Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адаптогенные эффекты хитозана и нанокомплекса "хитозан-золото" в условиях моделирования лучевого поражения и гипоксии на систему крови крыс

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Адаптогенные эффекты хитозана и нанокомплекса "хитозан-золото" в условиях моделирования лучевого поражения и гипоксии на систему крови крыс"

На правах рукописи

РЕЧКИНА ОКСАНА ЮРЬЕВНА

АДАПТОГЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ХИТОЗАНА И НАНОКОМПЛЕКСА «ХИТОЗАН-ЗОЛОТО» В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЛУЧЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ И ГИПОКСИИ НА СИСТЕМУ КРОВИ КРЫС

03.03.01- физиология 03.01.04-биохимия

- 1 НОЯ 2012

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород 2012

005054134

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии человека и животных и на кафедре высокомолекулярных соединений и коллоидной химии химического факультета Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Корягин Александр Сергеевич доктор химических наук, профессор Смирнова Лариса Александровна

доктор биологических наук, профессор Моничев Александр Яковлевич доктор биологических наук Япш Валерий Васильевич

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО "Нижегородская государственная медицинская академия" Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится: « /--Г. У/, » 2012г в часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 при Нижегородском государственном университете им. Н. И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ННГУ

Автореферат разослан« УС- » 2012г.

Автореферат размещен на сайте ВАК РФ « Л.& , ¿'Я » 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

доцент, кандидат биол. наук Копылова С.В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Среди экстремальных факторов детерминирующих стрессорные состояния организма человека и животных в настоящее время особо привлекают внимание ионизирующее излучение и дефицит кислорода. В этом свете актуальной является разработка новых эффективных адаптогенов с полифункциональными свойствами, обеспечивающих резистентность организма к действию радиации, гипоксии и других неблагоприятных факторов среды. Классические радиопротекторы и антигипоксанты обычно имеют кратковременное действие и выраженные побочные эффекты. В связи с этим перспективным представляется создание биопрепаратов на основе природных биологически активных веществ.

Активация процессов свободно-радикального окисления — обязательное звено в механизме действия радиации, гипоксии и других экстремальных факторов поэтому использование веществ, способных противостоять активации свободно-радикальных процессов является необходимым условием профилактики и лечения стрессорных поражений (Барабой и др., 2006). Несомненный интерес в этом направлении исследований представляет биополимер хитозан и его комплексы с другими физиологически активными веществами —антиоксидантами, иммуномодуляторами, зоотоксинами, антигипоксантамн.

Хитозан - продукт деацетшшрования полисахарида хитина. Интерес к нему связан с уникальными физиологическими и экологическими свойствами, такими как биосовместимость, биодеструкция, физиологическая активность при отсутствии токсичности, доступность сырьевых источников. Хитозан способен выполнять функции иммуномодулятора, носителя лекарственных средств, проникать в межклеточное вещество (Скрябин и др., 2002; Ravi Kumar et ai„ 2004). Известно, что золото - индифферентный нетоксичный металл, не оказывает повреждающего действия на структуру компонентов клеток. Наночастицы золота способны проникать в кровь при пероральном применении и оказывать антиоксидантное действие (Якимович и др., 2006). Можно полагать что антиоксидантные свойства нанокомгшекса «хитозан-золото» будут выше, чем у каждого компонента в отдельности.

Система крови является интегративной системой, наиболее полно отражающей состояние и характер метаболизма всего организма. Она играет решающую роль в развитии специфических и неспецифических реакций защиты организма. Кровь легко доступна для динамического и комплексного анализа. В качестве основных индикаторных показателей типа адаптационных реакций используют лейкоцитарную формулу и лейкоцитарный коэффициент (отношение между процентным содержанием лимфоцитов и сегментоядерных неитрофилов). Данные параметры гомеостаза крови достаточно полно отражают состояние важнейших физиологических систем и используются в качестве критериев адаптационных реакции организма (Васильев и др., 1992; Гаркави и др., 1998).

В настоящее время имеются лишь немногочисленные исследования, посвященные изучению адаптогенных эффектов многокомпонентной наноструктурированной системы «хитозан-золото-пчелиный яд» в условиях действия экстремальных факторов среды (Корягин и др., 2006; Коновалова, 2009; Таламанова, 2010). Вместе с тем сравнительного изучения адаптогенных свойств составляющих наноюомплекса (за исключением пчелиного яда) на систему крови экспериментальных животных в условиях действия повреждающих факторов среды не проводилось, что предполагает актуальность этой проблемы.

Цель исследования

Анализ адаптогенных эффектов хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» в условиях гамма-облучения и гипобарической гипоксии, оцениваемого по показателям системы крови крыс.

Задачи исследования

1 Изучение влияния растворов хитозана с разной молекулярной массой при курсовом пероральном применении на фоне предварительного однократного гамма-облучения экспериментальных животных в дозе 3 Гр на количество лейкощггов, лейкоцитарную формулу, величину лейкоцитарного коэффициента, количество клеток костного мозга, содержание продуктов перекисного окисления липидов и показатели биохемилюминесценции для выявления еш формы с наиболее выраженной физиологическои

активностью. ____

2 Изучить радиопротекгорную эффективность хитозана и нанокомплекса «хитозан-

золото» при курсовом пероральном применении перед однократным гамма-облучением лабораторных животных в дозе 5 Гр, оцениваемую по показателям периферической крови, красного костного мозга и активности свободно-радикальных процессов.

3 Исследовать адаптогенные эффекты хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» на систему' крови при курсовом пероральном введении после однократного гамма-облучения

экспериментальных животных в дозе 5 Гр.

4 Изучить антигипоксические свойства хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» при предварительном курсовом пероральном применении в условиях моделирования гипобарической гипоксии, оцениваемых по показателям системы крови, интенсивности свободно-радикальных процессов и активности лактатдегидрогеназы.

