Диссертации » Биологические науки » Биофизика

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Усиленная люминолом хемилюминесценция стимулированных нейтрофилов: внутриклеточные и внеклеточные источники свечения, роль соединений с активным хлором
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Усиленная люминолом хемилюминесценция стимулированных нейтрофилов: внутриклеточные и внеклеточные источники свечения, роль соединений с активным хлором"

На правах рукописи

Белакина Наталья Сергеевна

Усиленная люминолом хемилюминесценция стимулированных нейтрофилов: внутриклеточные и внеклеточные источники свечения, роль соединений с активным хлором

03.00. 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва-2004

Работа выполнена в ГУ «НИИ физико-химической медицины МЗ РФ» и в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российском государственном медицинском университете МЗ РФ»

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Мурина Марина Алексеевна

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Рощупкин Дмитрий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Потапенко Александр Яковлевич доктор медицинских наук Соодаева Светлана Келдибековна

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится "_"_2004 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.057.01 при ГУ «НИИ физико-химической медицины МЗ РФ» по адресу: 119992 Москва, ул. М. Пироговская, д. 1а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «НИИ физико-химической медицины МЗ РФ».

Автореферат разослан "_"_2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Азизова О.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. При активации фагоцитов бактериальными или химическими агентами в процессе так называемого "респираторного взрыва" образуются активные метаболиты кислорода. Фагоциты способны генерировать не только супероксид анион-радикал, гидроксильный радикал, пероксид водорода [Зенков и др., 2001]. В реакции, катализируемой миелопероксидазой, они синтезируют сильный окислитель - хлорноватистую кислоту (ионизированная форма гипохлорит-анион) [Klebanoff, Clark, 1977]. При взаимодействии гипохлорита с аминогруппами свободных аминокислот, пептидов, белков образуются соответствующие хлораминовые производные - биогенные хлорамины [Weiss et al., 1982; Maeda, 1991; Thomas, 1995]. Все эти окислители и свободные радикалы сейчас часто называют активными оксидантами [Зенков и др., 2001]. Известно, что они образуются и внутри клетки, и секретируются в окружающую среду.

Изменение функциональной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов, а именно генерации активных оксидантов, является важнейшим патогенетическим фактором, его оценка актуальна как для экспериментальной, так и для практической медицины, так как позволяет судить о микробицидном потенциале нейтрофила и о степени риска повреждения собственных тканей организма. Это требует тщательного изучения механизма продукции активных оксидантов, разработки методов их обнаружения и средств нейтрализации. Основным методом исследования респираторного взрыва фагоцитов является регистрация хемилюминесценции, усиленной активаторами, главным образом, люминолом и люцигенином. В ряде работ [DeChatalet et al., 1982; Говорова и др., 1988] получены убедительные данные, что усиленная люминолом хемилюминесценция нейтрофилов непосредственно возникает после образования гипохлорита, который синтезируется миелопероксидазой из хлорида с использованием пероксида водорода [Klebanoff, Clark, 1977]. В свою очередь пероксид водорода образуется при диспропорционировании первичного продукта респираторного взрыва -супероксидного анион-радикала [Weiss et al., 1982; Byczkowski, 1988]. Совсем не изученным до сих пор остаётся вопрос о конкретных механизмах, по которым в системе люминол - нейтрофилы возникает свечение с участием гипохлорита. При изучении функций фагоцитов с использованием хемилюминесцентных характеристик совершенно необходимы количественные сведения об излучении, генерируемом в клеточных структурах, и хемилюминесценции, обусловленной оксидантами в окружающей среде. Эта проблема остается нерешенной.

Гипохлорит и хлорамины обладают не только антибактериальным действием, но и могут модифицировать клетки крови. Установлено [Мурина, Рощупкин, Сергиенко, 1986-2004], что гипохлорит и хлораминовые производные аминокислот, окисляя серосодержащие группы, снижают функциональную активность тромбоцитов. Хлораминовые производные аминокислот и таурина предложены [Мурина и др., 1993, 2001] в качестве противотромботического средства тромбоцитотропного типа действия. В связи с этим представляет интерес выяснение возможного побочного действия хлораминов на лейкоциты. Известно, что хлорамины по сравнению с гипохлоритом гораздо слабее модифицируют лейкоциты [Grisham, 1984; Wright, 1985]. В ряде работ высказывается мнение, что некоторые хлораминовые соединения способны регулировать нормальные физиологические процессы в фагоцитах. Из-за

высокой концентрации таурина (20-50 мМ) в цитоплазме нейтрофилов при их активации в качестве вторичного продукта образуется преимущественно N-хлортаурин [Marcinkiewicz et al., 1998]. Предполагается [Park, 1995], что на поверхности макрофагов имеется собственный рецептор для N-хлортаурина. N-Хлортаурин может проникать в клетку и уменьшать по принципу отрицательной обратной связи производство медиаторов воспаления (окиси азота, простагландина Е2, альфа-фактора некроза опухоли), тем самым, защищая от повреждения клетки [Marcinkiewicz et al., 1995-2000; Park et al., 1995-1996; Vogt, 1994]. Однако в литературе нет сведений о влиянии хлораминовых производных аминокислот на продукцию активных метаболитов кислорода в нейтрофилах.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение физико-химических основ хемилюминесценции люминола в суспензии активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов, выяснение генерации реактивных оксидантов в клетке и окружающей среде.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать природу окислителя, обусловливающего хемилюминесценцию в системе активированные полиморфно-ядерные лейкоциты - люминол.

2. Установить соотношение свечения, генерируемою в клеточных структурах, и свечения в окружающей среде.

3. Изучить действие хлораминовых производных аминокислот на генерацию нейтрофилами активных оксидантов в ходе респираторного взрыва.

Научная новизна исследования. В диссертационной работе проведено исследование природы оксидантов, непосредственно вызывающих окисление люминола, в суспензии активированных нейтрофилов кролика. Получено, что хемилюминесценция в системе стимулированные нейтрофилы - люминол не связана с хлораминами и гидроксильным радикалом. Основной механизм этой хемилюминесценции - прямое окисление люминола гипохлоритом.

Впервые использован подход, заключающейся в применении комплекса специально подобранных перехватчиков активных метаболитов кислорода (свободных радикалов и соединений с активным хлором) и тем самым тушителей хемилюминесценции. Применялись перехватчики тиольной природы, устраняющие все активные метаболиты кислорода. Использование двух видов таких перехватчиков (проникающих и непроникающих в клетку) позволило отделить свечение клеточных структур и свечение, генерируемое оксидантами в окружающей среде. Обнаружено, что около половины свечения люминола является результатом его окисления в окружающей клетку среде, и оно полностью подавляется непроникающим восстановленным глутатионом; источником значительной части свечения является сама клетка, и это свечение тушат проникающие сульфгидрильные соединения, такие как дитиотреитол и ацетилцистеин. Для избирательной нейтрализации экстраклеточных оксидантов можно рекомендовать тотальный перехватчик -восстановленный глутатион, непроникающий в клетки, действие которого обусловлено исключительно сульфгидрильной группой.

Установлено, что хлорамины по сравнению с гипохлоритом натрия не оказывают заметного влияния на нейтрофилы, оцениваемого по критерию усиленной люминолом хемилюминесценции.

Практическое значение работы. Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных причин заболеваемости и смертности людей в наиболее продуктивном возрасте. Хлораминовые производные аминокислот и таурина предложены в качестве антитромботческих средств, тромбоцитотропного типа действия [Мурина и др., 1993, 2001]. Важное значение имеет изучение побочного действия хлораминовых производных аминокислот на функциональную активность полиморфно-ядерных лейкоцитов. Тот факт, что хлорамины сами по себе не активируют нейтрофилы и не влияют на продукцию активных форм кислорода (респираторный взрыв в нейтрофилах), является достоинством хлораминов как новой группы противотромботических соединений.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке рекомендаций, касающихся, во-первых, использования хемилюминесцентного метода для оценки функциональной активности нейтрофилов, и, во-вторых, разработки средств защиты тканей в очаге воспаления от повреждающего действия активных метаболитов кислорода, генерируемых нейтрофилами.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Internation conference "Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health" (Smolensk, 2003); на научно-практической конференции «40 лет Медико-биологическому факультету. Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» (Москва, 2003); на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах, содержит 45 рисунков и 1 таблицу, состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", "Приложение" и выводов. Список литературы включает 230 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Реактивы. В работе использовали коммерческие препараты люминола, форбол-12-м иристат-13-ацетата (ФМА) (Serva), гипохлорита натрия (Aldrich), урографина (Schering), аминокислот (Reanal и Реахим), таурина

(2-аминоэтансульфоновой кислоты), декстрана 500, фиколла, восстановленного и окисленного глутатиона, дитиотреитола, N-ацетилцистеина, диметилсульфоксида, 4-аминобензоилгидроксида и салицилгидроксамовой кислоты (Sigma).

Получение N-хлорпроизводных аминокислот и таурина. Хлораминокислоты получали при взаимодействии гипохлорита натрия с раствором аминокислоты в молярной концентрации, превышающей концентрацию гипохлорита натрия на 10 %. ^^Дихлортаурин получали при введении в раствор гипохлорита натрия сухой навески таурина, при этом концентрация полученного соединения по активному хлору была эквимолярна концентрации гипохлорита натрия. Образование хлорпроизводных контролировали спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-46 (Россия) по наличию в спектре поглощения максимума 252-255 нм для монохлорпроизводных и 300 нм для ^^дихлортаурина. Концентрации гипохлорита, N-хлорфенилаланина, N-монохлртаурина и N.N-дихлортаурина определяли методом йодометрического титрования [Кудрявцев и др., 1980]. Исследуемые соединения

растворяли в фосфатном растворе, приготовленном на бидистиллированной воде и

содержащем 138 мМ NaCl, 2,7 мМ КС1,8 мМ Na2HP04,1,5 мМ КН2Р04 (рН = 7,4).

Объект исследования; выделение нейтрофилов. Полиморфноядерные лейкоциты выделяли из периферической крови кролика, которую забирали из краевой вены уха и стабилизировали цитратом натрия (5 % раствор; соотношение по объему 10:1). Для осаждения эритроцитов в кровь вводили декстран с молекулярной массой 500 кД, смесь инкубировали 15 мин при 37 °С, затем 45 мин при комнатной температуре. Для разделения клеток в надосадочной жидкости на фракции использовали метод дифференциального центрифугирования в градиенте плотности. Примесь эритроцитов в клеточном осадке на фиколл-урографине, содержащем полиморфноядерные лейкоциты, удаляли воздействием кратковременного (30 с) осмотического шока. Клетки суспендировали в фосфатном буфере с добавлением глюкозы (5 мМ) и хранили при температуре тающего льда [Натвиг и др., 1980]. Получаемая фракция полиморфноядерных лейкоцитов состояла преимущественно из нейтрофилов (90-93 %). Жизнеспособность клеток, оцениваемая с помощью трипанового синего, составляла 94-98 %.

Регистрация хемилюминесценции. Регистрация хемилюминесценции проводилась на люмиагрегометре ("P.I.C.A.", хемилюминесцентный канал) фирмы Chrono-Log Corporation (США). При регистрации хемилюминесценции люминола, вызванной хлораминами, в 0,4 мл раствора хлорамина с помощью шприца быстро вводили 0,1 мл раствора люминола, смесь непрерывно перемешивали магнитной мешалкой. При регистрации хемилюминесценции люминола, вызванной нейтрофилами, в 0,4 мл суспензии клеток (концентрация клеток 1x106 клеток в 1 мл) с помощью шприца быстро вводили 0,01 мл раствора ФМА (5 мкг/мл) и 0,1 мл раствора люминола, смесь непрерывно перемешивали магнитной мешалкой. Конечная концентрация люминола 0,02 мМ. Все измерения проводили при температуре 37 °С.

На рисунках представлены усредненные зависимости интенсивности хемилюминесценции по данным не менее 5 независимых опытов.

Статистическая обработка. Статистическая обработка полученных результатов проводилась по параметрическому t-критерию Стьюдента и непараметрическому U-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни. Результаты приведены в виде средних арифметических значений, их разброс описывали среднеквадратической ошибкой средней величины [Лакин, 1990].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава I. Природа оксидантов, непосредственно вызывающих окисление люминола, индуцированное нейтрофилами

В активированных фагоцитах человека усиленная люминолом хемилюминесценция связана с активностью миелопероксидазы [DeChatalet et al., 1982]. В опытах на нейтрофилах (полиморфно-ядерных лейкоцитах) кролика с использованием ингибиторов миелопероксидазы [Davies, 1989] — салицилгидроксамовой кислоты и 4-аминобензоилгидразида, были получены аналогичные результаты. Нейтрофилы инкубировали в течение 1-5 минут в присутствии ингибиторов миелопероксидазы, затем в суспензию вводили ФМА и люминол. Инкубация нейтрофилов в присутствии салицилгидроксамовой кислоты

(0,05 мМ) или 4-аминобензоилгидразида (0,2 мМ) сопровождалась снижением интенсивности хемилюминесценции, измеренной в максимуме, примерно на 90 % по сравнению с контролем. Таким образом, хемилюминесценция люминола, индуцированная нейтрофилами кролика (как и в случае с нейтрофилами человека), обусловлена продуктом миелопероксидазной реакции - гипохлоритом.

