Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохемилюминесценция лейкоцитов крови сельскохозяйственных животных в оценке их функционального состояния

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Биохемилюминесценция лейкоцитов крови сельскохозяйственных животных в оценке их функционального состояния"

■ ■ ЛКННСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

РОССйЛСИИЛ ГОСЗ'ДЛРС'ГБЕННЫЛ вдщишйй УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

БАРАНОВ

Александр Валерьевич

БИ0ЖЖЮ..МНВСЦБН4/Ш ЛШЩлТОВ ЯРОЮ сельскохозяйственных ЗКВОЯШ Е ОЦВКНЕ Ж ФУНКЦЙШИЛЬШГО оостояния

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена на кафедре биофизики Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии им. К.И. Скрябина

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А.И. Куравлев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук O.A. Азизова кандидат биологических наук С..Л. Зубкова

Ведутдее учережцение - Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится "...." ......... 1992 г.

в ".,.." часов на заседании специализированного совета К.084.14.04 при Российском государственном медицинском университете гю адресу: II7869, г. Москва, ул. Островитянова, I.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета

Автореферат разослан "...," ......... 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

доцент й.В. Буромский

»ртгци.1 0БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из проявлений функциональной активности иммунокомпетентных клеток является их активация, представляющая собой линейную послецовательность определенных этапов, начиная от контакта клетки со стимулирующим агентом и, заканчивая комплексом биохимических процессов, получивших в литературе название " дыхательного взрыва " ( Howes K.M., Steele H.ü.» 197t; Babior, Г978; Johnston, 1978f i'/Jaual , T983 i Ерин A.H. и др., 1983; Ля-шенко В.А. и др., 1988 ).

Как известно, одним из результатов феномена " дыхательного взрыва " является хемилюминесценция клеток, возникающая при их стимуляции или воздействии на них ( Allen , 1972; De Ciiatelet , 1982; Andersen , 1979 ; Takestiig , 1987 ).

Именно с этим связано широкое применение хемилюминесцентного метода в медико - биологических исследованиях для изучения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, и, в частности, мо-нонуклеаров ( Земсков В.М. и др., 1983; Коркина Д.Г., Величковский Б.Т., 1989; Маянский А.Н. и др., 1989; Владимиров Ю.А., Шарстнев Я.П., 1989 ).

Несмотря на значительное количество работ, посвященных изучению явления хемилюминесценции при активации мононуклеаров крови многие аспекты данного явления окончательно не выяснены.

Во многом это определяется тем, что в большинстве предыдущих исследований функциональная активность стимулированных мононуклеаров рассматривалась как отдельно взятый критерий, оторванный от патологического процесса ( Астафьев Д.Г. и др., 1989; Семенкова Г.Н. и др., 1990 ). Работ, рассматривающих функциональную активность мононуклеаров крови вместе с изменениями происходящими в иммунной системе, например, при приобретенных иммунодефицигах, что могло бы

служить адекватной моделью для изучения цигофизических закономерностей активации мононуклеаров, в доступной нам литературе обнаружено недостаточно С Gandido et el., 198J ; Коркина Л.Г. и цр., 1985 ).

В связи с этим актуальными представляются исследования функциональной активности стимулированных мононуклеаров гтпри^рической крови проведенные как на модельной системе, так и в реальных условиях, отражающих изменения функционального состояния клеток, в" частности, при поражении животных онковирусной инфекцией.

Цель работы.Исследование кинетики и механизма генерации активных форм кислорода мононуклеарами крови животных и выявление основных факторов определяющих взаимосвязь хемилюминесценции клеток с их функциональной активностью в процессе стимуляции.

Исходя из этого определены следующие задачи исследования:

1. Оценить чувствительность и рабочие характеристики кафедрального люминометра; провести сравнение с зарубежными и отечественными аналогами.

2. Определить интенсивность спонтанной, собственной и активированной хемилюминесценции лимфоцитов и моноцитов крови сельскохозяйственных и лабораторных животных. Провести анализ влияния на интенсив ность хемилюминесценции процедуры подготовки клеточных суспензий

к исследованию, возрастных и индивидуальных особенностей животных.

3. Изучить особенности механизма генерации активных форм кислорода мононуклеарами крови сельскохозяйственных животных.

4. Исследовать характер взаимосвязи хемилюминесценции клеток с их функциональной активностью.

