Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие сил на клетки в суспензии в поле стоячей ультразвуковой волны

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Действие сил на клетки в суспензии в поле стоячей ультразвуковой волны"

На правах рукописи

Садикова Диана Габдельфартовна

ДЕЙСТВИЕ СИЛ НА КЛЕТКИ В СУСПЕНЗИИ В ПОЛЕ СТОЯЧЕЙ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ВОЛНЫ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

у

Пущине - 2009

003469126

Работа выполнена в Лаборатории биологических эффектов неионизирующих излучений Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН (ИБК РАН) г. Пущино Московской обл.

Научные руководители: доктор биологических наук

Пашовкин Тимофей Николаевич,

доктор физико-математических наук ¡Печатников Владимир Алексеевич!

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Харакоз Дмитрий Петрович,

кандидат физико-математических наук Андреев Валерий Георгиевич

Ведущая организация: Государственный научный центр Российской Федерации ■

Институт медико-биологических проблем РАН

Защита диссертации состоится _2009 г. в . на заседании совета

Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН г. Пущино

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь совета Д 002.093.01 ,

кандидат физико-математических наук Ланина Н. Ф.

Актуальность темы.

Многие исследования биологических систем на клеточном уровне организации в области биологии клетки, клеточной инженерии и биотехнологии зависят от эффективности методов, которые обеспечивают выделение, разделение и концентрирование клеток. При этом значительные усилия исследователей направлены на сокращение времени выделения клеток в нативном состоянии, что позволяет удлинять время эффективной работы с клетками.

Наряду с широко известными и давно используемыми методами, в последние годы начали интенсивно развиваться ультразвуковые методы разделения и концентрирования клеток различного происхождения в полях стоячих ультразвуковых волн [Князьков H.H., 1983, Князьков H.H., Шильников Г.В., 1996, Князьков H.H. и др., 2006, 2007, 2008, Groschl М, 1998, Peterson F, 2004]. Их перспективность обусловлена тем, что: а) методы работают в широком диапазоне концентраций клеток, б) методы обладают высокой скоростью разделения, в) перевод клеток в новые среды суспендирования происходит без извлечения клеток из камеры разделения, г) фрагменты клеток автоматически удаляются из суспензии в процессе разделения.

Дальнейшее развитие ультразвуковых методов разделения и концентрирования клеток зависит от понимания физических явлений, лежащих в основе этих методов, и в первую очередь от понимания механизмов действия различных сил в ультразвуковых полях на клетки в суспензиях.

В настоящее время существует ряд работ, которые посвящены рассмотрению действию сил на различные клетки и частицы в поле стоячих ультразвуковых волн [Yoshioka К., Kawasima Y., 1955, Weiser А.Н., Apfel R.E., 1984, Coakley W.T., 1997, Hawkes J.J. and Coakley W.T., 2001]. В первую очередь это связано с применением стоячих ультразвуковых волн в качестве акустических фильтров, задерживающих твердые частицы и различного вида клетки биологического происхождения в узлах переменного давления этих волн. Первичным механизмом таких эффектов является действие различных сил в поле стоячей ультразвуковой волны на частицы и клетки в суспензиях. Возможность перераспределения клеток в объеме под действием этих сил привели в последние годы к развитию ряда новых методов концентрирования и разделения клеток в поле стоячей ультразвуковой волны для медицинских, биотехнологических целей и для научных исследований в области биологии клетки. Однако они ограничиваются либо рассмотрением отдельных сил, либо теоретическими расчетами. Для возможности предсказания поведения клеток в поле стоячих ультразвуковых волн при использовании ультразвуковых систем необходимо комплексное исследование ряда физических параметров клеток и сред культивирования, входящих в формулы для расчета различных сил, действующих на клетки: радиационной, Стокса, Бьеркнеса, Бернулли и гравитационной. Эти силы давно изучены и их действие на твердые частицы, и газовые пузырьки описаны в целом ряде работ [Шутилов В.А., 1980, Горьков Л.П., 1961, Zheng X., Apfel R.E., 1995]. Тем не менее, для биологии и медицины

важно оценить величины этих сил при действии ультразвука на различные виды клеток животного и растительного происхождения. Это связано с тем, что для большинства клеток в литературе нет данных об их волновых свойствах, сжимаемости и ряде других параметров, необходимых для расчета величин таких сил. Наличие крайне ограниченного количества данных в литературе обусловлено тем, что лишь единичные лаборатории в мире обладают аппаратурой, позволяющей с высокой точностью измерять акустические параметры клеток и сред культивирования и получать данные, необходимые для расчета сил, действующих на клетки в суспензиях. Поэтому, большой интерес представляют количественные исследования основных параметров ультразвука, клеток и сред культивирования, с помощью которых можно управлять процессом концентрирования и разделения клеток в поле стоячих волн.

Разработки систем ультразвукового разделения и концентрирования невозможны без метрологии ультразвуковых полей, формирующихся различного типа излучателями. Поэтому вопросам метрологии в работе уделено особое внимание в связи с тем, что радиационные силы, действующие на клетки с близкими волновыми параметрами, также мало различаются. Следовательно, тонкая настройка энергетических параметров поля является залогом успешного применения ультразвуковых систем для разделения таких клеток на фракции.

Быстрое эмпирическое развитие ультразвуковых методов разделения и концентрирования клеток в суспензиях и крайне малое количество данных о волновых параметрах большинства клеток и сред суспендирования определяет актуальность данного исследования.

Цель работы.

Исследование сил, действующих в поле стоячей ультразвуковой волны на клетки в суспензиях и составляющих основу методов ультразвукового концентрирования и селектирования нативных клеток.

Основные задачи исследования:

1. Исследование параметров ультразвука, клеток и сред суспендирования, влияющих на процессы концентрирования и разделения клеток.

2. Расчет сил, действующих на клетки в стоячей ультразвуковой волне.

3. Теоретическое определение граничных условий для концентрирования и разделения клеток на основании величин рассчитанных сил.

4. Экспериментальное подтверждение граничных условий зон вымывания и концентрирования для клеток различного вида в координатах: средняя плотность энергии и линейная скорость протока суспензии клеток.

5. Проверка жизнеспособности клеток при воздействии на них ультразвукового поля.

Научная новизна

Впервые исследован комплекс физических параметров ультразвука, клеток различного вида и сред культивирования, влияющих на динамику перемещения клеток различного вида в узлы или пучности ультразвукового давления в поле стоячей ультразвуковой волны. К ним относятся: волновые свойства клеток, сред культивирования и их соотношения, геометрические размеры клеток, частота и пространственное распределение интенсивностей ультразвука, вязкость суспензий клеток и сред культивирования, скорости протока суспензий, тип и объем камер разделения и концентрирования. С использованием полученных параметров рассчитаны силы радиационного давления, Стокса, Бьеркнеса, Бернулли и гравитации, действующих на клетки разной природы. Предложен метод анализа, позволяющий подбирать параметры эффективного разделения и концентрирования клеток в камере для проточного ультразвукового селектирования.

Научно-практическая значимость работы.

Результаты данного исследования могут быть использованы для оптимизации ультразвуковых методов быстрого выделения, сепарации и концентрирования клеток различного типа в суспензиях. Они могут найти применение в биологии, биотехнологии, молекулярной биологии, гидробиологии, экологии, медицинской диагностике.