Теоретически окисление люминола гипохлоритом может происходить по трем путям. Первый — центральный путь: по данным многих авторов определенная часть хемилюминесценции в активированных нейтрофилах обусловлена прямой реакцией гипохлорита (хлорноватистой кислоты) с люминолом (за счет высокой константы скорости взаимодействия гипохлорита с люминолом). Этот путь не вызывает сомнения. Второй путь предположительно связан с образованием гидроксильного радикала. Известно, что при взаимодействии гипохлорита с супероксид анион-радикалом может образовываться гидроксильный радикал, который также может образовываться при взаимодействии гипохлорита с ионами переменной валентности. Поэтому, в принципе, возможно появление хемилюминесценции за счет окисления люминола гидроксильным радикалом. Третий путь: мы предполагаем, что возможен ещё один путь, когда хемилюминесценция люминола при активации фагоцитов может быть результатом его окисления хлораминовыми соединениями.

1.1. Роль гидроксильного радикала

На рис. 1. показана зависимость интенсивности усиленной люминолом хемилюминесценции нейтрофилов от времени после их стимуляции введением форболмиристата (ФМА). Основное свечение продолжалось 15-20 минут; максимум интенсивности приходился на период 2-4 минуты.

С целью проверки участия гидроксильного радикала в формировании хемилюминесценции в системе активированные нейтрофилы - люминол, был использован специфический перехватчик гидроксильного радикала -диметилсульфоксид (ДМСО). Встает вопрос, какая концентрация ДМСО требуется для эффективного перехвата гидроксильных радикалов. Очевидно, что для снижения хемилюминесценции обусловленной гидроксильными радикалами на 50 %, скорости реакции гидроксильного радикала с люминолом и ДМСО должны быть равны, то есть: К/ [Л] = К2 [ДМСО], где к — константы скорости реакций, [Л] — концентрация люминола, [ДМСО] — концентрация ДМСО. Известно, что константа скорости взаимодействия гидроксильного радикала с ДМСО диффузионная примерно равная 1010 моль/лс. Для люминола необходимо взять константу скорости не меньшую, тогда искомая концентрация ДМСО равна 0,02 мМ. Однако не наблюдалось значительного тушения хемилюминесценции ни при конечной концентрации ДМСО 0,02 мМ, ни при концентрации более чем на 2 порядка большей — 2,6 мМ (рис. 1, кривая 2). Получается, что реакция гидроксильного радикала с люминолом не дает заметного вклада в свечении, наблюдаемое при активации нейтрофилов. При увеличении концентрации ДМСО до 261 мМ, наблюдалось сильное тушение интенсивности хемилюминесценция люминола в нейтрофилах: примерно на 50 % в максимуме интенсивности (рис. 1, кривая 3). Очевидно, это не связано с избирательным взаимодействием люминола с гидроксильным радикалом. Одна из причин этого тушения - взаимодействие ДМСО с соединением с активным хлором.

Рис.1. Влияние диметилсульфоксида (ДМСО) на хемилюминесценцию в системе стимулированные ФМА нейтрофилы - люминол. 1 - Контроль, 2 и 3 - ДМСО введен в суспензию нейтрофилов за 1 минуту до ФМА и люминола в конечных концентрациях 2,6 мМ и 261 мМ, соответственно.

1„, % - нормированная интенсивность хемилюминесценции: в контроле (1) в максимуме интенсивность свечения принята за 100 %.

I- время после введения люминола, мин.

Для доказательства этого было проведено изучение хемилюминесценции модельной системы. Если ДМСО предварительно проинкубировать с гипохлоритом или хлорамином в течение 5 мин, то при введении люминола в такую смесь свечение не наблюдалось (рис. 2, кривая 3) или было сильно ослабленным (рис. 3, кривая 3).

I, усл. ед.

12000

6000

Рис. 2. Хемилюминесценция люминола, индуцированная введением гипохлорита (0,1 мМ) (кривая 1); ДМСО (1,3 мМ) и гипохлорита (0,1 мМ) (кривая 2); или смеси гипохлорита (0,2 мМ) с ДМСО (0,2 мМ) (кривая 3). I - время после введения гипохлорита, секунды;

I - интенсивность хемилюминесценции, усл. ед.

0 5

ю и

ДМСО в очень высокой концентрации (13 мМ) ослабляет хемилюминесценцию и при ее измерении обычным способом, когда вначале к раствору люминола добавляется этот перехватчик, а затем индуцируется свечение введением гипохлорита (рис. 2, кривая 2) или хлорамина (рис. 3, кривая 2).

I, усл. ед. 30 ь

Рис. 3. Хемилюминесцендия люминола, индуцированная введением Ы-хлорфенилаланина (0,2 мМ) (кривая 1);

ДМСО (1,3 мМ) и Ы-хлорфенилаланина (0,2 мМ) (кривая 2);

или смеси Ы-хлорфенилаланина (0,2 мМ) с ДМСО (0,2 мМ) (кривая 3).

20

10

С 2

3

о

0 5 10 15 ^ мин

1.2. Роль хлораминов

Рассмотрим теперь возможность протекания хемилюминесценции по третьему пути, когда хемилюминесценция может возникать непосредственно при окислении люминола хлораминами. Возможность этого следует из модельных опытов. Обнаружено, что хлораминовые производные аминокислот вызывают свечение люминола [Рощупкин и др., 2002]. Эта хемилюминесценция усиливается пероксидом водорода [Zgliczynski et э1., 1985].

После стимуляции нейтрофилов ФМА в клетках возможны две ситуации. Во-первых, возможна ситуация, когда в окружающей среде нет соединений содержащих аминогруппы. В этом случае хлорамины могут образовываться на поверхности клеток. Так как хлорамины - долгоживущие соединения, они должны накапливаться во времени после стимуляции клеток. В результате накопления хлораминов, если люминол вводить спустя некоторое время после стимуляции клеток, свечение должно быть выше, чем в контроле. Для выяснения этого вопроса, в нейтрофилы люминол добавляли сразу или через 11 минут после активации клеток ФМА. При введении люминола через 11 минут после ФМА, на 13 минуте регистрации интенсивность хемилюминесценции возрастала примерно на 70 % (р<0,05) по сравнению с контролем (рис. 4, кривая 2). Светосумма, определяемая как площадь под кинетической кривой интенсивности хемилюминесценции (с 13 по 21 минуты регистрации), возрастала примерно на 70 % (р<0,05) по сравнению с контролем. Для выяснения природы соединений, ответственных за усиление хемилюминесценции в этом эксперименте, была использована салицилгидроксамовая кислота. Ингибитор миелопероксидазы не должен действовать после накопления продукта, если усиление хемилюминесценции, обусловлено хлораминами. С целью проверки этого предположения нейтрофилы активировали ФМА, инкубировали 10 минут, вводили салицилгидроксамовую кислоту (0,05 мМ), инкубировали 1 минуту, затем вводили люминол. Было получено, что введение салицилгидроксамовой кислоты в суспензию активированных нейтрофилов через 10 минут после ФМА приводило к полному тушению хемилюминесценции (рис. 4, кривая 3). Можно сделать вывод, что миелопероксидаза сохраняет свою активность в течение всего времени регистрации

хемилюминесценции, то есть всё время образуется гипохлорит. Известно [ЬасзБоп, 2000; Мо2аИ, 2000], что свечение гипохлорита резко усиливается в присутствии пероксида водорода. По-видимому, в нашей системе происходит накопление пероксида водорода, что приводит к усилению хемилюминесценции (рис. 4, кривая 2). Таким образом, не удалось обнаружить участия клеточных хлораминов в усиленной люминолом хемилюминесценции активированных нейтрофилов.

Рис. 4. Хемилюминесценция нейтрофилов в условиях введения люминола в разное время после активации клеток и их инкубации с салицилгидроксамовой кислотой.

1„, %

1 - Контроль; 2 - люминол введен в суспензию нейтрофилов через 11 минут после ФМА; 3 - люминол введен в суспензию нейтрофилов через 11 минут после ФМА, салицилгидроксамовая кислота (0,05 мМ) введена за 1 минуту до люминола.

Стрелкой указан момент введения люминола.

Рассмотрим вторую ситуацию, когда во внешней среде присутствуют аминокислоты. Исследовали изменение хемилюминесценции люминола, вызванной нейтрофилами, в результате введения экзогенных аминокислот. Можно было ожидать изменение кинетической кривой хемилюминесценции. Ожидалось, что аминокислоты не вызовут ослабления хемилюминесценции. Однако получилось, что аминокислоты уже в конечной концентрации 3 мМ достоверно снижают интенсивность хемилюминесценции; тушение, измеренное в максимуме, составляет примерно 20 % (р<0,05) (рис. 5). С увеличением концентрации вводимых в суспензию нейтрофилов таурина и аланина (до 15 мМ) интенсивность свечения снижается примерно на 40 % (рис. 6).

В дальнейшем фенилаланин (3 мМ) и таурин (3 мМ) вводили в нейтрофилы непосредственно перед стимуляцией клеток ФМА, клетки инкубировали в течение 10 минут при 37 °С, затем добавляли люминол. И в этих опытах фенилаланин и таурин также достоверно (р<0,05) снижали интенсивность хемилюминесценции в системе (рис. 7, кривые 2 и 3).

Вероятно, в процессе перехвата гипохлорита аминокислотами образуется мало хлораминов. Они из-за низкой константы скорости не компенсируют то свечение, которое вызывается окислением люминола гипохлоритом: константа скорости взаимодействия хлораминов с люминолом ниже, чем константа скорости гипохлорита. Это ослабление свечение, несвязанное с изменением состояния клеток, необходимо учитывать при использовании метода хемилюминесценции в системах, где есть аминокислоты.

1н, %

Рис. 7. Влияние таурина (3 мМ) и фенилапанина (3 мМ) на интенсивность хемшноминесценции в системе стимулированные ФМА нейтрофилы -люминол.

1 - Контроль,

2 и 3 - таурин и фенилаланин соответственно введены в суспензию нейтрофилов, клетки стимулировали ФМА и инкубировали в течение 10 минут до введения люминола.

Стрелкой указан момент введения люминола.

100

50

1 2 3

0 -а-■-1-10 10 20 30 40 1, мин

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что хемилюминесценция в стимулированных нейтрофилах не связана с хлораминами. Диметилсульфоксид в умеренных концентрациях, при которых он выступает в качестве специфического перехватчика гидроксильных свободных радикалов, не влияет на усиленную люминолом хемилюминесценцию нейтрофилов. Это свидетельствует, что в нейтрофилах не происходит образование гидроксильных радикалов с участием гипохлорита, синтезируемого миелопероксидазой. Основной механизм хемилюминесценции люминола в нейтрофилах - прямое окисление люминола гипохлоритом.

Глава 2. Влияние серосодержащих соединений на хемилюминесценцию в системе стимулированные нейтрофилы - люминол

Один из подходов решения проблемы, какая часть свечения при активации нейтрофилов обусловлена окислением люминола в клеточных структурах, какая -снаружи клеток, заключается в использовании перехватчиков оксидантов. Очевидно, во-первых, нужно использовать тотальный (универсальный) перехватчик, реагирующий со всеми реактивными оксидантами. Во-вторых, для тушения свечения в окружающей клетку среде, требуется перехватчик, который не проникает в клетку. В работе использовали сульфгидрильные соединения, как тотальные перехватчики, которые с высокой константой скорости реагируют со многими окислительными агентами: гидроксильным радикалом, супероксид анион-радикалом, гипохлоритом и хлораминами. Исключением является пероксид водорода [Winteгboum et э1., 1994 -2001]. Нужно отметить, что пероксид водорода сам по себе не вызывает свечение люминола в нейтрофилах из-за низкой концентрации (свечение наблюдается при концентрации пероксида, равной примерно десяткам микромолей).

