемной концентрации форменных элементов (С.А.Селезнев и др., 1985, С.Могпэ е! а1.,1989), было предложено (В.ААграненко, 1980,1981) использовать стабилизированный по гематокриту показатель — коэффициент агрегации. Динамика коэффициента агрегации цельной крови при эксикозе выявила несоответствие его изменений по отношению к фотометрическим показателям степени агрегации (снижение на 33%, Р<0.05 на 3 сутки, на 42%,Р<0.05 на 6 сутки и на 43%, Р<0.05 на 10 сутки безводного содержания), что ставит под сомнение информативность и адекватность этого расчетного показателя.

Расчет коэффициента агрегации для ПЭ40 продемонстрировал практически полное совпадение его изменений с динамикой предельного напряжения сдвига. Так как влияние показателя гемато — крита было полностью исключено, рост предельного напряжения сдвига ПЭ40 на начальных этапах эксперимента (19%,Р<0.05), по-видимому, явился следствием интенсификации процесса агрегато — образования и роста вязкости плазмы. Последующее снижение предела текучести, особенно выраженное на 6 сутки (25%,Р<0.05), позволяет предположить, что образующиеся агрегаты стали менее устойчивы к сдвигу, возможно, вследствие изменений свойств клеточной поверхности.

Известно (С-Моглв а1.,1989), что эритроциты, закрепленные глютаральдегидом, не могут ни агрегировать, ни деформироваться и демонстрируют снижение предельного напряжения сдвига на 2/3 по отношению к нефиксированным клеткам. Сходная тенденция — существенное повышение текучести ПЭ40 (особенно выраженное при расчете относительной вязкости — 12%,Р<0.05), начиная с 6 СБС, позволяет предположить, что на данном этапе эксперимента имеют место изменения свойств клеточной поверхности эритроцитов, хотя ' нельзя исключить и влияние значительно возросшей вязкости плазмы.

Важность клеточного фактора в процессе агрегатообразования ■ побудила к исследованию агрегатных и реологических характеристик взвесей различных по возрасту и свойствам пулов эритроцитов. Известно, что по градиенту плотности красные клетки крови раз — ^ деляются на возрастные фракции (Л.МигрЬу, 1973), различающиеся, как по биохимическим характеристикам (И.СоЬеп е! а1., 1976, Н.А.Федоров, 1976), так и по геометрии (С.ИаБЬ е! а1., 1981, 1990, СШп(1егкатр е1 а1.( 1982) и мембранным характеристикам (1Я.Маес1а е! а1., 1994). у

Исследования агрегатных свойств возрастных фракций эритроцитов подтвердили значительную роль клеточного фактора в процессе агрегатообразования.

Эксперименты с разделенными по возрасту эритроцитами в контроле показали существенное повышение степени агрегации с ростом плотности клеток. Следует отметить, что возрастные фракции эритроцитов отличались не только степенью агрегации в исходном состоянии, но и динамикой их агрегатных свойств при дегидратации

Если в контроле степень агрегации возрастала по мере старения клеток (различия между степенями агрегации молодых и старых клеток достигали 305%, Р<0.001), то на 3 сутки это соотношение изменилось на противоположное за счет разнонаправленного изменения этого показателя для разных возрастных фракций, в результате чего степень агрегации старых клеток стала ниже, чем мо—

лодых (различия достигали 45%,Р<0.05). 6. и 10 СБС характеризовались различным по степени ростом агрегатообразования для эритроцитов разного возраста. Вследствие этого на конечных этапах эксперимента отмеченные в контроле значительные различия степени агрегации возрастных пулов красных клеток крови оказались сглаженными и наибольшей агрегабельностыо отличались уже не старые, а зрелые клетки (превышение достигало 47%,Р<0.05).

В процентном отношении наиболее выраженным изменениям подверглись агрегатные свойства молодых клеток (до 605%,Р<0.001), наиболее устойчивыми к дегидратации оказались более плотные эритроциты (максимальный прирост составил 79%,Р<0.01), изменения степени агрегации зрелых клеток достигали 211%, Р<0.001.

Известно, что при старении эритроцитов имеет место не только дегидратация (Н.А.Федоров,1976, A.Williams, D.Morris,1980, G.Nash et al.,1988,1991), но и целый спектр мембранных нарушений: изменение • поверхностного заряда (Н.А. Федоров, 1976, N.Cohen et al., 1976, Г.М.Покалев,1984), агрегация мембранных белков (N.Maeda et al., 1983, W.Corry et al.,1980), нарушения мембранной проницаемости (N.Cohen et al.,1976), ассиметрии липидов (G.Ñash et al„Í990), активизация процессов перекисного окисления (R.Heusinkveld et al., 1978, N.Maeda et al., 1983, G.Nash et al., 1990). Причиной разрушения эритроцитов при старении, по мнению Н.А.Федорова (1976), является не столько уменьшение запасов энергии, сколько неспособность восстановить структурные части — белки и липиды из—за отсутствия необходимых субстратов- и ферментных систем. Следовательно, наблюдаемые у более плотных клеток структурные . на—рушения мембраны, видимо, носят необратимый характер.

Недостаточность сведений о структуре и функциях белковых и липидных компонентов мембраны не позволяет оценить, какие именно нарушения ответственны за изменения агрегационных свойств красных клеток крови при старении и каков механизм агрегации различных возрастных пулов эритроцитов.

Существующие на сегодняшний день две основные модели агрегации предполагают диаметрально противоположные соотношения между адсорбцией белков или полимеров (агрегантов) на клеточной поверхности и агрегацией эритроцитов. Мостиковый механизм агрегатообразования (S.Chien, S.Lung, 1987, D.Brooks, 1971, 1988) за— ■ ставляет предположить, что повышенная агрегация старых клеток ' связана с тем, что данная фракция эритроцитов адсорбирует агрегаты в большей степени, чем молодые клетки. Согласно модели "истощенного слоя" (G.Lowe, 1988, P.Bongrand, 1988) осмотиче.ский градиент приводит к клеточному контакту, а, следовательно, более плотные эритроциты должны адсорбировать меньше белков, чем верхняя фракция. Пока не получено доказательств в пользу той или

иной модели, однако предварительные электрокинетические данные для фракционированных по возрасту эритроцитов (5.5о\гетнто — Сокег, Н.Ме1эе1тап, 1990) позволяют оценить как более предпочти тельную модель истощенного слоя для объяснения различий агрегатных свойств возрастных пулов эритроцитов.

Множественный регрессионный анализ полученных данных позволил оценить вклад в процесс агрегатообразования плазменных и клеточных факторов на различных этапах эксперимента. В качестве плазменных факторов были приняты концентрации белковых фракций: альбумина (А), глобулинов (Г) и фибриногена(Ф), а также вязкость плазмы (ВП). Влияние клеточных факторов, по нашему мнению, могли представить значения низкосдвиговой вязкости эритроцитов со стандартным показателем гематокрита в неагреги — рующей среде (ВФ), отражающие мембранную вязкоэластичноств (Т.БШай, 1985, М.МоЬагкЗаБ е1 а1., 1992). Оценена зависимость наблюдаемой степени агрегации в различных режимах измерения на всех этапах дегидратации (рис.2).

В качестве общих тенденций можно, отметить значительное влияние уровня фибриногена на процесс агрегатообразования на начальных этапах дегидратации и несомненное преобладание вклада клеточных факторов на конечном этапе эксперимента.

Рис.2. Изменение вклада плазменных и клеточных факторов в процесс агрегатообразования при эксикозе:(А)— режим М и (Б) — режим М1

Существенная зависимость степени агрегации от концентраций агрегатообразующих белков на 3 сутки позволяет заключить, что на данном этапе обезвоживание в значительной мере изменило плазменные свойства (белковое содержание, вязкость, осмоляльность), существенно не затронув мембранных свойств эритроцитов.

Известно, что сохранение обособленности — важнейшая задача клетки и компартментализация — одна из основных функций мембран. Переход к агрегированному состоянию подразумевает перестройку поверхности, происходящую под влиянием изменений условий существования.

Экстремальные состояния, к которым относится длительная водная депривация (до 10 суток), по всей видимости сопровождаются структурными перестройками мембран эритроцитов, приводящими к изменению их способности агрегировать друг с другом.

Известно, что между любыми двумя клетками действуют как силы • отталкивания, возникающие вследствие существования электрического заряда на их поверхности, так и силы притяжения (силы Баядер—Ваальса), обусловленные квантово — механическими эффектами взаимодействия электронных осцилляторов (Ю.М.Васильев, А.Г.Маленков, 1968). Причем силы отталкивания с расстоянием спадают гораздо быстрее, чел? силы притяжения. Баланс этих двух сил. и определяет возможность установления и степень прочности межклеточного контакта.

При малых расстояниях между поверхностями (« 10 °А ) предпо — лагается существование так называемого первого минимума энергии, когда сила сцепления значительна. При больших расстояниях между клетками преобладают силы отталкивания (потенциальный барьер) и, наконец, при еще больших расстояниях энергия притяжения несколько преобладает над энергией отталкивания (второй минимум). Прочность сцепления при этом невелика и для установления устойчивых контактов часто необходимо присутствие "цементирующих" ' веществ.

Анализируя эти данные, можно высказать мнение, что агрегация . эритроцитов в норме осуществляется при их сближении до рас— • стояния второго минимума. Участие агрегантов способствует упрочению контакта. Изменение свойств поверхности красных клеток крови при экстремальных и патологических состояниях (уменьшение заряда, нарушение структуры и проницаемости) способствует их сближению до расстояния первого минимума, когда образующиеся контакты отличаются значительной прочностью и отпадает необходимость в участии молекул—агрегантов.

ВЫВОДЫ:

1. Комплексная оценка агрегатных свойств крови при общей дегидратации организма выявила значительную интенсификацию аг— регатообразования эритроцитов. Рост степени агрегации и каче —

ственные характеристики агрегатов определяются глубиной изменений в системе крови и зависят от степени обезвоживания.

2. Начальный этап дегидратации (3 СБС) характеризуется значительным ростом степени агрегации, гемоконцентрацией, увеличением осмоляльности и содержанием общего белка плазмы. Изме— • нения фракционного состава белкового пула в значительной степени связаны с резким увеличением содержания альбуминов, направленным на удержание жидкости в сосудистом русле и поддержание объема плазмы. Вязкость плазмы и крови возрастает при всех режимах течения.

3. Изменения комплекса биохимических и реологических параметров крови на 6 сутки безводного содержания свидетельствуют о возможном формировании нового уровня гомеостаза: степень агрегации увеличивается незначительно, содержание фибриногена и глобулинов сохраняется на уровне предыдущего этапа эксперимента. Относительное повышение текучести крови, приведенной к стандартному показателю гематокрита, свидетельствуют о ригидификации красных клеток крови.

4. На 10 сутки безводного содержания отмечен самый значи— • тельный рост степени агрегации. Образующиеся при этом агрегаты имеют глыбчатую форму и объединяют значительное количество эритроцитов. Наблюдается дальнейшее увеличение объемной кон—, центрации форменных элементов, осмоляльности плазмы. При незначительных вариациях в содержании общего белка соотношение белковых фракций существенно изменяется за счет снижения доли альбуминов и роста уровня фибриногена и глобулинов. Вязкость плазмы и нативной крови возрастает при всёх режимах течения.

5. Относительный вклад плазменных и клеточных факторов в процесс объединения эритроцитов в агрегаты зависит от степени обезвоживания. На начальных этапах дегидратации основная роль принадлежит плазменным факторам, по мере усиления эксикоза превалирующим становится влияние клеточных факторов.

6. Изучение агрегатных свойств разделенных по возрасту эритроцитов в норме показало существенные различия в их arpera— бельности по мере старения. Показано, что в норме максимальная степень агрегации характерна для старых клеток, а минимальная — для молодых.

7. В ходе дегидратации отмечена тенденция к выравниванию способности к агрегатообразованию разных возрастных .пулов зри — троцитов за счет значительного роста агрегабельности молодых клеток и умеренного увеличения степени агрегации зрелых эритроцитов. Менее всего при обезвоживании возрастает агрегабель — ность старых клеток.

8. Сравнительный анализ ряда методов исследования агрегате— образования позволил оценить их информативность, чувствительность и целесообразность использования. Наиболее. адекватными являются фотометрический и микроскопический методы оценки степени агрегации.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Изменение реологических свойств крови и водного баланса при обезвоживании организма.// Мат. международной научно — практической конференции "Физическая культура и спорт учащейся молодежи в развивающемся мире". — Шуя, 1994. — С.61. (Соавт. С.В.Гудимов, Л.В.Крутова, И.Ю.Смирнов).

2. Реологические свойства крови при низкоинтенсивном лазерном облучении на фоне мышечных нагрузок.// Мат. международной научно — практической конференции "Физическая культура и спорт учащейся молодежи в развивающемся мире". —Шуя, 1994, —С.77. (Соавт. И.Ю.Смирнов, С.В.Гудимов, Л.В.Крутова).

3. Гемореологический аспект различных этапов общей дегидратации у белых крыс.//Экспериментальные и клинические аспекты адаптации мккрогемоциркуляции. — Ярославль, 1995.— С.88—92. (Соавт. В.Н.Левин, А.В.Муравьев).

Раиионализаторские предложения по теме диссертации:

1. Метод разделения эритроцитов крови по возрасту. Удостоверение №76 от 05.06.95, ЯГПУ, Ярославль. (Соавт. С.В.Гудимов, Л.В.Крутова, И.Ю.Смирнов).

2.Способ компенсации сил поверхностного натяжения жидкости на выходе из капилляра. Удостоверение №77 от 05.06.95, ЯГПУ, Ярославль. (Соавт. И.Ю.Смирнов, С.В.Гудимов, Л.В.Крутова).

3.Способ камерного подсчета эритроцитов и агрегатов эритроцитов. Удостоверение №82 от 23.11.95, ЯГПУ, Ярославль. (Соавт. В.К.Кожухова).