Научная новизна. Благодаря использованию экспериментальной установки зафиксирована спонтанная хемилюминесценция мононуклеаров кро-

ви сельскохозяйственных животных.Показана связь мечду сверхслабым свечением сыворотки крови и активированной ХЛ мононуклеаров, стимулированных ФГА ( фитогемагглютинином ).Проведено сравнение хемилюминесценции клеток трех видов животных - коров, крыс и баранов. Получены данные о генерации активных форм кислорода моно-нуклеарами, выделенными из крови здоровых и инфицированных онковирусом коров.Уточнены механизмы собственной и активированной ХЛ моноцитов и лимфоцитов.Интенсивность свечения клеток как спонтанного, так и стимулированного определена количественно и выражена в абсолютных единицах ( квант/(с 4^П).

Теоретическая и практическая значимость работы. Измерение спонтанного свечения клеток дает нам возможность пользоваться следующей классификацией рассмотренных типов хемилгаминесценций:

1. Спонтанная ХЛ - свечение клеток при отсутствии в системе индукторов ( стимуляторов ) дыхательного взрыва типа зимозан, латекс, лектины и т.д., и активаторов типа люминол, люцигенин.

2. Собственная ХЛ - свечение клеток при введении в систему индукторов дыхательного взрыва.

3. Активированная ХЛ - свечение клеток при введении в систему активаторов типа люминол и др., без каких-либо дальнейших воздействий на систему.

4. Активированная стимулированная ХЛ - свечение клеток при введении в систему как индуктора, так и активатора.

Кроме того, полученные данные позволяют расширить представление о механизме хемилюминесценции мононуклеаров крови животных. Наиболее вероятно, что хемилюминесценция мононуклеаров отражает функциональную активность клеток, в частности, активность каскада мембранных ферментов, связанных с рецепторным аппаратом клеток. Обобщение результатов работы дает возможность более полно

уяснить роль кислородных радикалов в системе межклеточной кооперации.

Методы диссертационной работы решением Ученого совета биологического факультета МВА включены в методические указания для студентов биологического факультета "Методы регистрации свобод-нэрадикального окисления липидов в сыворотке, плазме и мембранах клеток кропи", раздел II, ГЛ. 2.2., МБА, 1989; внедрены в практику учебного процесса на кафедре биофизики и физики..Латериалы диссертационной работы используются при чтении лекций по теме: " Киангорап биология " на кафедре биофизики и физики МВА.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на заседании Московского общества испытателей природы ( 1988 г., г. Москва ), на Всесоюзной научной конференции " Актуальные проблемы ветеринарной и зоотехнической науки в интенсификации животноводства " ( 1989 г., г. Москва ), на Всесоюзной школе - семинаре " Био - термо - хемилюминесценция " ( 1990 г., г. Суздаль ).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.Работа изложена на 104 страницах машинописного текста, включавт 18 рисунков, 9 таблиц и список литературы из 141 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовались белые крысы породы Вистар, а также коровы черно-пестрой породы в возрасте 4; - 7 лет к бараны романовской породы и возрасте 2-3 лет. '

В соответствии с тделью исследования коровы были разбиты на две группы:

1. Здоровые по клиническим признакам, с отрицательным результатом серологического анализа

2. Инфицированные вирусом лейкоза, что оценивалось на основами:? тайных клинических и серологических исследований.

А1атериалом исследования служили мононуклеары, выделенные из периферической крови коров, крыс и баранов на градиенте плотности, а также сыворотка и плазма крови.

Исследования проводили на экспериментальном хемилюмиюметре, собранном из стандартных блоков.

Мононуклеары из крови животных выделяли по модифицированному методу Воут ( 1968 ), реакцию иммунодиффузии проводили по методике Бурбы Л.Г. ( 1983 ); подготовку суспензии лимфоциты/моноциты и регистрацию активированной ХЛ проводили по методике Чуча-лина А.Г., Коркиной Л.Г. и др. ( 1987 ); измерение спонтанного сверхслабого свечения сыворотки крови и спонтанной ХЛ клеточной взвеси осуществляли по методике Гарусова Б.Н. и др. ( 1961 ), Макарова С.Н. ( 1979 ); регистрацию инициированной перекисью водорода хемилюминесценции по методу Попова A.A., Тарусова Б.Н. ( 1965 ), Серкиза Я.И. и др. ( 1984 ).

применением стандартного пакета статистических программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТОВ Биохемилюминесценция мононуклеаров крови сельскохозяйственных животных и ее механизм В процессе исследований мы.рассматривали несколько типов хешлто-

Полученные данные обрабатывались на компьютере IBM

- б -

минесценций изучаемой суспензии клеток:

1. Спонтанную ХЛ - свечение клеток, отражающее исходное состояние метаболических процессов в клетке, в частности, ПОЛ мембран.

2. Активированную ХЛ - свечение клеток при введении в систему активатора, но в отсутствие каких-либо индукторов, что давало возможность учитывать влияние люминола на окислительный метаболизм клеток.

3. Собственную ХЛ - свечение клеток при введении в систему индукторов дыхательного взрыва, но в отсутствие активаторов, что позволяло оценить взаимодействие индуктора с рецелторным аппаратом клеток и активность мембранных ферментов.

4. Активированную стимулированную ХЛ - свечение клеток при введении в систему как активатора, так и индуктора, таким образом, оценивали не только вне - , но и внутриклеточные процессы ХЛ.

Анализ уровня спонтанного свечения суспензии мононуклеаров здоровых коров показал, что среднее значение интенсивности ХЛ составляет ( 1,04 ~ 0,09 ) х 10^ квант/(с 4lf), при диапазоне колебаний ( 0,5 + 2 ) х Ю3 кванг/( с Распределение относительных частот по уровням свечения характеризуется наличием основного

максимума, совпадающего в пределах доверительного интервала со

i

значением математического ожидания уровня свечения ыононуклеарной суспензии крови коров данной группы, j

Среднее значение активированной люминолом ХЛ мононуклеаров здоровых коров составило ( 5,46 - 0,74 ) х 10^ квант/(с

4 f), при

диапазоне колебаний 10^-f 10^ кванг/(С|4^).Увеличение интенсивности ХЛ срллаио о процессами внутриклеточного окисления люминола. Интересно, что если спонтанная ХЛ практически не отражает ви-

цовые особенности клеток, то введение в систему лшинола приводит к увеличению интенсивности активированной ХЛ в ряду: бараны - крысы - коровы ( табл. 2 ).

Таблица 2

Видовые особенности хемилюминесценции мононуклеаров животньн, х 10^ квант/{ е 41/").

Виды тавотных

корова

крыса

баран

Число исследований

18 20 8

Спонтанная ХЛ

0,104±0,009 О,106-0,018 0,01

Активированная люминолом ХЛ

¿,46 ± 0,74 1,21 ± 0,19 0,93 ± 0,01

изменения показателей достоверны ( р <1 0,05 ) Также, для группы здоровых коров установлено среднее значение уровня собственной ХЛ - ( 3,22 - 0,71 ) х 10^ квант/(с 47Г), при диапазоне колебаний - ( 1,08 т 6,07 ) х 10^ квант/(с 4*Г). Анализ распределения уровней относительных частот свечения в этой группе животных характеризуется пологим плечом в области ( 2,5 -г 4,5 ) х 10^ квантДс 41Г) ( рис. I ).Интенсивность свечения возрастала в ряду: бараны - крысы - коровы.Интерес вызывает то, что интенсивность собственного свечения моноцитарно-лимфоцитарной взвеси крови коров ниже, чем интенсивность активированной люминолом ХЛ этой же взвеси.Вероятно, это вызвано тем, что при изучении собственной ХЛ суспензии клеток в качество индуктора использовали фитогемагглю-танин ( ФГА ), являющийся мембраноакгивным агентом, в то время как люминол мог проникать в фагосомы моноцитов и участвовать в

Ъ 1 Ч Ь 65

Урк/*«. 1000 Л/с

5 15 25 Л5 45 55 УрсЫч, сЫчйжк »0000 Л/с

Рис. I. Распределение относительных частот собственного ( а ) и активированного ( б ) свечения мононуклеаров крови коров

в окислительных процессах внутри клеток.

Интенсивность активированной стимулированной ХЛ для группы здоровых коров при введении в систему зимоэана составляла - ( 2,0о ± 0,16 ) х Юб квант/(с ЦТ).Анализ распределения уровней относительных частот свечения характеризуется максимумом в области (I, + 2,о ) х 10б квантДс ( рис. I ).Кроме того, интенсивность активированной стимулированной ХЛ при введении в клеточную систему различных стимуляторов отражает видовые особенности клеток и возрастает в ряду: бараны - коровы - крысы ( табл. 3 ).

Хемилюминесцетдоя, вызванная эимозаном практически на порядок больше, чем ХЛ, вызванная ФГА ( р < 0,05 ), что связано с фагоцитированием зимозана моноцитами и генерированием активных форм кислорода внутри клеток.Интерес вызывает изменение видового ряда возрастания интенсивности ХЛ, что, возможно, связано с содержанием примеси грлнудоцитов в выделенной фракции лимфоциты/моноциты из «IVни крыс.

Таблица 3

Видовые особенности активированной ХЛ мононуклеаров крови при введении различных индукторов, х 10^ квант/(с 4if).

Виды животных Количество Зимозач PFA

исследований ( 10 мкг/мл ) ( 3,5 мкг/мл )

корова 18 2,05 - 0,18 0,17 ± 0,03

крыса 20 6,71 ± 0,32 0,33 - 0,01

баран 8 1,69 ± 0,09

р<<0,03

Для изучения особенностей механизма генерации активных форм кислорода мононуклеарной взвесью исследовали влияние ингибиторов, блокирующих различные АФК и ферменты: аснорбат ингибирует супероксид - анион ( 0г ) ( Ghesoü , 1975; Kraut , туво ; Владимиров ¿O.A., iüepcTHSB i.Ilr, 1989 ), маннит - гидроксильный радикал ( WO- ) ( Bors , 1986; Владимиров JO.А., 1987 ), гидрохинон к гис-тицин - синглетный кислород ( Ог ) ( ctorey et al.» 1987; Владимиров jO.A. , Шерстнев Л.П., 1989 ), таурин - гипохлорит ( ) ( Welch , 1987; Gyllennammar , 1987; Владимиров Ю.А., Шерстнев ш.П., 1989 ), азид натрия - гемсодертацие ферменты, включая мйело-пероксидаэу и каталазу ( Бахов Н.К. и др., 1987; Glasburg , 1987 ).

Как видно из рис. 2., при добавлении к суспензии клеток вместе с зимозаном 10 мМ аскорбага, который предположительно выполняет роль перехватчика 0г f интенсивность собственной ХЛ не только не уменьшилась по сравнению с контролем, но и увели-

чилась на 30 + Зо Б то время как ингибирование активированной ХЛ клеток, стимулированных зимозаном было почти 100 %.

Получение таких результатов, на наш взгляд, связано с тем, что аскорбат предотвращает связывание активных форм кислорода с люминолом и, таким образом, предотвращает его превращение в аминофталат, который, как известно, нестабилен и спонтанно ре-лаксирует в исходное состояние, что сопровождается ХЛ. Таким образом, аскорбат является специфическим перехватчиком АФК, выполняющим свои антирадикальные функции только в присутствии лв-шнола.

Тем неменее, даже учитывал полученные данные, приходится констатировать, что при стимуляции мононуклеаров зимозаном образуются практически все активные формы кислорода: Ог / Н0'}

г

НгОг , Ог , которые в той или иной степени принимают участие в генерации люминолзавискмой хемилюминесценции.

В наших исследованиях маннит, являющийся перехватчиком гид-роксильного радикала ( НО* )> введенный в систему вместе с зимозаном, в концентрации I мМ, крайне незначительно ингибиро-вал собственную хемилюминесценцию мононуклеарной взвеси, выделенной из периферической крови животных. При исследовании активированной хемилюминесценции лимфоцитов и моноцитов крови, стимулированных зимозаном в присутствии маннига ( I мУ ), интенсивность хемилюмикесцентного ответа снижалась на 70 + 75 %.

Исходя из полученных результатов 'необходимо подчеркнуть, что по всей видимости, гидроксильный*радикал ( ) не иг-

I I

3

о-£ ь

•л

3 X

се

3 t-

8 s

•/• 'VX гмпшяпш

'A ÏX шшть

рает существенной роли в собственной XI лимфоцитарно - коноцитарной суспензии клеток,выделенной из крови коров.

Гидрохинон,являющийся тушителем синглетного кислорода с 0г ), в концентрации I мкЛ1 ингкбировал собственную ХЛ клеточной суспензии на 90 * 95 % и увеличивал интенсивность активированной ХЛ стимулированных зимозаном клеток на 40 -г 45 $.Это свидетельствует о

том,что гидрохинон скорее всего перехватывает п- :с ......у-

лы промежуточных продуктов ПОЛ мембран, которые вносят значительный вклад в собственную ХЛ. Гистидин, предположительно являющийся перехватчиком 03 в концентрации 10 м/1 в наших экспериментах снижал на 80 85 /о интенсивность собственной ХЛ, и на 50 * 55 % интенсивность активированной стимулированной ХЛ лимф^циташо-моно-

9

цитарноц взеси.Б качество индуктора дыхательного взрыва клеток в обоих случаях использовали зимозан.Полученные результаты позволяют говорить о существенной роли синглетного кислорода в собственной ХЛ.

В наших опытах ингибитор миелопероксидлзы ( «1П0 ) азид натрия в концентрации I м.Л тупил собственную ХЛ ко но ну ¡еле арной суспензии клеток крови коров и крыс практически полностью, и сникал интенсивность активированной ХЛ стимулированных зимозаном теле к к на ¿0 -г 60 %.Добавление таурина, соединения инактивирующего

его- в концентрации 10 мМ снижало интенсивность собственной ХЛ на 40 4а % и активированной ХЛ стимулированных зимозаном ( 10 мг/мл ) клеток на 65 * 75 %.

Таким образом, реакции с участием МП0 ответственны за значительную часть суммарной интенсивности собственной ХЛ лимфоцитарно -моноцитарной суспензии клеток выделенной из крови коров, и механизм активированной стимулированной ХЛ клеток тоже во многом определяется реакциями катализируемыми миелопероксидазой.

Исследование хемплпминесценции мононуклеаоных клеток здоровых и инфицированных вирусом лейкоза животных

5 постановке эксперимента мы исходили из того,что функциональная активность клеток находится в прямой зависимости от состояния организма или иммунной системы.Поэтому в качестве опытных были выбраны коровы, сыворотка крови которых давала выраженной положительный результат реакциии иммуноциЭДузии.Такие животные считаются инфицированными вирусом лейкоза крупного рогатого скота, и отличаются от нормальных резким снижением иммунного статуса организма.

Для этой группы ксров зарегистрировано среднее значение спонтанной ХЛ - ( 0,011 - 0,0012 ) х 10 квант/(с активированной -< 0,26 ± 0,05 ) х 10 квант/(с 4-гГ); собственной - ( О, II ~ 0,02 )

х 10 кванг/(с 410; активированной ХЛ стимулированных клеток -5

( 0,19 ¿ 0,06 ) х 10 квант/(с 4тГ).Анализируя соотношение интенсив ностей ХЛ'в экспериментальных группах животных отмечаем, что спонтанная ХЛ суспензии клеток здоровых и больных животных почти одинаковы; значения активированной различаются в 2 раза; собственной в 3 и активированной ХЛ стимулированных клеток более чем в 10 раз ( табл. 4 ).

Таблица 4

Интенсивность хемилюминесцеиции мононукл^аров крови здоровых и инфицированных животных, х 10 квант/(с 4<5Г)

Улвотные Число Спонтанная Собственная Актив. Активир.

исследований ХЛ ХЛ ХЛ стимулир.

ХЛ

здоровые 18 0,01*0,009 0,32*0,07 0,55*0,07 1,69*0,25

инфицированные

вирусом лейкоза 18 0,01^0,001 0,11*0,02 0,26*0,05 0,19*0,06

р-^0,05 - различия между группами достоверны

Вместе с тем, для суспензии клеток данной группы животных хароктп: но увеличение интенсивности ХЛ в ряду: спонтанная * собственная * ■г активированная стимулированная -е- активированная.

Таким образом, снижение генерации АФК моноцитами и лимфоцитами, а следовательно и их функциональной активности - признак, характеризующий состояние иммунной системы инфицированных вирусом лейкоза животных.

Взаимосвязь хемилюминесценции клеток я спонтанного сверхслабого свечения енворогки крови здоровых и инфицированных вирусом лейкоза животных

Для группы инфицированных коров установлено среднее значение

2

интенсивности ХЛ сыворотки крови - ( 4,37 - 0,71 ) х 10 квант/(С 4 <) .Свечение было длительным, непрерывным и характеризовалось одним максимумом.С увеличением температуры сыворотки крови интенскв-

0 " 4 + а

ноегь ХЛ возрастала и пои 54 С достирана - ( 10,8 I 1,76 ) х 10 квант/Сс 4 "ЭГ").

Соотношение интенсивно стей сверхслабого свечения сыворотки крови здоровых и инфицированных вирусом лейкоза животных показывает, что ХЛ сыворотки крови контрольных коров выше, чем инфицированных ( табл. 5 ).

Таблица 5

Зависимость спонтанной хемилюминесцонции сыворотки крови животных от температуры, х 10 кванг/(с

Животные Количество 37°С 45°С 54"с исследований

здоровые 18 6,4 ±1,44 10,0*2,14 17,1±2,9 инфицированные

вирусом лейкоза 18 4,37±0,71 5,57+1,63 Ю,8±1,7

р<10,01

Во всех случаях наличие лейкозного процесса сопровождалось однотипным изменением интенсивности ХЛ - ее снижением.Очевидно, более низкий уровень свечения сыворотки крови лейкозных коров обусловлен снижением интенсивности ПОЛ, что аналогично ранее полученным результатам при развитии злокачественных опухолей у человека .и лабораторных животньх ( Куравлев,Тарусов.Есакова,1963; Иванов, Тарусов,1970; Еурлакова и др.,1975 ).Снижение скорости ПОЛ, по всей видимости, означает уменьшение концентрации вторичных продуктов лероксидации липидов сыворотки крови, в частности,гидроперекисей, предположительно ^грающих роль предстимуляторов мононуклеаров ( Клебанов, 1988 ).

Таким образом, снижение интенсивности ХЛ сыворотки крови должно на наш'взгляд, сопровождаться падением интенсивности ХЛ суспензии лимфоциты-моноциты.Это хорошо подтверждает опыт проведенный на 20 контрольных и инфицированных животных.В каждой группе рассматоива-

I

лась зависимость интенсивности ХЛ суспензии лимфоцитов и монопигов от уровня свечения сыворотки крови.Оказалось, что снижение уровня ХЛ мононуклеаров сопровождается падением интенсивности сверхслабого свечения сыворотки крови.Для контрольных животных коэффициент корреляции составил 1 = 0,7,' для инфицировнных ^ = 0,92.Полученные коэффициенты демонстрируют достаточно большие внутригрупповые взаимосвязи интенсивности X"1 клеток и уровня свечения сыворотки крови коров.Чтобы получить представление об общей картине зависимости данные двух изучаемых групп свели воедино ( рис.-^ ).

Построенный график четко отражает взаимосвязь между свечением взвеси клеток и сыворотки крови: чем меньше уровень свечения сыворотки крови животного, тем меньше интенсивность ХЛ мононуклеаров ( % * 0,0 ),Проявилась и качественная сторона взаимной связи: более низкие показатели уровня свечения сыворотки крови и суспен-

интенсивность спонтанного свечения сыворотки крови, х 10 (квант/Сс4«ЗТ^ ]

Рис.3 . Зависимость интенсивности активированной хемилюми-несценции стимулированных ФГА ( 3,5 мг/мл ) мпно-нуклеаров от уровня спонтанного свечения-сыворотки крови ( ▼ - здоровые; • - лейкозчые животные ).

зж клеток крови приходятся на долю коров, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Конечно, было бы неправомерно утверждать, что практически всегда уменьшение уровня ХЛ мононуклеаров сопровождается снижением интенсивности свечения сыворотки крови, тем неменее высокая степень связи между этими показателями в группе здоровых животных позволяет предположить универсальность этой зависимости.

Исследование инициированной Не0г хемилюминесценции плазмы крови животных

Проведенные исследования показали, что кинетические кривые, от-

рожающие параметры ХЛ плазмы крови, как у больных, так и у здоровых коров качественно не различаются.Однако, имеются значительные количественные различия.Так, амплитуда начальной вспышки ( )

у здоровых ксров больше, чем у инфицированных, а светосумма реакции за 5 мин. Xi,) у опытных животных почти в 2 раза ниже, чем в контроле.Амплитуда"конечной вспышки ( Тг ) в обеих группах животных практически совпадала ( табл. б ).

Таблица 6

Параметры инициированной № хешлюминесценции плазмы крови коров, х 10 ( кванг/(с A'f ))

Животные Количество Амплитуда Амплитуда Амплитуда

исследований начальной вспышки конечной спетосу1я/и ( 1х ) вспышки за 5 мин.

(Ja ) <£]>)

здоровые 18 10,77*0,68 0,24^0,18 2,57*0,16

инфицированные випусом

лейкоза 18 6*00^ 0,63 0,24±0,0ô 1,?б±0,25

Так как ИгОг разлагается в реакции Фентона с образованием гид-роксильного радикала ( НО' ), который взаимодействует с липидами и запускает процессы ПОЛ, то величина ХЛ плазмы крови прямо пропорциональна степени резистентности липидов к окислению и обратно пропорциональна активности антиоксидантов в исследуемых пробах.

Таким образом, липи.ды плазмы крови инфицированных вирусом лейкоза животных менее подвержены процессу перекисного окисления.

Все это подчеркивает возможность того, что интенсивность ХЛ моно-нуклеаров, а значит и генерация ими активных форм кислорода находится и тесной сшш с интенсивностью процессоо ПОЛ протекающих в сыворотке и плазме крови.

ВЫЕС'ДН

1. Показано наличие спонтанной, собственной и активированной хе-шшоыинссценции мононуклеаров, выделенных из крови крупного рогатого скота.

2. Показано, что срецтшй уровень: I) спонтанной хемилюминсспении'

мононуклеагов,выделенных на гтациенте плотности <Тч:чотя-пою•• т

~ 6

из крови зцпровык норов ( с = 10 /мл ) при pH = '',4 и температуре 37 °С составляет - ( 1,04 ± 0Р98 ) х Ю3 квант/(с 4if); 2) собственной хемилтмнесценцхи мононуклва.ров при использовании в качестве индуктора ФГА ( 3,5 мг/мл ) - ( 0,32 - 0,07 ) х 10° квант/ (с 4*if); 3) активированной хешлюшне спенции мононуклеаров, стимулированных ФГА ( 3,5 мг/мл ), концентрация люшнола 0,6 шМ, -( 1,68 ± 0,25 ) х Юб квант/(с

J. Установлено трехкратное уменьшение собственной и десятикратно активированной хемилюкинеспешлии стимулировянной ФГА ( о, 5 мг/кл

с

взвеси мононуклеаров, вып,сленной из крови коров ( с = 10 /мл ), инфицированных вирусом лейкоза, по сравнению с уровнем свечения мононуклеаров контрольных животных.

4. Показано снижение интенсивности спонтанной хемилюминесценции сыворотки крови ( V = 2 мл;Т = ¿7 С ) у инфицированных вирусом лейкоза коров.

5. Обнаружено, что снижение интенсивности активированной хемилюминесценции стимулированных &ГА ( 3,5 мг/мл ) мононуклеаров, полу ценных из крови лейкозных животных, как правило, сопровождается падением уровня сверхслабого свечения сыворотки крови этих животных ( V = 2 мл; I = 37°С ).

6. Показано, что собственная хемилюминесценцяя стимулированных

зимозаном ( 10 мг/мл ) мононуклеаров периферической крови животных в большой степени обусловлена миелопероксидазной реакцией. У. Отмечено, что при активированной хсмилютпссцстми стимулировании х зимозаном ( 10 кг/мл ) мононуклеаров периферической крови животных образуются практически все вицы активных форм кислорода. 8. Б эксперимента:: обнаружены различия в интенсивности инцуциро-..■•¡..¡г неппкстпн г- ;,проца хемилюшнесценции плазмы крови здоровых и инфицированных вирусом лейкоза коров.

Список Работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Журавлев А.И., Мяльдзин А.Р., Баранов A.B. Методы регистрации свободнорадикального окисления липидов в сыворотке, плазме и мембранах клеток крпвн. // Методические указания, i., MBA. - 1989. -с. 9 - 12.

2.Макаров С.Н., Баранов A.B. Хемилюшнесцентные критерии фагоцитирующих и иммунологически активных клеток крови. // Тезисы докладов Всесоюзной конференции " Актуальные проблею ветеринарной и зоотехнической науки в интенсификации животноводства". М., MBA. - 1990.

- с. 49 - 50.

3. Баранов A.B. Биохемилюминесценция лимфоцитов коров при стимуляции опсонизированным зимозаном. // Проблемы ветеринарной биологии. Сб. науч. тр., MBA. М., 1990. - с. 52 - 53.

4. Баранов A.B. Соотношение интенсивностей спонтанной и индуцированной люминолзависимой биохемилюминесценции лейкоцитов. // Тезисы докладов Всесоюзной школы - семинара " Био - термо - хемилюминес-ценция". М., ПИК ВИНИТИ. - 1990. - с. 69.

ТиР- SS" иниитэи-кшмаш