Апробация диссертации.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на II Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005», Москва, 21-24 июня 2005 г.; 8-й международной Пущинской конф. мол. ученых «Биология - наука XXI века», 17-21 мая 2004 г.; Десятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», С.-Петербург, 20-21 апреля 2007 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликованы 11 работ, из них 6 статей в рецензируемых отечественных журналах.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, из части, описывающей полученные результаты и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на страницах, содержит У/ иллюстраций, графиков и таблиц. Библиография включает //О ссылок.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы рассматриваются силы, действующие в стоячей ультразвуковой волне на частицы различной природы: радиационная, гравитационная, Стокса, Бьеркнеса и Бернулли. Приведены данные о скорости

и поглощении ультразвука в различных средах, сжимаемости, так как эти параметры необходимы для расчета сил. Рассмотрены вопросы метрологического контроля ультразвукового поля, используемого в нашей работе. Проведен анализ существующих принципов и различных методов ультразвукового концентрирования и разделения твердых частиц и клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования

В работе использовались эритроциты морских свинок (беспородных) и крыс (линии Вистар), дрожжи (Saharomices cerevisiae).

Эритроциты морских свинок и крыс получали из крови животных, полученной при декапитации на специальной гильотине. Кровь помещали в физиологический раствор 0.9% NaCl с добавлением гепарина. Затем клетки отмывались три раза и разводились в 0.9% NaCl до требуемой концентрации. Клетки дрожжей получали, используя сухую культуру дрожжей Saharomices cerevisiae. Сухую культуру разводили в дистиллированной воде для того, чтобы предотвратить размножение клеток, и получить устойчивую концентрацию клеток в суспензии.

Размер клеток определялся методом световой микроскопии. Для этого клетки, находящиеся в камере Горяева, фотографировали с помощью цифровой видеокамеры и определяли размеры, используя программу IGL Trace 1.26b.

Визуализация и калибровка ультразвуковых полей

Визуализация ультразвуковых полей проводилась с помощью метода, разработанного Т.Н. Пашовкиным и Г.В. Шильниковым. Суть метода заключается в том, что интенсивность прокрашивания индикаторной пористой пластинки (однородной плотной бумаги) в растворе метиленового синего пропорциональна локальной интенсивности ультразвука. Исследования проводили в кювете с пьезопреобразователем от терапевтического генератора УЗТ-Э.04Д с частотой 2.64 МГц, интенсивностью 1 Вт/см2 , индикаторная пластинка размером 5x6 см располагалась параллельно поверхности пьезопреобразователя на расстоянии от 0.5 до 5 см с шагом 5 мм. Калибровка, связывающая интенсивность прокрашивания с локальной интенсивностью ультразвука, осуществлялась по средней по пространству и времени (Isata) интенсивности, которая измерялась с помощью стандартного измерителя мощности ультразвука ИМУ-3. Трехмерное распределение интенсивности ультразвука строили с помощью приложения, написанного в программном пакете МАТЛАБ 6.0.

Измерение скорости ультразвука

Для измерения скорости ультразвука в клеточной суспензии применяли резонаторный метод, который основан на измерении собственной частоты выбранной гармоники колебаний акустического резонатора с использованием аппарата РУЗИ-6, разработанного А.П. Сарвазяном. Рабочий объем ячейки 0.8 мл. Относительная точность измерения скорости ультразвука составляла 10"3%.

Скорость звука в суспензии клеток измерялась при температуре 25°С.

Скорость звука в материале клетки была рассчитана для всех видов клеток с использованием линейной части зависимости приращения скорости ультразвука от концентрации клеток в суспензии.

Измерение вязкости суспензии клеток

Измерение вязкости суспензии проводили с помощью капиллярного вискозиметра ВПЖ-9.

Измерение плотности клеток

Плотность клеток была рассчитана по сухому весу клеток, полученному выпариванием воды из суспензии клеток в термостате до постоянного веса с учетом концентрации клеток и их объема. Взвешивание проводили на весах Mettler с точностью 0.0001 г.

Метрологическое обеспечение работ с ультразвуковыми полями

Контроль средней плотности энергии в камере для разделения и концентрирования клеток в поле стоячей волны проводили с использованием дифференциальных термопар, калиброванных по интенсивности ультразвука, с линейной зависимостью термо-ЭДС от интенсивности ультразвука в диапазоне интенсивностей 0-15 Вт/см2, пересчитанной в среднюю плотность энергии в камере стоячей волны.

Метод продольного ультразвукового селектнрования

Метод разделения и концентрирования основан на принципе, который назван автором (H.H. Князьковым) продольным ультразвуковым селектированием (ПУС) суспензий. Он заключается в том, что клетки удерживаются полем стоячей ультразвуковой волны при протоке суспензии вдоль направления распространения ультразвука. При этом в поле стоячей волны на частицы действуют силы различной природы (сила радиационного давления или радиационная сила), силы со стороны потока жидкости, гравитации и силы взаимодействия между частицами. Для обеспечения эффективной работы метода длину ультразвуковой волны выбирают из соотношения Л<2ж-а, где X — длина ультразвуковой волны, а - характерный размер смещаемых полем частиц. При нарушении этого условия использование силы радиационного давления становится не эффективным. Из-за сложного характера зависимости радиационной силы от характеристик системы (таких как сжимаемость и размер клеток, скорость звука в материале клетки и среде), работа метода не может быть описана простым математическим выражением, поэтому скорость движения жидкости и интенсивность ультразвукового поля определялась для каждого конкретного случая экспериментально [Князьков H.H., 1983].

Измерение количества живых клеток (в %) после воздействия на них стоячей ультразвуковой волны

Определения количества живых клеток дрожжей, эритроцитов крыс и морских свинок в зависимости от времени воздействия ультразвукового поля, проводилось микроскопическим методом. Исследовали повреждения мембран клеток с использованием красителя. Для этого суспензия клеток окрашивалась трипановым синим, и затем считалось соотношение числа окрашенных и не окрашенных клеток под световым микроскопом. Этот краситель окрашивал только поврежденные клетки. Ультразвуковое воздействие на клетки проводили в камере для ультразвукового селектирования с включением замкнутого протока среды суспендирования и периодическим отбором клеток для анализа. Это позволило сделать оценку количества нативных клеток в камере к концу процедуры концентрирования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Метрология ультразвукового поля

При выборе параметров ультразвукового поля необходимо учитывать пространственное распределение интенсивностей в бегущей ультразвуковой волне. Для измерения распределения локальных интенсивностей был использован разработанный ранее Т.Н. Пашовкиным и Г.В. Шильниковым колориметрический метод (Рис. 1). Сделанная нами модификация этого метода с использованием трехмерных изображений позволяет более точно и быстро определять пространственное положение и значения локальных и средних интенсивностей в ультразвуковых пучках (Рис. 2).

В работе использованы две системы продольного ультразвукового селектирования, работающие на частоте 2.64 МГц: а) с плоским пьезокерамическим излучателем площадью 2 см2 и б) с фокусирующим излучателем площадью 4 см2, имеющим радиус фокального пятна 1.2 мм и длину фокальной области 7 мм. Для генерации ультразвука были использованы аппарат для ультразвуковой терапии УЗТ 3.06 и ультразвуковой ингалятор ШНАрох!, модифицированный под ультразвуковой концентратор клеток с максимальной интенсивностью в фокальной области излучателя 15 Вт/см2, что в пересчете на среднюю плотность энергии стоячей ультразвуковой волны в камере для концентрирования и разделения клеточной суспензии соответствовало 2.6 Дж/см3.