2.1. Хемилюминесценция в системе стимулированные ФМА нейтрофилы -люминол в присутствии сульфгидрильных соединений

В качестве непроникающего через цитоплазматическую мембрану нейтрофилов перехватчика использовали восстановленный глутатион. Введение восстановленного глутатиона (0,2 мМ) в суспензию нейтрофилов до их активации (без предварительной инкубации) вызывало уменьшение интенсивности хемилюминесценции почти во все времена, но наиболее выражено это снижение в максимуме (рис. 8).

1н,% 100

50

Рис. 8. Влияние восстановленного глутатиона на хемилюминесценцию в системе стимулированные ФМА нейтрофилы - люминол.

1 - Контроль,

2 - восстановленный глутатион (0,2 мМ) введен в суспензию нейтрофилов до ФМА.

О 5 101, мин

В максимуме интенсивности хемилюминесценции была измерена зависимость эффективности тушения хемилюминесценции от концентрации восстановленного глутатиона. При концентрации глутатиона 0,2 мМ тушение хемилюминесценции в нейтрофилах кролика выходит на плато. Максимальное тушение хемилюминесценции составляет примерно 40-50 % (рис. 9).

%

0,3 0,4 С.мМ

Рис. 9. Зависимость интенсивности хемилюминесценции, измеренной в максимуме, в системе стимулированные ФМА нейтрофилы - люминол от концентрации восстановленного глутатиона.

Восстановленный глутатион введен в суспензию нейтрофилов до ФМА. С - концентрация восстановленного глутатиона.

Введение окисленного глутатиона (0,1 мМ) в суспензию нейтрофилов как до, так и после активации клеток ФМА, не оказывало заметного влияния на хемилюминесценцию в исследуемой системе. Это значит, что описанное тушение восстановленным глутатионом хемилюминесценции в системе стимулированные ФМА нейтрофилы - люминол обусловлено исключительно сульфгидрильной группой.

Далее были проведены опыты с дитиотреитолом - соединением, проникающим в клеточные структуры. Дитиотреитол (0,1 мМ) вводили в клетки за 3 минуты до ФМА и люминола. Инкубация нейтрофилов с дитиотреитолом вызывала более сильное тушение хемилюминесценции в системе активированные нейтрофилы - люминол: в максимуме интенсивность хемилюминесценции снижалась примерно на 70 % (рис. 10).

Рис. 10. Влияние дитиотреитола на хемилюминесценцию в системе стимулированные ФМА нейтрофилы -люминол.

1 - Контроль,

2 - дитиотреитол (0,1 мМ) введен в суспензию нейтрофилов за 3 минуты до ФМА и люминола,

3 - дитиотреитол (0,1 мМ) добавлен в суспензию нейтрофилов, клетки инкубировали 3 минуты, затем введены восстановленный глутатион (0,2 мМ), ФМА и люминол.

Для сравнения было изучено действие другого проникающего внутрь клеток соединения - ацетилцистеина. Надо отметить, что это лекарственное соединение применяется в медицине. После предварительной (3 мин) инкубации с нейтрофилами, ацетилцистеин (0,2-0,6 мМ) вызывал значительное ингибирование хемилюминесценции люминола. Снижение интенсивности хемилюминесценции в максимуме достигает, как и в случае с дитиотреитолом, примерно 70 % (рис. 11). Возможно, способность ацетилцистеина ингибировать окислительные процессы в активированных нейтрофилах имеет определенное значение в его терапевтическом действии.

Надо отметить, что тушение хемилюминесценции в системе нейтрофилы -люминол в присутствии восстановленного глутатиона, дитиотреитола или ацетилцистеина не является результатом влияния этих соединений на активацию клеток, так как их введение после активации клеток ФМА также снижает хемилюминесценцию.

Интересно, что сочетанное действие дитиотреитола (0,1 мМ) и восстановленного глутатиона (0,2 мМ) не приводило к усилению тушения хемилюминесценции в системе нейтрофилы - люминол (рис. 10, кривая 3). Добавление восстановленного глутатиона не усиливало действие дитиотреитола; по-видимому, дитиотреитол взаимодействует как с продуктами окисления определяющими свечение самой клетки, так и с продуктами окисления люминола в окружающей среде.

1к.% 100

Рис. 11. Действие ацетилцистеина на интенсивность хемшноминесценции в системе стимулированные ФМА нейтрофилы - люминол.

1 - Контроль,

2 и 3 - ацетилцистеин в конечных концентрациях 0,2 и 0,6 мМ, соответственно, введен в суспензию нейтрофилов за 3 минуты до ФМА и люминола.

50

1 2 3

0

0

5

10 t, М1н

Таким образом, проникающие внутрь клетки дитиотреитол и ацетилцистеин вызывают более сильное тушение интенсивности хемилюминесценции в системе люминол - нейтрофилы, по сравнению с восстановленным глутатионом. Все данные можно интерпретировать следующим образом: около половины свечения люминола -экстраклеточное: оно является результатом окисления люминола реактивными оксидантами в окружающей клетку среде. Это свечение полностью подавляется непроникающим восстановленным глутатионом. Источником значительной части свечения является сама клетка, и это свечение тушат проникающие сульфгидрильные соединения, такие как дитиотреитол и ацетилцистеин.

Для избирательной нейтрализации экстраклеточных оксидантов можно рекомендовать тотальный перехватчик — восстановленный глутатион, непроникающий в клетки. Его действие обусловлено исключительно тиольной химической группой. Об этом свидетельствует тот факт, что окисленный глутатион не влияет на свечение люминола в стимулированных нейтрофилах.

Судя по эффективности тушения свечения люминола, ацетилцистеин, благодаря его способности проникать в клетки, устраняет и экстраклеточные оксиданты, и их большую часть в клеточных структурах. Возможно, что терапевтическое действие ацетилцистеина при воспалительных процессах включает нейтрализацию реактивных оксидантов, генерируемых фагоцитами в очаге воспаления.

В ряде работ высказывается мнение, что некоторые хлораминовые соединения способны модифицировать физиологические процессы в фагоцитах [Park et al., 1995; Marcinkiewicz et al., 1995-2001; Kim et al., 1996; Vogt, 1996]. В последнее время хлораминовые производные аминокислот и таурина предложены в качестве противотромботического средства тромбоцитотропного типа действия [Мурина и др.,

Глава. 3. Хемилюминесцениия системы Фагоциты - люминол в присутствии биогенных хлораминов

1988, 2001]. Поэтому представляет интерес выяснение возможного побочного действия биогенных хлораминов на лейкоциты.

В задачу настоящей работы входило исследование действия биогенных хлораминов на хемилюминесценцию системы нейтрофилы - люминол как при неактивированном состоянии клеток, так и в условиях их стимуляции, опосредованной рецепторами. В данной работе изучалось влияние ^хлорфенилаланина на нестимулированные нейтрофилы и влияние ^хлорфенилаланина, ^монохлортаурина и ^^дихлортаурина на стимулированные ФМА клетки. Способность ^хлорфенилаланина вызывать хемилюминесценцию люминола, хорошо изучена [Рощупкин и др., 2002]. ^^Дихлортаурин представляет особый интерес, поскольку именно это соединение наиболее перспективно как противотромботическое средство [Мурина и др., 2001]. Для сравнения в некоторых опытах было исследовано действие гипохлорита.

3.1. Влияние ^хлорфенилаланина на хемилюминесценцию в системе неактивированные нейтрофилы -люминол

При добавлении люминола к суспензии неактивированных нейтрофилов наблюдается слабое свечение (рис. 12, кривая 1). В начале была изучена возможность хлораминов оказывать влияние на процесс активации нейтрофилов.

Рис. 12. Кинетические кривые интенсивности хемилюминесценции люминола.

1 и 3 - Суспензии нестимулированных нейтрофилов и клеток, стимулированных форболмиристатом, соответственно;

2 - нестимулированные нейтрофилы в присутствии И-хлорфенилаланина (0,1 мМ);

4 и 5 - раствор И-хлорфенилаланина (0,1 мМ) и смесь Ы-хлорфенилаланина (0,1 мМ) с пероксидом водорода (30 нМ), соответственно.

После добавления ^хлорфенилаланина (0,1 мМ) в суспензию клеток до введения люминола наблюдается значительно более высокая интенсивность хемилюминесценции (рис. 12, кривая 2). Интенсивность хемилюминесценции люминола в максимуме возрастает в 1,5,2,3 и 2,8 раза (по сравнению с контрольным образцом) при добавлении в суспензию нейтрофилов ^хлорфенилаланина соответственно в конечных концентрациях 0,05, 0,1 и 0,2 мМ. Специальные опыты показали, что введение в суспензию клеток аминокислоты фенилаланина (3 мМ) не приводит к изменению хемилюминесценции люминола, то есть описанное выше

I МИН

усиление свечения системы люминол - нейтрофилы в присутствии N-хлорфенилаланина обусловлено активностью его хлораминовой группы.

Интересно, что хемилюминесценция люминола в суспензии неактивированных нейтрофилов в присутствии хлорамина сравнима со свечением, наблюдаемым при стимуляции клеток ФМА. Максимальная интенсивность хемилюминесценции люминола в нейтрофилах с ФМА (0,1 мкг/мл) составляла 200±25, а в случае неактивированных клеток с N-хлорфенилаланином (0,1 мМ) — 123±8 усл. ед. (рис. 12, кривые 3 и 2, соответственно).

Можно было бы полагать, что это обсуждаемое усиленное свечение происходит в результате активации клеток хлорамином, как в случае других известных активаторов. Однако ранее было показано [Рощупкин и др., 2002], что хлораминовые производные аминокислот сами индуцируют свечение люминола. Поэтому необходимо учесть, что усиление хемилюминесценции в системе люминол -нейтрофилы может происходить в результате прямого действия N-хлорфенилаланина на люминол. В простой модельной системе, состоящей из люминола и N-хлорфенилаланина, свечение значительно слабее хемилюминесценции люминола в суспензии неактивированных нейтрофилов с хлорамином в этой же концентрации (рис. 12, кривые 4 и 2, соответственно). Выходит, что усиленное свечение системы люминол - нейтрофилы в присутствии хлорамина нельзя объяснить только тем, что он прямо ицдуцирует хемилюминесценцию люминола. Вместе с тем хорошо известно, что нейтрофилы продуцируют пероксид водорода [Зенков и др., 2001]. Введение пероксида водорода (10-30 нМ) в смесь люминола с N-хлорфенилаланином вызывает дозозависимое усиление хемилюминесценции (рис. 13). На рис. 13 представлен график изменения светосуммы за период 15 минут от концентрации N-хлорфенилаланина в присутствии пероксида водорода. Светосумму, определяемую как площадь под кривой зависимости интенсивности хемилюминесценции от времени, рассчитывали численным интегрированием кривой интенсивности с использованием метода прямоугольников (программа Excal 2000). Обнаружено, что хемилюминесценция смеси люминола с N-хлорфенилаланином, содержащей 30 нМ пероксида водорода, близка к свечению системы люминол - нейтрофилы в присутствии N хлорфенилаланина в той же концентрации. Можно предположить, что неактивированные нейтрофилы продуцируют примерно 20-30 нМ пероксида водорода. Таким образом, усиленная хемилюминесценция в системе люминол -нейтрофилы в присутствии N-хлорфенилаланина обусловлена не активацией клеток, а результатом прямого окисления люминола N-хлорфенилаланином и пероксидом водорода. Этот вывод интересен, так как известно, что вообще-то хлорамины модифицируют функциональную активность лейкоцитов [Marcinkiewicz et al., 1995— 2001; Kim etal., 1996].

Зависимость между величиной светосуммы хемилюминесценции и концентрацией пероксида водорода в смеси нейтрофилов с N-хлорфенилаланином линейная. Поэтому измерение хемилюминесценции системы, состоящей из люминола, нейтрофилов и N-хлорфенилаланина, можно использовать как тест на содержание пероксида водорода в клетках.

Э, усл. ед.

Рис. 13. Светосумма хемилюминесценции (8, усл. ед.) системы люминол - нейтрофилы -Ы-хлорфенилаланин (1) и раствора люминола с Ы-хлорфенилаланином в присутствии пероксида водорода в конечных концентрациях 0,10,20, 30 нМ (соответственно кривые 2 - 5). С - концентрация Ы-хлорфенилаланипа.

3000

2000

1000

0

0,05 0,10

0,20

С, мМ

3.2. Влияние хлораминов на хемилюминесценцию в системе стимулированные ФМА нейтрофилы -люминол

Далее было изучено влияние хлораминовых производных ряда аминокислот на усиленную люминолом хемилюминесценцию активированных нейтрофилов. Хлорамины вводили в клетки за 5 минут до ФМА и люминола. Все исследуемые хлорамины в конечной концентрации 0,01 мМ (по активному хлору) не изменяли свечения люминола в суспензии стимулированных нейтрофилов. При увеличении концентрации ^^дихлортаурина, ^монохлортаурина и ^хлорфенилаланина до 0,1 мМ измеренная в максимуме интенсивность хемилюминесценции возрастала соответственно в 1,5,2,0 и 2,5 раза (рис. 14).