Научная новнзна исследования

Впервые показано, что профилактическое пероральное введение хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» перед однократным гамма-облучением лабораторных животных приводит к развитию состояния радиорезистентности системы крови.

Впервые установлено, что пероральное применение хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» на фоне предварительного повреждающего действия гамма-облучения оказывает адаптогенное действие, переводя организм из состояния стресса в состояние

близкое к норме. „„„„„„„

Впервые выявлено, что предварительное пероральное курсовое введение

лабораторным животным хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» в условиях гипобарической гипоксии, сопровождается снижением интенсивности процессов перекисного окисления липидов, нормализацией активности одного из ключевых ферментов энергетического обмена - лактатдегидрогеназы.

Установленные адаптогенные эффекты нанокомплекса «хитозан-золото» выражены более значимо по сравнению с хитозаном как при действии радиации, так и гипоксии.

Научно-практическая значимость

Полученные результаты расширяют представления о физиологических и биохимических механизмах адаптации в условиях действия радиации и гипоксии при применении биологически активных веществ. Выявленные адаптогенные свойства хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» в условиях моделирования лучевой болезни и гипобарической гипоксии дополняют знания о молекулярных механизмах ответа организма на возникающий окислительный стресс. Обнаруженные радиопротекторные и антигипоксические эффекты хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» открывают перспективу их применения с целью создания многокомпонентных систем с другими физиологически-активными веществами как полифункциональных адаптогенов.

Основные положения, выноснмые на защиту

1 Профилактическое пероральное применение хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» перед однократным гамма-облучением лабораторных животных в дозе 5 Гр снижает повреждающее действие радиации на систему крови.

2. Курсовое пероральное применение хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото»

экспериментальным животным после однократного гамма-облучения в дозе 5 Гр оказывает положительный адаптогенный эффект, переводя организм из состояния стресса в состояние устойчивой активации.

3. Профилактическое курсовое пероральное применение хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» повышает устойчивость системы крови животных к гипобарической гипоксии, снижая интенсивность процессов ПОЛ, уменьшая активность лактатдегидрогеназы.

4. Адаптогенные эффекты нанокомплекса «хитозан-золото» в условиях действия неблагоприятных факторов среды выражены более явно по сравнению с хитозаном.

Апробация работы

Результаты работы были доложены и обсуждены на XVI и XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009, 2011); на 14 и 15 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010, 2011); European polymer congress (Gras, Austria,

2009); на III Всероссийском, с международным участием, конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010); на X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2011); на VI российской конференции с международным участием «гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2011); на III научно-практическом симпозиуме «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград,

2010); на XVI Международной экологической студенческой конференции "Экология России и сопредельных территорий" (Новосибирск, 2011).

По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 — в изданиях, рекомендованных ВАК. (I работа принята к печати в журнале из перечня ВАК «Перспективные материалы»).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа в объеме /^страниц содержит главы: обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы' Диссертация иллюстрирована SO таблицами, с/ рисунками.

Библиографические указания включают ¿C) литературных источника

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа была проведена на 126 нелинейных крысах самцах массой 200 - 250 г, выращенных в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде, а также' естественном чередовании суточной освещенности.

Было проведено 4 серии экспериментов в опытах in vivo. Общее распределение животных по сериям представлено в табл.1. Задачей первой серии экспериментов было исследование адаптогенных свойств хитозана с различной молекулярной массой и его олигомера при курсовом пероральном введении на фоне предварительного гамма-облучения с целью выбора наиболее эффективной формы хитозана. Животные подвергались общему однократному гамма-облучению в дозе 3,0 Гр (мощность облучения - 1 Гр/мин), вызывающему костномозговую форму лучевой болезни легкой степени тяжести (Ярмоненко,' Вайнсон, 2007). В течение 7 дней животным вводили растворы высокомолекулярного хитозана в дозе 100 мг/кг с молекулярной массой 130 кДа, 230 кДа, смесь (4 кДа + 130 кДа) и его олигомера (4 кДа), предоставленные кафедрой высокомолекулярных соединений и коллоидной химии химического факультета ННГУ им. Н. И. Лобачевского. Хитозан в исследуемых растворах вводили крысам в количестве 1 мл перорально с помощью зонда периодичностью 1 раз в сутки, первый раз - через 2 часа после облучения. Кровь для анализа забирали из подъязычной вены на 1-е, 14 и 28-е сутки после окончания введения препаратов, что соответствовало 8, 21 и 35 суткам после облучения. Выбор этапов забора крови был

обусловлен тем, что эти периоды характеризуются типичными для системы крови реакциями на курсовое введение адаптогенов (Горизонтов и др., 1983; Гаркави и др., 2003). В крови определяли количество лейкоцитов, а также индикаторные показатели: количество сегментоядерных нейтрофилов, количество лимфоцитов и значение лейкоцитарного коэффициента (отношение процента лимфоцитов к относительному содержанию сегментоядерных нейтрофилов), значение которого снижается при стрессе и увеличивается при устойчивой активации (Гаркави и др., 1998), содержание продуктов ПОЛ и интенсивность процессов СРО методом биохемилюминесценции. На 28 сутки дополнительно осуществляли подсчет общего количества клеток красного костного мозга в бедренной кости.