Известно, что пороги кавитации при воздействии ультразвуком с частотой 2.64 МГц существенно выше, чем при воздействии ультразвуком с частотой 0.88 МГц. Поэтому, возможность разрушения клеток при увеличении частоты ультразвука уменьшается. Следовательно, при работе в стоячей ультразвуковой волне с суспензиями клеток возможно увеличение средней плотности энергии, что существенно увеличивает возможности ультразвуковых методов разделения и концентрирования. Этим объясняется выбор частоты источника излучения в нашей работе.

При частоте 2.64 МГц наблюдается более равномерное распределение интенсивностей в ближней зоне излучателя, чем при частоте 0.88 МГц (Рис. 2,

Рис.1. Распределение интенсивностей в сечении ультразвукового пучка, при средней интенсивности ультразвука I Вт/см" и при частоте а) 0.88 МГц и 6)2.64 МГц.

Расстояние от излучателя - 2 см.

о

Рис. 2. Трехмерное распределение локальных интенсивностей в сечении ультразвукового пучка. Интенсивность - 1 Вт/см2, частота - 0.88 МГц. Размеры изображения - 4 х 4.5 см. Расстояние от излучателя - 2 см.

Рис. 3. Трехмерное распределение локальных интенсивностей в сечении ультразвукового пучка. Интенсивность - 1 Вт/см2, частота - 2.64 МГц. Размеры изображения - 4 х 4.5 см. Расстояние от излучателя - 2 см.

Основные параметры клеток и сред суспендирования

Для исследования сил, действующих на клетки в ультразвуковом поле, необходимо определить основные параметры клеток и сред суспендирования, влияющие на эти силы: скорость звука в материале клетки и сред, вязкости клеточных суспензий и сред, размер клеток, их плотность и сжимаемость. Полученные экспериментальные данные для расчета сил приведены в таблице 1.

Таблица 1. Основные параметры исследуемых клеток и сред

Свойства материала клеток Свойства сред

Эритроциты крысы Эритроциты морской свинки Клетки дрожжей Дистиллиро ванная вода 0.9% NaCI

Плотность (кг/м3) 1,108 1,09 1,085 0,999 1,005

Средний размер (микрон) ~6 ~7 1,45 - -

Объем (микрон3) 56,54 76,96 11,5 - -

Скоростьзвука в материале (м/с) 1584 1600 1581,5 1497 -1507

Сжимаемость (бар"1) 35,9 35,8 36,8 44,6 43,8

Силы, действующие на клетки в поле стоячей ультразвуковой волны

При движении клеток в потоке жидкости в поле ультразвуковой волны, на них действует совокупность сил, рассмотрение которых позволит предсказать поведение клеток при разделении или их концентрировании.

Радиационная сила

Радиационная сила является наиболее важной из сил, которые действуют на тело в ультразвуковом поле. Действие этой силы приводит в движение клетки в поле стоячей ультразвуковой волны. Используя данные, приведенные в таблице, были рассчитаны силы радиационного давления для клеток дрожжей, эритроцитов крыс и морских свинок.

= ЕкУ

* 1 + 2( 1 - —

2 +

Ро

где р,р о - плотность частицы и среды, соответственно, с, с0 - скорость звука в

ТГ /

материале частицы и среды, соответственно, Ь =— - средняя плотность

со

энергии, /- интенсивность ультразвукового поля, V- объем клетки.

4

Объем для клеток дрожжей - -лг' (объем сферы, где г - радиус клетки), для

эритроцитов - (объем цилиндра, где £> - диаметр, к - высота).

В результате расчетов мы получили зависимость радиационной силы от средней плотности энергии для эритроцитов морских свинок и крыс, клеток дрожжей (Рис. 4).

Средняя плотность энергии х 10 (Дж/см )

Рис. 4. Зависимость радиационной силы от средней плотности энергии ультразвукового поля для 1) эритроцитов морской свинки, 2) крыс и 3) клеток дрожжей.

Сила Стокса

При движении клеток в поле стоячей ультразвуковой волны на клетки действует сила сопротивления или трения, которая выражается законом Стокса.

Ртр = Яб ГУТ],

где 77 - вязкость среды, г - радиус частицы, V - скорость движения среды. В рассматриваемой нами системе концентрирования клеток в ультразвуковом поле при наличии протока среды культивирования, существует две силы Стокса. Первая возникает при движении клеток к узлу или пучности ультразвукового поля под действием силы радиационного давления, вторая при действии потока среды, движущейся с определенной скоростью, на клетки. Сила Стокса сильно зависит от скорости движения клеток или скорости обтекания клеток средой суспендирования. Первой силой Стокса можно пренебречь, так как скорость движения клеток под действием силы радиационного давления имеет порядок -10-30 мкм/с. Поэтому мы учитывали только вторую силу Стокса, так как линейные скорости протока среды составляли -0.1-1.2 см/с.

Линейная скорость протока среды (см/с)

Скорость протока среды (мл/мин)

Рис. 5. Зависимость силы Стокса от скорости прокачки среды в камере для ультразвукового концентрирования и селектирования.

Используя выражение для силы трения, нами получены зависимости силы Стокса от скорости протока среды для клеток дрожжей, эритроцитов крысы и морской свинки. Диапазон изменений величин этих сил при линейных и объемных скоростях прокачки суспензии показан на рис. 5.

Сила Бьеркпеса

Когда клетки достигают узла давления, на них действует сила взаимодействия, которая называется силой Бьеркнеса. Сила взаимодействия представляет собой радиационную силу, испытываемую клеткой за счет рассеяния звуковой волны от другой клетки.

Единственная величина в выражении, которая изменяется в процессе движения клеток в ультразвуковом поле - это угол, под которым находится ось соединения центров исследуемых клеток по отношению к направлению движения клеток.

где с1 - расстояние между центрами частиц, р и (30 - сжимаемость частицы и жидкости, соответственно, в - угол между осью частиц и направлением распространения падающей звуковой волны, у(х) и р(х) - колебательная скорость двигающихся частиц, на которые действует ультразвук и давление этого поля соответственно.

Для всех клеток кроме эритроцитов крыс, при некоторых углах сила Бьеркнеса становится положительной. Если угол расположения оси равен нулю, первый элемент формулы для силы взаимодействия представляет собой вклад в силу отталкивания, тогда как вторая часть всегда определяет силу притяжения. В случае, когда сила Бьеркнеса для клеток становится отрицательной, (то есть второй элемент формулы становится больше), и клетки только притягиваются друг к другу, происходит агрегация клеток в поле стоячей ультразвуковой волны. Изменяя в формуле угол в оси от 0 до 90 градусов, можно рассчитать значения силы Бьеркнеса для некоторого момента времени. Часть этих значений имеет положительный знак, а часть -отрицательный. В результате расчетов мы получили диапазон величины силы Бьеркнеса для эритроцитов крыс от -2.7 х 10'8 до -5.9 * Ю-9 Н, эритроцитов морских свинок от 6 х ю-8 до -2.5 х Ю-7 Н, и дрожжей (от 8 х 10"12 до -2.3 х Ю"10 Н). Если предположить, что 100 % клеток в некоторый момент времени принимают положение от 0 до 90 градусов, то можно сказать, что притягиваться друг к другу будет 99% эритроцитов крыс, 75% эритроцитов морской свинки и 95% дрожжей.