'»> 0/,° Рис. 14. Кинетические кривые

250

200

100

150

4

интенсивности хемилюминесценции люминола, вызванной стимулированными ФМА нейтрофилами, в контроле (1) и при действии КЫ-дихлортаурина (2), К-монохлортаурина (3), М-хлорфенилаланина (4). Конечная концентрация хлораминов 0,1 мМ по активному хлору.

50

И

о

о

5

10 I мин

Таким образом, М-хлорфенилаланин усиливает хемилюминесценцию системы стимулированные нейтрофилы - люминол сильнее, чем М-монохлортаурин и К,К-дихлортаурин. Аналогичная закономерность наблюдается и при введении этих хлораминов через 2 или 5 минут после люминола. Так, в случае введения через 2 минуты после люминола интенсивность хемилюминесценции системы нейтрофилы -люминол в момент её регистрации 2,5 минуты возрастает примерно в 1,5 раза при действии М,М-дихлортаурина и М-монохлортаурина и в 7,5 раз при добавлении N хлорфенилаланина (рис. 15).

При введении хлораминов через 5 минут после люминола интенсивность свечения в момент её регистрации 5,5 минут возрастает в 1,4 и 5,0 раза под влиянием соответственно М-монохлортаурина и М-хлорфенилаланина, но достоверно не изменяется в случае М,М-дихлортаурина (рис. 16).

Таким образом, при добавлении хлораминов после люминола эффект усиления хемилюминесценции сильнее выражен на 2 минуте введения. Как и в случае

неактивированных клеток, в системе активированные нейтрофилы - люминол усиление хемилюминесценции хлораминами, по-видимому, обусловлено их прямым действием на люминол. Более выраженное действие ^хлорфенилаланина в системе определяется особенностями его химического взаимодействия с люминолом, описанного ранее [Рощупкин и др., 2002]. С другой стороны, можно сказать, что хлорамины в исследованных концентрациях не ингибируют респираторный взрыв нейтрофилов, оцениваемый с помощью хемилюминесцентного зонда люминола.

Для сравнения было исследовано действие гипохлорита натрия на усиленную люминолом хемилюминесценцию стимулированных нейтрофилов. Оказалось, что характер действия гипохлорита зависит от его концентрации (рис. 17). При конечной концентрации 0,01 мМ наблюдается усиление хемилюминесценции: её интенсивность в максимуме увеличивается примерно в 1,5 раза. При более высоких концентрациях гипохлорита натрия (0,02 до 0,04 мМ) происходит резкое снижение уровня хемилюминесценции.

Рис. 17. Кинетические кривые интенсивности хемилюминесценции люминола, индуцированной стимулированными ФМА нейтрофилами, в контроле (1) и при действии гипохлорита натрия (2-4) в конечных концентрациях 0,01,0,02 и 0,04 мМ, соответственно.

1, мин

Хорошо известно [Говорова и др., 1987; Amhold, 1993], что гипохлорит индуцирует хемилюминесценцию люминола, сильно возрастающую в присутствии пероксида водорода. Таким образом, полученное в нашем эксперименте тушение хемилюминесценции люминола в суспензии активированных нейтрофилов гипохлоритом натрия свидетельствует о том, что в отличие от хлораминов гипохлорит подавляет функциональную активность самих клеток.

Ранее было показано, что хлорамины модифицируют функциональные процессы в тромбоцитах - подавляют агрегацию, реакцию выброса содержимого плотных гранул, синтазу простагландина Н2. При введении в кровь хлорамины в концентрациях, приводящих к сильному подавлению агрегации тромбоцитов, не вызывают существенной модификации эритроцитов по критерию их гемолиза и агрегации [Мурина и др., 1997-2002]. Тот факт, что хлорамины сами по себе не активируют нейтрофилы и не оказывают влияния на продукцию активных форм кислорода (респираторный взрыв в нейтрофилах), является достоинством хлораминов как новой группы противотромботических соединений.

выводы

1. В системе полиморфно-ядерные лейкоциты - люминол при стимуляции клеток агонистом форбол-12-миристат-13-ацетатом максимальное снижение интенсивности хемилюминесценции под действием восстановленного глутатиона (0,2 мМ), не проникающего через мембрану, составляет примерно 40%. Проникающие сульфгидрильные соединения дитиотреитол (0,1 мМ) и М-ацетилцистеин (0,2 мМ) вызывают более сильное ингиб,ирование хемилюминесценции: её интенсивность снижается на 60-70 %. Таким образом, около 40 % хемилюминесценции люминола регистрируется, из внеклеточной, среды, остальное свечение — вклад клеточных структур.

2. Специфический перехватчик гидроксильных радикалов диметилсульфоксид в умеренных концентрациях не влияет на усиленную люминолом хемилюминесценцию нейтрофилов Это свидетельствует, что не имеет места генерация гидроксильных радикалов с участием гипохлорита, синтезируемого миелопероксидазой. При высоких концентрациях диметилсульфоксида наблюдается сильное ингибирование хемилюминесценции, обусловленное его прямой реакцией с гипохлоритом.

3. При введении люминола в суспензию полиморфно-ядерных лейкоцитов через 11 минут после начала их стимуляции форбол-12-миристат-13-ацетатом, наблюдается повышение остаточного свечения. Его светосумма примерно на 70% выше по сравнению со светосуммой в случае присутствия люминола до стимуляции клеток Причина этого не образование стабильных хлораминов, а, по-видимому, накопление участвующего в превращениях люминола пероксида водорода.

4. В присутствии экзогенного М-хлорфенилаланина (0,05-0,2 мМ) наблюдается усиление хемилюминесценции в системе полиморфно-ядерные лейкоциты -люминол без их стимуляции агонистом. Это усиление хемилюминесценции обусловлено не активацией клеток хлорамином, а, вероятно, представляет собой результат прямого окисления люминола хлорамином и эндогенным пероксидом водорода.

5. Экзогенные аминокислоты и таурин в значительных концентрациях вызывают выраженное подавление хемилюминесценции системы активированные полиморфно-ядерные лейкоциты - люминол. при концентрации 3 и 15 мМ интенсивность свечения снижается соответственно примерно на 20 и 40%. Снижение хемилюминесценции, вероятно, обусловлено перехватом гипохлорита аминогруппами; образующиеся хлорамины из-за низкой концентрации не дают заметного вклада в хемилюминесценцию

6. Ацетилцистеин, благодаря его способности проникать в клетки, устраняет и экстраклеточные оксиданты, и их большую часть в клеточных структурах. Возможно, терапевтическое действие ацетилцистеина при воспалительных процессах включает нейтрализацию реактивных оксидантов, генерируемых фагоцитами в очаге воспаления.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Мурина М.А., Белакина Н.С., Рощупкин Д. И. Хемилюминесценция системы полиморфноядерные лейкоциты - люминол в присутствии биогенных хлораминов. // Биофизика, 2004, Т. 49, № 6, с. 1099-1105.

2. Мурина М.А., Чудина Н.А., Белакина Н.С., Рощупкин Д.И., Сергиенко В.И. Зависимость действия хлораминовых производных аминокислот от их структуры и окислительной способности на агрегацию тромбоцитов. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004, Т. 138, № 12, с. 632-634.

3. Balakina N.S., Roshhupkin D.I., Sokolov A.Yu., Chudina N.A., Murina M.A. Influence of biogenic chloramines on chemiluminescence in neutrophil-luminol sustem. // Internation conference. "Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health. Work collection". Smolensk, Russia, 2003, p. 9.

4. Chudina N.A., Balakina N.S., Roshhupkin D.I., Sergienko V.I., Halilov E.M., Murina M.A. Antioxidative effect of sulfur-containing compounds and drugs on neutrophil-luminol sustem. // Internation conference. "Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health. Work collection". Smolensk, Russia, 2003, p. 11-12.

5. Белакина H.C., Рощупкин Д.И., Мурина М.А. Действие биогенных хлораминов на хемилюминесценцию стимулированных и не стимулированных нейтрофилов. // Научно-практическая конференция «40 лет Медико-биологическому факультету. Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины. Тезисы докладов». М., 2003, с. 10.

6. Мурина МА., Белакина Н.С., Чудина Н.А., Кравченко Н.Н., Сергиенко В.И. Генерация биогенных хлораминов нейтрофилами и их противотромботическая активность. // III съезд биофизиков России. Тезисы докладов. Воронеж, 2004, Т. II, с. 550-551.

№20 8 5 3

РНБ Русский фонд

2005-4 20686

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Белакина, Наталья Сергеевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. Особенности полиморфно-ядерных лейкоцитов.

1.1. Морфология и функции полиморфно-ядерных лейкоцитов.

1.2. Активация нейтрофилов.

1.3. Активные метаболиты кислорода.

1.4. Сульфгидрильные соединения.

ГЛАВА II. Хлораминовые производные аминокислот и таурина.

ГЛАВА III. Хемилюминесценция суспензии гранулоцитов.

3.1. Хемилюминесценция в присутствии активаторов.

3.2. Хемилюминесценция системы нейтрофилы - люминол.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Реактивы.

1.1. Получение N-хлорпроизводных аминокислот и таурина.

2. Объект исследования: выделение нейтрофилов.

3. Методы исследования

3.1. Регистрация хемилюминесценции.

3.2. Определение «активного хлора» в реакции гипохлорита натрия и хлораминов с серосодержащими соединениями.

3.3. Статистическая обработка полученных результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Природа оксидантов, непосредственно вызывающих окисление люминола, индуцированное нейтрофилами.

1.1. Роль гидроксильного радикала.

1.2. Роль хлораминов.

ГЛАВА 2. Влияние серосодержащих соединений на хемилюминесценцию в системе стимулированные нейтрофилы - люминол.

2.1. Влияние сульфгидрильных соединений на хемилюминесценцию люминола, вызванную N-хлорфенилаланином в присутствии пероксида водорода.

2.2. Хемилюминесценция в системе стимулированные ФМА нейтрофилы -люминол в присутствии сульфгидрильных соединений.

ГЛАВА 3. Хемилюминесценция системы нейтрофилы - люминол в присутствии биогенных хлораминов.

3.1. Влияние N-хлорфенилаланина на хемилюминесценцию люминола в суспензии неактивированных нейтрофилов.

3.2. Влияние хлораминов на хемилюминесценцию люминола в суспензии клеток, стимулированных ФМА.

3.3. Влияние аминокислот и таурина на хемилюминесценцию в системе нейтрофилы - люминол.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усиленная люминолом хемилюминесценция стимулированных нейтрофилов: внутриклеточные и внеклеточные источники свечения, роль соединений с активным хлором"

При активации фагоцитов бактериальными или химическими агентами в процессе так называемого "респираторного взрыва" образуются активные метаболиты кислорода. Фагоциты способны генерировать не только супероксид анион-радикал, гидроксильный радикал, пероксид водорода [12]. В реакции, катализируемой миелопероксидазой, они секретируют сильный окислитель -хлорноватистую кислоту (ионизированная форма гипохлорит-анион) [77]. При взаимодействии гипохлорита с аминогруппами свободных аминокислот, пептидов, белков образуются соответствующие хлораминовые производные - биогенные хлорамины [189,201]. Все эти окислители и свободные радикалы сейчас часто называют активными оксидантами. Известно, что они образуются и внутри клетки, и секретируются в окружающую среду.

Изменение функциональной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов, а именно продукции активных метаболитов кислорода, является важнейшим патогенетическим фактором, оценка которого актуальна для экспериментальной и практической медицины. Точная качественная и количественная характеристика активных метаболитов кислорода позволяет судить о микробицидном потенциале нейтрофила и о степени риска повреждения собственных тканей организма. Это требует тщательного изучения механизма продукции активных оксидантов, разработки методов их обнаружения и средств нейтрализации. В настоящее время в исследованиях процессов активации фагоцитов, сопровождающихся образованием активных форм кислорода, широкое применение находит метод регистрации хемилюминесценции с использованием химических усилителей (активаторов), прежде всего люминола и люцигенина [67]. В литературе есть данные о хемилюминесценции люминола при действии многих окислителей. Окисление люминола, проникающего внутрь клетки, - это сложный многостадийный процесс, начальные этапы которого сильно зависят от первичного окислителя [88, 142, 157, 158]. В ряде работ показано [10, 83], что люминол усиливает свечение фагоцитов за счет его окисления гипохлоритом. Однако до сих пор остается не изученным вопрос о конкретных механизмах, по которым в системе люминол -нейтрофилы возникает свечение с участием гипохлорита. Предполагается [35, 36], что в суспензии стимулированных нейтрофилов свечение может быть также результатом действия на люминол хлораминовых соединений. Таким образом, встает вопрос о природе оксиданта, который непосредственно реагирует с люминолом в нейтрофилах.

