Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрофизический анализ и препаративное разделение клеток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электрофизический анализ и препаративное разделение клеток"

/

АЯАДЕПИЯ НАУК СССР ОРДЕРА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ХИ^ЧЗСКОЛ ОИЗИКИ им. К.Н.СШНОБА

На правах рукописи

МйРОШНИКОВ АНАТОЛИЯ ИГНАТЬЕВИЧ

УДК 577.3.05; 578.088; 577.3:61/63.

ЗЗЕдТРОФЯЗЙЧЕСХЙл АНАЛИЗ И ПРЕПАРАТ2ВН05 РАЗДЕЛЕНИЕ лЛЕТОК

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1989

Рабога выполнена в Институте биологической физики АН СССР

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Комиссаров Геннадий Германович, донкор биологических наук Лебедев Олег Евгеньевич, донтор биологических наук Федоров Юрий Иванович.

Ведущая организация: Биологический факультет Московского Государственного Университета им, Н.В, Ломоносова.

Защита состоится __ 1990 г. в _____ часов

на заседании Специализированного совета Д 002.26,07 при Инстищ химической физики АН СССР по адресу: 117977, В-334 Москва, у/.. Косыгина8 4.

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке Института хиг ческой физики АН СССР.

Автореферат разослан "__________1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

А.Ф. Ванин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность Электрические свойства клеток, кке-

очных органеля, субклеточных структур - есть один из фундамен-альнкх принципов функционирования биологических систем, Эдектри-еские характеристики клеток наряду с физико-химическими свойст-амз окрунанщей клетки среды so кнопок определяют процессы взаи-одействия клеток метлу собой и с окрукащей средой.

При решении многих теоретических я прикладных задач биопо-медицины, микробиологии определязгада® являются процессы трас-порта веществ и ионов, энергетики клеток, реакции клеток на не;z~:ic физкко-хкквческне воздействия. Успешное исследование этих pcueccoa в значительной степени зависит от знания электрических аракт ери с тик киеток.

Первые работы по изучению электрических характеристик клеток заряда, электропроводности) проводились еще зо второй половине рошлого века. Начало систематического изучения заряда клеток от-осится к 1930 году. Позднее, в 60-е годы появились работы ло ручекии диэлектрической проницаемости и электропроводности тка-ей, клеток v клеточных органелл. К началу 70-х годов был достигнут определенный прогресс в изучении электрических характерно-ик клеток. Наибольиее число работ было посвящено клеточному эле-трофорезу ( Ambrose (Ed) Cell electrophoresis 1965 ; Shaw (Ed). Electrophoresis 1969 ). Физико-химические основы теории электрических характеристик дисперсных систем изложены в работах (Ду— ин, Шилов, IS72). По изучению других электрических характеристик клеток - диэлектрической проницаемости, электропроводности, оляризуег,гости - были опубликованы немногочисленные работы разных второв: диэлектрическая проницаемость и электропроводность на сновании мостовых измерений ( Shwan , 1959), диэлектрическая роницаемость методом диэлектрофореза (phol , 1966), электропро-одность методом электромагнитофореза (.Kolin , 1958), поляризуе-:ость методом оптической регистрации электроориентации (Толстой др., 1966; Стоилов и др., 1968). Изучению нормы и патоюгии ;леток крови на основе анализа заряда клеток были посвящены ра-оты (Чижевский, 1959; 1973; Харамоненко, Ракитянская, 1974),

Широкое развитие электрофизического анализа клеток и его ис-ользование при решении биологических задач в начале 70-х годов ормозилось по нескольким причинам:

■ полным отсутствием коммерческих приборов, т.к» ни в одной стра- . е мира не выпускались соответствующие коммерческие приборы?

- отсутствием биофизических принципов измерения электрических х; рактористик клеток и трудностями при интерпретации экспериментальных результатовI

- отсутствием компяекскых исследований различных электрических характеристик» которые позволяют полнее и точнее понять биологический смысл экспериментальных результатов.

Цель работа» Целью настоящего исследования явилось теоретическое и экспериментальное изучение электрических характеристик клеток и клеточных органеял: поверхностного заряда, диэлектрн-. веской проницаемости, электропроводности, поляризуемости, разработка методов экспериментального измерения и количественного моделирования этих характеристик и применение электрофизического анализа клеток в биологии, медицине, микробиологии.

Основные задачи исследования.

1. Разработка системы способов, устройств, методик для изш рения электрических характеристик клеток и препаративного разделения клеточных суспензий.

2. Экспериментальные измерения и количественное моделирование различных электрических характеристик. Построение электрофизической модели клетки и изучение частотной зависимости электрических характеристик клеточных структур и клеток в целом. Выяснение механизма поведения клеток в электрических полях.

3. Применение электрофизического анализа клеток ври решении научных и прикладных задач биологии, медицины, микробиологии:

" - исследование взаимодействия антигенов с клеточной поверхностью при сенсибилизации эритроцитов;

- разработка биофизических принципов подготовки пробы крови и проведение анализа натнвных эритроцитов;

. - исследование функционального и морфологического состояния кито хондрий при их энергизации и деэнергизации; -.изучение изменения барьерных свойств мембран микроорганизмов под действием физико-химических факторов.

Научная новизна работы. Разработан электрофизический анализ клеток, основанный на комплексном измерении электрических характеристик клеток и интерпретации результатов в сочетании с электрофизическими моделями и в этом направлении проведено теоретичес кое и экспериментальное изучение заряда клеток, диэлектрической проницаемости, электропроводности, поляризуемости и показана эффективность применения такого анализа при решении задач биологии медицины, микробиологии.

. Разработана система способов, устройств, методик, знщшценны

*

2 авторским;! свидетельства?®, п редназкачанных для измерения ь,::- . :тричэских характеристик клеток и препаративного разделения кле-гачных суспензий. Методы измерений и препаративного разделения ¡зарабатывались с учетом биологической гетерогенности клеток и зкбнчйвостй п&р&матров нативных клеток во времени и под влиянием внешних воздействий.

Построены электрофизические модели эритроцита и подобраны .начения параметров модели, при которых теоретические кривые со--тзетствуит экспериментальным. Построенные модели позволили опре-;еллть электрические характеристики отдельных структурных элемен-ов без разрушения эритроцитов и связать физический и биологичес-лй смысл этих'характеристик. На основе разработанных моделей в очетанпи с комплекснчми измерениями различных электричеоких ха-актеристик предложен механизм явления переориентации эритроцита тносительно вектора напряженности электрического поля.

Показана применимость электрофизического анализа для исспе-.ования разных видов клеток и клеточных органе лл и для исследова-ия разных специфических функций клеток и их связи с окружающей ¿едой:

показано, что при взаимодействии эритроцитов .о антигенами про-сходит изменение электроповерхностных характеристик и анализ тих характеристик позволяет изучать механизм взаимодействия ан-игенов с клеточной поверхностью и определять отепень заполнения оверхности антигенами;

разработаны биофизические принципы подготовка пробы крови и роведения электрофизического анализа натнвных эритроцитов, что озволило выявить разницу во взаимодействии эритроцитов с перфтор-рганическими эмульсиями по сравнению с белково-солевыми раство-ами ;

показано, что величина и изменение электрических характеристик ктохондрий зависит от функционального и морфологического состоя-ия органели, комплексные измерения различных характеристик поз-олипо исследовать разные стороны процесса энергизации-деэнерги-ации митохондрий.

Практическое значение работы. Решение биологических задач а основании электрофизического анализа позволило решить приклад-ые задачи медицины и микробиологии:

разработаны способы повышения качества и понижения стоимости ромышленных медицинских препаратов - эритроцитарных диагности-умов, предназначенных для диагностики инфекционных и ряда неин-" экционяых заболеваний. Повышение качества препаратов достигнуто .

путем количественного контроля технологического процесса лроизвс ства кг основе анализа электрических характеристик эритроцитов; - изучено ¿¡вменение барьерных свойств мембран клеток под действ: ем дазинфектантов, используемых для дезактивации микроорганизме^ при получении питьевой воды. Показано, что измерение электрических характеристик микроорганизмов позволяет оперативно подбиратз деэинфектанты и автоматизировать процесс получения литьевой ыдг

Устройства препаративного разделения биосуспензий элзятросс рззом б свободном потоке буфера после испытаний в 1976-78 гг. в ЦНИИ гематологии и переливания крови дважды успешно сдавал!:сь Межведомственным комиссиям - в 1978 г. на основе разделения форменных элементов крови и в 1980 г. на основе разделения бактериальных суспензий. По многочисленным просьбам в различные организации были переданы полученные результаты, проведены совместные исследования, оказано содействие в сборке установок и освоению методик измерений электрических характеристик клеток в том числ< Ростовский медицинский институт, 1977 г.; Киевский институт прос яем онкологии,1979 г.; Бакинский Научный центр биологических исследований, 1980 г.; Ставропольский институт вакцин и сывороток, 1980 г.; Противочумный институт Кавказа и Закавказья, 1980 г.; Томский онкологический центр, 1981 г.; Ленинградский институт м< дицинской лабораторной техники, 1981 г.; Ленинградский институт вакцин и сывороток, 1984 г.; Оренбургский медицинский институт, 1985 г»: Акты Межведомственных комиссий приведены в приложении ; диссертации.