Сила гравитации

На любую частицу, находящуюся в поле земного тяготения, действует сила гравитации или сила притяжения к земной поверхности. На клетки, которые уже находятся в узле давления ультразвукового поля или двигаются в направлении узла, действует сила гравитации, которая заставляет оседать клетки, если они находятся в неподвижном положении, или отклоняться от прямолинейного движения к ближайшему узлу давления.

где g ускорение свободного падения, г - радиус частицы, р и р0 - плотность частицы и среды, соответственно.

Несмотря на то, что радиус эритроцитов крысы и морской свинки больше, чем у клеток дрожжей, их форма не является шарообразной. Поэтому в расчетах силы гравитации мы заменили объем шара объемом цилиндра как наиболее схожей с формой эритроцитов. В результате расчетов мы получили величины сил гравитации для: эритроцитов крыс - 4 х 10"17 Н, эритроцитов морских свинок-4.2 х Ю"п Н, и дрожжей-4.8 х Ю'17Н.

Сила Бернулли

Когда клетки находятся в узле давления ультразвукового поля, в жидкости, которая движется с некоторой скоростью v, то вследствие пониженного давления между этими клетками возникает сила притяжения Бернулли.

Рыг=\*-р(гМ/<1*У

где г\, г2 - радиус сферы, с1 - расстояние между центрами двух сфер.

Сила Бернулли, действующая на эритроциты крыс, морских свинок и клеток дрожжей увеличивается по квадратичному закону и составляет для эритроцитов величину 10"14 Н, для клеток дрожжей 10"15 Н. Для клеток дрожжей не имеет значения расположение клеток относительно потока жидкости, так как они имеют форму сферы. Для эритроцитов это существенно, так как они могут располагаться как плоской стороной, так и ребром к направлению потока. Расположение эритроцитов относительно потока жидкости существенно влияет на величину силы Бернулли, которая действует на клетки. Характер зависимости для эритроцитов, расположенных ребром к потоку жидкости, такой же, как и у эритроцитов расположенных плоской стороной, но на порядок меньше - 10~15 Н. Если характер зависимости в основном зависит от квадрата скорости потока жидкости, то величина силы - в основном зависит от размера клетки, находящейся в этом потоке.

Условия для удержания клеток в ультразвуковом поле в потоке жидкости

Анализируя величины этих сил, мы видим, что необходимо рассмотреть движение клеток под действием двух основных сил: радиационной и Стокса, возникающей за счет потока среды, так как остальные силы либо очень малы, либо отвечают за взаимодействие клеток между собой (сила Бьеркнеса). Для силы Стокса и радиационной силы можно записать условие начала вымывания клеток из узлов переменного давления: Рг > , (/•"„, - сила Стокса, /V -радиационная сила). Исследуя эти силы, и сравнив правую и левую часть выражения, можно подобрать граничные условия для разделения и концентрирования клеток в суспензии в поле стоячей ультразвуковой волны.

Наиболее наглядная картина определения возможностей разделения клеток на фракции выявлена в системе координат: средняя плотность энергии стоячей ультразвуковой волны (X) и линейная скорость протока суспензии клеток (У). Из рисунка 6 видно, что для каждого вида клеток появляются 2 зоны, в одной -клетки будут концентрироваться, в другой - вымываться. При сравнении этих зон для разных видов клеток мы получаем зону разделения, где одни клетки будут концентрироваться, а другие вымываться. Местоположение линий раздела зон для каждого вида клеток различно. Поэтому тангенсы углов наклона этих линий являются главной характеристикой каждого вида клеток, определяющей возможность их разделения на фракции.

Для экспериментальной проверки наших теоретических расчетов в системе координат средней плотности энергии и скорости протока среды, нами были выбраны 2 уровня энергии: 1.6 Дж/см3 и 2.5 Дж/см3.

Линейная скорость суспензии (см/с)

Объемная скорость суспензии (мл/мин)

Рис. 6. Определение зон концентрирования, разделения и вымывания клеток 3 видов в системе координат: средняя плотность энергии стоячей ультразвуковой волны (X) и линейная скорость протока суспензии клеток (У). Теоретически рассчитанные линии раздела зон (1, 2, 3) и экспериментально полученные (точки) данные для: клеток дрожжей (1), эритроцитов крыс (2), эритроцитов морских свинок (3).

На рисунке 6 разными точками отмечено, при каких объемных, и соответствующих им линейных, скоростях протока суспензий будет наблюдаться граница концентрирования/вымывания для изучаемых клеток.

Концентрирование клеток в поле стоячей ультразвуковой волны

Используя параметры средней плотности энергии поля стоячей ультразвуковой волны и скоростей прокачки суспензии эритроцитов для зон концентрирования, показанных на рис. 6. было проведено концентрирование этих клеток. Рис. 7 иллюстрирует процесс концентрирования эритроцитов крысы в проточной камере с фокусирующим излучателем в моменты времени О, 5 и 10 минут после включения ультразвука. Исходная концентрация клеток -10б кл/мл. Средняя плотность энергии - 1.2 х 10"2 Дж/см3. Конечная концентрация клеток в камере через 10 минут концентрирования — 2 х 108 кл/мл.

Следует отметить, что агрегация клеток в узлах переменного давления может увеличить эффективность концентрирования клеток, так как радиационная сила пропорциональна гг и будет увеличиваться быстрее, чем сила Стокса, которая пропорциональна г.

Рис. 7. Концентрирование эритроцитов крыс в поле стоячей ультразвуковой волны. Стрелками показаны камеры, в которых концентрируются клетки. / = 2.64 МГц. Время концентрирования: 0, 5, 10 минут после включения ультразвука. Средняя плотность энергии - 1.2 х 10"2 Дж/см3.

Экспериментальное определение линейных скоростей протока суспензий клеток, при которых для двух значений средних плотностей энергии ультразвука начинается вымывание клеток из узлов переменного давления показано на рис. 8-10. Видно, что для всех типов клеток при определенных скоростях прокачки суспензии начинается вымывание клеток из камеры. Пунктирной линией на графиках отмечены скорости, которые были показаны на рис. 6 как граничные. При увеличении этих скоростей начинается вымывание клеток из узлов переменного давления. Для средней плотности энергии 1.6 Дж/см3 граничная скорость протока суспензий клеток, определяющая производительность систем ультразвукового селектирования, составляет: 0.4 мл/мин для клеток дрожжей, 0.9 мл/мин для эритроцитов крыс и 1.1 мл/мин для эритроцитов морских свинок. Для средней плотности энергии 2.5 Дж/см3 граничная скорость протока суспензий клеток составляет: 0.7 мл/мин, 1.4 мл/мин, 1.6 мл/мин соответственно. Результаты экспериментов подтверждают наши теоретические расчеты, приведенные на рис. 6.

Линейная скорость суспензии (см/с)

0) аз Í1

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Объемная скорость суспензии (мл/мин) а)

Линейная скорость суспензии (см/с) 0,0 0,085 0,17 0,25 0,34 0,425

Объемная скорость суспензии (мл/мин)

б)

Рис. 8. Зависимость концентрации клеток дрожжей в суспензии от скорости протока суспензии в стоячей ультразвуковой волне со средней плотностью энергии: а) 1.6 х 10"3 Дж/см3, б) 2.5 х 10"3 Дж/см3.

ф

Q.