При изучении функций фагоцитов с использованием хемилюминесцентных характеристик совершенно необходимы количественные сведения об излучении, генерируемом в клеточных структурах, и хемилюминесценции, обусловленной оксидантами в окружающей среде. Таким образом, очень важна другая проблема. Она сводится к вопросу о том, какая часть свечения при активации нейтрофилов обусловлена окислением люминола в клеточных структурах, какая снаружи клеток.

Известно, что гипохлорит и хлорамины - соединения, содержащие активный хлор, обладают антибактериальным действием, могут модифицировать клетки крови. Ранее в нашей лаборатории было установлено [19-22,33,34,39], что гипохлорит и хлораминовые производные аминокислот, окисляя серосодержащие группы, снижают функциональную активность тромбоцитов, ингибируют их синтазу простагландина Нг, реакцию высвобождения плотных гранул, циклооксигеназное окисление липидов. Интересно, что действие хлораминовых производных разных аминокислот на тромбоциты различно: антиагрегационный эффект усиливается при снижении молекулярной массы хлораминов [22], и при удалении хлораминовой группы от отрицательно заряженной карбоксильной группы. В последнее время хлораминовые производные аминокислот и родственных соединений предложены в качестве противотромботического средства тромбоцитотропного типа действия [21]. В связи с этим представляет интерес выяснение возможного побочного действия биогенных хлораминов на лейкоциты. Известно, что хлораминовые производные аминокислот по сравнению с гипохлоритом гораздо слабее модифицируют лейкоциты [103,222]. В ряде работ высказывается мнение, что некоторые хлорамины способны регулировать нормальные физиологические процессы в фагоцитах. Из-за высокой концентрации таурина (20-50 мМ) в цитоплазме нейтрофилов при их активации в качестве вторичного продукта образуется преимущественно N-хлортаурин [150]. Предполагается [170], что на поверхности макрофагов имеется собственный рецептор для N-хлортаурина. N-Хлортаурин может проникать в клетку и уменьшать по принципу отрицательной обратной связи производство медиаторов воспаления (окиси азота, простагландина Е2, фактора некроза опухоли а), тем самым, защищая от повреждения клетки [124, 148-152, 170,205]. Однако в литературе нет сведений о влиянии хлораминовых производных аминокислот на продукцию активных метаболитов кислорода в нейтрофилах.

Целью настоящей работы было изучение физико-химических основ хемилюминесценции люминола в суспензии активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов, выяснение генерации реактивных оксидантов в клетке и окружающей среде.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА I. Особенности полиморфно-ядерных лейкоцитов

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Белакина, Наталья Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. В системе полиморфно-ядерные лейкоциты - люминол при стимуляции клеток агонистом форбол-12-миристат-13-ацетатом максимальное снижение интенсивности хемилюминесценции под действием восстановленного глутатиона (0,2 мМ), не проникающего через мембрану, составляет примерно 40%. Проникающие сульфгидрильные соединения дитиотреитол (0,1 мМ) и N-ацетилцистеин (0,2 мМ) вызывают более сильное ингибирование хемилюминесценции: её интенсивность снижается на 60-70 %. Около 50 % хемилюминесценции люминола регистрируется из внеклеточной среды, остальное свечение - вклад клеточных структур.

2. Специфический перехватчик гидроксильных радикалов диметилсульфоксид в умеренных концентрациях не влияет на усиленную люминолом хемилюминесценцию нейтрофилов. Это свидетельствует, что не имеет места генерация гидроксильных радикалов с участием гипохлорита, синтезируемого миелопероксидазой. При высоких концентрациях диметилсульфоксида наблюдается сильное ингибирование хемилюминесценции, обусловленное его прямой реакцией с гипохлоритом.

3. При введение люминола в суспензию полиморфно-ядерных лейкоцитов через 11 минут после начала их стимуляции форбол-12-миристат-13-ацетатом, наблюдается повышение остаточного свечения. Его светосумма примерно на 70 % выше по сравнению со светосуммой в случае присутствия люминола до стимуляции клеток. Причина этого не образование стабильных хлораминов, а накопление участвующего в превращениях люминола пероксида водорода.

4. В присутствии экзогенного N-хлорфенилаланина (0,05-0,2 мМ) наблюдается усиление хемилюминесценции в системе полиморфно-ядерные лейкоциты -люминол без их стимуляции агонистом. Это усиление хемилюминесценции обусловлено не активацией клеток хлорамином, а, вероятно, представляет собой результат прямого окисления люминола хлорамином и эндогенным пероксидом водорода.

5. Экзогенные аминокислоты и таурин в значительных концентрациях вызывают выраженное подавление хемилюминесценции системы активированные полиморфно-ядерные лейкоциты - люминол: при концентрации 3 и 15 мМ интенсивность свечения снижается соответственно примерно на 20 и 40 %. Снижение хемилюминесценции, вероятно, обусловлено перехватом гипохлорита аминогруппами; образующиеся хлорамины из-за низкой концентрации не дают заметного вклада в хемилюминесценцию.

6. Ацетилцистеин, благодаря его способности проникать в клетки, устраняет и экстраклеточные оксиданты, и их большую часть в клеточных структурах. Возможно, терапевтическое действие ацетилцистеина при воспалительных процессах включает нейтрализацию реактивных оксидантов, генерируемых фагоцитами в очаге воспаления.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Белакина, Наталья Сергеевна, Москва

1. Алмазов В.А. (ред.). Физиология лейкоцитов человека. Л.: Наука. - 1979. -С. 211.

2. Афанасьев Ю.И. (ред.). Гистология. М.: Медицина - 1989. - С. 432.

3. Бережная Н.М. Нейтрофилы и иммунологический гомеостаз. Киев: Наукова думка. - 1988. - С. 194.

4. Биленко М.В. Ишемические и репенфузионные повреждения органов. -М. Медицина, 1989. С. 368.

5. Варфоломеев С.Д., Мевх А.Т. Простагландины молекулярные биорегуляторы. -Изд-во МГУ. - 1985.

6. Владимиров Ю.А., Оленев В.И., Суслова Т.Б., Потапенко А.Я. Механизм перекисного окисления липидов и его действие на биологические мембраны. -В кн.: Итоги науки и техники. Биофизика, Т.5.- М.: Изд-во ВИНИТИ. 1975.

7. Владимиров Ю.А., Шерстнев М. П. Хемилюминесценция клеток животных. // Итоги Науки и Техники, Сер. Биофизика, том. 24, Москва, ВИНИТИ, 1989.

8. Гамалей И.А., Клюбин И.В. Перекись водорода как сигнальная молекула. // Цитология. 1996. - Т. 38. - № 12. - С. 1233-1247.

9. Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Лызлова С.Н. Особенности хемилюминесценции люминола, возбуждаемом при каталитическом действии миелопероксидазы. // Биохимия 1987. - Т.52. - № 10.- С.: 1670 - 1676.

10. Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Лызлова С.Н. Влияние низкомолекулярных соединений на хемилюминесценцию люминола, обусловленную действием продуктов миелопероксидазного катализа и экзогенного гипохлорита. // Биохимия 1988. - Т.53 - С.: 2025 - 2032.

11. Евгина С.А., Панасенко Г.М., Сергиенко В.И., Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липопротеинов крови человека, индуцированное гипохлорит-анионом. // Биол. мембраны. 1992. - Т. 9. - № 9. - С. 946 - 953.

12. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Менщикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимические и патофизиологические аспекты, Майк Наука / Интерпериодика, 2001.

13. Колесниченко JI.C., Кулинский В.И. Глутатионтрансферазы. // Успехи соврем, биологии. 1989. - Т. 107., вып. 2. - С. 179 -194.

14. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона. // Успехи соврем, биол. 1990. - Т. 110., вып. 1. - С. 20-33.

15. Ларкий Э.Г. Методы определения и мемаболизм металлобелковых комплексов. // Итоги науки и техники. Сер. Биологическая химия. 1990. - Т. 41.

16. Лакин Г.Ф. Биометрия. // Учебное пособие для биологических специальностей вузов. 4-е изд. 1990. - С. 113 - 115.

17. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. // Биохимия человека.- М.- Мир, 1993.-С.415.

18. Маянский А. Н., Маянский Д. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге.-Новосибирск: Наука,- 1989. С. 344.

19. Мурина М.А., Кузнецов В.Н., Рощупкин Д.И. Противоагрегационное дейтствие гипохлорита на тромбоциты. // Бюл. экс. биол. и мед.-1986.-№ 12.-С.: 676-678.

20. Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Прямое и косвенное противоагрегационное действие гипохлорита натрия на обогащенную тромбоцитами плазму крови. // Бюл. эксп. биол. и мед.- 1989.-№ 12.-С.:702 -704.

21. Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Средство для снижения агрегации тромбоцитов. // Официальная бюллетень комитета российской федерации по патентам и товарным знакам. Изобретения.- 1993.-№ 30.-С.62.

22. Мурина М.А., Рощупкин Д.И, Кравченко Н.Н, Садовников В.Б., Сергиенко В.И. Противоагрегационное действие хлораминовых производных аминокислот на тромбоциты в присутствии плазмы крови. // Биофизика 1997. - № 6 - С.: 12791285.

23. Натвиг Дж.Б., Перлманн П., Вигзелл X. Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика. М.: Медицина, 1980. - С. 215.

24. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. Активированные формы кислорода и их роль в организме. // Успехи биол. химии. 1990. - Т. 31-С.180-208.

25. Осипов A.H., Якутова Э.Ш., Владимиров Ю.А. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа. // Биофизика. -1993. Т. 38, вып. 3. - С. 390-396.

26. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Владимиров Ю.А., Арнольд Д., Сергиенко В.И.// Биофизика 1995. - Т.40. - С. 1234-1242.

27. Панасенко О.М., Евгина С.А., Сергиенко В.И. Изучение способности гипохлорита проникать в липидную фазу липопротеинов крови человека. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1993. - № 4. - С. 358-360.

28. Пол У. Иммунология. М.: Мир. - 1989. - С. 360.

29. Разумовский С.Д. Кислород элемент, формы и свойства. // М.: Химия, 1979.

30. Роит А. Основы иммунологии. М. - Мир. -1991.

31. Ромм А.Р., Шерстнев М.П., Волков В.В., Владимиров Ю.А. Действие лазерного излучения на перекисную хемилюминесценцию раневого экссудата. // Бюл. эксперим. Биол. и Мед. 1986. - Т.102. № 10. - С.: 426-428.

32. Рощупкин Д.И., Артюхов В.Г. Основы фотобиофизики. Воронеж: ВГУ, -1997.

33. Рощупкин Д.И., Бержицкая В.В., Мурина М.А., Различие в ингибирующем действии продуктов реакции, катализируемой миелопероксидазой, на тромбоцитыю. // Биофизика 1998. - Т. 43. - № 2. - С.: 323-328.

34. Рощупкин Д.И., Мурина М.А, Аднорал Н.В., Кравченко Н.Н., Сергиенко В.И. Угнетение функции тромбоцитов биогенными хлораминами.// Физиология человека 1998. - № 3. - С.: 113-120.

35. Рощупкин Д. И., Чудина Н.А., Мурина М. А. Кинетические особенности хемилюминесценции люминола, вызванной биогенными хлораминовыми соединениями. // Биофизика 2002. - Т.47. - № 2. - С.: 211-218.

36. Рощупкин Д. И., Чудина Н.А., Мурина М. А. Хемилюминесценция при окислении люминола хлораминовыми производными биогенных соединений. // Биофизика 2002. - Т.47. - №1. - С.: 27-30.

37. Сергиенко В.И., Мурина М.А., Панасенко О.М., Трунилина Н.Н., Евгина С.А., Айдыралиев Р., Рощупкин Д.И. Молекулярно-клеточные механизмы действиягипохлорита натрия на тромбоциты и липопротеины. // Вестник РАМН 1995. -№ 3. - С.: 48-53.

38. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифической реакции организма на эстремальное воздействие. // Вопр. мед. химии. 1988. - № 6. - С. 2-11.

39. Часовникова JI.B., Формазюк В.Е., Сергиенко В.И., Кокряков В.Н. Взаимодействие миелопероксидазы и дефензинов с монослоями липидов. // Биохимия. 1992. - Т. 57, вып. 1. - С. 97-102.

40. Чирков Ю.Ю., Белушкина Н.Н., Тыщук И.А., Северина И.С. Роль гуанилатциклазы в регуляции агрегации тромбоцитов человека. // Вестник АМН СССР -1991.-С.51.