Таблица I

Общее количество экспериментальных животных и их распределение по сериям

Серии исследований Доза у-облучения, Гр Количество животных

Изучение адаптогенных свойств хитозана с разной молекулярной массой при курсовом пероральном введении на фоне предварительного •/-облучения, оцениваемых по показателям периферической крови, красного костного мозга и активности свободно-радикальных процессов для отбора наиболее эффективной формы хитозана. 3,0 36

Исследование профилактического радиопротекторного действия хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» при однократном общем у-облучении на показатели периферической крови и свободно-радикальные процессы в плазме крови. 5,0 30

Изучение адаптогенных эффектов хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» на систему крови при курсовом пероральном введении после однократного у-облучения экспериментальных животных. 5,0 30

Изучение антигипоксических свойств хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» к действию гипобарической гипоксии по показателям белой и красной крови, интенсивности свободнорадикального окисления и активности лактатдегидрогеназы. 30

Общее количество животных 126

Во второй серии экспериментов проводили сравнительное исследование радиозащитных эффектов хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» при однократном общем гамма-облучении. Растворы нанокомплекса и хитозана были получены по методике Л. А Смирновой и др. (2005) и предоставлены кафедрой высокомолекулярных соединений и коллоидной химии химического факультета ИНГУ им. Н. И. Лобачевского. Хитозан использовали с молекулярной массой 130 кДа и степенью деацетилирования 0,82 в дозе 100 мг/кг. Наночастицы золота получали в растворе хитозана при УФ-индуцированном восстановлении золотохлористоводородной кислоты. Вводимая доза золота составляла 0,5

мг/кг. Средний размер наночастиц золота в нанокомпозите находился в пределах 5-10 нм. Система сохраняла устойчивость не менее 3 месяцев (Якимович, 2006). Хитозан в составе нанокомпозита выполняет восстановительную и стабилизирующую функцию (Якимович, 2008). Растворы (нанокомплекс, хитозан, физ. раствор) вводили с периодичностью 1 раз в сутки в течение 7 дней. Так как через неделю после окончания введения «препаратов» происходит развитие реакции активации (Корягин и др., 2006), через 7 дней после окончания введения растворов животные подвергались общему однократному гамма-облучению в дозе 5,0 Гр, вызывающей развитие костномозговой формы лучевой болезни средней степени тяжести (мощность облучения - 1 Гр/мин) на терапевтической установке АГАТ-С (Со60) на базе Нижегородского городского онкологического диспансера. Изменение состояния основных показателей крови (количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула, значение лейкоцитарного коэффициента, количество эритроцитов и концентрация гемоглобина), содержание продуктов ПОЛ и интенсивность процессов СРО определяли на 1, 14 и 28 сутки после облучения. На 28 сутки вели подсчет общего количества клеток костного мозга экспериментальных животных. В качестве индикаторных показателей характеризующих функциональное состояние организма (стресс, активация, тренировка) были выбраны параметры системы крови - лейкоцитарная формула и лейкоцитарный коэффициент.

Задачей третьей серии экспериментов было сравнительное исследование адаптогенных свойств хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» при курсовом пероральном применении в условиях предварительного гамма-облучения. Животные подвергались общему однократному гамма-облучению в дозе 5,0 Гр. Хитозан и нанокомплекс «хитозан-золото» вводили крысам в количестве 1 мл перорально с помощью зонда периодичностью 1 раз в сутки. Контрольным животным вводили физиологический раствор в том же количестве, введение проводили в течение 7 суток, начиная через 2 часа после облучения. Кровь для анализа забирали из подъязычной вены на 1-е, 14 и 28-е сутки после окончания терапии, что соответствовало 8, 21 и 35 суткам после облучения. Выбор этапов забора крови был обусловлен тем, что эти периоды характеризуются типичными для системы крови реакциями на курсовое введение адаптогенов (Горизонтов и др., 1983; Гаркави и др., 2003). В крови определяли количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, лейкоцитарный коэффициент, содержание продуктов ПОЛ и интенсивность процессов СРО. На 28 сутки осуществляли подсчет общего количества клеток красного мозга.

В четвертой серии экспериментов при сравнительной оценке антигипоксических свойств хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» исследуемые растворы (хитозан, нанокомплекс, физиологический раствор) вводили в течение 7 суток с периодичностью 1 раз в сутки перорально при помощи зонда в объеме 1 мл. Животные подвергались действию гипобарической гипоксии (8000м над уровнем моря, 30 минут) через неделю после окончания курса введения «препаратов». На следующие сутки определяли показатели белой и красной крови, содержание продуктов ПОЛ, интенсивность процесса СРО методом биохемилюминесценции и активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ).

Количество лейкоцитов определяли с помощью камеры Горяева (Ронин, Старобинец, 1989). Определение лейкоцитарной формулы - общепринятым методом с окраской мазков по Романовскому - Гимзе (Козинец, Макаров, 1998). Подсчет общего количества клеток костного мозга в бедренной кости — методом П. Д. Горизонтова (1983). Подсчет числа эритроцитов - фотоэлектроколориметрическим методом (Меньшиков и др., 1987); концентрацию гемоглобина - стандартным гемиглобинцианидным методом (Меньшиков и др., 1987). Активность ЛДГ определяли по Кочетову (1971). Продукты ПОЛ (диеновые, триеновые коньюгаты, основания Шиффа) — в гептан-изопропанольных фракциях (Волчегорский и др., 1989). Интенсивность свободнорадикального окисления — методом индуцированной биохемилюминесценции (БХЛ) (Кузьмина и др., 1983).

Результаты исследований статистически обрабатывали с помощью программы ВЮБТАТ. Независимые выборки сравнивали с помощью непараметрических критериев Крускала-Уоллиса и Ньюмена-Кейлса (Гланц, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение адаитогенной эффективности растворов хитозана с различной молекулярной массой при курсовом пероральном применении после однократного гамма-облучения в

дозе 3 Гр

Изучение адаптогенной эффективности растворов хитозана с различной молекулярной массой на систему крови облученных животных при курсовом применении после однократного гамма-облучения в дозе 3 Гр, вызывающего костно-мозговую форму лучевой болезни легкой степени тяжести, показало, что на 1 сутки после окончания введения растворов хитозана в опытных и контрольной группах наблюдался сегментоядерный нейтрофилез, лимфопения и снижение лейкоцитарного коэффициента по отношению к интактным животным. Это свидетельствовало, что облучение животных приводило их в состояние стресса (Гаркави, 1990; Барабой, 2006) (рис. 1).

Интактные Контроль Олигохитозан 4 Хитозан 130 Хитозан 230 Смесь 4 кДа + кДа кДа кДа 130 кДа

Сегментоядерные нейтрофилы Лимфоциты А Лейкоцитарный коэффициент

Рис. 1. Значения индикаторных показателей крови крыс на 1 сутки после окончания перорального введения растворов хитозана в условиях предварительного гамма-облучения в дозе 3 Гр

Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интактным животным.

Через 2 недели после окончания курса введения растворов хитозана облученные животные еще не вышли из состояния стресса.

На 28 сутки исследуемые показатели крови у опытной группы <«итозан 130 кДа» статистически значимо не отличались от интактных крыс. Это может свидетельствовать с большей долей вероятности о завершении процессов выхода животных данной группы из состояния стресса и переход к состоянию близкому к норме. В других группах исследуемые показатели отличались от интактных животных.

Общее количество клеток костного мозга в группе «хитозан 130 кДа» приближается к показателю интактных животных, что, возможно, обусловлено интенсивными репаративными процессами протекающими в пораженном костном мозге, в остальных экспериментальных группах данный показатель статистически значимо ниже (р<0.05) значений интактных животных (табл. 1), что служит констатацией более низкой скорости

восстановительных процессов. Таким образом, показатели системы крови служат доказательством того, что наиболее выраженным адаптогенным эффектом обладает хитозан с молекулярной массой 130 кДа, по сравнению с другими формами хитозана.

Таблица 2

Значения индикаторных показателей крови крыс и общее количество кроветворных клеток костного мозга на 28 сутки после окончания пероралыюго введения растворов хитозана в условиях предварительного гамма-облучения в дозе 3 Гр

Группа Сегментоядерные нейтрофилы, % Лимфоциты, % Лейкоцитарный коэффициент Общее кол-во клеток костного мозга, хЮ6 кл/л

Интактные 13,7 ±0,88 72,0 ±4,04 5,30 ±0,61 17,0 ±0,72

Контроль 27,6 ±2,73* 53,6 ±4,59* 2,06 ± 0,37 5,57 ±0,81*

Олигохитозан 4 кДа 18,8 ± 3,53*# 57,0 ±3,5* 3,65 ±0,91 7,58 ± 1,18*

Хитозан 130 кДа 15,5 ± 2,25# 71,0 ± 2,67# 5,28 ± 1,06 15,3 ± 1,26#

Хитозан 230 кДа 21,3 ±3,98* 59,2 ±5,01* 3,5 ±0,88 2,08 ± 0,36*#

Смесь 4 кДа + 130 кДа 25,7 ± 3,66* 53,7 ±4,15* 2,35 ± 0,39 2,33 ± 0,43 *#

Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интактным животным; # -р<0.05 по отношению к контролю.

Действие ионизирующего излучения на организм увеличивает активность свободно-радикальных процессов. Показатели биохемилюминесценции на 1 сутки подтверждают увеличение максимальной интенсивности процессов ПОЛ в опытных и контрольной группах относительно группы «интакгные». Суммарный показатель активности ПОЛ и АОС в данных группах также выше интактных животных (табл. 3).

На 28 сутки значения свободно-радикального окисления в опытной группе «хитозан 130 кДа» достигли уровня интактных животных, в отличие от других исследуемых групп, что свидетельствует о более выраженном антиоксидантном действии хитозана с молекулярной массой 130 кДа (табл. 3).

Таблица 3

Показатели биохемилюминесценции плазмы крови крыс на 1 и 28 сутки после окончания пероралыюго введения растворов хитозана в условиях предварительного

гамма-облучения в дозе 3 Гр

Сутки 1 сутки 28 сутки

Группы животных 1 шах (тУ) 5 (за 30 сек) I тах (тУ) 8 (за 30 сек)

Интактные 375,7 ± 57,9 2070 ± 194,6 247,8 ± 67,2 2694 ±98,1

Контроль 602,1 ±43,5* 3740 ±217,3* 581,5 ±58,9* 4181 ± 124,3*

Олигохитозан 791,5 ± 63,9*# 4020 ± 186,0* 543,1 ±38,4* 3982 ± 115,7*

Хитозан 130 кДа 600,7 ± 45,0* 3294 ± 190,8* 343,8 ± 41,7# 2865 ± 109,3#

Хитозан 230 кДа 750,3 ± 35,3* 4378 ±243,2* 377,4 ± 38,9# 3201 ± 89,9*#

Смесь 674,5 ± 15,0* 3973 ± 155,4* 408,2 ± 18,8# 3751 ±96,6*#

р<0.05 по отношению к контролю.

Содержание продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов, триеновых конъюгатов, оснований Шиффа) на 1 сутки во всех исследуемых группах было статистически значимо выше (р<0.05) показателей интактных животных, что еще раз говорило об усилении процессов пероксидации. Однако к 14 суткам содержание первичных и конечных продуктов ПОЛ в группе получавшей хитозан с Мг 130 кДа снижалось, таким образом так проявлялось его антиоксидантное действие. Такая тенденция наблюдалась и на 28 сутки после окончания курсового введения растворов хитозана. Показатели активности ПОЛ диеновые и триеновые конъюгаты не являются стойкими соединениями, быстро метаболизируют в основания Шиффа, поэтому уровень последних является наиболее информативным. Содержание оснований Шиффа в группе «хитозан 130 кДа» достоверно не отличается от значений интактных животных (р>0.05) (рис. 2).

Рис. 2. Содержание оснований Шиффа в плазме крови крыс на 28 сутки после окончания перорального введения растворов хитозана в условиях предварительного гамма-облучения в дозе 3 Гр.

Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интактным животным; # -р<0.05 по отношению к контролю.

Проведенные исследования по изучению адаптогенных и антиоксидантных свойств растворов хитозана с различной молекулярной массой (4 кДа-230 кДа) на систему крови при действии ионизирующей радиации на организм животных показывают, что раствор хитозана с молекулярной массой 130 кДа проявляет наиболее выраженные адаптогенные и антиоксидантные эффекты, приближая показатели крови к значениям интактных животных, и снижая активность свободно-радикального окисления. Это послужило основой для его дальнейшего использования в составе нанокомплекса «хитозан-золото».

Сравнительное шученне радиопротекторной эффективности хитозана и нанокомплекса «хнтозан-золото» при его профилактическом курсовом применении при однократном гамма-облучении лабораторных животных в дозе

5 Гр

На следующие сутки после однократного гамма-облучения отмечалось снижение количества лейкоцитов во всех исследуемых группах относительно интактных животных, особенно в группе «контроль», что указывало на сильное повреждающее действие радиации на систему крови.

Происходило также статистически значимое (р<0.05) снижение количества лимфоцитов и лейкоцитарного коэффициента в опытных и контрольной группах относительно интактных животных, и статистически значимое (р<0.05) увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов. Эти показатели подтверждали, что гамма-облучение животных сопровождается развитием стресса, а адаптогенные эффекты исследуемых растворов еще не проявляются (табл. 4). Следует указать, что количество выживших лейкоцитов в группах получавших хитозан и нанокомплекс было выше, чем в контроле, это свидетельствовало об определенном защитном действии «препаратов» на систему крови.

Таблица 4

Количество лейкоцитов и значения индикаторных показателей крови крыс на 1 сутки после однократного гамма-облучения в дозе 5 Гр при профилактическом пероралыюм введении хитозана и нанокомплекса хитозан-золото

Группа Кол-во лейкоцитов, х109/л Сегментоядерные нейтрофилы,% Лимфоциты, % Лейкоцитарный коэффициент

Интактные 14,1±1,64 21,2±2,64 65,6±5,92 3,6±1,32

Контроль 3,1±0,33* 63,2±4,2* 20,5±4,8* 0,32±0,04*

Хитозан 130 кДа 7,58±0,62*# 48,4±2,9* 20,1 ±4,6* 0,42±0,08*

Хитозан -золото 9,64±0,44*# 55,5±3,61* 11,6±1,51*# 0,2±0,03*

р<0.05 по отношению к контролю.

На 28 сутки животные контрольной группы все еще находились в состоянии стресса. У крыс получавших раствор хитозана с молекулярной массой 130 кДа и нанокомплекс наблюдалось статистически значимое увеличение количества лимфоцитов, лейкоцитарного коэффициента и уменьшение количества сегментоядерных нейтрофилов относительно показателей контроля и приближение данных параметров к значениям интактных животных. Это служило доказательством того, что животные данных групп вышли из состояния стресса (рис. 3).

Показатели 28 суток (количество лимфоцитов, величина лейкоцитарного коэффициента) у опытной группы получавшей нанокомплекс статистически значимо отличаются от значений группы получавшей хитозан, это с большей долей вероятности позволяет утверждать, что адаптогенный эффект нанокомплекса более выражен по сравнению с раствором хитозана. Можно полагать, что защитное действие нанокомплекса определяется не только хитозаном, но во многом и золотом.

Интактные Контроль Хитозан 130 кДа Хитозан-золото

-""Т Сегмснтоядсрные нейтрофилы Лимфоциты

Л— Лейкоцитарный коэффициент __

Рис. 3. Количество лейкоцитов и значения индикаторных показателей крови крыс на 28 сутки после однократного гамма-облучения в дозе 5 Гр при профилактическом пероральном введении хитозана и нанокомплекса хитозан-золото

Примечание-, статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интактным животным; # -р<0.05 по отношению к контролю.

1 сутки 28 сутки

■ Интактные И Контроль □ Хитозан 130 кДа И Хитозан - золото

Рис. 4. Содержание оснований Шиффа в плазме крови крыс на 1 и 28 сутки после однократного гамма-облучения в дозе 5 Гр при профилактическом пероральном введении хитозана и нанокомплекса хитозан-золото

Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интактным животным; # -р<0.05 по отношению к контролю.

Радиооблучение сопровождается увеличением активности свободно-радикальных процессов. На 1 сутки после гамма-облучения содержание первичных и конечных продуктов

ПОЛ в плазме крови у всех исследуемых групп было статистически значимо выше относительно группы «интактные». Это указывало на то, что облученные животные находятся в состоянии окислительного стресса. Однако на 14 сутки в опытной группе получавшей нанокомплекс отмечается статистически значимое уменьшение содержания диеновых конъюгатов, триеновых конъюгатов и оснований Шиффа по отношению к контрольной группе. На 28 сутки содержание оснований Шиффа в группе получавшей хитозан, было ниже, чем в контроле (снижение процессов перекисного окисления липидов), а в опытной группе получавшей нанокомплекс приближается к значению интактных животных, что может свидетельствовать о нормализации процессов пероксидации в организме (рис.4).

Восстановление показателей периферической крови, уменьшение продуктов ПОЛ у животных опытных групп, получавших раствор хитозана и нанокомплекс «хитозан-золото» свидетельствует о радиозащитных свойствах как хитозана, так и нанокомплекса.

Результаты проведенного анализа также показали, что адаптогенные эффекты более выражены у нанокомплекса «хитозан-золото», чем у хитозана, что может быть связано с высокой антирадикальной активностью наночастиц золота.

Сравнительное изучение адаитогенной эффективности хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» при курсовом пероралыюм применении после однократного гамма-

облучеиии в дозе 5 Гр

При сравнительном изучении адаптогенной эффективности хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» на фоне предварительного повреждающего действия радиации установлено, что на 1 сутки после окончания его курсового перорального применения облученным животным количество лейкоцитов в исследуемых группах было статистически значимо ниже по отношению к интактным животным. Наблюдалось существенное (р<0.05) снижение количества лимфоцитов и лейкоцитарного коэффициента во всех группах относительно интактных животных, а также достоверное (р<0.05) увеличение сегментоядерных нейтрофилов, это указывает на то, что облученные животные в начальный период после окончания курса введения «препаратов» продолжают находиться в состоянии стресса, а адаптогенный эффект веществ еще не проявляется. Это, по всей видимости, связано с тем, что реакция активации начинает формироваться через 1 неделю после окончания введения исследуемых соединений.

На 28 сутки показатели периферической крови (количество лимфоцитов, сегментоядерных нейтрофилов, лейкоцитарный коэффициент) у животных опытных групп, получавших раствор хитозана и нанокомплекс «хитозан-золото» статистически значимо не отличались от показателей интактных животных.

Наиболее чувствительной к повреждающему действию радиации является система кроветворения, поэтому ее показатели являются наиболее информативными. Количество клеток красного костного мозга у контрольных животных было в 3,25 раза ниже, чем в группе «интактные» - репарационные процессы в данной группе еще не завершились. У животных получавших раствор хитозана количество клеток костного мозга ниже, чем у интактных крыс (в 1,8 раза), но выше, чем в контроле. По всей видимости, восстановительные процессы у этих животных еще не завершились, но адаптогенный эффект хитозана наблюдается. У животных получавших нанокомплекс данный показатель был статистически значимо выше значений контроля и находился на уровне интактных животных (табл. 5).

Содержание первичных и конечных продуктов ПОЛ на 1 сутки после проведенного курса «терапии» в контрольной и опытных группах было статистически значимо выше, чем у интактных животных. Это дополнительно подтверждало, что животные данных групп находятся в состоянии окислительного стресса.

Таблица 5

Количество лейкоцитов, значения иидикаторных показателей крови крыс и общее количество кроветворных клеток костного мозга в бедренной кости на 28 сутки после окончания курсового применения хитозаиа и нанокомплекса «хитозан-золото» на фоне предварительного гамма-облучения в дозе 5 Гр

Группы Сегментоядер ные нейтрофилы, % Лимфоциты, % Лейкоцитарный коэффициент Количество лейкоцитов, х109/л Общее количество клеток костного мозга, х106 кл

Интактные 19,4±0,81 61,0 ± 1,14 3,14 ± 1,4 8,96 ± 0,8 14,9 ± 1,9

Контроль 62,54 ±2,63* 19,86 ± 1,95* 0,74 ± 0,32* 4,84 ±0,3* 4,58 ± 2,4*

Хитозан 130 кДа 20,41±3,95# 67,85 ±3,61# 3,32 ± 0,91# 5,24 ± 0,4* 8,1 ±3,25*

Хитозан-золото 16,89±2,73# 69,42 ± 1,64# 4,11 ±0,6# 9,08 ± 0,19#+ 12,9 ± 2,3#

Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интактным животным; # -р<0.05 по отношению к контролю; + - р<0.05 по отношению к группе «хитозан 130 кДа».

На 28 сутки у животных контрольной группы содержание первичных и конечных продуктов ПОЛ было статистически значимо выше, чем у интактных животных. Необходимо отметить, что уровень продуктов ПОЛ в опытных группах был статистически значимо ниже, чем в контроле и статистически значимо, за исключением диеновых конъюгатов, не отличается от интактных животных, что указывает на более низкую интенсивность процессов пероксидации, чем в контрольной группе (табл.6).

Таблиг/а 6

Содержание продуктов ПОЛ в плазме крови крыс на 28 сутки после окончания перорального введения хитозана и нанокомплекса «хнтозан-золото» в условиях предварительного гамма-облучения в дозе 5 Гр

Группа Диеновые коньюгаты, отн. ед. оп. пл. Триеновые коньюгаты, отн. ед. оп. пл. Основания Шиффа, отн. ед. оп. пл.

Интактные 0,203 ± 0,002 0,042 ± 0,005 0,043 ±0,011

Контроль 0,358 ± 0,007* 0,289 ±0,016* 0,138 ±0,045*

Хитозан 130 кДа 0,167 ± 0,006*# 0,054 ± 0,004# 0,098 ± 0,006#

Хитозан-золото 0,152 ±0,0008*# 0,031 ±0,003# 0,095 ± 0,008#

р<0.05 по отношению к контролю.

Статистически значимых отличий в содержании продуктов ПОЛ между группами, получавшими хитозан и нанокомплекс, выявлено не было.

Показатели биохемилюминесценции (максимальная интенсивность процессов ПОЛ, светосумма S) через 28 суток после окончания введения «препаратов» в контрольной группе и группе получавшей раствор хитозана бьии статистически значимо выше, чем у интактныех животных. У животных опытной группы получавшей нанокомплекс значения I шах и S не имели статистически значимых отличий от значений интактных животных. Это свидетельствует о нормализации активности свободно-радикального окисления в опытной группе получавшей нанокомплекс «хитозан-золото» и его высокой антирадикальной эффективности (табл.7).

Таблица 7

Показатели индуцированной биохемилюминесценции плазмы крови крыс через 28 суток после окончания пероралыюго введения хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» в условиях предварительного гамма-облучения в дозе 5 Гр

Группы Imax, имп/сек S, за 30 сек

Интактные 241,1 ± 16,1 1735,0 ± 189,3

Контроль 291,6 ±23,8* 2446,0 ± 189,0*

Хитозан 130 кДа 283,4 ± 30,5* 1896,7 ± 79,3*#

Хитозан-золото 235,8 ±21,6 1698,9 ± 125,6#

Примечание: статистически значимые отличия: * -р < 0.05 по отношению к интактным животным; # -р < 0.05 по отношению к контролю.

Анализ показателей периферической крови, биохемилюминесценции, продуктов ПОЛ свидетельствует; что хитозан и нанокомплекс обладают адаптогенной эффективностью, статистически значимых отличий между данными группами обнаружено не было. У нанокомплекса более выражен адаптогенный эффект - количество лейкоцитов и клеток костного мозга на уровне интактных животных.

Сравнительное изучение антигипоксических свойств хитозана н нанокомплекса «хитозан-золото» при предварительном курсовом применении в условиях гипобарической гипоксии

Моделирование состояния гипобарической гипоксии (условная высота 8000 м) проводили на 7 сутки после окончания курса введения хитозана и нанокомплекса. На следующие сутки после гипоксии было выявлено, что в контрольной группе наблюдалась лимфопения, сегментоядерный нейтрофилез и снижение лейкоцитарного коэффициента относительно интактных крыс (табл.8).

Таблица 8

Лейкоцитарная формула и лейкоцитарный коэффициент в крови крыс при моделировании гипобарической гипоксии после окончания перорального введения хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото»

Группы животных Сегментоядерньге нейтрофилы, % Лимфоциты, % Лейкоцитарный коэффициент

Интактные 20,2 ± 1,16 61,6 ±2,19 3,05 ±0,14

Контроль 49,8± 2,61* 41,1 ±2,2* 0,82 ±0,10*

Хитозан 130 кДа 26,5±0,87# 56,8±1,5# 2,15 ±0,10

Хитозан-золото 23,4±1,03# 58,8±2,35# 2,55 ± 0,20

Примечание, статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интактным животным; # -р<0 05 по отношению к контролю.

Это указывало, что животные контрольной группы находятся в состоянии стресса после

воздействия гипоксии. В группах животных получавших нанокомплекс «хитозан-золото» и раствор хитозана с Мг 130 кДа данные показатели не отличались от соответствующих значений интактных животных и были близки к показателям нормы, что говорит об адаптогенных эффектах к условиям гипоксии как хитозана, так и нанокомгшекса.

0,35

о.з

0,25 0,2 0,15 0,1 0.05 0

Контроль Хетозан 130 кДа Хитозан-золото

Рис. 5. Содержание оснований Шиффа в плазме крови крыс при моделировании гипобарической гипоксии после курсового перорального введения хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото»

Примечание, статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интактным животным; # -р<0.05 по отношению к контролю.

Рис. 6. Концентрация гемоглобина (г/л) в периферической крови крыс при моделировании гипобарической гипоксии после окончания перорального введения хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото»

Примечание статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интактным животным; # -р<0.05 по отношению к контролю.

При гипоксии происходит усиление свободно-радикальных процессов. Одним из проявлений адаптогенной активности веществ следует считать их антиоксидантное действие, поскольку защита организма от разного рода повреждений в значительной степени связана и сопровождается повышением антиоксидантного потенциала организма (Яременко, 2008).

Основания Шиффа оказывают наиболее разрушительное действие на липидный бислой мембран. Содержание оснований Шиффа в плазме крови у животных контрольной группы и группы получавшей раствор хитозана было статистически значимо выше уровня данного показателя у интактных животных (в 5,8 и в 2,9 раз соответственно). Это указывало на состояние окислительного стресса у контрольных животных, подтверждая, что гипоксия сопровождается повреждающим действием на биологические мембраны. Содержание оснований Шиффа в опытной группе получавшей нанокомплекс статистически значимо не отличалось от интактных, что еще раз подтверждает его антиоксидантные свойства (рис.5).

Известно, что одной из реакций животных на гипоксию является увеличение концентрации гемоглобина и количества эритроцитов.

Концентрация гемоглобина в контроле и группе получавшей раствор хитозана была статистически значимо выше данного показателя у группы «интактные», это указывает на развитие компенсаторной реакции в ответ на гипоксию (рис. 6). Тогда как в группе получавшей нанокомплекс концентрация гемоглобина существенно не отличалась от значений интактных животных.

Для гипоксии характерно нарушение энергетического обмена, в частности метаболизма углеводов, а именно резкое усиление пути анаэробного гликолиза, помимо снижения количества синтезируемой АТФ, приводит к накоплению молочной кислоты. Накопление восстановленных эквивалентов в клетке ограничивает утилизацию лактата через окисление его в пируват. Существенному изменению при гипоксии подвергается активность лактатдегидрогеназы (Хватова, Мартынов, 1977). Наши исследования показали, что активность ЛДГ в контрольной группе и в группе получавшей раствор хитозана была выше соответственно в 1,5 и 1,2 раза по сравнению с интактными животными (р<0.05), что служило подтверждением нарушения аэробных энергетических процессов.

Низкая активность фермента ЛДГ в опытной группе «хитозан-золото» после гипоксии с большой долей вероятности указывала на переключение метаболизма по пути полного окисления пирувата в условиях дефицита кислорода (рис. 7).

Рис.7. Активность лактатдегидрогеназы (ммоль пирувата/мин х мкг белка) в плазме крови крыс через неделю после курсового перорального введения хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» в условиях гипобарической гипоксии

Примечание, статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интактным животным; # -р<0.05 по отношению к контролю.

Изменение показателей крови, нарушение энергетического обмена, увеличение

процессов ПОЛ свидетельствуют о том, что гипоксия приводит к развитию стресса у контрольных животных. Профилактическое курсовое применение нанокомплекса «хитозан-золото» повышает устойчивость организма животных перед гипоксией, приводя в соответствие индикаторные показатели периферической крови к параметрам нормы, снижая содержание конечных продуктов ПОЛ, уменьшая активность лактатдегидрогеназы. Раствор хитозана оказывает менее выраженное антигипоксическое действие по сравнению с нанокомплексом. Это позволяет с высокой степенью вероятности предполагать, что адаптогенная антигипоксическая эффективность нанокомплекса «хитозан-золото» определяется как хитозаном, так и золотом.

ВЫВОДЫ

1. Профилактическое курсовое пероральное применение хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» перед гамма-облучением в дозе 5 Гр снижает повреждающее действие радиации на систему крови, нормализуя индикаторные показатели системы крови, уменьшая содержания продуктов перекиснош окисления липидов в плазме крови, сокращая сроки восстановительных процессов.

2. Курсовое пероральное применение хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» животным, предварительно облученным в дозе 5 Гр, оказывает адаптогенное действие на систему крови, переводя организмы из состояния стресса в состояние активации, уменьшая интенсивность свободно-радикальных процессов.

3. Предварительное курсовое пероральное введение хитозана и нанокомплекса «хитозан-золото» приводит к повышению устойчивости крыс к гипобарической гипоксии, приводя индикаторные показатели крови к параметрам нормы, снижая интенсивность процессов перекисного окисления липидов, нормализуя активность лактатдегидрогеназы плазмы крови.

4. Адаптогенные эффекты нанокомплекса «хитозан-золото» в условиях моделирования лучевого поражения и гипоксии выражены статистически более значимо по сравнению с хитозаном.

Список публикаций по теме диссертации. В рецензируемых изданиях рекомендованных ВАК:

1. Ешкова О.Ю. (Речкина О.Ю.). Терапевтические эффекты хитозана при костномозговой форме лучевой болезни у лабораторных животных // Ешкова О.Ю., Таламанова М.Н., Веселова Т.А, Мочалова А.Е., Корягин A.C. Вестник Нижегородского университета им. Н. И. Лобачевского. 2010. № 2(2). С. 513-515.

2. Ешкова О.Ю. (Речкина О.Ю.). Адаптогенные эффекты наноструктурированного препарата «хитозан» в условиях действия неблагоприятных факторов // Ешкова О.Ю., Таламанова М.Н., Корягин A.C. Медицинский альманах: Мат-лы 10 научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (17-18 марта 2011г Нижний Новгород). Н. Новгород, 2011. с. 214-215.

3. Ешкова О.Ю. (Речкина О.Ю.). Адаптогенные эффекты нанопрепарата «хитозан-золото» в условиях гипоксии // Корягин A.C., Мочалова Л.Е., Саломатина Е.В., Смирнова Л. А. Ешкова О.Ю. Перспективные материалы 2012, № 5. С • S3-J"-7.

В других изданиях и материалах конференций:

4. Ешкова О.Ю.(Речкина О.Ю.) Влияние природного полимера хитозана на активность перекисного окисления липидов при экспериментальной форме лучевой болезни // Мат-лы 16 международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов»; (13-18 апреля 2009)(электронный ресурс). Москва, 2009. С. 15.

5. Eshkova O.Yu. (Речкина О.Ю.). Therapeutic efficiency of chitosan with different molecular weight on simulating radiation sickness// Mochalova A.E., Eshkova O.Yu., Koryagin A.S., Smirnova L.A. European polymer congress. 12-17 July, 2009. Gras, Austria, 2009. P. 237.

6. Ешкова О.Ю. (Речкина O.IO.),. Антиоксидантный эффект природного полимера хитозана при экспериментальной форме лучевой болезни // Ешкова О.Ю., Саломатина Е.В., Таламанова М.Н. Мат-лы 14-й Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (19-23 апреля 2010г. Пущино). 2010. С. 168.

7. Ешкова О.Ю. (Речкина О.Ю.) Биопрепарат «яд пчелы и хитозан» как радиопротектор // Таламанова М.Н., Ешкова О.Ю., Корягин A.C. Мат-лы XXI съезда физиологического общества им. И. П. Павлова. Тезисы докладов. (19-25 сентября 2010 г. Калуга) 2010. С.591-592.

8. Ешкова О.Ю. (Речкина О.Ю.), Влияние высокомолекулярного хитозана на процессы пероксидации при радиопоражении / Ешкова О.Ю., Мочалова А.Е. Мат-лы III Всероссийского (с международным участием) конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2010» (24-28 мая 2010 г. Нижний Новгород): Изд-во ННГУ, 2010. С. 130.

9. Ешкова О.Ю. (Речкина О.Ю.), Высокомолекулярный хитозан — эффективный антиоксидант // Ешкова О.Ю., Саломатина Е.В., Таламанова М.Н., Мочалова А.Е., Смирнова JI.A., Корягин A.C. Мат-лы 3-го научно-практического симпозиума «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (12-14 мая 2010 года, Волгоград, Россия). Кислород и антиоксиданты. 2010. Вып. 2. С. 81-82.

10. Ешкова О.Ю. (Речкина О.Ю.) Влияние биопрепаратов хитозана на активность перекисного окисления липидов при профилактике лучевой болезни // Мат-лы 18 международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (11-15 апреля 2011 г, МГУ) (электронный ресурс). Москва, 2011. С. 255.

11. Ешкова О.Ю. (Речкина О.Ю.) Радиозащитное действие биополимера хитозана при профилактике лучевой болезни // Ешкова О.Ю., Таламанова М.Н., Корягин A.C. Мат-лы 15 школы-конференции «Биология-наука 21 в.» (18-22 апреля 2011 г. Пущино). Пущино, 2011. С. 184.

12. Ешкова О.Ю. (Речкина О.Ю.). Антигипоксический эффект нанокомплекса "хитозан-золото" // Демина Е.И., Ешкова О.Ю., Корягин A.C., Ерлыкина Е.И... Мат-лы 6 российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (11-13 октября 2011). Патогенез 2011.Т. 9(3) С. 29.

13. Ешкова О.Ю. (Речкина О.Ю.) Адаптогенный эффект препарата хитозана в условиях гипобарической гипоксии // Дыдыкина В.Н., Ешкова О.Ю. Мат-лы XVI Международной экологической студенческой конференции "Экология России и сопредельных территорий" (28 - 31 октября 2011 г., НГУ). Новосибирск, 2011. С. 259.

Подписано в печать 26 09.2012 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1. Заказ № 672. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в РИУ ННГУ им. Н И. Лобачевского. 603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская, 37