CD

s га

Линейная скорость суспензии (см/с) 0,0 0,043 0,085 0,127 0,17 0,21 0,25

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Объемная скорость суспензии (мл/мин) а)

Линейная скорость суспензии (см/с) 0,085 0,17 0,25 0,34 0,425 0,51 0,6

1 2 3 4 5 6 7 8

Объемная скорость суспензии (мл/мин) ^

Рис. 9. Зависимость концентрации эритроцитов крыс в суспензии от скорости протока суспензии в стоячей ультразвуковой волне со средней плотностью энергии: а) 1.6 х 10'3 Дж/см3, б) 2.5 х

10"3 Дж/см3.

Линейная скорость суспензии (см/с) 0,0 0,085 0,17 0,25 0,34 0,425 0,51

Q. О 2

Т-1-1-'-1---1-1-1-'-1-1-

0 1 2 3 4 5 6

Объемная скорость суспензии (мл/мин)

Линейная скорость суспензии (см/с)

0,0 0,085 0,17 0,25 0,34 0,425

Объемная скорость суспензии (мл/мин)

б)

Рис. 10. Зависимость концентрации эритроцитов морских свинок в суспензии от скорости протока суспензии в стоячей ультразвуковой волне со средней плотностью энергии: а) 1.6 х 10"3 Дж/см3, б) 2.5

х 10"3 Дж/см3.

Жизнеспособность клеток

Для практического применения ультразвукового метода разделения и концентрирования клеток важно знать, в каком функциональном состоянии они находятся после воздействия. Определение количества живых клеток проводилось оптическим методом с использованием витального красителя трипанового синего, после 10-ти минутного воздействия на клетки ультразвукового поля.

В результате экспериментов было показано, что при воздействии стоячих ультразвуковых волн на клетки наблюдается рост количества живых клеток в камере по сравнению с контролем (клетки, не подвергавшиеся воздействию ультразвуком) (рис. 11).

100 -

ш

* о.

о ф

£ I

с ^

о т

о >.

т

со

х

ф __ =г i-

о

О- Б

94-

92-

90-

: ] Клетки после 10 минут облучения в УЗ поле И Контроль

ж

86-I--

дрожжи

крысы

Рис. II. Количество живых клеток (в %) от количества всех клеток дрожжей, эритроцитов крыс и морских свинок в зависимости от времени нахождения клеток в ультразвуковом поле.

Видно, что количество живых клеток после воздействия ультразвукового поля изменялось в пределах контроля. Это говорит о том, что в наших условиях клетки остаются в нативном состоянии.

Выводы

• Впервые для ряда клеток (эритроцитов морских свинок и крыс, дрожжей) измерены параметры клеток и сред культивирования, включая: скорости ультразвука в материале клеток, плотности клеток и сред, сжимаемости клеток и сред культивирования.

• Для исследованных клеток, рассчитаны силы радиационного давления, силы Стокса, Бьеркнеса, Бернулли и гравитационной силы на основании экспериментальных данных. Выделены силы, определяющие процесс удерживания клеток различных типов: радиационная и сила Стокса, возникающая при протоке сред культивирования.

• Предложен метод определения параметров эффективного удерживания и разделения клеток различного вида в узлах переменного давления стоячей ультразвуковой волны в системе координат: линейных скоростей протока среды и средней плотности энергии ультразвукового поля Условием удержания клеток является соотношение/^ > Fstt.

• Показано экспериментально, что до 10 минут облучения клеток в поле стоячей ультразвуковой волны частотой 2.64 МГц и максимальной средней плотности энергии 2.5 х Ю-3 Дж/см3 исследуемые клетки остаются в нативном состоянии.

Основные публикации по теме диссертации

Статьи

1. Садикова Д.Г., Андреев A.A., Шкидченко А.Н., Пашовкин Т.Н. Динамики концентрирования клеток в поле стоячей ультразвуковой волны. // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2006 г., №8-9, С.95-99.

2. Пашовкин Т.Н., Пашовкина М.С., Садикова Д.Г., Шильников Г.В. Распределение интенсивностей в ультразвуковых пучках терапевтических излучателей с использованием красителей: Зх-мерное представление распределений интенсивностей в сечениях ультразвуковых пучков и 3D-реконструкция ультразвуковых полей в водных средах. // Вестник новых медицинских технологий, 2006, т.ХШ, №3, С.155-159.

3. Утешев В.К., Пашовкин Т.Н., Севиров А.Н., Мельникова Е.В., Садикова Д.Г., Карнаухов В.Н., Гахова Э.Н. Выживаемость зародышей амфибий после воздействия непрерывного ультразвука. // Биофизика, 2006, том 51, вып.З, С.539-544.

4. Гахова Э.Н., Пашовкин Т.Н., Мельникова Е.В., Утешев В.К., Садикова Д.Г. Ультразвук может изменять проницаемость зародышевых оболочек амфибий. //Ветеринарная патология, 2007, №1, С.7-9.

5. Пашовкин Т.Н., Садикова Д.Г., Пашовкина М.С., Шильников Г.В. Применение ультразвуковой стоячей волны в биологических исследованиях и клеточных технологиях. // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2007, № 3, С. 133-138.

6. А.А.Андреев, Д.Г.Садикова, Т.Н.Пашовкин Действие сил на клетки дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) в поле стоячей ультразвуковой волны.//Вестник новых медицинских технологий. 2007. T.XIV, №2, С. 1215.

Тезисы

1. Садикова Д.Г, Пашовкин Т.Н. Действие пондермоторных сил на эритроциты человека in vitro в поле стоячей ультразвуковой волны. В сб. Биология - наука XXI века, 8-я международная Пущинская конф. мол. ученых, 17-21 мая 2004 г., с.93.

2. Д.Г. Садикова, Т.Н. Пашовкин. Распределение интенсивностей в сечениях ультразвуковых пучков терапевтических и диагностических излучателей в жидких средах. // Программа II Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005», Москва, 21-24 июня 2005 г.

3. Н.С. Васильева, Д.Г. Садикова, Е.П. Хижняк, Т.Н. Пашовкин. Распределение температур в моделях мягких биологических тканей при действии ультразвука терапевтического диапазона интенсивностей. // Программа II Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005», Москва, 21-24 июня 2005 г.

4. Д.Г. Садикова, Т.Н. Пашовкин. Распределение интенсивностей в сечениях ультразвуковых пучков терапевтических и диагностических излучателей в жидких средах. В сб. материалов II Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005», Москва, 21-24 июня 2005 г., с.225.

5. Э.Н. Гахова, Т.Н. Пашовкин, Е.В. Мельникова, В.К. Утешев, Д.Г. Садикова. Ультразвук может изменить проницаемость зародышевых оболочек амфибий. Международная конференция «Сохранение генетических ресурсов», Москва. 2006.

Список цитируемой литературы

Горьков Л.П. О силах, действующих на малую частицу в акустическом поле в идеальной жидкости//Докл. АН СССР. 1961. Т. 40. вып.1.С. 88-91. Князьков H.H. Способ разделения и концентрирования жидкой дисперсной системы и устройство (его варианты) для его осуществления. К заявке № 3472566/23-26 1983 г.

Князьков H.H., Курочкин В.Е., Шарфарец Б.П. Радиационное давление на сферу в смешанном поле бегущей и стоячей плоских волн // Доклады АН, 2009, Т. 424, № 6.

Князьков H.H., Макарова Е.Д., Морев С.А., Спиваков Б.Я., Шкинев ВМ. Методологические основы применения ультразвукового поля стоячей волны для проточного фракционирования частиц разной природы // Научное приборостроение, 2006, Т. 16, №1 С. 23-34 .

Князьков Н.Н., Макарова Е.Д., Морев С.А. Ультразвуковое проточное фракционирование частиц различной природы 1. Предельные параметры фракционирования неорганических частиц // Научное приборостроение, 2007, Т. 17, №1, С. 3-14.

Князьков Н.Н., Макарова Е.Д., Рабижанович А.Д. Ультразвуковое проточное фракционирование частиц различной природы. 2. Принципы выбора оптимальных условий фракционирования однокомпонентных частиц разной природы и неоднородных (двухкомпонентных) частиц. Предельные параметры разделения // Научное приборостроение, 2008, Т. 19, №1, С. 40-55. Князьков Н.Н., Шильников Г.В. // Ультразвуковое концентрирование клеток, культур тканей. Бюлл. эксп. биол. мед., 1996, № 3, С. 312-316. Курочкин В.Е., Шарфарец Б.П. Связь радиационного давления с амплитудой рассеяния сложных включений в идеальной жидкости // Доклады АН, 2008, Т. 419, №3, С. 1-4.

Применение ультразвука в медицине. Ред. К. Хилл. М.: Мир, 1989. Шарфарец Б.П., Курочкин В.Е., Князьков Н.Н. Радиационное давление в произвольном падающем поле. Связь с амплитудой рассеяния включения // Доклады АН, 2008, Т. 421, №2, С. 186-189.

Шарфарец Б.П., Курочкин В.Е., Князьков Н.Н. Радиационное давление на включение с заданной амплитудой рассеяния в произвольном внешнем поле // Акустический журнал, 2009, Т. 55, № 2.

Шутилов В.А. Основы физики ультразвука // Изд. Ленинградского университета. Ленинград. 1980. 104-114.

Coakley W.T. Ultrasound separations in analytical biotechnology. // TIBTECH DECEMBER 1997. V. 15.

Collas P., Barnatz M., Shipley C. Acoustic levitation in the presence of gravity. // J. Acoust. Soc. Am. 86(2) (1989) 777-787.

Hawkes J.J. and Coakley W.T. Force field particle filter, combining ultrasound standing waves and laminar flow. // Sensors and Actuators B: Chemical Volume 75, Issue 3, 15 May 2001, Pages 213-222.

Hertz H.M. Standing-wave acoustic trap for no intrusive positioning of microparticles. // J. Appl. Phys. 78(8) (1995) 4845-4849.

Holwill I.L., Davies G.B., Titchener-Hooker N.J., Hoare M. Particle manipulation by ultrasonic standing wave field to complement dynamic light scattering experiments. // Part. Syst. Charact. 12(3) (1995) 139-147.

King L.V. On the acoustic radiation pressure on sphere, // Proc. R. Soc. London A147 (1934) 212-240.

Kozuka Т., Tuziuti Т., Mitome H., Fukuda T. One-dimensional transportation of particles using an ultrasonic standing wave. // Proc MHS '95 - IEEE 6th Int Symp on Micro Machine and Human Science, 1995 179-185 ISBN 0-7803-2676-8. Kozuka Т., Tuziuti Т., Mitome H., Fukuda T. Non-contact micromanipulation using an ultrasonic standing wave field. // Proc IEEE 9th Ann Int Workshop on Micro Electro Mechanical Systems, 1996 435-440 ISSN 1084-6999. Takeuchi M., Yamanouchi K. Ultrasonic micromanipulation of small particles in liquid. // Jpn. J. Appl. Phys. (Part 1) 33(5B) (1994) 3045-3047.

Wu J. Acoustical tweezers. // J. Acoust. Soc. Am. 89(5) (1991) 2140-2143. Weiser A.H., Apfel R.E.: Interparticle forces on red cells in a standing wave field.// Acustica. 1984 (vol. 56), 114-119.

Yoshioka K., Kawasima Y. Acoustic radiation pressure on a compressible sphere. // Acustica 5 (1955) 167-173.

Zheng X., Apfel R.E. Acoustic interaction forces between two fluid spheres in an acoustic field // J. Acoust. Soc. Am. 1995. V. 97. № 4. P. 2218-2226.

Заказ № 35-а/04/09 Подписано в печать 24.04.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Садикова, Диана Габдельфартовна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР СОВРЕМЕННОГО СОСТОЯНИЯ ПРОБЛЕМЫ

1.1. Пондеромоторные силы

1.2. Основные концепции и обзор методов ультразвукового 16 разделения и концентрирования частиц в суспензиях

1.3 Состояние исследований по действию сил на частицы и 22 клетки в ультразвуковом поле.

1.4 Изменение скорости ультразвука и сжимаемости в 25 растворах и суспензиях.

1.5. Метрология ультразвукового поля

1.6. Биологические эффекты ультразвука.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Метрология ультразвуковых полей

3.2 Параметры необходимые для расчета сил, действующих в 56 ультразвуковом поле на клетки в суспензии

3.3. Силы, действующие на клетки в поле стоячей 67 ультразвуковой волны

3.4 Условия удержания клеток в ультразвуковом поле в потоке 82 жидкости

3.5. Концентрирование клеток в поле стоячей ультразвуковой 90 волны

3.6. Жизнеспособность клеток

3.7 Распределение клеток и кавитационных пузырьков в ультразвуковом поле

3.8. Акустические течения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Действие сил на клетки в суспензии в поле стоячей ультразвуковой волны"

Актуальность темы.

Актуальность этого исследования обуславливается: быстрым развитием . ультразвуковых методов разделения и концентрирования клеток в суспензиях; отсутствием количественных данных о волновых параметрах для большинства клеток и сред для их культивирования и суспендирования; возможностью эффективного использования методов, которые представляют взаимозависимости рассчитанных сил, теоретически предсказывающих возможности разделения и концентрирования клеток различного происхождения методом ультразвукового продольного селектирования и концентрирования.

Исследования биологических систем на клеточном уровне организации, на уровне тканей и организма в целом связано с использованием ряда технических систем и методов, которые обеспечивают разделение и концентрирование клеток, и являются длительными и дорогостоящими (например, центрифугирование, электрофорез). Дальнейшее развитие этой области зависит не только от разработки новых, более совершенных методов концентрирования и разделения с помощью ультразвуковой техники, но и от изучения физических законов и процессов, лежащих в основе целого класса новых ультразвуковых методов как препаративного, так и диагностического назначения.

В медицинской диагностике ультразвук применяется для ускорения проведения серологических реакций, ускорения реакции агглютинации, проведения иммуносуспензионного анализа методом флуоресцирующих антител. Первичным механизмом перечисленных применений ультразвука является действие различных сил ультразвукового поля на клетки и частицы в суспензиях. Перераспределение клеток в объеме под действием сил, действующих на клетки в ультразвуковом поле, привели к развитию ряда новых методов концентрирования и разделения клеток в поле стоячей ультразвуковой волны для медицинских, биотехнологических целей и для научных исследований в области биологии клетки.

Следует сказать, что акустическое управление отдельными (или немногочисленными) частицами является широкой областью исследования, с возможными практическими приложениями, например, в микроскопии [Hertz Н.М. 1995, Wu J. 1991], приготовлении образцов [Holwill I.L., et al. 1995], биотехнике [Takeuchi М., Yamanouchi К. 1994], микромеханической обработке [Kozuka Т., et. al. 1995, 1996] или космических технологиях [Collas P., et al. 1989].

Крайне важным при работе с клетками в ультразвуковых полях является исследование механизмов (кавитационного, теплового и механического) биологического действия, ультразвука для определения функционального состояния клеток и выделения клеток в нативном виде. В зависимости от интенсивности ультразвука может преобладать один из механизмов. Поэтому важно провести оценки вкладов каждого из перечисленных факторов при формировании физических и биологических эффектов.

В терапевтическом диапазоне интенсивностей необходимо обращать основное внимание на изменение функционального состояния клеток под действием механических факторов воздействия: пондеромоторных сил, действующих в ультразвуковых полях на клетки, микротечений. При повышении интенсивности ультразвука рассматриваются тепловые факторы воздействия как преобладающие. При дальнейшем повышении интенсивности ультразвука рассматриваются в первую очередь кавитационные эффекты, как правило, приводящие к повреждению биологических систем по свободнорадикальному механизму и за счет образования мощных микротечений вблизи кавитирующих или осциллирующих микропузырьков.

В настоящее время существует ряд работ, которые посвящены рассмотрению действию сил на различные клетки и частицы в ультразвуковом поле [Coakley W.T. 1997, Hawkes J J., Coakley W.T. 2001, King L.V., 1934, Weiser A.H., Apfel R.E., 1984, , Kawasima Y., Yoshioka K., 1955]. Однако многие из них ограничиваются рассмотрением либо отдельных сил, либо теоретическими расчетами на основании литературных данных. До настоящего момента не проводилось анализа всех физических параметров (плотности, сжимаемости, скорости звука для большинства клеток и сред культивирования), влияющих на поведение клеток в стоячих ультразвуковых волнах. Для большинства клеток нет расчета сил, и полного анализа действия всех сил в поле стоячей ультразвуковой волны на клетки в суспензиях. Поэтому, большой интерес представляют исследования основных параметров объектов воздействия и сред культивирования, с помощью которых можно управлять процессом концентрирования и разделения клеток в ультразвуковом поле. Цель работы.

Исследование сил, действующих на клетки в суспензии в поле стоячей ультразвуковой волны, и параметров действующего фактора, клеток и сред культивирования, определяющих величины этих сил в методах ультразвукового концентрирования и селектирования нативных клеток. Основные задачи исследования:

1. Получение и анализ параметров, связанных с ультразвуком, с клетками и средами суспендирования, лежащих в основе процессов концентрирования и разделения клеток.

2. Расчет сил, действующих на клетки в стоячей ультразвуковой волне.

3. Теоретическое определение граничных условий для концентрирования и разделения клеток на основании рассчитанных сил.

4. Экспериментальное подтверждение полученных данных.

5. Проверка жизнеспособности клеток при воздействии на них ультразвукового поля.

Научная новизна. v

Впервые исследован весь комплекс физических параметров, влияющих на динамику перемещения клеток различного вида в узлы или пучности ультразвукового давления в поле стоячей ультразвуковой волны под действием пондеромоторных сил. Мы выявили 15 существенных параметров относящихся как к клеткам и средам культивирования, так и к ультразвуку, как воздействующему фактору.

Проведен анализ действия сил на клетки в суспензиях, находящихся в поле стоячей ультразвуковой волны при различных средних плотностях энергий поля.

Рассчитаны силы радиационного давления, Стокса, Бьеркнеса, Бернулли и гравитационные силы применительно к клеткам, имеющим разную природу, размеры и физические параметры.

Найдены граничные условия, позволяющие подбирать условия для эффективного разделения и концентрирования клеток в камере для проточного селектирования.

Теоретически исследованы повреждающие факторы, которые могут возникнуть при концентрировании клеток в ультразвуковом поле. Показано, что основные повреждающие факторы, которыми могут являться акустические микротечения и образование сдвиговых напряжений, возникающих около клеток, не вызывают повреждений исследуемых клеток в исследованном нами диапазоне средних плотностей энергии и частот ультразвукового поля.

Практическая значимость работы. Результаты данного исследования могут быть использованы для разработки и оптимизации ультразвуковых методов быстрого выделения, сепарации и концентрирования клеток различного типа в суспензиях. Они могут найти применение в биологии, биотехнологии, молекулярной биологии, гидробиологии, экологии, медицинской диагностике.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Садикова, Диана Габдельфартовна

ВЫВОДЫ

Впервые для ряда клеток (эритроцитов морских свинок и крыс, дрожжей) измерены параметры клеток и сред культивирования, включая: скорости ультразвука в материале клеток, плотности клеток и сред, сжимаемости клеток и сред культивирования. Для исследованных клеток, рассчитаны силы радиационного давления, силы Стокса, Бьеркнеса, Бернулли и гравитационной силы на основании экспериментальных данных. Выделены силы, определяющие процесс удерживания клеток различных типов: радиационная и сила Стокса, возникающая при протоке сред культивирования. Скорость протока определяет производительность систем ультразвукового селектирования.

Предложен метод определения параметров эффективного удерживания и разделения клеток различного вида в узлах переменного давления стоячей ультразвуковой волны в системе координат: линейных скоростей протока среды и средней плотности энергии ультразвукового поля Условием удержания клеток является соотношение Fr > Fstt.

Показано экспериментально, что в течение 10 минутного облучения клеток полем стоячих ультразвуковых волн исследуемые клетки остаются в нативном состоянии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Появление метода ультразвукового селектирования для выделения, разделения и концентрирования клеток в суспензии позволило решить задачу быстрого, эффективного и неинвазивного способа работы с клетками в динамическом режиме.

Проведенные в данной работе исследования позволили выявить ряд зависимостей, имеющих важное значение для применения метода ультразвукового селектирования. Кроме того, эти исследования позволили более точно и полно описать механизмы действия сил на клетки в суспензии в стоячей ультразвуковой волне и выделить граничные условия для концентрирования и разделения клеток с применением метода продольного ультразвукового селектирования.

Например, полученные данные о силах, действующих на клетки, позволили выделить 15 основных управляющих параметров, которые в дальнейшем могут быть использованы при развитии метода разделения и концентрирования клеток в суспензии с помощью стоячей ультразвуковой волны.

Параметры, относящиеся к ультразвуковому полю:

I) частота ультразвука, 2) средняя плотность энергии, 3) форма поля или пространственное распределение интенсивности (плоский или фокусирующий излучатель), 4) параметры модуляции ультразвука.

Параметры, относящиеся к клеткам: 5) размеры клеток, 6) форма клеток, 7) скорость ультразвука в материале клеток, 8) плотность нативных клеток, 9) плотность поврежденных клеток, 10) исходная концентрация клеток.

Параметры, относящиеся к среде культивирования:

II) скорость ультразвука в среде культивирования, 12) плотность среды, 13) температура среды.

Параметры, относящиеся к потоку среды культивирования:

14) скорость прокачки среды через ультразвуковую камеру,

15) распределение скоростей в потоке (равномерность движения среды в разных участках ультразвуковой камеры.

Данные о возможных повреждающих факторах, такие как сдвиговые напряжения, а так же исследования жизнеспособности клеток, позволяют утверждать, что условия работы с клетками в ультразвуковом поле является безопасным.

Метрологические исследования, дали более полную картину места нахождения клеток в поле стоячей ультразвуковой волны.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Садикова, Диана Габдельфартовна, Пущино

1. Бергман Л. Ультразвук. Изд. Ин. Лит. Москва. 1956.

2. Букин В.А. Дис. . канд. Физ.-мат. наук. Пущино. 1982.

3. Волоцкой М.П., Гаврилюк Б.К., Елецкий B.C., Князьков Н.Н. Способконцентрирования частиц жидкой дисперсной системы. // А.С. СССР №893880, 1980.

4. Волькенштейн М.В. Биофизика. Наука, М. 1988. Горелов С.Е. Дис. . канд. биол. наук. Пущино. 1987.

5. Девдариани А.К., Колобов Н.П., Маренина К.Н. Ультразвуковое исследование объемных свойств водных растворов некоторых электролитов. // Журнал физической химии. 1973. Т. XLVII. №. 12. 30063009.

6. Маргулис М.А. О кинетике изменения числа кавитационных пузыриков в ультразвуковом поле. // Акустический журнал 1976. Т. 22. вып. 2. С. 261265.

7. Ультразвук. Гл. ред. Голямина И.П. Изд. Сов. Энциклопедия. 1979 стр. 265.

8. Харакоз Д.П. Дис. . канд. биол. наук. 1983.

9. Шутилов В.А. Основы физики ультразвука. Изд. Ленинградского университета. Ленинград. 1980. 104-114

10. Яковлев Ю.Ю. Трехмерная реконструкция мозга моллюска Lymnaea stagnalis. Дис. канд. биол. наук. Пущино 2001 г.http://www.img.ras.ru/Sec/DevinLecture.doc Введение в молекулярную генетику дрожжей сахаромицетов.

11. Benes Е., Hager F., Bolek W., Groschl M. Separation of dispersed particles by drifting ultrasonic resonance fields. // Ultrasonics Int. Conf. Proc. (Cambridge: Butterworth-Heinmann) 1991. pp 167-70.

12. Coakley W.T. Ultrasound separations in analytical biotechnology. // TIBTECH DECEMBER 1997. vol. 15

13. Coakley. Investigation of enhancement of two processes, sedimentation and conjugation, when bacteria are concentrated in ultrasonic standing waves. // Bioseparation 9: 343-349, 2001.

14. Coakley W.T., Hawkes J J., Sobanski M.A., Cousins C.M., Spengler J. Analytical scale ultrasonic standing wave manipulation of cells and microparticles. // Ultrasonics 38 (2000) 638-641.

15. Collas P., Barnatz M., Shipley C. Acoustic levitation in the presence of gravity. // J Acoust Soc Am 86(2) (1989) 777-787.

16. Crum L.A., Bjerknes forces on bubbles in a stationary sound field. // J. Acoust. Soc. Am. 57(6) (1975) 1363-1370.

17. Doblhoff-Dier O., Gaida Т., Katinger H., Burger W., Groschl M., Benes E. A novel ultrasonic resonance field device for the retention of animal cells. // Biotechnol Prog 10(4) (1994) 428-432.

18. Doinikov A.A., Theory of acoustic radiation pressure for actual fluids, // Am. Phys. Soc. v. 54 №6 1996. ■

19. Doubrovski V.A. and Konstanten N. Dvoretski. Ultrasonic wave action upon the red blood cell agglutination in vitro. II Ultrasound in Med. & Biol., Vol. 26, No. 4, pp. 655-659, 2000.

20. Fittipaldi F. Particle coagulation by means of ultrasonics. // Acustica 41(4) (1979)263-266.

21. Fontaine I., David Savery, and Guy Cloutier. Simulation of Ultrasound Backscattering by Red Cell Aggregates: Effect of Shear Rate and Anisotropy. // Biophys. Journal V. 82 April 2002 1696-1710.

22. Frank A., Bolek W., Groschl M., Burger W., Benes E. Separation of suspended particles by use of the inclined resonator concept. // Ultrasonics International '93.

23. Fukada K.M. Kawasaki T. Seimiya Y. Abe M. Fujiwara K. // Ohbu Colloid Polym Sci 278:576-580 (2000)

24. Gupta S. and Donald L. Feke lea Manas-Zloczower. Fractionation of mixed particulate solids according to compressibility using ultrasonic standing wave fields. // Chemical Engineering Science Volume 50. Issue 20 , October 1995, Pages 3275-3284.

25. Hawkes J.J. and Coakley W.T. Force field particle filter, combining ultrasound standing waves and laminar flow. // Sensors and Actuators B: Chemical Volume 75, Issue 3 , 15 May 2001, Pages 213-222.

26. Hawkes J.J., David Barrow and Coakley W.T. Microparticle manipulation in millimetre scale ultrasonic standing wave chambers. // Ultrasonics Volume 36, Issue 9 , August 1998, Pages 925-931.

27. Hawkes J.J., David Barrow, Joseph Cefai and Coakley W.T. A laminar flow expansion chamber facilitating downstream manipulation of particles concentrated using an ultrasonic standing wave. // Ultrasonics Volume 36, Issue 8 , July 1998, Pages 901-903.

28. Hawkesy J.J, Cefaiz J.J, Barrowyx D.A, Coakley W'.T. and Briartyk L Greg. Ultrasonic manipulation of particles in microgravity. // J. Phys. D: Appl. Phys. 31 (1998) 1673-1680. Printed in the UK.

29. Herzfeld K. F., Propagation of Sound in Suspensions, // Phil. Mag. (7), 9, 752 (1930).

30. Hertz H.M. Standing-wave acoustic trap for no intrusive positioning of microparticles. // J Appl Phys 78(8) (1995) 4845-4849.

31. Holwill I.L., Davies G.B., Titchener-Hooker N.J., Hoare M. Particlemanipulation by ultrasonic standing wave field to complement dynamic lightscattering experiments. // Part Syst Charact 12(3) (1995) 139-147.

32. Hurrell A. The reconstruction of transducer vibration patterns from theamplitude distribution of the radiated pressure field alone. // Ultrasonics 341996)91-97.

33. King L.V., On the acoustic radiation pressure on sphere, // Proc. R. Soc. London A147 (1934) 212-240.

34. Mantysalo M. and Mantysalo E. Extraction and filtering in ultrasonic field: finite element modeling and simulation of the processes. // Ultrasonics 38 (2000) 723-726.

35. Takashi M. and Tetsuo O. Ultrasonic Radiation Novel Principle for

36. Microparticle Separation. //ANALYTICAL SCIENCES 2001, vol. 17 2001

37. Takeuchi M., Yamanouchi K. Ultrasonic micromanipulation of small particlesin liquid. // Jpn J Appl Phys (Part 1) 33(5B) (1994) 3045-3047.

38. Tibor Hianik, Peter Rybar, Ingolf Bernhardt. // Bioelectrochemistry 52 2000197.201

39. Tolt T.L., Feke D.L. Separation devices based on forced coincidence response of fluid-filled pipes. // J Acoust Soc Am 91(6) (1992) 3152-3156.

40. Whitworth G., Grundy M.A., Coakley W.T. Transport and harvesting of suspended particles using modulated ultrasound. // Ultrasonics 29(6) (1991) 439-444

41. Wu J. Acoustical tweezers. // J Acoust Soc Am 89(5) (1991) 2140-2143 Yasuda K., Umemura S., Takeda K. Concentration and fractionation of small particles in liquid by ultrasound. // Jpn J Appl Phys (Part 1) 34(5B) (1995) 2715-2720.

42. Yoshioka K., Kawasima Y., Acoustic radiation pressure on a compressible sphere. // Acustica 5 (1955) 167-173.