41. Шаронов Б.П., Говорова Н.Ю., Лызлова С.Н. Антиокислительные свойства и деградация белков сыворотки активными формами кислорода (02*, ОСГ), генерируемые стимулированными нейтрофилами.// Биохимия- 1988.- Т. 53 -вып. 5-С.: 816-825.

42. Шаронов Б.П., Чурилова И.В. Окислительная модификация и инактивация супероксиддисмутазы гипохлоритом. // Биохимия. 1992. - Т. 57, вып. 5. - С. 719-727.

43. Шинкаренко Н.В., Алексовский В.Б. Химические свойства синглетного молекулярного кислорода и значение его в биологических системах. // Успехи химии. 1982. - Т. 51. - № 5. - С. 713-735.

44. Abuja P.M., Albertini R. Methods for monitoring oxidative stress, lipid peroxidation andoxidation resistance of lipoproteins. // Clinica Chimica Acta. 2001.-V.306.- P.: 1-17.

45. Albrich J.M., Mc Carthy A., Hurst J.K. Biological reactivity of hypochlorous acid implications for microbicidal mechanisms of leukocyte myeloperoxidase. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1981.- V.78.- P.: 210-214.

46. Allen RC, Loose LD. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages.//Biochem Biophys Res Commun. 1976 - V.69. - P.:245-52.

47. Anderson R., LukeyP.T., TheronA.J., DippenaarU. Ascorbate and cysteine-mediated selective neutralisation of extracellular oxidants during N-formyl peptide activation of human phagocytes. // Agents Actions 1987. - V.20 - No.l- P.: 2 77286.

48. Andrew L.R. Waite T.D. Chemiluminescence of luminol in the presence of iron (II) and oxygen: oxidation mechanism and implications for its analytical use. // Anal.Chem.- 2001. V.73. - P.: 245909 - 5920.

49. Arnhold J, Hammerschmidt S, Arnold K. Role of functional groups of human plasma and luminol in scavenging of NaOCl and neutrophil-derived hypochlorous acid. //Biochim Biophys Acta 1991. - V.1097. - No.2. - P.: 145-151.

50. Arnhold J., Mueller S., Arnold K., Sonntag K. Mechanismsof inhibition of chemiluminescence in the oxidation of luminol by sodium hypochlorite. // J. Biolumin. Chemilumin.-1993. -V. 6.-P.307-313.

51. Aruoma O.I., Halliwell В., Hoey B.M, Butler J. The antioxidant action of N-acetylcysteine: its reaction with hydrogen peroxide,hydroxyl radical, superoxide, and hypochlorous acid. // Free Radic Biol. Med. 1989. - V.6. - No.6. - P.: 593-597.

52. Arnhold J., Mueller S., Arnold K., Sonntag K. Mechanismsof inhibition of chemiluminescence in the oxidation ofluminol by sodium hypochlorite. // J. Biolumin. Chemilumin. -1993. -V.6. P.:307-313.

53. Auchere F, Capeillere-Blandin C. NADPH as a co-substrate for studies of the chlorinating activity of myeloperoxidase. // J.Biochem. 1999. - V.343. - Pt. 3.- P.: 603-613.

54. Babior B.M.; Andreoli Т.Е. Phagocytes and Oxidative Stress. T//he American Journal of Medicine. -2000. -V.109.- No.l. P.: 33-44.

55. Bast A., Haenen G.R.M.M., Doelman C.J.A. Oxidants and antioxidants: Stat of the art. // Amer. J. med. 1991. - V. 91., Suppl.3C. - P. 2S-13S.

56. Bergt C, Marsche G, Panzenboeck U, Heinecke J. W., Malle E, Sattler W. Human neutrophils employ the myeloperoxidase/hydrogen peroxide/chloride system to oxidatively damage apolipoprotein A-I. // Eur. J. Biochem 2001. - V.268. - P.: 3523-3531.

57. Bjerrum O.W., Human neutrophil structure and function with special reference to cytochrome b559 and 2-microglobulin. // Danish Med. Bull. 1993. - V. 40. - P. 163187.

58. Bokoch G.M. Chemoattractant signaling and leukocyte activation.// Blood 1995. -V.86.-P.: 1649-1660.

59. BrestelE.P. Co-oxidation of luminol by hypochlorite and hydrogen peroxide implications for neutrophil chemiluminescence. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. - V.126. -No.l. - P.: 482-8.

60. Briheim G, Stendahl O, Dahlgren C. Intra and extracellular events in luminol dependent chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes. // Infect Immun. -1984.-V.45.-P.: 1-5.

61. Byczkowski J.Z., Gessner T. Biological role of superoxie ion-radical. // Int. J. Biochem. 1988. - V. 20. - P. 569-580.

62. Campbell A.K., Hallet M.B., Weeks I.Chemiluminescence as an analytical tool in cell biology and medicine. // Methods Biochem Anal. -1985.- V.31-P.317-416.

63. Carr A.C., Hawkins C.L., Thomas S.R., Stocker R., Frei B. Relative reactivities of N-chloramines and hypochlorous acid with human plasma constituents. //Free Radic. Biol. Med.- 2001.- V. 30.-No. 5.- P. 526-536.

64. Carr A.C., Tijerina Т.,Frei B. Vitamin С protects against and reverses specific hypochlorous acid- and chloramine-dependent modifications of low-density lipoprotein.//Biochem J.- 2000.- V. 346.- P. 491-499.

65. Carr A.C., Winterbourn C.C. Oxidation of neutrophil glutathione and protein thiols by myeloperoxidase-derived hypochlorous acid. //Biochem J.- 1997.- V. 327.- P. 275281.

66. Champiat R, Larpent N. Reactions de luminescence. In: Masson, editor. Bioluminescence: principes et applications.// Paris: Biotechnologies- 1993- p. 15135.

67. Cheung K., Archibald A.C., Robinson M.F. Luminol-dependent chemiluminescence produced by neutrophils stimulated by immune complexes. //Aust J Exp Biol Med Sci. -1984.- V. 62- P. 403-419.

68. Chorazy M, Kontny E, Marcinkiewicz J, Maslinski W. Taurine chloramine modulates cytokine production by human peripheral blood mononuclear cells. // Amino Acids. 2002;23(4):407-13.

69. Claiborne A. Catalase activity. // Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. Boca Raton: CRC Press, 1986. - P. 283-284.

70. Claiborne A., Miller H., Parsonage D., Ross R. P. Protein-sulfenic acid stabilization and function in enzyme catalysis and gene regulation. // FASEB J. 1993. - V. 7. -P.: 1483-1490.

71. Clark R. A; Klebanoff S. Myeloperoxidase-H202-halide system: cytotoxic effect on human blood leukocytes. //Blood. -1977.- V. 50. -No. 1.- P. 65-70.

72. Cooper, A.J.L., Kristal, B.S. Multiple roles of glutathione in the central nervous system. // Biol. Chem. -1997. V. 378.- P. 793-802.

73. Dahlgren C., Karlsson A. // Journal of Immunological Methods Respiratory burst in human neutrophils 232 (1999) 3-14

74. Dahlgren C., Stendahl O. Role of myeloperoxidase in luminol-dependent chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes. //Infect Immun. -1983.- V.39.-No. 2.- P. 736-741.

75. Dang P.M-C., Cross A.R., Babior B.M. Assembly of the neutrophil respiratory burst oxidase: A direct interaction between p67PHOX and cytochrome b558.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001.-V. 98.- No. 6.- P.3001-3005.

76. Davies B, Edwards SW. Inhibition of myeloperoxidase by salicylhydroxamic acid. // Biochem J. 1989. - Mar 15. -V. 258. -T. 3. - P. 801-806.

77. DeChatelet.L. R., Long G.D., Shirley P.S., Bass D.A., Thomas M.J., Henderson F.W., Cohen M.S. Mechanism of the luminol-dependent chemiluminescence of human neutrophils.//!. Immunol.-1982.- V. 129.- No. 4.- P. 1589-1593.

78. DeChatelet, L.R., Shirley, P.S. Evaluation of chronic gran-ulomatous disease by a chemiluminescence assay of microliter quantities of whole blood.// Clin. Chem. -1981., V. 27.- P. 1739.

79. Demiryurek A.T., Wadsworth R.M. Superoxide in the pulmonary circulation.//Pharmacology & Therapeutics.-1999.- V. 84.- P.355-365.

80. Denu J. M., Tanner K. G. Specific and reversible inactivation of protein tyrosine phosphatases by hydrogen peroxide: Evidence for a sulfenic acid intermediate and implications for redox regulation. // Biochemistry 1998. - V. 37. - P.: 5633-5642.

81. Dringen R. Metabolism and functions of glutathione in brain. //Progress in Neurobiology 2000.- V. 62. - P. 649-671.

82. Edwards S.W. Luminol- and Iucigenin-dependent chemilumines-cence of neutrophils: role of degranulation.// J Clin Lab Immunol. 1987. - V. 22. - P. 35-39.

83. Faldt, J., Ridell, M., Karlsson, A., Dahlgren, C. The phagocyte chemiluminescence paradox: luminol can act as an inhibitor of neutrophil NADPH-oxidase activity.// Lumines-cence-1999-14, 153.

84. Faulkner K., Fridovich I. Luminol and lucigenin as detectors for 02*". // Free Radic. Biol. Med. 1993 - V. 15. - P. 447^51.

85. Fenna R., Zeng J., Davey C. Structure of the green heme in myeloperoxidase. //Arch Biochem Biophys.- 1995.- V. 316.- P. 653-656.

86. Flohe, L.; Brigelius-Flohe, R.; Saliou, C.; Traber, M. G.; Packer, L. Redox regulation of NF-kappa b activation. // Free Radic. Biol. Med. 1997 - V. 22. - P. 1115-1126

87. Floris R., Wever R. Reaction of myeloperoxidase with its product HOC1. //European Journal of Biochemistry- 1992.- V. 207.- P. 697-702.

88. Follin, P., Briheim, G., Dahlgren, C., 1991a. Mechanisms in neutrophil priming: haracterization of the oxidative response induced by formylmethionyl-leucyl-phenylalanine in human exudated cells. // Scand. J. Immunol. V. 34. - P. 317.

89. Follin, P., Johansson, A., Dahlgren, C., 1991b. Intracellular pro-duction of reactive oxygen species in human neutrophils fol-lowing activation by the soluble stimuli fMLP, dioctanoylglyc-erol and ionomycin. // Cell Biochem. Funct. V. 9. - P. 29.

90. Fridovich I. Fundamental Aspects of Reactive Oxygen Species, or What's the Matter with Oxygen? // Annals of The New York Academy of Sciences.- 1999.-V. 893.- P. 13-18.

91. Furtmuller P.G., Burner U., Obinger C. Reaction of myeloperoxidase compound I with chloride, bromide, iodide, and thiocyanate. // Biochemistry- 1998.- V. 37.- P. 17923-17930.

92. Gate L., Paul L., Nguyen Ba, G., Tew K.D., Tapiero H. Oxidative stress induced pathologies: the role of antioxidants. // Biomed. Pharmacother.- 1999.- V. 53.- P. 169-180.

93. Ghibelli L., Fanelli C., Rotilio G., Lafavia E., Coppola S., Colussi C., Civitareale P., Ciriolo M.R. Rescue of cells from apoptosis by inhibition of active GSH extrusion. // J. FASEB -1998.- V. 12.- P. 479-486.

94. Gitler С., Mogyoros M., Kalef E. Labeling of protein vicinal dithiols: Role of protein-S2 to protein-(SH)2 conversion in metabolic regulation and oxidative stress. // Methods Enzymol 1994.- V. 33. - P.: 403^15.

95. Goldman R., Stoyanovsky D.A., Day B.W., Kagan V.E. Reduction of phenoxyl radicals by thioredoxin results in selective oxidation of its SH-groups to disulfides. An antioxidant function of thioredoxin. // Biochemistry 1995. - V. 34. P.: 47654772.

96. Grierson L., Hildenbrand K., Bothe E. Intramolecular transfor-mation reaction of glutathione thiol radical into a non-sulphur-centered radical: a pulse radiolysis and EPR study. // Int. J. Radiat. Biol. 1999. - V. 62. - P.: 265-277.

97. Grisham M.B., Jefferson M.M., Thomas E.L. Role of monochloramine in the oxidation of erythrocyte hemoglobin by stimulated neutrophils. // J. Biol. Chem.-1984.-V. 259.-No. 11.-P. 6757-6765.

98. Guzik T.J., West N.E.J., Black E., McDonald D., Ratnatunga C., Pillai R., Channon K.M. Vascular superoxide production by NAD(P)H oxidase association with endothelial dysfunction and clinical risk factors. // Circ Res.- 2000.- V. 86,- P. 85-90.