Апробация работа и публикации. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на 17 Международном биофизическом конгрессе (Москва, 1972), Всесоюзной конференции "Физико-ма: матические и биологические проблемы действия электромагнитных лс лей и ионизации воздуха (Ялта, 1975), Всесоюзной конференции "Са зические методы и вопросы метрологии биомедицинских измерений" (Москва, 1976), Всесоюзном совещании с участием сотрудников Н/П Карл Цейсс Йена ГДР "Клеточный электрофорез в биологии и .медицине" (Пущино, 1979), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1932), Конференции памяти ак. Г.М.Франка (Пущино, 1984), У Международном совещании "Клеточный электрофорез, аппаратура и применения" (Росток, ГДР, 1984), на Международной школе "Электрома: нитные поля и биомембраны"(Пленен, НРБ, 1936) прочитана лекция "Электрические характеристики клеток в радиочастотном диапазоне' Международном совещании"Физические методы характеризацаи биоло-

гических ктв ток" (Росток, ГДР, 1988). В материалы совещания вкяю- -чен доклад "Электрофорез и электросриентация: перспективы ж совместного использования для характеразации клеток".

По теме диссертации опубликовано 44 работы, в том числе 2 монографии, 16 авторских свидетельств и 26 статей.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, основных результатов, списка литературы и приложения. Общий объем диссертации 261 страница в том числе 46 рисунков и 14 таблиц» Список литературы содержит 319 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов. В приложения приведены Акты Межведомственных комиссий»

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали жидкие и сухие эрвтроцитаршэ матяос-тикумы производства Ленинградского НИИ'Вакцин и сывороток с дизентерийным антигенами из Шнгелл зонне, фяекснер8 ньюкзс^л, но-лученными по методу Буавена-Ленди. В случае гкидкого препарата I мл суспензии осаждали центрифугированием при 350 з, 5 ш, затем ¿вахяы отмывали в 2 мл и ресуспендировали а I мл среды измерения. В слз>чае сухих препаратов в ампулу заливали I мд дистиллированной воды и выдерживали при 4 °С а течение суток. Далее подготовка препарата проводилась так же, как отдкогоо Для яодго-тезки измерительной пробы в 4 мл среды измерения вводила 15-20 г.-кл препарата до концентрации клеток 5»10® - 5>10? кп/мца Измерительная среда: 15 мМ триэтаноламина, 10 мМ глюкозы5 4 мМ уксус-но—кислого калия, 240 мМ глицина (аминоуксусной кислоты). уксусная кислота до рН 7,4. Электропроводность среда (1,3-1,4)»10"■ См/м. При определении оптимальных условий для образования и рзгя-страцин комплекса антиген-антитело использовав гадкие ш суете эритроцитарные диагностикумы из Шигелл ньюкестл я аитатинирзетие сыворотки к Шигелл ныокестл, зоннз, флекснер с татряш для реакции пассивной гемагглитинации 1:6400 - 1:Х2800о Реакцию взаимодействия антиген-антитело и измерения проводила в забуфзрзнном физиологическом растворе при концентрации клеток 5*10 -кл/мл. Сыворотки разводили перед работой в соотношении 1:10 стерильным забуференным физиологическим раствором. При исследовании нативных эритроцитов пробы крови брали из хвостовой венн бэлых крыс-самцов линии Вистар весом 180-200 г. Капля крозз СП51-0515 мл) брали непосредственно в 5 мл измерительной среди,, Измзрагэ Ладную среду готовили из двух растворов в соотнотешга 85а я 15ба Состав раствора а) (на I литр дистиллированной зодн);аманоукоус=

■• • §

ная кислота - 280 ыМ, глюкоза - 6 мМ, лимонная кислота - б мМ, соляная кислота - до рН 7,3-7,4. Раствор б) - среда Эрла. Электропроводность измерительной среды 0,25-0,26 См/н. Непосредствен но перед измерениями, которые проводили через 30-4-0 шин после взятия врови, исходную суспензию разводили измерительной средой до концентрации клеток 5.I06 - 5.I07 кл/мл. Выделение митохондрий из печени самцов крыс Вистар весом 180-200г. проводили с помощью дифференциального центрифугирования. Качество митохондриал ного препарата оценивали по величине дыхательного контроля, вели чина которого в эксперименте равнялась 3,5-4,0. Митоходрии храни ли при температуре 4 °С в среде, содержащей 0,3 М сахарозы, О, 0,005 tí трис рН 7,5. Перед измерениями митохондрии переводили в •измерительную среду до конечного содержания белка 0,25 мг/мл. В экспериментах с бактериальными клетками использовали 18-часовую культуру клеток E.col, выращенную на мясо-пептонном агаре при 37 °С. Перед измерениями культуру отмывали в стерильной дистиллированной воде и ресуспензировали в растворе глюкозы и бикарбоната натрия с электропроводностью 10"^ См/м и рН 7,3.

Для проведения электрофизического анализа клеток использовали разработанные способы, устройства, методики в том числе методы аналитического и препаративного клеточного электрофореза, мостовые измерения, электроориентация и диэлектрофорез, а такие прибор автоматического клеточного электрофореза Пармоквант-2 (ЩР). При подготовке клеток к измерениям использовали реактивы фирм Serva , Reanal % Реахим и методы контроля: кондуктометричес кии (RadelkLs 0K-I02/I ВНР), полярографический (LP-7, ЧССР), рН--метричесний, фотоэлеятрокалориметрический, микроскопический.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК И ПРЕПАРАТИВНОГО РАЗДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК

§ I. Измерение электрических характеристик клеток

I.I. Аналитический клеточный электрофорез

Традиционная методика измерения электрофоретической подвик-ности (ЭФП) заключалась в том, что задавались три параметра из четырех (путь нлетки, величина.тока, электропроводность (ЭП) сре ды, которые благодаря малым инструментальным погрешностям могут быть намерены с высокой точностью, а четвертый параметр - время перемещения клеток в электрическом поле - измеряли секундомером, б

Согласно предложенной методике измерения ЭШ клеток и других дисперсных частиц, необходимо измерять расстояние, пройденное клеткой за фиксированное время действия электрического поля» При этом, погрешность, -вносимую при вычислении ЭШ от измерения Бремени, удается уменьшить до I %. Погрешность однократного измерения расстояния остается равной 2%. Для того, чтобы в данном случав получить среднеквадратичную погрешность среднего значения пути»равную I %, достаточно провести серию из 10 измерений, а общая погрешность определения ЭШ по формуле Питерса дает 2 %. -Таким образом, в случае измерения пути, пройденного клеткой за фиксированное время действия электрического поля, можно провести измерение ЙП с погрешностью 2-3% за 10 измерений. Чтобы добиться такой пе° югрешности определения ЭШ при измерении времени, необходимо довести серию из 30 измерений. Кроме того, предлагаемая методика ювыдает стабильность измеряемых параметров Стока и ЭП), так как электрическое пола включается только на период измерения, что шзньшает диффузию электролита из электродных отделений в измериг-?ельную ячейку.

Для реализации предложенной методики измерений ЭШ была разработана установка /Иванов и др., 1979/, которая состоит из так-' гас.чопа, на предметном столике которого расположена теркостатиро-• ¡анная измерительная ячейка в виде плоскопараллельного капилляра, ' ¡оединенного с электродными отделениями, блока питания-управления ! уяьтратермостата,

1.2. Электроориентация ишалитический диэлектрофорез

При исследовании биологических микрообъектов, характеризуются малой величиной электрической поляризуемости, малой асим-:етриэй форгш, слабым поглощением и рассеянием света, возникает ■.ообхо,дикость работать при высоких концентрациях клеток и повыаен-:ой напряженности электрического поля, что приводит к исканэниэ роцесеа ориентации. При уменьшении расстояния меяду клетками роисходит усиление взаимного влияния наведенных электрических, олей друг на друга, эффекта цепеобразования и агрегации клеток Зо!тяЬи зЬ а!», 1979 /. Увеличение напряженности электричес-ого поля с целью надежной регистрации ориентации меток может• ризести к изменению формы клеток /рг1оп1 ^ 1975 /, прони-аемэсти цитоплазматической мембраны /гЗлгтэгтагш. эt а!» ,1981 /,. а > случае использования неоднородных электрических полей - к нало-. ению диэлектрофоретического (ДЭЗ): осакдения клеток на этот про-есс. При измерении электроориентации (30) клеток*использовали -вухлучевую фотометрическую систему /Иванов и др., 1982, 1984/, -

Установка выполнена на оптической базе фотоэлектрического кг лориметра. Свет от источника в виде двух идентичных световых поте ков поступает на измерительные ячейки, заполненные суспензией исследуемых клеток. Прошедшие через ячейки световые потоки преобра-.. зуттся фотоприемниками в электрические сигналы, характеризующие • • оптическую плотность суспензии, содержащейся в ячейках. Сигналы '.. от фотоприемшков алгеброически складываются в блоке сравнен;"Л-. -усиления. Результирующий сигнал регистрируется самописцем. При : отсутствии электрического поля в обеих ячейках клетки имеют xaorj . ческую ориентацию. Под действием переменного электрического напр; жения, в ячейке с продольным подключением электродов клетки орие] тируются поперек светового потока и при этом происходит уменьше-" ние оптической плотности суспензии. Одновременно в ячейке с попе^ речным подключением электродов, ориентация клеток осуществляется вдоль направления светового потока, что приводит к увеличению по , терь световой энергии и, следовательно, увеличению оптической пл> ности суспензии. При этом происходит увеличение результирующего сигнала, значительное снижение влияния шумов, обусловленных флук ..; туацией интенсивности источников света, а также компенсация эффе • та ДЭЗ осавдения клеток на электродах измерительных ячеек. Одно. временная - регистрация 30 эффекта и ДЭЗ осаздения клеток приводи ! к противоречивы}.! требованиям к геометрии электрического поля в и I мерительной ячейке. Надежное различие двух эффектов при регистра ции достигается применением измерительных ячеек специальной геометрии /Фомченков и др., 1979/ и выбором режима работы.

..... § 2. Препаративное разделение клеточных суспензий

2.1. Препаративный клеточный электрофорез

Основным блоком устройства для препаративного клеточного электрофореза в потоке буфера является камера разделения, т.к. именно она определяет наиболее важные характеристики всего устрс ства - разрешающую способность и производительность /Мирошников др., 1974,1977,1930/.

В устройстве Кулон-ЗМ используется винтообразная камера раг деления с вытянутым (овальным) профилем /Мирошников и др., 1982/ ' .. Такой профиль по сравнению с круглым уменьшает деформацию инжек: руемой струи, возникающую из-за гидродинамического профиля скорс тей, и тем самым улучшает разрешающую способность устройства /Kolin , 1979/. Для выравнивания электропроводности и pH. по ширине камеры разделения в данном устройстве использовались би-8

юлярныэ ионообменные мембраны на лавсановой основе. 'Эти мембраны хредставляат собой двухслойные мембраны: один слой такой мембраны' :сть каткокосбмгнная мембрана МК-40Л, а второй слой-- анионообыен--:ая мембрана 1.1А-40Л. На установке Кулон-ЗМ было проведено раздел генио смеси фиксированных эритроцитов кролика и крысы (рис.1), !алря?.ен:'.осхь электрического поля в КР 70 В/см, температура буфе-га при зклэченнзм электрическом поле 12°С. Скорость инжекции об-:азца 2-3 мл/мин при 1-5Л07 клеток в мл. Линейная скорость про-'ока буфера составляла I см/с. Из рисунка видно, что крайние фракции (.'.'• 25 и 29) содержат эритроциты только одного вида, что указы-пех на возможность разделения гетерогенной суспензии на отдель» ке фракции. Полученная разрешающая способность (0,09 см) разка разрезающей способности коммерческих приборов с вер-скальным протоком (Эльфор-5, ДЕСАГА-48). Но следует отметить,что ] нашем случае такая разрешающая способность получена при боль-;еЛ толщине КР - 1,5 ил против 0,7-1,0 в аналогичных устройствах, 'анлм образом, периодическая инверсия потока позволяет более эф-.•зктизнэ подавить термическую конвекцию и тем садам получить при-:ерно в 1,5 раза большую разрешающую способность или в 1,5 раза ¡ользуи производительность при том же разрешении.

На установке для препаративного электрофореза в свободном огоке буфера Кулон-I было проведено препаративное разделение на-изньсх и кнактивированных дрожжевых клеток /Мирошников и др., 972,1973/. 3 установке Кулон-1 стабилизация потока буфера от ермкческой конвекции и устранение седиментации клеток дости-ается за счет периодической инверсии потока относительно напраз-ен;:я силы тяжести. Инверсия осуществляется путем вращения цилиндрического столба кидкости, заключенного между двумя цилиндра-с помощью ортогональных электрического и магнитного полей КоПп , 1979/. Для разделения брали равные объемы нативных и нактизпрозанньх кипячением клеток с концентрацией 2-3-10° кле-ок б мл. На рис.2 приведена гистограмма распределения нативных инактпвированных дрожжевых клеток по фракциям после разделения меси. При идентификации к подсчете нативных и инактивированных леток по фракциям после разделения использовали два способа икроскопироззния, которые дали одинаковые результаты,

На установке для препаративного электрофореза в свободном отоке буфера Кулон-2 было проведено препаративное разделение меси дзух видов бактерий /Габуев и др., 1976/. В установке Ку-он-2 стабилизация потока буфера от термической конвекции и уст-анения седиментации клеток достигается за счет вертикального ■

'рис. I Рис. 3

Рис, I. Гистограмма исходной смеси фиксированных эритроцитов кролика и крысы (сверху) и гистограммы отдельных фракций (от К? 25 до NS29) после препаративного разделения.

Рис. 2. Гистограмма распределения нативных и инактивирован-иых клеток candida tropicalis ИБФМ-303 после препаративного раз деления.

Рис. 3. Гистограмма распределения двух видов бактерий staph um'feíiK (i) и Е. col. B-II5 (2), записанных на ленте потенциометра о помощью оптического анализатора фракций.

i . ........., 1.....

'/í.

потока тонкого слоя буфера. Особенностью этой установки является . оптический анализатор фракций, который позволяет регистрировать процесс разделения непосредственно в камере разделения без предварительного отбора этих фракций. Оптический анализатор представляет собой механическое сканирующее устройство с источником света з области 250-600 нм и устройство регистрации прошедшего сквозь камеру разделения света. На рис.3 приведены результаты препаративного разделения смеси бактериальных клеток staph, aureus и E.coli в-115 . Гистограмма получена на ленте пишущего потенциометра сканирующего устройства. Условия разделения: фосфатный буфер pH = 7,0, Ö = 9.10"^ напряженность поля 35 В/см, время разделения 30 сек. Исходная концентрация меток в инжекторе Х-Й'Ю*3 клеток -в мл.

2.3. Улыразвукофорез ,

Разработан метод ультразвукового расслоения дисперсных систем, который заключается в том, что ламинарный поток дисперсной системы, ортогональный направлению ультразвуковых колебаний, расслаивается з поле стоячей ультразвуковой волны на слои фракций с периодом чередования однотипных фракций, равным половине длины волны. Оказалось, что эти слои сохраняются и по.сле выхода из зоны ультразвукового поля. Затем осуществляют непрерывный отбор фрак-инй с помощью коллектора, собирающего слои однотипных фракций зместе /Тихомиров и др., 1973/. Продолжительность озвучивания клеток при разделении мала Сне более 10 сек) и разделение осуществляется а отсутствии кавитации, что обеспечивает получение прпгжзнэнного концентрирования суспензии микроорганизмов /Мирош-никоз и др., IS7I, 1972/.,.Было получено увеличение концентрации суспензии микроорганизмов Endomycea magnusii в 1,7 раза rip сравнении с исходной, что близко к теоретическому пределу, равному 2. Теоретический предел определяется тем, что коллектором за равные промежутки времени в два буферных отделения отбираются равные объемы сгущенной суспензии и осветленной среды. Средняя плотность ультразвуковой энергии составляла 7 эрг/см"^, частота ультразвука 0,6 мГц, а производительность разделения 100 мл/мин. При этом никаких статистически достоверных различий в жизнеспособности озвученных и контрольных микроорганизмов обнаружено не было, хотя Endonyces magnuaii относятся к крупным клеткам и легко разрушаются при механических воздействиях. При разделении более мелких микроорганизмов candida tropicalis расслоение наблю--

далось з поле большей частоты (0,9 мГц) и интенсивности (40 эрг/см^).

ПРИМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРОФИЗИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В БИОЛОГИИ, МЕДИЦИНЕ, МИКРОБИОЛОГИИ

§ I. Изучение электрических характеристик эритроцитов при получении диагностикушв

I.I. Метод клеточного электрофореза при изучении взаимоде; ствия антиген-антитело

В работе / üzgiris, 1976 / использовали клеточный эле; рофорез для быстрой количественной регистрации процесса взаимодействия А-А, Для этого к суспензии латексных частиц, на повер; ности которых сорбированы антигены, приливают раствор, содержащий антитела, и контролируют процесс образования комплекса А-А на поверхности этих частиц по изменению их ЭФП. В работе /Сиро1: 1978/ описан электрооптический способ и соответствующее устройс во /Сирота и др., 1978/, позволяющий регистрировать первую фаз.1 реакции А-А. В этой работе также используют суспензии латексньо частиц, сенсибилизированных антигеном. Нами определены оптимал: ные условия для образования и регистрации комплекса А-А на эр;г роцитаршх диагностикумах методом клеточного электрофореза /Из; нов и др., 1,983/. На рис.4 представлены относительные изменен/.] ЭЗД эритроцитарных диагностикумов, инкубированных со специфиче< кой (кривая 3) и неспецифической (кривая 4) сызоротки при разш разведениях, с 2 предварительными отмывками клеток в Э5Р. Крив; 1,2 характеризуют соответственно те же процессы, но в этих случаях после инкубации диагностикумы только I раг отмывали и рес: пендировали в измерительной среде. Статистический анализ резул1 татов измерений показал высокую степень значимости (Р'< 0,01) отличия при разведении сыворотки 1:1600 в случае специфической и несиецифического взаимодействия. Исключение предварительных отмывок перед измерениями приводит к увеличению относительных изменений подвижности при 2 видах взаимодействий.

Зависимость относительного изменения Э$П эритроцитарного дйагностикума от времени его инкубации со специфической сыворс кой в разведеяии 1:800 представлена на рис.5. Из рисунка видно (кривая 2), что процесс образования комплекса на поверхности с< сибилизированных эритроцитов заканчивается быстрее в среде с hi ким значением ионной силы и ЭП 2,9.10~*См/м, а в более концент] рованной среде (ЭП 1,13 См/м) он протекает медленнее (кривая I; Возможно, уменьшение ионной силы среды инкубации изменяет прос ранственную конфигурацию окружения детерминантных групп антиге; 12

л

А

Разведен*, сыгорвтих Вреня мннубациж, ыкя.

Рне. 4. Относлтзльное изменение Эй! эри'троцктарньэс дизентерийных днагкогтикумзз из Шигелл ньвкастл после инкубации с гомологично,": :: гегерологичной сывороткой в разных разведениях. I - инкубация диагностикумов из Шигелл ньвкастл, 2-е сывороткой к Шигелл зоннэ без отмывки в 32Р, 3,4 - инкубация диагностикумов с дзум~ типами соответствующих сывороток и две предварительные отмывки з 3£Р. Время инкубации 20 мин, условия инкубации <3 = = 2,9-Ю"1 Си/и и рН = 7,0, температура 20°С.

Рис. 5. Относительное изменение Э5П эритроцитарных диагностику:,:оз из ¿игелл ньвкастл от времени инкубации с гомологичной сывороткой б разведенки 1:800. Уело бия инкубации: I - £> « 2,9-10 • 10"х Сг.Д:, рЬ; = 7,0. Температура среды инкубации 20°С, без предварительных отрывок.

1.2. Применение клеточного электрофореза при получении ар 1: тро цитарных диагностикумов

Качество диагностикумов характеризуют их чувствительностью и специфичностью к данному виду антител, отсутствием реакции на кеспеиихические антитела и спонтанной агглютинации, стандартностью характеристики /Каральник, 1976/, Пригодность данной партии эритроцитов для производства диагностикумов определяют по отсутствию спонтанной агглютинации после добавления их к физиологическому раствору. Качество готовых препаратов определяют по титрам реакции непрямой (или пассивной) гемагглютинации (ШГА) с гипериммунными сыворотками и сыворотками больных людей (специфическая активность) и сыворотками здоровых доноров (неспецифическая активность /Эссель, 1965; Каральник, 1976/. Нами показана возможность повышения качества эритроцитарных диагностикумов с помощью метода клеточного электрофореза на этапе проверки пригодности фиксированных эритроцитов и на этапе проверки качества готовых жид-

13

ких и сухих препаратов /Мирошников и др., 1984, 1985/.

В таблице I приведены данные ЭЙ1 восьми партий фиксированных эритроцитов (колонка I) в сопоставлении с определением нзсп*. цифичнасти препаратов, изготовленных на этих эритроцитах, по тит рам1ШГА. Из таблицы I видно, что первые четыре партии (1-4) и жидких, и сухих препаратов имеют титры ШГА с сыворотками здоровых доноров больше, чем 1/100, т.е. имеют высокую неспецифическую активность. Такие препараты по техническим условиям реглгмэ:-та производства необходимо забраковать. Интересно отметить, что у всех этих партий фиксированных эритроцитов ЗЗД меньше 2 мкм• •с""^*см. Препараты партий 5-8 имеют титры меньше 1/100, т.е. соответствуют техническим условиям. ЭФП эритроцитов этих партий больше 2 мкм-с"^-В"^.см.

В таблице 2 приведены сопоставительные данные Э5П восьми партий эритроцитов, нагруженных антигеном зонне (колонки I и 4) в•сопоставлении с определением неспецифичности препаратов по ти! рам ШГА с донорскими сыворотками. Из этой таблицы видно, что пре параты первых четырех серий (1-4) и жидкие, и сухие имеют высоки неспецифичные титры (больше 1/100) и по техническим условиям дол жны быть забракованы. Соответственно препараты серий 5-8 удовлет воряют техническим условиям. Граничным значением ЭЙ1 эритроцитов для плодах и хороших препаратов в данном случае является 1,1 мкы • с""*.В .см - ниже этого значения препараты плохие, выше - хорошие.

Для отбора эритроцитов необходимо предварительно установить граничное значение ЭФП. Если ЗФП у фиксированных эритроцитов ниже граничного значения, то ведут их выбраковку. Граничное значение можно определить однократным определением 35П фиксированных эритроцитов при параллельном контроле титров РИГА диагностикумов изготовленных на этих эритроцитах.

Для отбраковки неспецифичных готовых препаратов тоже необхо димо установить граничное значение ЭЗП и если у готового препара та ¿Ш ниже граничного - то такой препарат необходимо забраковать. Граничное значение (нижнее) можно определить однократным определением ЭЙ1 специфических и неспецифических серий целевых препаратов при параллельном их контроле по титрам ШГА с гипериммунными сыворотками здоровых доноров.

1.3. Изучение модификации поверхности эритроцитов сенситино -антигеном

Определение оптимальной дозы антигена для сенсибилизации частиц-носителей при получении диагностикумов производится по ме

Таблица I.

. Тигр да агпзст/.кума в РаГА с донорской СЬ;500СТК0й

м 1 • см нидкий пр е парат сухой препарат

1 1,41 1/1200 1/1200

1,47 1/12С0 1/1200

3 1,59 1/300 1/600

1,93 1/300 1/300

и 2,02

2,13 менее менее

? 2,23 ' 1/100 1/100

3 2,31

Габли и а 2.

поепаоат Сухой поелаоат

Н ¡км • 0 ЬГру--■р'.тов .см Тито с донорской сывороткой Титр с гипер-иммун. СЫЕСрОТ- кой ЭЙ] нагруженных эоитроци-тое мкм.с"^.В"^ ■ Титр с Титр с доноре- гипер-кой сы- им: лун. бссэт- сыворот-„„ коV. ' ко;:

¡.7? 1/1200 1/6400 0.77 1/1200 1/С-гОО '

■ 1/1200 1/6400 0.64 1/1200 1/1^00

1/300 1/6400 0.69 1/600 1/6чС0

- 1/300 1/12аОО 0.69 1/150 1/6*00

.16 1/6400 1.10 1/12Ы0

менее 1/12300 1.34 менее 1/оч00

.37 1/100 1/6400 1.29 1/100 1/6400

.Зс 1/6400 1.37 1/6400

одике "пробных посадок" или оценки относительного количества ан-игена, связанного эритроцитам /Каральник, 1576/. Нал*, проведено сследозание степени модификации поверхности формализированкых р:'.трзцитоз при сенсибилизации их разными дозами липополисахарид-^ антигенов методом клеточного электрофореза и показана возмоя-ссть определения оптимальной дозы таких антигенов /Мирошников и о., 1334/.

В таблице 3 приведены результаты электрофоретических измерений диагкостикумов Шигелл зонне в зависимости от дозы нагрузки для еидких и сухих препаратов. Для каждого'препарата приведены: среднее значение ЭВД в среднеквадратичное откло-

нение в %, число перезаряженных клеток в пробе (Пр), титры с ги-периммукными сыворотками (Т-ры).

Таблица 3. Диагностикуш из Шигелл зонне

Нагруз- Баран № I

ка , жидкие сухие

мкг/мл U 6' Пр Т-ры UL <э пР Т-ры

25 1,88 7,7 0 25600 1,91 9,5 I 6400

50 1,67 10,5 I 25600 1,78 8,9 0 6400

100 1,46 10,8 3 25600 1,62 11,1 I 6400

150 1,37 14,9 5 25600 1,52 9,9 I 6400

200 • 1,20 17,1 6 25600 1,30 9,6 4 6400

250 1,17 XS 10 25600 1,21 12,6 2 6400

Из таблицы видно, что с увеличением дозы нагрузки уменьшается среднее значение 3$П и увеличивается СКО гистограммы. Последовательное уменьшение среднего значения ЭШ и увеличение СКО приводит к тому, что ЭШ некоторых клеток в препарате становится нуле во{ и даже положительной, Эти клетки обозначены как Пр (перезаря кенные).

Таблица 4. Влияние дозы сенситина на качество эритроцитарного диагностикума дизентерии Флекснер в сопоставлении с данными электрофоретических измерений

Доза сенситина, мкг/мл

25 50 75 100 125 150 200

Титр диагностикума в ШГА с сывороткой больных

'0 0 1/200 1/400' 1/400 1/600 I/IÔ00

Титр диагностикума в HíTA с сывороткой здоровых доноров

0 0 0 1/2 1/4 1/80 1/400

и 1,57 1,39 1,21 1,13 1,02 0,91 0,81

6- % 5,2 7,0 7,5- 9,0 ■ 12,7 13,9 15,5

2 8 II 23 34 68 - 83

К=и/б- 0,30 0,20 0,16 ОДЗ 0,08 0,06 0,04 ,

, » »

Из таблицы 4 видно, что с увеличением сенсибилизирующей дозы чувствительность диагностикумов к сыворотке больных возрастает, Ьо при отом возрастает титр Н1ГА с сывороткой здоровых доноров, т.е. диагностикам становится неспецифичным.

При выбор.; оптимальной дозы сенситина по электрофоретическим измерениям необходимо' учесть два параметра гистограммы - среднее значение ЭЗП и СКО, например, воспользоваться коэффициентом К= ^/с? , Определить граничные значения этого коэффициента можно из однократного сравнения значений К и титров Й1ГА диагностикумов при разной дозе сенситина, как это сделано з таблице 4, Из таблиц видно, что диагностику^ из Шигелл флекснер удовлетворяет требованиям Регламента производства при дозе нагрузки 75-100 мкг/мл, что соответствует значениям К=0,16-0,13, а оптимальный дозе 100 мкг/м соответствует К=0,13»

§ 2. Электрофизический анализ функционального и морфологического состояния митохондрий

Впервые исследования Э0 эффекта изолированных митохондрий печени крыс з различных функциональных состояниях проведены з нашей работе /хуапот et а1.,1985 /. На рис.6 (кривая I) представлен 00 спектр изолированных митохондрий. Добавление к суспензии митохондрий индуктора калиевой проводимости - валиномицина - приводит к значительному уменьшению высокочастотного максимума 30 спектра органелл (рис. 6,2). При этом в области низких частот существенных изменений спектра не происходит.

Разобщитель ДНа вызывал подобное изменение высокочастотного максимума 30 спектра суспензии пптохондрий. При этом, за время регистрации ЭО спектра происходило увеличение ЭП суспензии на 10-12$, обусловленное утечкой ионов из органелл. па рис,? показаны временные зависимости ЭЗ эффекта митохондрий в присутствии различных добавок. При увеличении времени инкубации жтоховдрик в измерительной среде обнаруживается снижение аффекта, Это связано с функциональным изменением митохондрии, о чем свлдотельствует также уменьшение дыхательного контроля на ;30-3о$, Подавление дыхательной функции митохондрий антимицином Л приводило лиль к небольшое уменьшению 30 эффекта, тогда как добавление валиномиш-на увеличивало скорость падения эффекта. Измерение светорассеяния суспензии митохондрий не выявили изменения Форш (объема) микто-хондрий в этих условиях. Теоретический анализ высокочастотной релаксации 30 эффекта для случая бактериальных клеток /Фомченков и .

Рис.6. <Э0 спектр контрольных (I) и инкубированных з измерительной среде с содержанием ¿1/л вадпкомицпна (2) изолированных митохондрий.

P/ij.7. Зависимость,изменения 30 эффекта изолированных митохондрий на частоте ¿«10° Гц от времени инкубации в различных среда-:: I - стандартная изиесительная среда, 2 - сэеда с добавле.-.;:-

гу * " *

ем 1,1-10"' 1/л валиномицина, 3 - среда с добавкой 0,1 мкг акги-мицина А на I м? белка.

др., Iös4/ показал, что изменение эффекта з области частот 1Э4-Ю° Гц характеризует барьерные свойства цитоплазматичесхсЛ мембраны, а на частоте выше 10° Гц уменьшение эффективной ЭП клетки приводит также как и в случае митохондрий, к снижению зеличины ориентирующего момента сил, действующего на клет;:у, у, смещение его высокочастотного спада. Лсс.:ад:зание 32Л изолированных митохондрий в различных энергетических состояниях показало хорошую корреляцию мезду увеличением объема и изменением митохондрий. Наблюдаемое изменение электроловархностных свойств можно объяснить набуханием митохондрий, которое приводит к увеличению площади поверхности, несущей отрицательный заряд.

§'3. Контроль инактивации микроорганизмов деэинфектантами при получении питьевой воды

Изменение электрофизических сзойстз бактерий при воздействии антимикробных агентов исследовалось ранее с использованием элек-> трофоретических измерений /Кульский и др., 1932; Федоров и др., 1ЭЗЗ; Лебедев-и др., 1964/, где авторы изучали влияние ионов и 18 '

порошков тяжелых металлов на электроповерхностные свойства и жиз- . неспособность клеток. Дополнительную информацию о барьерных свойствах цитоплазматической мембраны по изменению внутриклеточной электропроводности дает электроориентационнкй метод, который позволил сделать подбор дезинфектантов оперативным и точным /Иванов и др., 1955/.

Ка рис.8 предстазлены ЭО спектры нативных и обработанных ги-похлорптом натрия й катионами серебра бактериальных клеток. Как видно, обработка бактериальных клеток дезинфектантами приводит к значительному снижению высокочастотного максимума. В соответствии с теоретическим анализом /Фомченков и др., 1984; Мирошников и др., 1966/ инактивация клеток дезинфектантами вызывает нарушение барьерных свойств мембраны, что приводит к частичному выходу ионов и низкомолекулярных компонентов цитоплазмы в окружающую среду. При этом происходит уменьшение ЗП цитоплазмы и, соответственно, общей эффективной ЭП клетки. Повреждение мембраны при обработке как гипохлсритоы натрия, так и катионами серебра и инактивация клеток хорою подтверждается и микробиологическими данными по посевам на чашки Петри. Из сопоставления ЭО спектров и микробиологических данных следует, что чем выше бактерицидный эффект дезинфектантов, тем ниже величина высокочастотного максимума.

Рис.8 30 спектры нативных (I) и обработанных гипохлоритам натрия (0,3 мг/л) (2) и катионами серебра (0,05 и 0,1 мг/л) (3 и 4) бактериальных клеток E.col. Время инкубации с агентами 30 ¿Лин., ЗП среды 0,9.Ю~2 См/м, рН = 7,3.

§ 4. Влияние эцульсии перфторуглеродов на электрофоретичес-кую подвижность эритроцитов

4.1. Влияние антикоагулянтов на электрофорегическу» подвин-ность клеток крови

При электрофоретических исследованиях форменных элементов крови больше влияние на точность измерений могут оказать вещества, добавляемые в пробу крови для предотвращения ее коагуляции. Было исследовано влияние гепарина, цитрата натрия, оксалата натрия, этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) путем сравнения 32П контрольных и опытных проб /Темнов и др., 1982/,

Прединкубация форменных элементов крови в течение 15 мин с 1% раствором цитрата натрия, 0,135/5 раствором оксалата натрия, 0,2о% раствором ЭДТА не оказывает необратимого воздействия на ве личину заряда клеточной поверхности. Поэтому, данные вещества :.:о гут быть использованы в этих концентрациях в качестве антикоагулянтов при электрофоретических исследованиях. Прединкубация с ге парином приводит к необратимому увеличению Э5П форменных элементов крови, пропорциональному его концентрации.

4.2. Кинетика электрофоретической подзижности эритроцитов при массивных кровозамещениях

Электрический заряд эритроцитов играет роль одного из регуляторов проховдекия этих клеток по кровеносным сосудам к капилля рам /Чикевский, 1975; Stoltz et al.,. 1971 ; Danon 1973 /. Установлено, что при различных критических состояниях (травматический шок, кровопотеря, перитонит, острая почечная недостаточно сть и др.) происходит резкое повышение вязкости и изменение рзол гических свойств крови, которое, как правило, сопровождается сни нением заряда эритроцитов /Мищук и др., 1981/. В связи с этим пр применении различных кровезаменителей имеет большое значение изу чение изменений Э*П эритроцитов /Мирошников и др., 1964; tiirosh-nikov et al.3 1985 /.

Многодневная кинетика изменения ЭЙ1 эритроцитов крысы после кровозамещения препаратом с перфторорганической эмульсией показа на на рис,9» Видно, что увеличение Э2П эритроцитов, вызванное действием препарата с эмульсией, сохраняется до двух суток. Torn как при кровозамещении белково-солевым раствором без эмульсии, начиная с первых суток происходит снижение Э2П эритроцитов,- коте рое достигает минимального значения на третьи сутки после крово-замещения. Такое же изменение Э5П наблюдается на третьи сутки и в случае с эмульсией,что вероятно, связано с выведением из крове 20

носного русла иерфторорганической эмульсии. Дальнейшее относительное увеличение Э5П, вероятно, связано с включением компенсаторных механизмов организма и постепенным восстановлением форменных элементов крови.

3 2.8

" 2 а

I

2.7

Рис.9. Изменение ЭЫ1 эритроцитов в течение двух недель после кровозамещения:о- О - интактные крысы, Л - Л » крово-эамещение препаратом с перфторорганической эмульсией, о - э -- кровозамещение белково-солевым раствором без эмульсии,,

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ИЭКСПЕРЩЩТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЗЛЕКТРОЗИЗИЧЗСКйХ ХАРАКТЕРИСТИК ЭРИТРОЦИТА

5 I. Двухфазная электрофизическая модель эритроцита на основе ориентационного эффекта

Эритроцит в модели представлен в виде диска с полуосями (X-= $ и С , т.е. сечение такого диска в плоскости 2=0 есть круг с радиусом О. = 8 , а сечение в плоскости X - 0 есть эллипс с полуосями О. и С /Мирошников и др., 1986, ¡."iro3h.ri.ikov е-Ь а1,,/3988/. Средний по времени момент, действующий на асимметричную частицу в переменном электрическом поле напряженности определяется выражением /Овчаренко и др., 1977/:

М = В-е С^пЕ*а(л29 (I)

где 0 - ¿тол между продольной осью частицы и направлением поля, "Йи 31 " продольная и поперечная поляризуемости частицы, которые для данного случая имеют вид:

й-т0^

асР

.«р)

(2)

(3)

где "Их и Из - коэффициенты деполяризации эллипсоида /Ландау и др., 1959/ а ^ - комплексные диэлектрические факторы срсды и клетни / РЬо1 , 1978/. Эффективную диэлектрическую проницаемость и электропроводность клетки задавали частотно-зависимыми с учетом основных механизмов электрической поляризации клеток, их

эльфа -1975/:

и бета- дисперсии /раи1у et а1

•М

¿г"»1 ег ±

ое

б!'1-

С Гг\.

1959; С

- ки

б"-1- б;"-1

НапаЛ ot а1,

'»п.

»УК

-

А +

н +

где , бд 1 » ^т.« I ~ низко, средне и высокочасгот-

(*/}пГ

00

(5)

ные значения эффективной диэлектрической проницаемости и электропроводности клеток; $ и - характеристические частоты альфа- и бега- дисперсии. На основании выражений (1-5) была получена расчетная формула, которая для данной модели имеет вид:

м =

л

5 нд

о'с а.

¿У.

+ 5 а

Т"

(б)

где есть функции частотной дисперсии эффективных значении

диэлектрической проницаемости и электропроводности клетки и среды. По этой формуле на ЗВМ расчитывали частотные зависимости величины М/Мо> Где _ значение М при частоте 4.10^ Гц и исходных значениях параметров модели эритроцита, которые выбирали из литературных данных / В1е11сг et а1 , 1975; Азат! et а1 , 1976/ и соответствия расчетных и экспериментальных кривых.

Построена двухфазная модель эритроцита и подобраны значения эффективных параметров диэлектрической проницаемости и электропроводности, при которых теоретические 30 спектры соответствуют экспериментальным в области альфа- и бета- дисперсии. Соответствие спектров удалось получить за счет раздельного изменения про-22

2

дольных и поперечных значений диэлектрической проницаемости и электропроводности во всем частотном диапазоне и изменением соотношения электропроводностей эритроцита и среды. Показано, что на низких и средних частотах форма спектра преимущественно зависит от соотношения продольных и поперечных проводимостей, а высокочастотная часть спектра определяется преимущественно соотношением продольных и поперечных значений диэлектрической проницаемости.

§ 2. Изучение частотной зависимости эффективных-электрических характеристик эритроцита

Для анализа экспериментальных данных зависимости 30 кривых от рН среды было рассчитано два семейства кривых высокочастотной части 30 спектра (таблица 5). При расчете, путем вариации продольных и поперечных значений высокочастотных электропроводности и диэлектрической проницаемости стремились построить кривые, близкие по форме и положению к экспериментальным 1фивым. Затем, рассчетным кризы..; были поставлены соответствующие значения рН экспериментальных кривых (нияние строчки в таблице 5 а) и б).

Таблица 5

I 2 3 4 5 6 7 8

<5* 0,03 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,15 0,2

0,03 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,15 0,2

«г 250 200 150 100 80 50 20 10 а

е1 130 100 50 30 25 20 15 10

5,3 7,5 9,6 рН

0,03 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,15 0,2

0,03 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,15 0,2

100 130 180 200 220 250 280 300 б

е* 8 10 20 . 23 27 30 • 35 • 40

3,8 6,6 рН

При построении расчетных кривых высокочастотной части в зависимости от электропроводности суспензии исходили из следующих условий: I) высокочастотная электропроводность эритроцита больше электропроводности среды; 2) средне- и низкочастотные

Рис. 10» а) Экспериментальные Э0 спектры фиксированных эритроцитов барана.при различных значениях рН суспензии: I - 9,6; 2 - 7р5| 5 - 6,6; 4 - 5,5; 5 - 3,8. Кр - величина изменения оптической плотности суспензии на частоте Ю5 Гц, рй 9,6 ЗП среды 8,5.КГ5 Сы/м,

б) Расчетные спектры до данным таблицы 5.

Рис. II, а) Экспериментальные 80 спектры фиксированных эритроцитов барана при различных значениях ЗП суспензии (См/ы): I -8.1(Г\ 2 - 1,1.10"% 3 - 2,б.Ю"2. Величина рН 7,6. К0 - величина изменения оптической плотности суспензии на частоте Ю5 Гц, при ЭП среды 8.10"^ См/ы. б) Расчетные 30 спектры по данным таблицы 6.

электропроводности для каждого значения высокочастотной электро- ' проводности должны изменяться в соответствии с частотной дисперсией электропрозодностей. При этих условиях было построено семей-'' стзо кривых (рис.II), каждой кривой которого соответствуют данные параметров мод-ли (таблица 6). Иэ сравнения расчетных и экспериментальных кривых видно, что прл совпадении общей формы и тенденции изменения, частоты расчетных минимумов сдвинуты по оси абсцисс в более высокочастотную область примерно на 1/3 декады и величина эффекта переориентации примерно э два раза меньше экспериментальных. Сдвинуть все расчетные кривые по частоте до совпадения с экспериментальными удалось уменьшением среды (и, соответственно, электропроводности клетки) в три раза. В работе /!'агаи1з а!» , 1973/ авторы также обнаружили разницу в три раза между вычисленными значениями электропроводности клеток и измеренными мостовым методом. Вычисления проводились в предположении, что подвижность ионов в цитоплазме равна таковой в' растворе. Несовпадение свидетельствует об уменьшении подеижности ионов в цитоплазме. -

Таблица б. Изменение параметров модели эритроцита при изменении электропроводности суспензионной среды

&S

<5*

<Эт

etf

б*

с"

£Л

СА

е,

ср

I 2 3 4 5 о

0,015 0,04 0,215 0,55 1,3 1,5

0,0165 0,044 0,236 0,605 1,43 1,65

0,018 0,048 0,258 0,66 1,56 1,6

0,0296 0,079 0,424 1,09 2,576 2,96

0,03 0,08 0,43 1,1 2,59 3,0

0,05 0,12 0,645 1,5 3,54 4,0

30 40 60 80 120 150

5 6- 10 15 30 40 .

З.Ю"4 8-1С"4 4,З.Ю-3 1,1 »ИГ2 2,6*10"^ : з.нг?

§ 3. Многофазная электрофизическая модель эритроцита на основе ориентационного эффекта

При построении многофазной модели эритроцит был представлен в зиде диска с полуосями 0го = 8о и с0 , окруженного несколькими конфокальными оболочками /Мирохников и др., 1986/. В качестве исходного диска и последующих оболочек использовали отдельные,структурные элементы эритроцита /Heinrich et al. , 1962/ и окружай-.

25

щую эритроцит среду: внутриклеточное содержимое (гемоглобин), слой молекул спектрина, бислойная мембрана, глиноналикс, плотная и диффузная части двойного электрического 'слоя. Для вычисления частотной зависимости ориентирующего момента сил, действующего на'эритроцит, использовали подход, разработанный в работе /Фом-ченков и др., 198V• Б этой работе на основании диэлектрической ■ " теории для однооболочечного эллипсоида /Bielicz et al. , 1975;

isami.et al. , 1976/ путем разделения вещественной и мнимой ча-: сти комплексной диэлектрической проницаемости клетки (цитоплазмы и мембраны) и_окрувавдей среды получены выражения для эффектив™ ной'диэлектрической проницаемости и электропроводности каждого ...последующего ыногооболочечного эллипсоида с учетом значений параметров всех предыдущих слоев. Частотную зависимость ориентиру-« ющего момента сил в случае ыногооболочечного эритроцита также ' определяли по формула (6), но ^ выражения для р Jl^ подставляли функции эффективных значений и соответствующего эллипсоида с учетом параметров всех предыдущих опоев эритроцита и их изменений в области частот бета-дисперсии,'На ЭВМ вычисляли отношение И/Ио » Mo " значение H на частоте 4.I05 Гц и ис-ходшх значениях-параметров модели.

Оказалось, что не все параметры модели оказывают одинаковое влияние на 30 спектры. Наибольшее влияние оназывают внутриклеточные параметры и параметры мембраны; некоторые параметры - глико-калккса, диффузной части двойного электрического слоя - оказывают меньшее влияние на 30 спектры. Параметры спектрина не оказывают влияния на форму спектра. f . Расчетные 30 спектры в зависимости от ЗП внешней среды приведены на рис.12. На этоы не рисунке приведены экспериментальные 30 кривые, полученные при изменении рН внешней среды.

с •

' Таблица 7,

б"ср

в"

dt

0,003 1,0 0,05 Ю"2 30 10

0,01 0,7

0,Ь>

10

25 10

0,03

0,5

0,3

2.10"

20

9

0,05 0,3 1,0 2.10 15 9

-2

0,08 0,1 5,0 5.10 10 8

-2

Щ)

! ы/% 1-е

1,0

0,5

0

Рис. 12. Расчетные ЭО кривые (сплошные кривые 1-5), достро- . енные при изменении неноторых исходных параметров модели (таблица 7). Экспериментальные ЭО спектры фиксированных эритроцитов при различных рН суспензии: О—О - 9,6, О—О - 7,5,, К0 - величина изменения оптической плотности суспензии на частоте 10^ Гц, рН 9,6, ЭП среды 8,5.Ю-3 См/м.

§ Исследование механизма переориентации эритроцита в электрическом поле

На основании разработанной модели эритроцита и проведенных измерений методами клеточного электрофореза и электроориентации предложен механизм явления переориентации /щ.хозЬхШссгс' вЬ аХ* 1988/. Переориентация обусловлена изменением соотношения ЭП эритроцита и ЭП среды. Возможны три случая разных соотношений этих электропроводностей. Первый случай - низкие частоты - проводимость мембраны мала и эритроцит ведет себя как непроводящая частица в проводящей среде. При этом силовые линии проходяг вокруг эритроцита и ориентируют его вдоль поля. Второй случай - с увеличением частоты поля проводимость мембраны увеличивается и на некоторой частоте становится соизмерима с проводимостью среды* Из приведенного выше анализа видно, что наилучшее соответствие теоретических и экспериментальных кривых в этом случае получено в "предполо-

ло&ении увеличения поперечной проводимости по сравнению с продольной (см.рнсД2 и таблицу 7). При этом силовые линии должны проходить поперек эритроцита и ориентировать его большой осью поперек поля. И третий случай -■ на высоких частотах сопротивление:.- мембраны можно пренебречь и рассматривать эритроцит как хорошо ирззо-дящуа частицу в плохо проводящей среде. Это приводит к концентрированию силовых линий внутри эритроцита и, соответственно, ср-ек-тацик его вдоль поля.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1« Впервые разработана система способов,устройств, методик, предназначенных для измерения различных электрических характеристик клеток и препаративного разделения клеточных суспензий б потоке буфера. Методы измерений - аналитический клеточный электрофорез 8 электроориентация и диэлектрофорез, мостовой измеритель; методы разделения - электрофорез, диэлектрофорез, электромагнита-форез* ультраэвукофорез. Разработаны биофизические принципы проведения измерений и препаративного разделения, включаацие подготовку препарата клеток к исследованиям, проведение исследований и обработку результатов, которые учитывают биологическую гетерогенность клеток, изменчивость параметров нативных клеток во времени к под влиянием внешних воздействий.

2. Построены электрофизические модели эритроцита и определены величины «электрических характеристик (диэлектрической проницаемости, электропроводности, поляризуемости) структурных элементов эритроцитов и околоклеточной среды и их изменение в области частот альфа- и бета- дисперсии. Правильность определения параметров проверялась по соответствию теоретических кризых ориентирующего момента сил, действующего на эритроцит в переменном электрическом поле и экспериментальных электроориенталионных кривых суспензии эритроцитов. При расчете ориентирующего момента сил использовали значения электрических параметров структурных

• элементов, выбранные исходя из биологических функций и физической природы данного структурного элемента клетки. Построенные МО' дели позволяют изучать электрические характеристики отдельных структурных элементов без разрушения эритроцита и сзязать физический и биологический смысл этих характеристик при интерпретации экспериментальных электроориентационных спектров.

3. Исследовано взаимодействие фиксированных эритроцитов с

поля сахариднезли антигенамн. Показано,' что'■ степ еньЧ1$ШШй"#--по>- • зе-дхяости эритроцитов под действием антигенов" зависит? о Т"' вида1-ц;1 доза антигена, что проявляется в' уменьшении: среднего зИ&ШШ> электрэфоретнческой подвижности, увеличении' средеекваДр&дашсГГсР отклонения и п:явления в отдельных случаях перезаряяеннй&< йй'етшл. С^с-естзенно, что разные антигены (зокне,- флекснер,-ньэкестл)'оТ-одного л того Ее вида бактерий Шигелл по разному' изменяют-" элекТ--рофоретическую подвижность эритроцитов,' что поз'вбйяе^ научить- !/.е--ханигм взаимодействия антигенов с клеточной- поверхностью'.« Показано, что степень заполнения поверхности эритроцита антир'ёнакя определяется отношением среднего значения эйектрофсрётичёсКой' под--в;г-'.нсгх/. к среднеквадратичному отклонению суспензии б'енШЙйЯШ-розанных данных антигеном, эритроцитов.

4. ггззаботан метод подготовки пробы кроьи и прбвЗДёнйя' гдектрсфсреткческпх измерений нативных эритроцитов: подобран' ионный состав измерительной среды и исключены антккоагулянты, которые модифицирует поверхность эритроцитов и искапают результаты измерений, кровь берется непосредственно в измерительную среду бэз последующих отмывок, которые приводят к денатурации эритроцитов в процессе измерений. Выявлена разница во взаимодействии натнвных эритроцитов с перфторорганическими эмульсиями по сравнению с белкоЕО-солевыми растворами. Показано, что эмульсия вызывает увеличение злектрофоретической подвижности эритроцитов после контакта с эмульсией в течение нескольких секунд. Установлено, что эмульсия Ензывает увеличение злектрофоретической подвижности гритропитсэ в течение первых суток после кровозамедзения у крыс,

и более быстрое возвращение к исходному значению злектрофоретической подлинности б случае двухнедельной кинетики по сравнению с белкозо-солевыми растворами.

5. Исследованы электрофизические характеристики митохондрий и показано, что их величина и изменения зависят от функционального и морфологического состояния органелл. Комплексные измерения различных электрических характеристик позволило исследовать разные гг-р-ны процесса энергиэацки-деэнергизации митохондрий.

Показано, что изменение электроориентационного эффекта митохондрий з области бета- дисперсии в соответствии с данными расчетов на электрофизических моделях вызвано нарушением барьерных сзсйстз внутренней мембраны митохондрий, индицированное действием разобщителей и связанного с этим изменением ионного состава внутри митохондрий. Временное изменение электроориентациошого эффекта на фиксированной частоте в области бета- дисперсии позво--

ляет регистрировать кинетику изменения концентрации ионов з митохондриях и изучать процесс функционирования митохондрий при энер-ги^ации-деэнергизации. Показано, что изменение электрофоретичес-кой подвижности митохондрий под действием субстрата связано с набуханием и изменением морфологии и не зависит от их зне^гизации.

б« На основании экспериментальных измерений методами аналитического клеточного электрофореза и электроориентации в сочетании с разработанными электрофизическими моделями предложен механизм явления переориентации эритроцита относительно зектора напряженности электрического поля з области частот бета- дисперсии. Переориентация эритроцита из положения большой осью (диаметром) вдоль поля в положение поперек поля обусловлена изменением соотношения электропроводности среды и электропроводности эритроцита. Это соотношение изменяется в зависимости от частотной дисперсии электрических параметров среды и эритроцита и разницы значений рН изоточек поверхности эритроцита и гемоглобина. Изменение соотношения электропроводности приводит к перераспределению силовых ликпй электрического поля - в одних случаях линии преимущественно проходят вокруг эритроцита, а в других - сквозь него - и переориентируют эритроцит, чтобы его положение вносило наименьшее искажение в распределение силовых линий поля.

7. Разработаны способы повышения качества промышленных эрит-роцитарных диагностических препаратов, не имеющие аналогов в мировой практике. Повышение качества препаратов, предназначенных для диагностики инфекционных и ряда неинфекционных заболеваний, достигнуто путем количественного контроля технологического процесса производства на основе анализа электрических характеристик эритроцитов. Применение этих способов поззоляет достичь существенного улучшения основных характеристик препаратов - повысить

их стандартность и специфическую активность за счет отбраковки некачественного сырья и некачественных готовых препаратоз, а также снизить расход дорогостоящих материалов - за счет определения оптимальной дозы антигена.

8. Изучено изменение барьерных свойств мембран клеток под действием дезинфектантов - гипохлорита натрия и азотнокислого серебра - используемых для дезактиз&ции микроорганизмов при получении питьевой воды. Показано, что действие дезинфектантов приводит к значительному снижению электроориентацконнэго эффекта в области бета- дисперсии, что в соответствии с данными расчетоз на электрофизических моделях свидетельствует о гибели микроорганизмов и нарушении барьерных свойств их мембран. Это коррелирует 30

с микробиологическим контролем бактерицидного действия дезинфен- • тактов. Измерение электроориентационного эффекта на фиксированной частоте производится быстрее, чем ш,:кробиологический тест на выживаемость микроорганизмов по посевам на чаики Петри и подсчету числа колоний. Это позволяет использовать электричесние измерения суспензии клеток для оперативного контроля степени вызхиваемости микроорганизмов при подборе дезинфентантов и автоматизировать процесс получения питьевой воды.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации

1. ШР02ШШВ А.И., ШУЛЬГА A.B., ФОМЧЕНКОВ B.W., ФИНАКОВ Г.З. ■Ультразвуковое концентрирование микроорганизмов // Микробиологи-чеокая промышленность. - 1971. - выл. 12. С.34-37.

2. ifiiFOillHHKOB А.И., Ч5КАН0В В.А., ФИНАКОВ Г.З., IffiAHOB А.Ю. Неприрывное фракционирование живых и мертвых дрожжевых нлетои методом электрофореза // Микробиологическая промышленность. -- 1972. - вып. 7. - С.7-9.

3. A.c. 357517 СССР. Способ неприрывного контроля концентрации дисперсных частиц / Мирошнинов А.И., Фомченков В.М., Финаков Г.З., Иванов А.Ю. - Заявл. 03.02.71; Опубл. 31.10.72, Бюл. №33»

4. A.c. 362628 СССР. Способ разделения задних тонко дисперсных систем / Тихомиров В.В., Мирошнинов А.И., Фомченков В.М., Габуев К.С. - Заявл. 03.02.71; Опубл. 29.12.72, Бюл. «23.

5. A.c. 372361 СССР. Способ разделения живых и мертвых клеток / Мирошнинов А.И., Чеканов В.А., Финаков Г.З., Иванов А.Ю. - Заявл. 23.04.71: Опубл. 01.03.73, Бюл. ИЗ.

6. A.c. 375080 СССР. Способ разделения жидких тонко дисперсных систем / Мирошнинов А.И., Фомченков Б.М. - Заявл. 06.04.71; Опубл. 23.03.73, Бюл. föI6.

7. A.c. 394320 СССР. Способ осветления суспензий / Мирошнинов А.И., Габуев И.С. - Заявл. 06.04.71; Опубл. 22.08.73, Бюл. ¡Й34.

8. l.il-iPOüiHi'IKOB А.И., ЧЕКАНОВ В.А., ФОМЧЕНКОВ В.М. Метод и устройства электрофореза в свободной среде // В сб.: Вопросы технической кибернетики биологического эксперимента. Пущино: Изд. ОНТИ, 1974. - С.84-93.

9. !.'м?0ШИК0В А.Л., ФИНАКОВ Г.З. Использование метода диэлек-TDDiLcDesa для изучения поведения микроорганизмов в неоднородных электрических полях // Б сб.: Вопросы технической кибернетики . биологического эксперимента. - Пущино: Изд. ОНТИ, 1974. - С.94-100.

1С. ФйКАКОБ Г.З., МИРОШНИКОВ А.И., НИКОЛАЕВ Ю.В. Применение метода неприрывного электрофореза в свободной среде для обнаружения комплекса ДНК с продуктами окисления полифенолов // В сб.: Болсосы технической кибернетики биологического эксперимента. -Пуа.чнс; -Изд. ОНТИ, 1974. - CI0I-I06.

11. :.;u?Giffii'IKOB А.И., ГАБУЕВ И.С., ФОМЧЕНКОВ В.М. Влияние ультразвукового поля на устойчивость клеточных суспензии // В сб.: Вопросы технической нибернетини биологического эксперимента. -Пчцино: Изд. ОНТИ, 1974. - С.76-80.

12. A.c. 474723 СССР. Устройство для разделения дисперсных частиц / Мирошнинов A.M., Фомченков В.М., Иванов А.Ю. - Заявл. 04.06.73; Опубл. 25.06.75, Бюл. №23.

13. A.c. 484 009 СССР. Устройство для разделения дисперсных |?астиц в электрическом поле / Мирошнинов А.И., Фомченков В.М.,

Иванов А.Ю. - Заявл. 03102.71: Опубл. 15.09.75, Бюл. J,ö4.

14 о ФОМЧЕНКОВ В .П., ШЙЮШНИКОВ А.И., ИВАНОВ А.Ю., ДУВШИННИНО-ВА В.В. Диэлектрофорегическое поведение клеточных суспензий // Электронная обработке материалов. - 1975. - й 2. С.60-64.

151 ГАБУЕВ И.О., ШРОШНЙКОВ А.И., ЧЕКАНОВ В.А., ИВАНОВ A.D. Установка для электройооеза в свободно;; среде с оптическим анализатором йоакдий /У Электронная обоабогка материалов. - ±976. -hi » С.79^81 с

1б0 А.с* 493776 ссср, Устройство для разделения частиц по злектромагнитофорезжческой подвижности./ Мироаников А.И., Гавр>-люк Б.К.. Фомчекков B.U., Иванов А.Ю. - Заявл. 30.11.72; Опубл. 25 »10.76, Бюл«. К239„

17. РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИИ / А.II. аирошикоз, Б.!!. Фэмченкоз, II.С» Гг.буев. Б,А. Чеканов, - И.: Наука,iS77. - I6dc.

18. A.c. 58692? СССР. Устройство для разделения дисперсных частиц / Нирошников А.И», Иванов А.Ю.., Чеканов В.А. - Баявл. 06. 01.76; Опубл. 05.01.78, Бюл. tel,

19. ИВАНОВ А.Ю., ГАБУЕБ И.С., НИРОШНИКОВ А.И., ЧЕКАНОВ Б.А. • Установка для измерения электрофореткческot; поделкности клеток

// Проблемы гематологии и пеоелквакия крови. - 1979. - '.2 3, -С.52-55. * •

20. ФОМЧЕНКОВ Б.М., ШРОШЙКОВ А.И. Ячейки для исследования электроориентации к диэленгрофореза клеток // Электронная обработка материалов,, - 1979» - !!? - С.91-93.

21. ШРОШШОЗ А.И., ФОМЧЕНКОВ В.Ы., ИВАНОВ А.Ю. Метод и аппаратура электрофореза в свободном потоке // В сб.: Методы '^акционирования кдеоных клеток крови к костного иозгэ. - Изд. ин-та гематологии и переливания крови, 1980, - С.34-63.

. 22. A.c. 709989 СССР. Устройство для измерения электропооьод-■' ности растворов / Чеканов В.А., Мирокников А.И. - Заявл. 02.02. . 77; Опубл.-15.01.80. Бюл. Кн2.

23. A.c. 744285 СССР. Устройство для дизлектроьоретического разделения дисперсных частиц / Фэыченяов B.i.'., Йиооеккков А..:. Заявл. 07.03.78; Опубл. 30.06.80, Бюл. ¡¿24. ; 24. ТЕМНОЕ A.B., НИРОШНИКОВ А.И., ТИЦЕНКО В.В. Влияние внтм-ноагулянтов на электрокинетические характеристик клеток // Проблемы гематологии и переливания крови. - 1982. - Ы. С.29-34.

25. A.c. 9I3I69 СССР. Способ определения электрических хорак-■ теристик асимметричных частиц / Иванов А.Ю,, Фомченнов Е.М., Нирошников А .И. - Заявл. 16.04.80; Опубл. 15.03.82, Бюл. ¡.¿10.

26. -ШРОШНИКОВ А.И., ИВАНОВ А.Ю., TEIfflOB A.B., ФЕДОРОВ H.A. Ероточный электрофорез с периодической инверсией потока // Проблемы гематологии и переливания крови. - 198. - Iii II. - С.53-63.

27. АКАТОВ B.C., ШРОШНИКОВ А.Й. Измерение адгезиькости кле-. ток н стеклу при неизменной плотности их поверхностных зарядов

// Биофизика. - 1983. - Т. 28. C.5I6-5I7.

28. ИВАНОВ А.Ю., ШРОШНИКОВ А.И. Метод электрофореза в ездкой "- фаэе при изучении взаимодействия антиген-антитело на эритроцитар-

ных диагностикумах // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1983. - Яг 6. - С.115-118.

' - 29. ИВАНОВ А.Ю., ФОМЧЕНКОВ В.М., ШРОШНИКОВ А.И. Способ регистрации' элевтроориентации клеток // Электронная обработка материалов., - 1984. -16 4. - С.53-57.

30. ШРОШНИКОВ А.И., ТЕМНОВ A.B., ИСЛАМОВ Б.И., ГРИШИНА Е.Б., •. БРУСТОВЕЦКШ H.H. Влияние эмульсии ПФОС на электрофоретическую

подвижность эритроцитов // В сб.: Фторуглеродные газоперенося-■ щие среды. - Пущино: Изд. ОНТИ, 1984. - С.152-156.

31. A.c. II24229 СССР. Способ определения дозы сенситина,

необходимой для получения эритроцитаряого диагностивума / Мирош- " иикоз Л.И., Темнов А.В., Дулатова Ы.В. и др, -Заявл* .17,06,83; Опубл. 15.II.84, Бюл, Ш1.

32. А.с. II24975 ССОР, Способ получения эритроцитарного диаг-ностикуна / Миооининов А,И., Темнов А,В., Савицкая 'О»В,'"и др. -Заявл. 18.07.8?; Опубл. 23.11.84, Бюл, Ш,

33. А.с. II'14976 СССР, Способ отбора эритроцитов для получения эригроцитарного диагностикума / Мирошников А.И., Теинов А.В. Савицкая О.В. и др, - Заявл. 18.07.83; Опубл. 23.11.84, Бюл. Ш.

34. КРАСНОГОРСКАЯ Н.В., МИРОШНИКОВ А.И., ШПАКОВ А.А. Некоторые электрические свойства крови и ее изменение под действием электромагнитных полей // В сб.: Электромагнитные поля в биосфере . - Н.: Наука, 1984, - Т. 2. - С.89-97,

35. КРАСНОГОРСКАЯ Н.В., МИРОШНИКОВ А.И., ФО!ИЕНКОВ В .М-., ИВА-КОВ А.Ю. Методы измерения электрических характеристик клеток и их применение в биологии и медицине //В сб.: Электромагнитные поля в биосФзре. - Г.1.: Наука, 1984, - Т. 2. - С.271-284,

36. LIIROSHITIKGY A.I., DULASOTA 11,7., TU.UiOV A.V., SAVITSKAYA 0.7., XVAIiOV A.Yu. Application of cell electrophoresis in production of erythrocyte diagnistic preparations//Ins Cell electrophoresis. Ed. Yt. Schiitt, H.KlinkEiann. - Berlin, 1985» ~ Р» 645-650.

37. иГКОЗШТГКОТ A.I., GRISHHiA E.V., ISLAL'QV B.I., Effect of t>erf luorocarbon emulsion on EH® of erythrocytes on scute loss of blood //In: Cell electrophoresis. Ed. V.'.Schutt, H.Klinlmann. -Berlin, 1985. - P.651-656.

38. ИВАНОВ А.Ю., ДЕЙНЕГА Е.Ю., МИРОШНИКОВ A.M., САШУ К О.С. Исследование изменения электроориентации клеток S.col, при действии дезинфектантов // Микробиология. - 1985. - Т. 54* - С.826 -829.

39. IVARC7 A.Yu., GOGVADZE V.G., I.5IRCSHNIKOT A.I,, ilEDVEDbV B.I. Electroorientation effect of isolated mitochondria in different functional states // Gen,Physiol.Biophys. - 1935. - Vol.4.

- P. 483-491.

40. МИРОШНИКОВ А.И., ФОМЧЕНКОВ B.M., ИВАНОВ А.Ю. Электрофизический анализ и разделение клеток. - М.: Науна, 1986. - 198с.

41. МИРОШНИКОВ А.И., ИВАНОВ A.D., ФОМЧЕНКОВ В.И., ШИРОКОВА А.Н. Электрофизическая модель эритроцита и ее использование для изучения явления поляризации клетон / АН СССР. Ин-т биолог, физики. - Пущине, 1986. - 37с, - Лея. в ВИНИТИ 27.02,86, 1Й2365-В86.

42. А.с. 797349 СССР. Устройство для электроЗюретического разделения дисперсных частиц / Мирошников А.И., Иванов А.Ю., Во-лоцкой М.П. - Заявл. 10.07.79; Опубл. 23.07.8S, Бюл. (,'527.

43. МИРОШНИКОВ А.И., ФОМЧЕНКОВ Б.М., ИВАНОВ А.Ю,, ШИРОКОВА А.Н. Многофазная электрофизическая модель эритроцита на основе электроориентационного эштекта / АН СССР. Ин-т биолог, Физики.

- Пущино. 1986. - 17с. -'¿ел. в ВИНИТИ 06,11,8б,цJ?8r6?S-B86. ПТГГ1

44. iAROGffiilKOV A .I., IViUiOV A.Yu., М.СНЕИКЬУ '/Лл., SHlPObO-va A.I;. Electroorientation studies on eloctrophysical properties of erythrocytes in radio-frequency range of alternating electric field // In: Electromagnetic "fields and biomembranes. Ed. I.UKar-kov, I.:.Blank. - li.Y., London: Plenum Press, 1988. - P.37-47.