99. Hall A.G.The role of glutathione in the regulation of apoptosis. // Eur. J. Clin. Invest.- 1999.-V. 29.-P. 238-245.

100. Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. // Blood.- 1998.-V. 92.- P. 30073017.

101. Harrison J.E. //FEBS.Letters. 1986.- V. 92.- No. 3.- P. 327-333.

102. Heinecke J.W. Superoxide-mediated oxidation of low density lipoprotein by thiols. // Oxy-Radocals in Molecular Biology and Pathology. N.Y.: Liss. - 1988. - P. 443457.

103. Held A.M., Hurst J.K. Ambiguity associated with use singlet oxygen trapping agents in myeloperoxidase-catalyzed oxidation. // Biochem. Biophys. Res. Com.- 1978.- V. 81.-No. 3.-P. 878-885.

104. Hippeli S., Heiser I., Elstner E.F. Activated oxygen and free oxygen radicals in pathology: New insights and analogies between animals and plants.// Plant Physiol. Biochem.- 1999.- V. 37.-No. 3.- P. 167-178

105. Imlay J.A., Linn S. DNA damage and oxygen adical toxicity. // Scirnvr. 1988. - V. 240.-P. 1302-1309.

106. Irisham M.B., Jefferson M.M., Thomas E.L. Role of monochloramine in the oxidation of erythrocyte hemoglobin by stimulated neutrophiles. // J. Biol. Chem.-1984.- V. 259.- No. 11.- P. 6757-6772.

107. Jones, D. P.; Maellaro, E.; Jiang, S.; Slater, A. F.; Orrenius, S. Effects ofN-acetyl-L-cysteine on T-cell apoptosis are not mediated by increased cellular glutathione. // Immunol. Lett. 1995 - V. 45. - P. 205-209.

108. Jones R.D., Morice A.H. Hydrogen peroxide an intracellular signal in the pulmonary circulation: involvement in hypoxic pulmonary vasoconstriction. // Pharmacology & Therapeutics. - 2000.- V. 88.- P.153-161.

109. Junod A.F. Effects of oxygen intermediates on cellular functions. // Amer. Revs. Respir. Dis. 1987. - V. 135., Suppl. - P. S32-S34.

110. Kalra J., Chaudhary A.K., Massey K.L., Prasad K. Effect of oxygen free radicals, hypoxia and pH on the release of liver lysosomao enzymes. // Mol. and Cell. Bioxhem. 1990. - V. 94. - P. 1-8.

111. Kanoffsky J.R., Wright J., Towler A.I. // FEBS Letters.- 1985.- V. 187.- No. 2.-P.299-301.

112. Karlsson, A. Wheat germ agglutinin WGA induces NADPH-oxidase activity in human neutrophils by interaction with mobilizable eceptors.// Infect. Immun.-1999.-67,3461.

113. Karlsson, A., Follin, P., Leffler, H., Dahlgren, C., Galectin-3 activates the NADPH-oxidase in exudated but not peripheral blood neutrophils. // Blood 1998. - V. 91. -P. 3430.

114. Kizak M, Miller C.W., Selsted M.E., Koeffler H.P. Myeloperoxidase (MPO) gene mutation in hereditary MPO deficiency. // Blood.- 1994- V. 83.- P. 1935-1940.

115. Klebanoff S.I., Clark R.A. Hemolysis and iodination of erythrocyte components by a myeloperoxidase-mediated system. // Blood.- 1975.- V. 45.- P. 698-707.

116. Klebanoff S.J., Clark R.A. The neutrophil elsevier. //North Holland, N.-Y., 1978.

117. Knebel, A.; Rahmsdorf, J.; Ullrich, A.; Herrlich, P. Dephosphor-ylation of tyrosine kinases as target of regulation by radiation, oxidants or alkylating agents. // EMBO J. 1996-V. 15.-P. 5314-5325.

118. Kobayashi Т., Robinson J.M., Seguchi H. Identification of intracellular sites of super-oxide production in stimulation neutrophils. // J. Cell Sci. 1998. - V. 111. -P. 81-91.

119. Kobayashi Т., Seguchi H. Novel insights into current models of NADPH oxidase regulation, assembly and localization in human polymorphonuclear leukocytes. // Histol. and Histopahtol. 1999. - V. 14. - P. 1295-1308.

120. Kohen R., Vellaichamy E., Hrbac J., Gati I., Tirosh O. Quantification of the overall reactive oxygen species scavenging capacity of biological fluids and tissues. // Free Radical Biology Medicine- 2000.-V. 28.- No. 6.- P. 871-879.

121. Kontny E, Maslinski W, Marcinkiewicz J. Anti-inflammatory activities of taurine chloramine: implication for immunoregulation and pathogenesis of rheumatoid arthritis.// Adv Exp Med Biol. 2003;526:329-40.

122. Kontny E, Rudnicka W, Kowalczewski J, Marcinkiewicz J, Maslinski W. Selective inhibition of cyclooxygenase 2-generated prostaglandin E2 synthesis in rheumatoid arthritis synoviocytes by taurine chloramine. // Arthritis Rheum. 2003 Jun;48(6):1551-5.

123. Kono Y., Fridovich I. Isolation and characterization of the pseuedocatalase of Lactobacillus plantarum: a new manganese-containing enzyme. // J. Boil. Chem. -1983.-V. 258.-P. 6015-6019.

124. Kudoh S., Suzuki K., Yamada M., Liu Q., Nakaji S., Sugawara K. Contribution of nitric oxide synthase to human neutrophil chemiluminescence. // Luminescence -1999.- V. 14.- No. 6.- P. 335-339.

125. Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: pop-ulation studies using Bayer-Technicon automated hematology. // J. Mol. Med. 1998. - V. 76. - P. 669.

126. Lampert M.B.,Weiss S.J. The chlorinating potential of the human monocyte. // Blood -1983.- V. 62.- No. 3.- P. 645-651.

127. Lanza F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. // J. Mol. Med.-1998.- V. 76.- P. 676-681.

128. Lind J.,Mereneyi G., Eriksen Т.Е. Chemiluminescence Mechanism of Cyclic Hydrazides Such as Luminol in Aqueous Solutions // J. Amer. Chem. Soc.- 1983.- V. 105.- P. 7655-7661.

129. Liu Y., Schuller-Levis G., Quinn M.R. Monocyte chemoattractant protein-1 and macrophage inflammatory protein-2 production is inhibited by taurine chloramine in rat C6 glioma cells. // Immunol. Lett.- 1999.- V. 70.- No. 1.- P. 9-14.

130. Lundqvist, H., Dahlgren, C. The serine protease inhibitor diisopropylfluorophosphate inhibits neutrophil NADPH-oxidase activity induced by the calcium ionophore ionomycin and serum opsonised yeast particles.Inflammation-1995-Res. 44,510.

131. Lundqvist, H., Dahlgren, C. Isoluminol-enhanced chemilu-minescence: a sensitive method to study the release of super-oxide anion from human neutrophils. //Free Radical Biol. Med.-1996.-20,785.

132. Marcinkiewicz J., Chain В., Nowak В., Grabowska A., Bryniarski K., Baran J. Antimicrobial and cytotoxic activity of hypochlorous acid: interactions with taurine and nitrite. // Inflamm. Res.- 2000.- V. 49.- No. 6.- P. 280-289.

133. Marcinkiewicz J., Grabowska A., Bereta J., Bryniarski K., Nowak B. Taurine chloramine down-regulates the generation of murine neutrophil inflammatory mediators. // Immunopharmacology- 1998.- V. 40.-No. 1.- P. 27-38.

134. Marcinkiewicz J., Grabowska A., Chain B.M. Modulation of antigen-specific T-cell activation in vitro by taurine chloramine. // Immunology- 1998.- V. 94.- No. 3.- P. 325-330.

135. Maridonneau-Parmi I., Tringale S., Tauber A. // J. Immunol.- 1986.- V. 137.- P. 2925-2929.

136. Mathyhartert M., Debydupont G., Melin P. et al. Bactericidal activity against Pseudomonas aeruginosa is acquired by cultured human monocyte-derived macrophages after uptake of myeloperoxidase. // Experentia. 1996. - V. 52. - P. 167-174.

137. McCord J.M., Russell W.J. Superoxide inactivates creatine phosphokinase during reperfusion of ischemic heart. // Oxy-Radicals in Molecular Biology and Pathology. -N.Y.: Less, 1988.-P. 27-35.

138. McPhail L.C., Qualliotine-Mann D., Waite K.A. Cell-free activation of neutrophil NADPH oxidase by a phosphatidic acid-regulated protein kinase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995.- V. 92.- P. 7931-7935.

139. Merenyi G., LindJ., EriksenT.E. Luminol chemiluminescence: chemistry, excitation, emitter. // J Biolumin. Chemilumin. 1990. - V.5. - No.l. - P.: 53-56.

140. MerenyiG., LindJ., EriksenT.E. Nucleophilic addition to diazaquonones. Formation and breakdown of tetrahedral intermediates in relation to luminol chemiluminescence. // J. Am. Chem. Soc. 1986. - V. 108. - P.: 7716-7726.

141. Morris J.C. Kinetics of reaction between aqueous chlorine and nitrogen compounds. //In: Principles and applications of water chemistry 1967.- P. 23-51.

142. Mueller S., Arnhold J. Fast and sensitive chemiluminescence determination of H202 concentration in stimulated human neutrophils. // J. Biolumin. Chemilumin.- 1995.-V.10.- P. 229-237.

143. Munday, R.; Winterbourn, С. C. Reduced glutathione in combination with superoxide dismutase as an important biological antioxidant defense mechanism. // Biochem. Pharmacol. 1989 - V.38. - P. 4349-4352.

144. Murphy M.E., Sies H. Visible-range low-level chemiluminescence in biological systems. // Methods Enzymol.- 1990.- V. 186.- P. 595-610.

145. Murrrell G., Bromley G.N. Modulation of fibroblast proliferation by oxygen free radicals. // Biobhem. J. 1990. - V. 265. - P. 659-665.

146. Nagl M.,Gottardi W. Rapid killing of Mycobacterium terrae by N-chlorotaurine in the presence of ammonium is caused by the reaction product monochloramine. // J. Pharm. Pharmacol.- 1998.- V. 50.- No. 11.- P. 1317-1320.

147. Nguyen A.T., Golub R., Feuillet-Fieux M.N., Descamps-Latscha B. Modulation of human granulocyte and monocyte chemiluminescence responses: evidence for distinct free radical generating systems. // J. Clin. Lab. Immunol.- 1983.- V. 12.- P. 47-55.

148. Nozaki O., Kawamoto H. Determination of hydrogen peroxide by micro-flow injection-chemiluminescence using a coupled flow cell reactor chemiluminometer. // Luminescence. -2000.- V.15.-No. 3.-P.137-42.

149. Oosthuizen M.M., Greyling D. Antioxidants suitable for use with chemiluminescence to identify oxyradical species. // Redox. Report.- 1999.- V. 4.-No. 6.- P. 277-290.

150. Park E., Quinn M.R., Wright C.E., Schuller-Levis G. Taurine chloramine inhibits the synthesis of nitric oxide and the release of tumor necrosis factor in activated RAW 264.7 cells. // J. Leukoc. Biol.- 1993.- V. 54.- No. 2.- P. 119-124.

151. Park E., Schuller-Levis G., Jia J.H., Quinn M.R. Preactivation exposure of RAW 264.7 cells to taurine chloramine attenuates subsequent production of nitric oxide and expression of iNOS mRNA. // J. Leukoc. Biol.- 1997.- V. 61.- No. 2.- P. 161-166.

152. Peskin A.V., Winterbourn C.C. Kinetics of the reactions of hypochlorous acid and amino acid chloramines with thiols, methionine, and ascorbate. // Free Radic. Biol. Med.- 2001,- V. 30,- No. 5.-P. 572-579.

153. Pietarinen-Runtti P., Lakari E., Raivio K.O., Kinnula V.L. Expression of antioxidant enzymes in human inflammatory cells. // Am. J. Physiol. Cell Physiol.- 2000.- V. 278.- P. 118-125.

154. Poumay Y., Ronveaux-Drpal M.F. Incubation of endothelial cells in a superoxide generation system: impaired low-density lipoprotein receptor-mediated endocytosis. // J. Cell Physiol. 1988. -V. 136. - P. 289-296.

155. Pruts W.A. Hypochlorous acid interactions with thiols, nucleotides, DNA and other biological substrates. // Arch. Biochem. Biophys.-1996.- V. 332.- No. 1.- P. 110-120.

156. Pullar J.M., Vissers M.C., Winterbourn C.C. Glutathione oxidation by hypochlorous acid in endothelial cells produces glutathione sulfonamide as a major product but not glutathione disulfide. // J. Biol. Chem.- 2001.- V. 276.- No. 25.- P. 22120-22125.

157. Quinn M.R.,Park E., Schuller-Levis G. Taurine chloramine inhibits prostaglandin E2 production in activated RAW 264.7 cells by post-transcriptional effects on inducible cyclooxygenase expression. // Immunol. Lett.- 1996.- V. 50.- No. 3.- P. 185-188.

158. Raschke P., Massoudy P., Becker B.F. Taurine protects the heart from neutrophil-induced reperfusion injury. //.Free Radic. Biol. Med.- 1995.- V. 19.- P. 461-471.

159. Rest RF. Measurement of human neutrophil respiratory burst activity during phagocytosis of bacteria.// Methods Enzymol. -1994.-V. 236.-P. 119- 37.

160. Rodgers M.A. Time resolved studies of 1.27 micron luminescence from singlet oxygen generated in homogeneous and microheterogeneous fluids. // Photochem. Photobiol.- 1983.- V. 37.- No. 1.- P. 99-103.

161. Rodrigues M.R., Rodriguez D., RussoM., CampaA. Macrophage activation includes high intracellular myeloperoxidase activity. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - V. 292. - No. 4. - P.: 869-873.

162. Rosen H., Klebanoff S. J. Chemiluminescence and superoxide production by myeloperoxidase-deficient leukocytes. // J. Clin. Invest. 1976 - V. 58. - P. 50.

163. Saito D., Nakaji S., Umeda Т., Kurakake Sh., Danjio K., Shimoyama Т., Sugawara K. Effects of long-distance running on serum opsonic activity measured by chemiluminescence.//Luminescence.-2003.-V. 17- P. 122-124.

164. Schreck, R.; Rieber, P.; Baeuerle, P. A. Reactive oxygen inter-mediates as apparently widely used messengers in the activation of the NF-kB transcription factor and HIV-1. // EMBO J. 1991. - V. 10. - P. 2247-2258.

165. Sen, С. K.; Packer, L. Antioxidant and redox regulation of gene transcription. // Faseb J. 1996 - V. 10. - P. 709-720.

166. Shan, X., Aw, T. Y., Jones, D. P. Glutathione-dependent protection against oxidative injury. // Pharmacol. Ther. 1990.- V. 47. - P. 61-71.

167. Slungaard A., Mahoney J.R. Thiocyanate is the major substrate for eosinophil peroxidase in physiologic fluids. Implications for cytotoxicity. // J. Biol. Chem.-1991.- V. 266.- P. 4903-4910.

168. Steinbeck M.J., Khan A.U., Karnovsky M.J. Intracellular singlet oxygen generation by phagocytosing neutrophils in response to particles coated with a chemical trap. // J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - P. 13425-13433.

169. Stelmaszynska Т., Zgliczynski I.M. Myeloperoxidase of human neutrophilic granulocytes as chlorinatiny enzyme.// Eur.J.Biochem.-1974.-V. 45.- P. 305-312.

170. Stief T.W.,Fareed J. The antithrombotic factor singlet oxygen/light ('Ог).// Clin. Appl. Thromb. Hemost.- 2000.- V. 6.- No. 1.- P. 22-30.

171. Stief T.W.,Kurz J.,Doss M.O. Singlet oxygen inactivates fibrinogen, factor V, factor VIII, factor X, and platelet aggregation of human blood. // Thromb. Res.- 2000.- V. 97.- No. 6.- P. 473-480.

172. Sullivan, S. G.; Chiu, D. Т.; Errasfa, M.; Wang, J. M.; Qi, J. S.; Stern, A. Effects of H2 02 on protein tyrosine phosphatase activity in HER14 cells. // Free Radic.Biol. Med. 1994 - V. 16. - P. 399-403.1. Л I

173. Suzuki Y.J., Ford G.D., Ingibition of Ca -ATPase of vascular smooth muscle sarcoplasmic reticulum by reactive oxygen intermediates. // Am. J. Physiol. 1991. -V. 261. - P. H568-H574.

174. Suzuki Y.J., Kawai E., Kodama Y. et al. Quantitative analysis of superoxide anion generation in living cells by using chemiluminescence video microscopy. // Biochim. En biophys. Acta. 1994. - V. 1201. - P. 328-332.

175. Suzuki H., Seto K., Mori M., Suzuki M., Miura S., Ishii H. Monochloramine induced DNA fragmentation in gastric cell line MKN45. // Am. J. Physiol.- 1998.- V. 275.- P. 712-716.

176. Teixeira H.D., Schumacher R.I., Meneghini R. Lower intracellular hydrogen peroxide levels in cells overexpressing CuZn-superoxide dismutase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA Biochemistry- 1998.- V. 95.- P.: 7872-7875.

177. Test S.T., Weiss S.J. Quantitative and temporal characterization of the extracellular H202 poll generated by human neutrophil^. // J. Biol. Chem. 1984. - V.259. - P. 399-405.

178. Thomas E.L. Myeloperoxidase, hydrogen peroxidase, chloride antimicrobial system: nitrogen chloride derivatives of bacterial components in bactericidae action against E.Coli. // Infect.Imm.-1979.- V. 23.- No. 2.- P. 522-531.

179. Thomas E.L.,Bozeman P.M., Jefferson M.M., King C.C. Oxidation of bromide by the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Formation of bromamines. // J. Biol. Chem.- 1995.- V. 270.- P. 2906-2913.

180. Thomas E.L., Jefferson M.M., Grisham M.B. Myeloperoxidase -catalized incorporation of amines into proteins: role of hypochlorous acid and dichloramines. // Biochemistry.-1982.-V. 21.- P. 6299-6308.

181. Thomas E. G., Hodgson M., Jones P. Kinetics and Mechanism of a Chemiluminescent Clock Reaction based on the Horseradish Peroxidase Catalysed Oxidation of Luminol by Hydrogen Peroxide. // J.Chem.Soc.Perkin Trans.2. 1990. -V. 8.-P.: 1385-1388.

182. Vladimirov Yu. A., Sherstnev M. P. Biophysical chemiluminescent analysis. In "Physicochemical Aspects of Medicine Rewiews" (Ed. Lopukhin Yu. M.), Soviet Medical Reviews/Section В, V. 2, Part 5. Harwood Academic Publishers GMBH, -1991.-P.: 1-44.

183. Vogt W. Complement activation by myeloperoxidase products released from stimulated human polymorphonuclear leukocytes. // Immunobiology.- 1996.- V. 195.-P. 334-346.

184. Vogt W., Hesse D. Oxidants generated by the myeloperoxidase-halide system activate the fifth component of human complement, C5. // Immunobiology.- 1994.-V. 192.-P. 1-9.

185. Wang J.F., Komarov P., de Groot H. Luminol chemiluminescence in rat macrophages and granulocytes: the role of N0,02"/H202, and HOC1. // Arch. Biochem. Biophys.- 1993.-V. 304.- No. 1.- P. 189-196.

186. Weber G.F. The measurement of oxygen-derived free radicals and related substances in medicine. // J Clin Chem Clin Biochem. 1990. - V. 28. - P. 569 -603.

187. Wefers H., Sies H. Oxidation of glutathione by the superoxide radical to the disulfide and the sulfonate yielding singlet oxygen. // Eur. J. Biochem. 1982 -V. 137. P.-29-36.

188. Weil J.C., Morris J.C. Kinetic studies on the chloramines. N-chlormethylamine and N-chlordimethylamine. // J. Amer. Chem. Soc.- 1979.- V.71.- No.5.- P.: 1664-1671.

189. WeimannA., Hildebrandt A.G., KahlR. Different efficiency of various synthetic antioxidants towards NADPH induced chemiluminescence in rat liver microsomes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1984. V.125 - No.3. - P.: 1033-1038.

190. Weiss S.J. The role of superoxide in the destruction of eiythrocute targets by human neunrophils. // J. Biol. Chem. 1980. - V. 225. - P. 9912-9917.

191. Weiss S., Lobuglio A.F. Biology of disease: phagocyte generated oxygen metabolites and cellular injury. // Lab. Invest.- 1982.- V. 47.- No. 1.- P. 5-18.

192. Weiss S.J., Slivka A. Monocyte and granulocyte-mediated human cell distruction: a role for the hydrogen peroxide-myeloperoxidase-chloride system.// J.Clin.Invest.-1982.- V. 69.- No. 2.- P. 255-262.

193. Weiss S.J., Lampert M.B., Test S.T. Long-lived oxidants generated by human neutrophils: characterizization and bioactivity. // Science.- 1983.- V. 222. P. 625628.

194. Weitzman S.A., Weitberg A.B., Clark E.P., Stossel T.P. Phagocytes as carcinogens: malignant transformation produced by human neutrophils. // Science.- 1985.- V. 227.-No. 4691.- P. 1231-1233.

195. Wenn J.S., Guille J., Gebicki J.M., Day R.O. Hydrogen peroxide modulation of the respiratory burst of human neutrophils. // Biochemical. Pharmacol. -1991.-V. 41. -P. 31-36.

196. Wheatley R.A., Sariahmetoglu M., Cakici I. Enhancement of luminol chemiluminescence by cysteine and glutathione. // Analyst.- 2000.- V. 125.- No. 11.-P. 1902-1904.

197. Winkler B.S., Orselli S.M., Rex T.S. The redox couple between glutathione and ascorbic acid: a chemical and physiological perspective. // Free Radical. Biol. Med.-1994.-V. 17.- P. 333-349.

198. Winterbourn C.C., Metodiewa D. The reactions of superoxide with reduced glutathione. //Arch. Biochem. Biophys.- 1994.- V. 314.- P. 284-290.

199. Winterbourn C.C., Metodiewa D. Reactivity of biologically important thiol compounds with superoxide and hydrogen peroxide. // Free Radical Biology & Medicine.-1999.- V. 27.- N. 3/4.-P. 322-328.

200. Wright C.E., Lin T.T., Lin Y.Y., Sturman J.A., Gaull G.E. Taurine scavenges oxidized chlorine in biological systems. // Prog. Clin. Biol. Res.- 1985.- V. 179.- P. 137-147.

201. Woronick C.L.,Maderazo E.G., Anthony M.N., Krause P.J., Shaafi R.I. Characterization of a direct effect of phorbol myristate acetate on human neutrophil cell membrane using 31D8 monoclonal antibody. // J. Leukoc. Biol.- 1992.- V. 51.- P. 289-295.

202. Zappacosta В., Mordente A., Persichilli S., Giardina В., De Sole P. Effect of homocysteine on polymorphonuclear leukocyte activity and luminol-dependent chemiluminescence. // Luminescence.- 2000,- V. 15.- No. 4.- P. 257-260.

203. Ziegler, D. M. Role of reversible oxidation-reduction of enzyme thiols-disulfides in metabolic regulation. // Annu. Rev. Biochem -1985 V. 54. - P. 305-329.

204. Zgliczynski J.M., Stelmaszynska Т., Ostrowski W., Naskalski J., Jzhaaja J. Chloramin as intermediates of oxidation reaction of aminoacid by myeloperoxidase./ / Biochem. Biophys. Acta.-1971.- V. 235- No. 2.- P. 419-424.

205. Zgliczynski J., Stelmaszynska Т., Ostrowiski W., Naskalski J., Sznajd J. Myeloperoxidase of human leukaemic leucocytes. Oxidation of amino acids in the presence of hydrogen peroxide. // Eur. J. Biochem. 1968.-V. 4 - P. 540-547.

206. Zgliczynski J., Olszowska E, Olszowski S, Stelmaszynska T, Kwasnowska E. A possible origin of chemiluminescence in phagocytosing neutrophils. Reaction between chloramines and H202. // Int. J. Biochem. -1985.-V.17.-No. 4,- P. 515-9.

207. Zhao R., Lind, J., Merenyi G., Eriksen Т. E. Kinetics of one-electron oxidation of thiols and hydrogen abstraction by thiyl radicals from a-amino C-H bonds. // J. Amer. Chem. Soc. 1999. - V. 116. - P.: 12010-12015.

Информация о работе
  • Белакина, Наталья Сергеевна
  • кандидата медицинских наук
  • Москва, 2004
  • ВАК 03.00.02
Диссертация
Усиленная люминолом хемилюминесценция стимулированных нейтрофилов: внутриклеточные и внеклеточные источники свечения, роль соединений с активным хлором - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Усиленная люминолом хемилюминесценция стимулированных нейтрофилов: внутриклеточные и внеклеточные источники свечения, роль соединений с активным хлором - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы