Анализ адаптогенного действия пчелиного яда к гипобарической гипоксии при внутрибрюшинном и пероральном введении лабораторным животным

Коновалова, Ольга Игоревна

Автореферат диссертации по теме "Анализ адаптогенного действия пчелиного яда к гипобарической гипоксии при внутрибрюшинном и пероральном введении лабораторным животным"

На правах рукописи

КОНОВАЛОВА ОЛЬГА ИГОРЕВНА

АНАЛИЗ АДАПТОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ПЧЕЛИНОГО ЯДА К ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ ПРИ ВНУТРИБРЮШИННОМ И ПЕРОРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ЛАБОРАТОРНЫМ ЖИВОТНЫМ

03.00.13 - физиология 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0034Б21гэ

Нижний Новгород 2009

003462179

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского и на кафедре биохимии им. Г. Я. Городисской Нижегородской государственной медицинской академии

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Корягин Александр Сергеевич

доктор биологических наук, профессор Ерлыкина Елена Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Конторщикова Клавдия Николаевна

доктор биологических наук Бояринова Лариса Валентиновна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Омская государственная

медицинская академия»

Защита диссертации состоится « 12 »_марта_2009 г. в 15.00 часов на

заседании диссертационного совета Д 212.166.12 при Нижегородском государственном университете им. Н. И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ННГУ

Автореферат разослан «__»_2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Корягин А.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Роль гипоксии очень велика в развитии многих альтерирующих изменений в организме человека. Практически при всех нарушениях сердечнососудистой системы, лёгких, системы крови, отравлениях изменяется либо доставка, либо утилизация кислорода. Классические химически синтезированные антигипоксанты, обычно косвенно снижающие последствия гипоксических состояний, зачастую обладают симптоматическим действием и имеют серьезные побочные эффекты. В решении указанной проблемы большое значение принадлежит поиску натуральных адаптогенных средств, которые включают зоо- и фитопрепараты, в том числе и зоотоксины (Яременко, 2008).

В настоящее время известно три типа адаптационных реакций: стресс, реакция активации и реакция тренировки. Стресс развивается в ответ на действие сильных раздражителей, обычно неблагоприятных для организма (Селье, 1972, 1977). При стрессе, наряду с элементами защиты, имеются элементы повреждения. Реакция активации развивается в ответ на средние по силе воздействия. При продолжительном действии раздражителя средней силы развивается устойчивая (стойкая) активация (Гаркави и др. 1998). Реакция тренировки возникает при действии на организм относительно слабых раздражителей. В отличие от стресса изменения при реакции активации и тренировки по своему характеру близки к вариантам нормы. На этой стадии происходит повышение резистентности, обусловленной подъёмом активности защитных и регуляторных систем организма (Гаркави и др., 1990).

Пчелиный яд представляет собой многокомпонентную систему, и, соответственно, может одновременно воздействовать на многие регуляторные и исполнительные системы организма. Хорошо известно, что малые дозы пчелиного яда оказывают радиозащитное действие, причем в его основе лежат механизмы развития неспецифической адаптационной реакции активации ((Корягин, Ерофеева, 2004; Корягин, 2007). Необходимо отметить, что исследований по изучению адаптогенных эффектов малых доз пчелиного яда к условиям действия других экологических неблагоприятных факторов, в частности, вызывающих развитие гипоксии, практически не проводилось.

В связи с высокой аллергенной и антигенной активностью пчелиного яда внутрибрюшинное введение зоотоксинов является малоперспективным в практической медицине. Более предпочтительным и общепризнанным методом применения препаратов является пероральный. Однако, поскольку яд пчелы имеет белково-пептидную природу и способен разрушаться протеазами пищеварительного тракта, его введение через рот в организм малоэффективно. Одним из вариантов решения этой задачи является пероральное введение зоотоксинов в составе нанокомпозитов, созданных на основе хитозана и наночастиц золота, способных связывать яд, предотвращать его разрушение, а также облегчать транспортировку в кровь через внутренний эпителиальный барьер кишечника (Таламанова и др., 2008).

Система крови является интегративной системой, наиболее полно отражающей состояние и характер метаболизма всего организма. Она играет решающую роль в развитии неспецифических и специфических реакций защиты организма. Кровь легко доступна для динамического и комплексного анализа. В качестве основных индикаторных показателей типа адаптационных реакций используют лейкоцитарную формулу и лейкоцитарный коэффициент (отношение между процентным содержанием лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов). Данные параметры гомеостаза крови достаточно полно отражают состояние важнейших физиологических систем и используются в качестве критериев адаптационных реакций организма (Васильев и др., 1992).

Вышеизложенное указывает на важность исследований по изучению адаптогенных свойств яда пчелы и нанокомпозитов, содержащих зоотоксины пчелы к условиям гипобарической гипоксии.

Цель исследования

Проведение анализа адаптогенного действия яда пчелы медоносной (Apis mellifera L.) к условиям гипобарической гипоксии, оцениваемого по показателям системы крови лабораторных животных, при курсовом внутрибрюшинном введении пчелиного яда и пероральном применении нанокомпозитов, содержащих зоотоксины пчелы.

Задачи исследования

1. Исследовать состояние свободнорадикальных процессов, антиоксидантного статуса плазмы крови, некоторых ферментов энергетического обмена и форменных элементов крови при курсовом внутрибрюшинном введении пчелиного яда экспериментальным животным в дозах, вызывающих развитие адаптационной реакции устойчивой активации.

2. Оценить возникновение резистентности экспериментальных животных к гипобарической гипоксии по показателям системы крови, активности процессов перекисного окисления липидов и активности ферментов энергетического обмена при предварительном курсовом внутрибрюшинном введении пчелиного яда.

3. Определить тип адаптационной реакции и изучить ее формирование у экспериментальных животных по показателям системы крови и свободнорадикального окисления при курсовом пероральном введении нанокомпозитов, содержащих зоотоксины пчелы.

4. Установить возникновение резистентности к гипобарической гипоксии лабораторных животных при предварительном пероральном введении нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, по показателям системы крови, свободнорадикальных процессов и активности ферментов энергетического обмена.

Научная новизна исследования

Впервые показано, что внутрибрюшинное курсовое введение лабораторным животным раствора яда пчелы (0,1 мг/кг), вызывающее в условиях нормоксии развитие неспецифической адаптационной реакции устойчивой активации, сопровождается снижением интенсивности свободнорадикальных процессов, увеличением мощности антиоксидантной системы организма, повышением активности фермента энергетического обмена сукцинатдегидрогеназы.

Впервые установлено, что реакция устойчивой активации, развивающаяся непосредственно после окончания курсового

внутрибрюшинного введения пчелиного яда (0,1 мг/кг) характеризуется резистентностью к барометрической гипоксии.

Впервые выявлено, что при курсовом пероральном введении нанокомпозитов, содержащих зоотоксины пчелы, реакция активации и резистентность к гипоксии формируются в течение недели после окончания применения препаратов.

Научно-практическая значимость

Полученные результаты расширяют представления о физиологических механизмах адаптации и поддержания постоянства внутренней среды организма в условиях гипоксии. Выявленные адаптогенные свойства раствора пчелиного яда (0,1мг/кг) в условиях моделирования гипобарической гипоксии дополняют знания о молекулярных механизмах реагирования организма на возникающий дефицит кислорода. Обнаруженные адаптогенные эффекты нанокомпозитов, содержащих зоотоксины пчелы, открывают перспективу их профилактического применения с целью повышения адаптационной устойчивости организма в условиях гипоксии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Адаптационная реакция устойчивой активации, вызванная курсовым внутрибрюшинным введением яда пчелы (0,1 мг/кг) крысам, сопровождается снижением интенсивности свободнорадикальных процессов, усилением мощности антиоксидантной системы плазмы крови и увеличением активности энергетических процессов.

2. Реакция устойчивой активации развивается непосредственно после окончания внутрибрюшинных инъекций пчелиного яда (0,1 мг/кг) лабораторным животным и характеризуется повышением толерантности к гипобарической гипоксии.

3. Курсовое пероральное введение нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, экспериментальным животным вызывает развитие неспецифической адаптационной реакции устойчивой активации спустя неделю после окончания применения препаратов.

4. Реакция устойчивой активации, возникающая при курсовом пероральном введении нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд (доза 0,5

мг/кг), приводит к возникновению резистентности животных к гипобарической гипоксии.

Апробация работы

Результаты работы были доложены и обсуждены на XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии», посвященной 20-летию Кировской государственной медицинской академии (Киров, 2007), Международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения д.б.н., проф. Сапожниковой Е.В. (Саранск, 2008), XIII Нижегородской сессии молодых ученых (Нижний Новгород, 2008), Нижегородском биохимическом обществе (Нижний Новгород, 2008).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 126 страницах, включая список литературы, и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов, приложения и библиографического указателя. Список цитируемой литературы содержит 147 источников. Диссертация иллюстрирована 37 таблицами, 16 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа была выполнена на 217 беспородных крысах-самцах массой 250300 г, выращенных в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде, а также естественном чередовании суточной освещенности. Во всех сериях опытов в каждой группе было по 7 животных. Кровь для анализа брали из подъязычной вены крыс.

В ходе исследований проведено in vivo 4 серии экспериментов (табл.1).

В первой серии экспериментов яд пчелы в объеме 0,2 мл (дозой 0.1 мг/кг, вызывающей развитие реакции активации (Корягин, Ерофеева, 2004)) вводили животным внутрибрюшинно в течение 7 дней с периодичностью 1 раз в сутки. Животным контрольных групп вводили растворитель пчелиного яда -физиологический раствор. После окончания серии инъекций через сутки определяли в крови количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, значение лейкоцитарного коэффициента, количество эритроцитов и концентрацию гемоглобина, количество клеток костного мозга в бедренной кости. Используя метод Fe2+ индуцированной биохемилюминесценции, оценивали интенсивность процесса СРО и активность антиоксидантной системы в плазме крови, также определяли концентрацию диенов, триенов, оснований Шиффа, активность супероксиддисмутазы и концентрацию церулоплазмина. Спектрофотометрически определяли активность ферментов энергетического обмена - сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы.

Во второй серии экспериментов после окончания введений яда крыс подвергали действию гипобарической гипоксии (условная высота 8 тыс. м) в

течение 30 минут (данные параметры использовались во всех экспериментах). Сразу после моделирования состояния гипоксии определяли концентрацию диеновых, триеновых конъюгатов, оснований Шиффа, показатели Ре2+ индуцированной биохемилюминесценции, концентрацию малонового диальдегида, содержание пировиноградной и молочной кислот, а также активность сукцинатдегидрогеназы в крови. На следующие сутки после моделирования состояния гипоксии определяли содержание лейкоцитов и количество клеток костного мозга в бедренной кости, лейкоцитарную формулу и лейкоцитарный коэффициент, количество эритроцитов и концентрацию гемоглобина.

Таблица 1

Общее количество животных и их распределение по сериям

№ Серии исследований Количество животных

1. Исследование состояния свободнорадикальных процессов, антиоксидантного статуса плазмы крови, некоторых ферментов энергетического обмена и показателей крови при курсовом внутрибрюшинном введении малой дозы пчелиного яда, вызывающих возникновение адаптационной реакции активации в условиях нормоксии. 21

2. Определение возникновения резистентности экспериментальных животных к гипоксии при предварительном курсовом внутрибрюшинном введении раствора пчелиного яда. 56

3. Установление типа адаптационной реакции при курсовом пероральном введении нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, в условиях нормоксии. 84

4. Изучение возникновения резистентности крыс к условиям гипобарической гипоксии при предварительном курсовом пероральном введении нанокомпозитов. 56

Общее количество животных 217

В третьей серии экспериментов дозы пчелиного яда, вводимые в составе нанокомпозитов, составляли 0.5 и 1 мг/кг (Таламанова и др., 2008). Смесь наночастиц вводили перорально при помощи зонда в объеме 1 мл в течение 7 дней с периодичностью 1 раз в сутки. Контрольный раствор содержал наночастицы золота и хитозан. На 1, 7 и 14 сутки после окончания введения нанокомпозитов крыс подвергали воздействию гипобарической гипоксии. На следующий день после моделирования гипоксии были определены следующие показатели: количество лейкоцитов в крови,

лейкоцитарная формула и лейкоцитарный коэффициент, количество эритроцитов и концентрация гемоглобина в крови, а также показатели биохемилюминесценции плазмы крови.

Растворы нанокомпозитов, состоящие из натуральных компонентов, были получены по методике, описанной Смирновой и др. (2005) и предоставлены кафедрой высокомолекулярных соединений и коллоидной химии химического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского. Хитозан использовали с молекулярной массой 120 кДа и степенью деацетилирования 0,82 в дозе 50 мг/кг. Вводимая доза золота составляла 0.5 мг/кг. Средний размер наночастиц золота в нанокомпозите находился в пределах 10-15 нм. Система сохраняла устойчивость не менее 3 месяцев (Якимович, 2007). Хитозан в составе нанокомпозитов выполняет восстановительную и стабилизирующую функцию (Якимович, 2008).

В четвертой серии экспериментов нанокомпозиты вводили в течение 7 суток. Через сутки и через неделю после окончания инъекций крыс помещали в условия гипобарической гипоксии. Анализ крови проводили на следующий день после экспозиции в барокамере. По показателям лейкоцитарной формулы, красной крови, активности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и ферментов энергетического обмена судили о характере адаптационных эффектов нанокомпозитов на специфическую резистентность, которую оценивали в условиях гипобарической гипоксии.

Общее количество лейкоцитов определяли с помощью камеры Горяева. (Ронин, Старобинец, 1989); подсчет лейкоцитарной формулы - с окраской мазков по Романовскому-Гимзе (Меньшиков и др., 1987); количество клеток костного мозга в бедренной кости - методом П.Д. Горизонтова (1983); подсчет числа эритроцитов - фотоэлектроколориметрическим методом (Меньшиков и др., 1987); концентрацию гемоглобина - гемиглобинцианидным методом (Меньшиков и др., 1987).

Интенсивность свободнорадикального окисления определяли методом индуцированной биохемилюминесценции (БХЛ) (Кузьмина, 1983); продукты ПОЛ (диеновые, триеновые конъюгаты, основания Шиффа) - в гептан-изопропанольных фракциях (Стальная, 1977; Волчегорский, 1989); концентрацию малонового диальдегида в крови - по стандартной методике (Владимиров, Арчаков, 1972); определение содержания церулоплазмина осуществлялось по методике, описанной В.Г. Колб, В.С. Камышниковым (1976).

Активность супероксиддисмутазы определяли по методу С. Чевари (1985); сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в крови - по методу Н.Д. Ещенко, Г.Г. Вольского (1982); лактатдегидрогеназы (ЛДГУ - по Кочетову (1971). Количественное определение пирувата и лактата проводили энзиматическим методом Хохорста (Асатиани, 1965; Ве^теуег, 1974).

Результаты исследований статистически обрабатывали с помощью программы ВЮБТАТ (Гланц, 1998). Независимые выборки сравнивали с

помощью однофакторного дисперсионного анализа, непараметрических критериев Крускала-Уоллиса и Ньюмена-Кейлса.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование состояния свободнорадикальных процессов, антиоксидантного статуса плазмы крови и ферментов энергетического обмена крови при курсовом внутрибрюшинном введении пчелиного яда

Многочисленные исследования функционального состояния тканевых, клеточных и внутриклеточных структур жизненно важных систем организма свидетельствуют о том, что под влиянием неблагоприятных факторов на уровне указанных компонентов возникают деструктивные изменения, в основе которых лежит усиление процессов свободнорадикального и перекисного окисления (Митрохин и др., 1991). Одним из проявлений адаптогенной активности препаратов следует считать их антиоксидантное действие, поскольку защита организма от разного рода повреждений в значительной степени связана и сопровождается повышением антиоксидантного потенциала организма (Яременко, 2008).

Через сутки после окончания внутрибрюшинного введения пчелиного яда, вызывающего в условиях нормоксии развитие реакции активации, у животных опытной группы отмечалось статистически значимое снижение показателя светосуммы Б биохемилюминесценции (р<0,05), который отражает суммарную активность процессов свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы по сравнению с контрольными и интактными животными (табл. 2).

Таблица 2

Светосумма $ (за 30 сек) и содержание продуктов перекисного окисления липидов (отн. ед.опт. пл.) в крови крыс на следующие сутки после внутрибрюшинного введения пчелиного яда (0.1 мг/кг)

Показатель Интактные Контроль (физ. раствор) Опыт (пчелиный яд)

Б, за 30 сек 92,38±5,21 92,32±1,58 79,05±1,58*#

Диеновые коньюгаты, отн. ед. оп. пл. 0,330±0,032 0,146±0,035* 0,186±0,013*

Триеновые коньюгаты, отн. ед. оп. пл. 0,267±0,010 0,132±0,014* 0,124±0,010*

Основания Шиффа, отн. ед. оп. пл. 0,025±0,002 0,019±0,003 0,007±0,002*#

Примечание: статистически значимые отличия: *- р<0,05 по отношению к ингактным; # - р<0,05 по отношению к контролю.

Данные биохемилюминесценции подтверждаются измерениями содержания продуктов ПОЛ. Уровень диеновых и триеновых конъюгатов в

крови статистически значимо снижался (р<0,05) у животных, которым вводили как физиологический раствор, так и яд относительно интактных (табл. 2). Содержание оснований Шиффа не изменялось в контроле в ответ на введение физиологического раствора. В опытной группе при введении пчелиного яда этот показатель статистически значимо снижался как относительно интактных, так и относительно контрольных животных. Диеновые и триеновые конъюгаты не являются стойкими соединениями, они быстро метаболизируют в основания Шиффа, поэтому уровень оснований Шиффа, вероятно, является более информативным показателем.

Исследование состояния антиоксидантной системы показало, что активность супероксидцисмутазы (СОД) увеличивалась в ответ на введение яда (рис. 1). При введении пчелиного яда отмечается активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (Артемов, 1969). Восстановление цитохрома Р45о, происходящее при гидроксилировании в процессе синтеза стероидных гормонов, в частности кортизола, сопровождается активацией кислорода. Образующийся при этом супероксид-анион-радикал 02" возможно индуцирует синтез фермента антиоксидантной системы защиты

сод.

Выявлено, что концентрация церулоплазмина статистически значимо снижалась у контрольных и опытных животных относительно интактных (р<0,05) (рис. 1). По мнению Н.К. Зенкова с сотр. (2001), церулоплазмин выступает в качестве донора меди для других медьсодержащих белков, в частности СОД. Способность церулоплазмина окислять ионы Бе2+ , а также ингибировать ОН-радикалы делает его наиболее эффективным сывороточным ингибитором активных форм кислорода (АФК) (Зенков и др., 2001).

Т 1-6

- 1.4

"1.25 -1 §

-- 0.8 | -■ 0.6 *

- 0.4 з = - 0.2 -- 0

■■СОД —♦—ЦП

Рис. 1. Активность супероксидцисмутазы (ед/г Нв х мин) и концентрация церулоплазмина (мкмоль/л) в крови крыс через сутки после курсового внутрибрюшинного введения пчелиного яда (0.1 мг/кг)

Примечание: статистически значимые отличия: *- р<0,05 по отношению к интактным животным; # - р<0,05 по отношению к контролю.

Исследованные показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты свидетельствуют о том, что курсовое введение

пчелиного яда экспериментальным животным сопровождается снижением интенсивности процессов ПОЛ и повышением активности антиоксидантной системы защиты крови организма экспериментальных животных.

Исследование ферментов энергетического обмена клеток крови на следующие сутки после окончания введения препарата показало, что пчелиный яд практически не изменяет активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в крови по сравнению с контрольной группой и вызывает статистически значимое увеличение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в 2,7 раз (рис. 2). Это согласуется с данными Гаркави Л.Х. и др. (1998), сообщающими, что при реакции активации в лимфоцитах значительно повышается активность СДГ.

120

цитатные физ. р-р пчел, яд

-«-сдг-4-лдГ

Рис. 2. Активность СДГ (нмоль/мл х мин) в крови и ЛДГ (U/л) в плазме крови 1фыс на следующие сутки после окончания курсового внутрибрюшинного введения пчелиного яда (0.1 мг/кг)

Примечание: статистически значимые отличия: *- р<0,05 по отношению к интактным; # - р<0,05 по отношению к контролю.

Таким образом, реакция активации, развивающаяся в ответ на внутрибрюшинное введение пчелиного яда в дозе ОД мг/кг, способствовала снижению интенсивности ПОЛ, активации антиоксидантной системы, что было отражено в снижении светосуммы S биохемилюминесценции, снижении концентрации оснований Шиффа, наблюдаемом увеличении активности СОД. Известно, что введение малых доз пчелиного яда характеризуется дополнительным синтезом глюкокортикоидов в надпочечниках. Синтез кортизола сопровождается выделением небольшого числа активных форм кислорода, которые могут участвовать в индукции ферментов антиоксидантной системы организма, в частности и супероксиддисмутазы.

Резкое увеличение активности СДГ указывает на активацию процессов окисления и свидетельствует о возможном энергостимулирующем эффекте пчелиного яда. Данный эффект, вероятно, можно также объяснить активацией симпатоадреналовых механизмов при введении пчелиного яда и усилением потребления кислорода организмом (Крылов, 2008), что несомненно

стимулирует работу электронпереносящей цепи, и в частности второй митохондриальный комплекс.

Определение возникновения состояния устойчивости к гипоксии при внутрибрюшинном введении пчелиного яда

При моделировании гипобарической гипоксии (подъем на условную высоту 8 тыс. м) установлено увеличение в крови контрольных крыс («гипоксия») общего количества лейкоцитов на 66% по сравнению с этим показателем у интактных животных (р<0,05) (табл. 3). Изучение лейкоцитарной формулы показало, что у животных группы «гипоксия» и «гипоксия + физ. раствор» наблюдались лимфопения и нейтрофильный лейкоцитоз, лейкоцитарный коэффициент в данных группах был статистически значимо ниже на 64%, чем у интактных (табл. 3). Это свидетельствует о формировании у контрольных групп животных состояния типичной стресс-реакции (Горизонтов, 1983; Гаркави, 1990; Барабой, 2006). Вероятно, лейкоцитоз в периферической крови при стрессе связан, кроме мобилизации пристеночного пула клеток, также и с выходом зрелых лейкоцитов из костного мозга. В пользу этого указывает снижение количества клеток костного мозга в бедренной кости крыс в контрольных группах на 41% по сравнению с интактными животными (табл. 3). По мнению O.K. Гаврилова с сотр. (1985), при стресс-реакции глнжокортикоиды вызывают нейтрофилез за счет усиления поступления зрелых нейтрофилов из костного мозга в кровь.

Таблица 3

Общее содержание лейкоцитов в периферической крови крыс и количество клеток костного мозга в бедренной кости после гипоксии при предварительном внутрибрюшинном введении пчелиного яда (0.1 мг/кг)

Показатель Интактные Контроль (гипоксия) Контроль (гипоксия+ физ. раствор) Опыт (гипоксия+ р-р пч. яда)

Лейкоциты, х 109кл/л 16,65±1,14 27,60+2,41* 23,05+1,17 18,37+0,58

Лимфоциты, % 77,63+0,75 63,8611,60* 60,14±3,76* 72,88±3,38#+

Сегментоядерные нейтрофилы, % 10,50±0,57 24,0711,72* 24,43+2,29* 16,44±2,29*# +

Лейкоцитарный коэффициент 7,39+0,24 2,65±0,13* . 2,64+0,21* 4,43±0,41*#+

Клетки костного мозга, хЮ6 в 1 бедр. к. 8.88±0.61 5.25+0.25* 5.20±0.26* 7.77±0.61#+

Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интакгным; # - р<0,05 по отношению к группе «гипоксия»; + - р<0,05 по отношению к контролю.

У животных, которым предварительно вводили пчелиный яд, подъем на высоту не приводил к возникновению стресса, что подтверждается сохранением содержания лейкоцитов равным таковому у интактных крыс (табл. 3). Количество лимфоцитов, сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов в опытной группе приближались к соответствующим показателям интактной группы животных. Количество клеток костного мозга в бедренной кости в опытной группе статистически значимо не отличалось от этого показателя у интактных животных (табл. 3). Данные показатели свидетельствуют об адаптированности животных к используемым условиям гипобарической гипоксии.

При оценке интенсивности свободнорадикальных процессов по показателям биохемилюминесценции (рис. 3) в условиях гипоксии было установлено незначительное увеличение светосуммы Б в контрольной группе животных, которой вводили физиологический раствор, что свидетельствует об активации свободнорадикального окисления. Вероятно, что при гипобарической гипоксии наиболее выражена стадия тревоги стресса с высоким уровнем адреналина в крови, на которую накладывается болевая реакция на инъекцию раствора.

Рис. 3. Светосумма Б (за 30 сек) в плазме крови крыс после гипобарической гипоксии при предварительном внутрибрюшинном введении пчелиного яда (0.1 мг/кг)

Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интаютым животным; # - р<0,05 по отношению к группе «гипоксия»; + - р<0,05 по отношению к контролю.

Показатель светосуммы Б, позволяющий оценить интенсивность свободнорадикальных процессов, достоверно снижался в опытной группе по сравнению с данным показателем у контрольных животных на 20% и сохранялся на уровне интактных. В опытной группе скорость нарастания

перекисного окисления ниже, чем в контрольной, что свидетельствует в пользу того, что адаптационная реакция в опытной группе животных является антистрессорной.

Можно полагать, что более слабые, чем стрессорные раздражители при многократном воздействии, также как и стрессорные, увеличивают мощность стресс-лимитирующих систем и формируют «феномен адаптационной стабилизации структур» (ФАСС), который проявляется в высокой устойчивости внутриклеточных компонентов к неблагоприятным воздействиям (Меерсон, Малышева, 1993). В настоящее время предполагают участие данного феномена в развитии резистентности к повреждающим факторам и при других неспецифических реакциях (к гипоксии в том числе) (Гаркави, 1998). Развитие ФАСС связано с накоплением в клетках белков теплового шока, синтез которых значительно возрастает после длительных или многократных воздействий (Меерсон, 1992). Усиление синтеза белков теплового шока индуцируется катехоламинами и кортикостероидами, образование которых усиливается при введении пчелиного яда. Феномен адаптационной стабилизации структур связан с механизмами долговременной адаптации.

Определение типа адаптационной реакции при курсовом пероральном введении нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, экспериментальным животным в условиях нормоксии.

Задачей данной серии эксперимента являлось определение типа неспецифической адаптационной реакции при курсовом пероральном введении зоотоксинов пчелы в составе нанокомпозитов по физиолого-биохимическим показателям системы крови и активности СРО. Для её решения был осуществлен анализ показателей лейкоцитарной формулы и индуцированной биохемилюминесценции плазмы крови. Проведено исследование действия двух доз пчелиного яда в составе нанокомпозитов: 0,5 и 1 мг/кг.

Анализ параметров крови (общее количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула) и интенсивности свободнорадикального окисления выявил, что через сутки после окончания перорального введения нанокомпозитов формирование адаптационной реакции развивается не полностью, так как заметного процесса изменения активности свободнорадикального окисления не происходило. Поэтому для выявления сроков полного формирования адаптационной реакции увеличили временной интервал и проводили исследование тех же показателей через неделю после окончания введения нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд.

Изучение показателей белой крови через 7 суток после окончания введения препарата позволило выявить, что содержание лейкоцитов в данном эксперименте в исследуемых группах сохранялось на одном уровне с интактными животными (табл. 4). В контрольной группе наблюдалось статистически значимое увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов на 21% относительно интактных крыс. Лейкоцитарный

коэффициент в контрольной группе относительно интактных животных не изменялся. Вероятно, у * крыс контрольной группы формируется неспецифическая реакция тренировки.

Таблица 4

Содержание лейкоцитов и лейкоцитарная формула в крови крыс через 7 суток после окончания перорального введения препаратов пчелиного яда

Показатель Интактные Контроль (хитозан + золото) Опыт (хитозан + золото + пчел, яд, 0,5 мг/кг) Опыт (хитозан + золото + пчел, яд, 1 мг/кг)

Лейкоциты, х 109кл/л 13,48±1,69 14,16±1,29 10,96±0,44 13,32±2,01

Сегментоядерные нейтрофилы, % 18,34±0,80 22,20±1,51* 13,60±0,38*# 17,34±1,65#+

Лимфоциты, % 74,66±0,31 74,08±1,65 82,64±0,74*# 79,78±2,01 *#

Лейкоцитарный коэффициент 4,09±0,17 3,42±0,33 6,11±0,23*# 4,85±0,61#+

Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0,05 по отношению к интактным; # - р<0,05 по отношению к контролю, + - р<0,05 по отношению к 1 опытной группе.

В обеих опытных группах количество лимфоцитов статистически значимо увеличивалось соответственно на 11% и 7%, а относительное содержание сегментоядерных нейтрофилов уменьшалось только в опытной группе (с дозой пчелиного яда 0,5 мг/кг в составе нанокомпозитов) на 26% относительно интактных животных (р<0,05). Лейкоцитарный коэффициент статистически значимо повышался в данной опытной группе на 49% относительно исходного показателя (р<0,05). Во второй опытной группе количество сегментоядерных нейтрофилов оставалось на уровне интактных крыс, а также наблюдалась тенденция к увеличению лейкоцитарного коэффициента относительно этой группы животных. Таким образом, в опытных группах развивается реакция активации, причем в опытной группе с дозой пчелиного яда 0,5 мг/кг в составе нанокомпозитов адаптационная реакция более выражена.

Через 7 суток после окончания введения препарата в контрольной группе не наблюдалось статистически значимых изменений свободнорадикального окисления относительно интактных. Однако в опытных группах отмечалось статистически значимое снижение активности свободнорадикального окисления. Показатель светосуммы Б БХЛ снижался в опытных группах относительно интактных в равной степени на 14% (рис. 4).

интактные хитозан+золото хитозан+золото+пч. хитозан+золаго+пч.

яд 0,5 мг/кг яд 1 мг/кг

Рис. 4. Светосумма Б плазмы крови крыс через 7 суток после окончания перорального введения препаратов

Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0,05 по отношению к шггактным животным; # - р<0,05 по отношению к контролю.

Таким образом, через неделю после перорального введения нанокомпозитов организм животных находился в состоянии наибольшей степени адаптированности. В использованных дозах пчелиный яд в составе нанокомпозитов вызывал развитие неспецифической реакции активации. Однако нанокомпозиты с дозой 0.5 мг/кг оказывали более выраженную адаптационную реакцию. Введение нанокомпозитов обеим опытным группам вызывало индукцию антиоксидантной системы организма через 7 суток после окончания введения препаратов.

Определение возникновения состояния устойчивости к гипоксии при пероральном введении нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд

Сравнивая действие двух доз пчелиного яда в составе нанокомпозитов (0,5 и 1 мг/кг) при применений в условиях нормоксии, нами найдено, что наиболее эффективной является доза 0,5 мг/кг. Наши исследования также показали, что в отличие от развития адаптационной реакции через сутки после внутрибрюшинного введения пчелиного яда формирование состояния устойчивой активации при пероральном применении в условиях нормоксии достигается через 7 суток после окончания использования препаратов. Поэтому в данном эксперименте использовалась доза пчелиного яда 0,5 мг/кг в составе нанокомпозитов, и животных подвергали гипобарической гипоксии через 7 суток после окончания перорального введения нанокомпозитов.

Было выявлено, что количество лейкоцитов в крови крыс, находившихся в условиях гипоксии, через 7 суток после окончания введения препаратов повышалось одинаково во всех группах, подвергавшихся гипоксии, по сравнению с интактными животными (табл. 5). Это свидетельствует о развитии реакции системы крови на гипоксическое повреждение.

Таблица 5

Содержание лейкоцитов и лейкоцитарная формула в крови крыс при моделировании гипобарической гипоксии через неделю после окончания перорального введения нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд

Показатель Интактные Контроль (гипоксия) Контроль (гипоксия+ хитозан -золото) Опыт (гипоксия+ хитозан-золото-пч. яд 0.5 мг/кг)

Лейкоциты, х 109 кл/л 16.65±1.14 27.60±2.41* 28.44±3.95* 28.44±1.71*

Сегментоядерные нейтрофилы, % 12,75±0,92 22,50±2,07* 16,№1,17 12,50±1,17#+

Лимфоциты, % 73,50±2,13 57,50±4,15* 64,70±2,97 69,30±3,11#

Лейкоцитарный коэффициент 6,01±0,68 2,56±0,21* 4,00±0,24* 5,80±0,69#+

Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интакгаым животным; # - р<0,05 по отношению к контролю (гипоксия).

Изучение относительного содержания разных форм лейкоцитов показало лимфопению и сегментоядерный нейтрофилез, а также снижение значения лейкоцитарного коэффициента в контрольной группе на гипоксию относительно интактных крыс (табл.5). Это свидетельствует о развитии стресс-реакции в контрольной группе в ответ на гипоксию. В другой контрольной группе животных, которой вводили препарат хитозан+золото, было зафиксировано статистически значимое снижение лейкоцитарного коэффициента относительно интактных, но в меньшей степени, чем в контрольной группе «гипоксия». Также в данной группе выявлена четкая тенденция к лимфопении и нейтрофилезу. Это указывает на адаптационный ответ с меньшими признаками повреждения, чем в группе «гипоксия». В опытной группе количество лимфоцитов, сегментоядерных нейтрофилов и лейкоцитарный коэффициент оставались на уровне соответствующих показателей интактных животных. Это свидетельствует об адаптированности опытных животных, находящихся в условиях реакции устойчивой активации к действию повреждающего влияния гипоксического фактора по сравнению с контрольными животными.

Существенному изменению при гипоксии подвергается активность лактатдегидрогеназы в плазме крови. Активность ЛДГ в контрольной группе («гипоксия») увеличивалась на 48% (р<0,05) (рис. 5). Нарушение метаболизма углеводов, а именно резкое его усиление по пути анаэробного гликолиза, помимо снижения количества синтезируемой АТФ, приводит к накоплению молочной кислоты. Накопление восстановленных эквивалентов в клетке ограничивает утилизацию лактата через окисление его в пируват (Хватова, Мартынов, 1977).

Снижение активности фермента ЛДГ в контрольной «хитозан + золото» и опытной «хигозан+золото+пчелиный яд» группах через неделю после

окончания перорального введения свидетельствует о переключении метаболизма по пути полного окисления пирувата в условиях дефицита кислорода (рис. 5)

250

интактные

гипоксия

гип+хит+зол

гип+жт+зол+пч. яд 0.5 мг/кг

Рис. 5. Активность ЛДГ (ммоль пирувата/ мин х мкг белка) в плазме крыс через неделю после курсового перорального введения нанокомпозитов в условиях гипобарической гипоксии

Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0.05 по отношению к интактным животным; # - р<0,05 по отношению к группе «гипоксия».

Таким образом, наши исследования показывают, что устойчивость к гипоксии при пероральном способе введения препаратов развивается через 7 дней после окончания введения препаратов. Вероятно, процессы всасывания компонентов нанокомпозитов, развитие реакции крови, а также индукция антиоксидантной системы требуют определенного периода времени, большего, чем при внутрибрюшинном введении пчелиного яда.

Следовательно, курсовое пероральное введение нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, оказывает адаптогенное действие, что свидетельствует о перспективности их профилактического применения с целью повышения адаптационных возможностей организма в условиях гипоксии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Курсовое внутрибрюшинное введение лабораторным животным пчелиного яда в дозе 0,1 мг/кг, вызывающее развитие неспецифической адаптационной реакции устойчивой активации непосредственно после окончания введения препарата, сопровождается снижением интенсивности перекисного окисления липидов и увеличением антиоксидантного статуса организма. Предположительно, введение зоотоксинов вызывает активацию симпатоадреналовой и гипоталамо-гипофизо-надпочечниковой систем, и, как

следствие, продукцию активных форм кислорода, которые с большой долей вероятности индуцируют мощность антиоксидантной системы защиты. Наблюдаемое повышение активности сукцинатдегидрогеназы указывало на стимуляцию биоэнергетических процессов.

При моделировании барометрической гипоксии у контрольных животных происходило развитие стресса, о чем свидетельствовали показатели лейкоцитарной формулы. В опытных группах, которым предварительно вводили раствор пчелиного яда, развития стресс-реакции после барометрической гипоксии в организме не наблюдалось. По всей видимости, это связано с реализацией стресс-лимитирующих систем, индуцируемых предварительным введением яда. Таким образом, реакция устойчивой активации, формирующаяся при курсовом внутрибрюшинном введении пчелиного яда, характеризуется возникновением устойчивости лабораторных животных к гипоксии.

При пероральном введении нанокомпозитов, содержащих зоотоксины пчелы, возникновение реакции устойчивой активации наблюдалось через неделю после окончания применения препаратов. Можно полагать, что это обусловлено неполным всасыванием нанокомпозитов, а также длительной диссоциацией компонентов яда от ядра всосавшихся наночастиц в крови. Реакция активации, вызванная пероральным введением нанокомпозитов, как и при внутрибрюшинном введении яда, сопровождается индукцией антиоксидантной системы.

Реакция активации, развивающаяся через неделю после окончания перорального введения нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, характеризуется резистентностью к гипоксии, на что указывали индикаторные показатели системы крови. Это, видимо, связано с повышением антиоксидантного статуса организма и коррекцией энергетического обмена.

Полученные результаты указывают на перспективность использования нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, в качестве адаптогена к экологически неблагоприятным условиям, в частности, гипоксии.

ВЫВОДЫ

1. Развитие неспецифической адаптационной реакции устойчивой активации, вызванное курсовым внутрибрюшинным введением пчелиного яда (0.1 мг/кг) крысам, характеризуется статистически значимым повышением содержания эритроцитов, снижением светосуммы Б биохемилюминесценции, уменьшением содержания продуктов липопероксидации (диеновых, триеновых конъюгатов и оснований Шиффа), увеличением активности СОД и

сдг.

2. Адаптационная реакция устойчивой активации, индуцированная курсовым внутрибрюшинным введением пчелиного яда (0,1 мг/кг) сопровождается формированием устойчивости лабораторных животных к гипобарической гипоксии спустя сутки после окончания инъекций, о чем свидетельствуют:

а) соответствие количества и соотношения форменных элементов крови условиям нормы;

б) снижение интенсивности свободнорадикальных процессов и нормализация активности ферментов энергетического обмена.

3. Курсовое пероральное введение нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд (0,5 мг/кг и 1 мг/кг), экспериментальным животным вызывает возникновение адаптационной реакции устойчивой активации через неделю после окончания введения препаратов.

4. Реакция устойчивой активации, стимулированная пероральным введением нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, приводит к повышению устойчивости крыс к гипоксии, на что указывает:

а) соответствие индикаторных показателей системы крови опытных животных параметрам нормы,

б) снижение интенсивности свободнорадикальных процессов, активация антиоксидантной системы, уменьшение активности лактатдегидрогеназы плазмы крови.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Александрова, О.И. (Коновалова, О.И.) Влияние пчелиного яда на энергетический обмен, перекисное окисление липидов и систему крови в условиях кратковременной барометрической гипоксии / О.И. Александрова (О.И. Коновалова), Е.А. Ерофеева, A.C. Корягин, В.В. Логинов // Естествознание и гуманизм. Сб. науч. трудов. - 2006. - Т. 3. - № 3. - С. 73.

2. Александрова, О.И. (Коновалова, О.И.) Влияние пчелиного яда на интенсивность перекисного окисления липидов и энергетический обмен у крыс при многократном введении в условиях относительной нормы / О.И. Александрова (О.И. Коновалова), Е.А. Ерофеева, A.C. Корягин, О.Н. Гамова // Естествознание и гуманизм. Сб. науч. трудов. - 2006. - Т. 3. - № 4.- С. 36.

3. Корягин, A.C. Адаптогенные свойства пчелиного яда при действии экстремальных факторов различной природы / A.C. Корягин, Е.А.Ерофеева, О.И. Александрова (О.И. Коновалова) // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - 2007. - №3. - С. 113-115.

4. Александрова, О.И. (Коновалова, О.И.) Сравнительный анализ адаптогенных свойств некоторых зоотоксинов в условиях кратковременной барометрической гипоксии / О.И. Александрова (О.И. Коновалова) // Вятский медицинский вестник. Мат-лы Всероссийской научно-практ. конференции «Актуальные вопросы современной биохимии», поев. 20-летию Кировской государственной медицинской академии. - 2007. - №4. - С. 81-83.

5. Александрова, О.И. (Коновалова, О.И.) Адаптогенные свойства пчелиного яда в условиях кратковременной барометрической гипоксии / О.И. Александрова (О.И. Коновалова), Е.А. Ерофеева, М.Н. Таламанова, О.Н. Гамова // Мат-лы докл. XIV Междунар. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых учёных «ЛОМОНОСОВ». [Электронный ресурс] - 2007.

6. Александрова, О.И. (Коновалова, О.И.) Сравнительный анализ адаптогенных свойств некоторых зоотоксинов в условиях кратковременной барометрической гипоксии / О.И. Александрова (О.И. Коновалова), Е.А. Ерофеева // Тез. докл. V Всероссийской конф. с межд. участием, поев. 100-летию со дня рожд. В.Н. Черниговского. - 2007. - С. 27-28.

7. Александрова, О.И. Исследование типа неспецифического адаптационного ответа и антиоксидантно-прооксидантного статуса организма при пероральном введении пчелиного яда в составе нанокомпозитов / О.И. Александрова (О.И. Коновалова) // XIII Нижегородская сессия молодых ученых. Естественно-научные дисциплины. - 2008. - С. 7.

8. Корягин, A.C. Исследование неспецифического адаптационного ответа и антиоксидантно-прооксидантного статуса организма при пероральном введении нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд / A.C. Корягин, Е.А. Ерофеева, О.И. Александрова (О.И. Коновалова) // Биология: Теория, практика, эксперимент: мат-лы Междунар. науч. конф., поев. 100-летию со дня рожд. д.б.н., проф. Сапожниковой Е.В. Кн.2. - 2008. - С. 180-182.

Подписано к печати 02.02.09. Формат 60х84'/.6. Бумага писчая. Печать офсетная. Гарнитура «Тайме» Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ 15.

Полиграфический участок НГМА > 603005, Н. Новгород, ул. Алексеевская, 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коновалова, Ольга Игоревна

Введение.

1. Обзор литературы.:.

1.1. Неспецифические адаптационные реакции организма.

1.2. Молекулярные и физиологические механизмы гипоксии.

1.3. Адаптогены.

1.3.1. Химический состав пчелиного яда и его биологическое действие.

1.3.2. Золотосодержащие нанокомпозиты хитозана и их биологическое действие на организм.

2. Материалы и методы исследования.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Физиолого-биохимические показатели состояния системы крови крыс после курсового внутрибрюшинного введения яда пчелы.

3.1.1. Исследование состояния свободнорадикальных процессов, антиоксидантного статуса плазмы крови и ферментов энергетического обмена крови при курсовом внутрибрюшинном введении пчелиного яда в условиях нормоксии.

3.1.2. Определение возникновения состояния устойчивости к гипоксии при внутрибрюшинном введении пчелиного яда

3.2. Определение типа адаптационной реакции при курсовом пероральном введении нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, экспериментальным животным.

3.2.1. Определение типа адаптационной реакции при курсовом пероральном введении нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, экспериментальным животным в условиях нормоксии.

3.2.2. Диагностика возникновения состояния устойчивости к гипоксии при пероральном введении нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ адаптогенного действия пчелиного яда к гипобарической гипоксии при внутрибрюшинном и пероральном введении лабораторным животным"

Актуальность проблемы

Роль гипоксии очень велика в развитии многих альтерирующих изменений в организме человека. Практически при всех нарушениях сердечнососудистой системы, лёгких, системы крови, отравлениях изменяется либо доставка, либо утилизация кислорода. Классические химически синтезированные антигипоксанты, обычно косвенно снижающие последствия гипоксических состояний, зачастую обладают симптоматическим действием и имеют серьезные побочные эффекты. В решении указанной проблемы большое значение принадлежит поиску натуральных адаптогенных средств, которые включают зоо- и фитопрепараты, в том числе и зоотоксины (Яременко, 2008).

В настоящее время известно три типа адаптационных реакций: стресс, реакция активации и реакция тренировки. Стресс развивается в ответ на действие сильных раздражителей, обычно неблагоприятных для организма (Селье, 1972, 1977). При стрессе, наряду с элементами защиты, имеются элементы повреждения. Реакция активации развивается в ответ на средние по силе воздействия. При продолжительном действии раздражителя средней силы развивается устойчивая (стойкая) активация (Гаркави и др. 1998). Реакция тренировки возникает при действии на организм относительно слабых раздражителей. В отличие от стресса изменения при реакции активации и тренировки по своему характеру близки к вариантам нормы. На этой стадии происходит повышение резистентности, обусловленной подъёмом активности защитных и регуляторных систем организма (Гаркави и др., 1990).

Пчелиный яд представляет собой многокомпонентную систему, и, соответственно, может одновременно воздействовать на многие ре1уляторные и исполнительные системы организма. Хорошо известно, что малые дозы пчелиного яда оказывают радиозащитное действие, причем в его основе лежат механизмы развития неспецифической адаптационной реакции активации ((Корягин, Ерофеева, 2004; Корягин, 2007). Необходимо отметить, что исследований по изучению адаптогенных эффектов малых доз пчелиного яда к условиям действия других экологических неблагоприятных факторов, в частности, вызывающих развитие гипоксии, практически не проводилось.

В связи с высокой аллергенной и антигенной активностью пчелиного яда внутрибрюшинное введение зоотоксинов является малоперспективным в практической медицине. Более предпочтительным и общепризнанным методом применения препаратов является пероральный. Однако, поскольку яд пчелы имеет белково-пептидную природу и способен разрушаться протеазами пищеварительного тракта, его введение через рот в организм малоэффективно. Одним из вариантов решения этой задачи является пероральное введение зоотоксинов в составе нанокомпозитов, созданных на основе хитозана и наночастиц золота, способных связывать яд, предотвращать его разрушение, а также облегчать транспортировку в кровь через внутренний эпителиальный барьер кишечника (Таламанова и др., 2008).

Система крови является интегративной системой, наиболее полно отражающей состояние и характер метаболизма всего организма. Она играет решающую роль в развитии неспецифических и специфических реакций защиты организма. Кровь легко доступна для динамического и комплексного анализа. В качестве основных индикаторных показателей типа адаптационных реакций используют лейкоцитарную формулу и лейкоцитарный коэффициент (отношение между процентным содержанием лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов). Данные параметры шмеостаза крови достаточно полно отражают состояние важнейших физиологических систем и используются в качестве критериев адаптационных реакций организма (Васильев и др., 1992).

Вышеизложенное указывает на важность исследований по изучению адаптогенных свойств яда пчелы и нанокомпозитов, содержащих зоотоксины пчелы к условиям гипобарической гипоксии.

Цель исследования

Проведение анализа адаптогенного действия яда пчелы медоносной (Apis mellifera L.) к условиям гипобарической гипоксии, оцениваемого по показателям системы крови лабораторных животных, при курсовом внутрибрюшинном введении пчелиного яда и пероральном применении нанокомпозитов, содержащих зоотоксины пчелы.

Задачи исследования

1. Исследовать состояние свободнорадикальных процессов, антиоксидантного статуса плазмы крови, некоторых ферментов энергетического обмена и форменных элементов крови при курсовом внутрибрюшинном введении пчелиного яда экспериментальным животным в дозах, вызывающих развитие адаптационной реакции устойчивой активации.

2. Оценить возникновение резистентности экспериментальных животных к гипобарической гипоксии по показателям системы крови, активности процессов перекисного окисления липидов и активности ферментов энергетического обмена при предварительном курсовом внутрибрюшинном введении пчелиного яда.

3. Определить тип адаптационной реакции и изучить ее формирование у экспериментальных животных по показателям системы крови и свободнорадикального окисления при курсовом пероральном введении нанокомпозитов, содержащих зоотоксины пчелы.

4. Установить возникновение резистентности к гипобарической гипоксии лабораторных животных при предварительном пероральном введении нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, по показателям системы крови, свободнорадикальных процессов и активности ферментов энергетического обмена.

Научная новизна исследования

Впервые показано, что внутрибрюшинное курсовое введение лабораторным животным раствора яда пчелы (0,1 мг/кг), вызывающее в условиях нормоксии развитие неспецифической адаптационной реакции устойчивой активации, сопровождается снижением интенсивности свободнорадикальных процессов, увеличением мощности антиоксидантной системы организма, повышением активности фермента энергетического обмена сукцинатдегидрогеназы.

Впервые установлено, что реакция устойчивой активации, развивающаяся непосредственно после окончания курсового внутрибрюшинного введения пчелиного яда (0,1 мг/кг) характеризуется резистентностью к барометрической гипоксии.

Впервые выявлено, что при курсовом пероральном введении нанокомпозитов, содержащих зоотоксины пчелы, реакция активации и резистентность к гипоксии формируются в течение недели после окончания применения препаратов.

Научно-практическая значимость

Полученные результаты расширяют представления о физиологических механизмах адаптации и поддержания постоянства внутренней среды организма в условиях гипоксии. Выявленные адаптогенные свойства раствора пчелиного яда (0,1 мг/кг) в условиях моделирования гипобарической гипоксии дополняют знания о молекулярных механизмах реагирования организма на возникающий дефицит кислорода. Обнаруженные адаптогенные эффекты нанокомпозитов, содержащих зоотоксины пчелы, открывают перспективу их профилактического применения с целью повышения адаптационной устойчивости организма в условиях гипоксии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Адаптационная реакция устойчивой активации, вызванная курсовым внутрибрюшинным введением яда пчелы (0,1мг/кг) крысам, сопровождается снижением интенсивности свободнорадикальных процессов, усилением мощности антиоксидантной системы плазмы крови и увеличением активности энергетических процессов.

2. Реакция устойчивой активации развивается непосредственно после окончания внутрибрюшинных инъекций пчелиного яда (0,1 мг/кг) лабораторным животным и характеризуется повышением толерантности к гипобарической гипоксии.

3. Курсовое пероральное введение нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, экспериментальным животным вызывает развитие неспецифической адаптационной реакции устойчивой активации спустя неделю после окончания применения препаратов.

4. Реакция устойчивой активации, возникающая при курсовом пероральном введении нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд (доза 0,5 мг/кг), приводит к возникновению резистентности животных к гипобарической гипоксии.

Апробация работы

Результаты работы были доложены и обсуждены на XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии», посвященной 20-летию Кировской государственной медицинской академии (Киров, 2007), Международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения д.б.н., проф. Сапожниковой Е.В. (Саранск, 2008), XIII Нижегородской сессии молодых ученых (Нижний Новгород, 2008), Нижегородском биохимическом обществе (Нижний Новгород, 2008).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 126 страницах, включая список литературы, и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов, приложения и библиографического указателя. Список цитируемой литературы содержит 147 источников. Диссертация иллюстрирована 37 таблицами, 16 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Коновалова, Ольга Игоревна

ВЫВОДЫ

1. Развитие неспецифической адаптационной реакции устойчивой активации, вызванное курсовым внутрибрюшинным введением пчелиного яда (0.1 мг/кг) крысам, характеризуется статистически значимым повышением содержания эритроцитов, снижением светосуммы S биохемилюминесценции, уменьшением содержания продуктов липопероксидации (диеновых, триеновых конъюгатов и оснований Шиффа), увеличением активности СОД и СДГ.

2. Адаптационная реакция устойчивой активации, индуцированная курсовым внутрибрюшинным введением пчелиного яда (0,1 мг/кг) сопровождается формированием устойчивости лабораторных животных к гипобарической гипоксии спустя сутки после окончания инъекций, о чем свидетельствуют: а) соответствие количества и соотношения форменных элементов крови условиям нормы; б) снижение интенсивности свободнорадикальных процессов и нормализация активности ферментов энергетического обмена.

3. Курсовое пероральное введение нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд (0,5 мг/кг и 1 мг/кг), экспериментальным животным вызывает возникновение адаптационной реакции устойчивой активации через неделю после окончания введения препаратов.

4. Реакция устойчивой активации, стимулированная пероральным введением нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, приводит к повышению устойчивости крыс к гипоксии, на что указывает: а) соответствие индикаторных показателей системы крови опытных животных параметрам нормы, б) снижение интенсивности свободнорадикальных процессов, активация антиоксидантной системы, уменьшение активности лактатдегидрогеназы плазмы крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Курсовое внутрибрюшинное введение лабораторным животным пчелиного яда в дозе 0,1 мг/кг, вызывающее развитие неспецифической адаптационной реакции устойчивой активации непосредственно после окончания введения препарата, сопровождается снижением интенсивности перекисного окисления липидов и увеличением антиоксидантного статуса организма. Предположительно, введение зоотоксинов вызывает активацию симпатоадреналовой и гипоталамо-гипофизо-надпочечниковой систем, и, как следствие, продукцию активных форм кислорода, которые с большой долей вероятности индуцируют мощность антиоксидантной системы защиты. Наблюдаемое повышение активности сукцинатдегидрогеназы указывало на стимуляцию биоэнергетических процессов.

При моделировании барометрической гипоксии у контрольных животных происходило развитие стресса, о чем свидетельствовали показатели лейкоцитарной формулы. В опытных группах, которым предварительно вводили раствор пчелиного яда, развития стресс-реакции после барометрической гипоксии в организме не наблюдалось. По всей видимости, это связано с реализацией стресс-лимитирующих систем, индуцируемых предварительным введением яда. Таким образом, реакция устойчивой активации, формирующаяся при курсовом внутрибрюшинном введении пчелиного яда, характеризуется возникновением устойчивости лабораторных животных к гипоксии.

При пероральном введении нанокомпозитов, содержащих зоотоксины пчелы, возникновение реакции устойчивой активации наблюдалось через неделю после окончания применения препаратов. Можно полагать, что это обусловлено неполным всасыванием нанокомпозитов, а также длительной диссоциацией компонентов яда от ядра всосавшихся наночастиц в крови. Реакция активации, вызванная пероральным введением нанокомпозитов, как и при внутрибрюшинном введении яда, сопровождается индукцией антиоксидантной системы.

Реакция активации, развивающаяся через неделю после окончания перорального введения нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, характеризуется резистентностью к гипоксии, на что указывали индикаторные показатели системы крови. Это, видимо, связано с повышением антиоксидантного статуса организма и коррекцией энергетического обмена.

Полученные результаты указывают на перспективность использования нанокомпозитов, содержащих пчелиный яд, в качестве адаптогена к экологически неблагоприятным условиям, в частности, гипоксии.

102

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коновалова, Ольга Игоревна, Нижний Новгород

1. Ажуцкий Д.Г., Ажуцкий Г.Ю., Борисенко С.Н. Взаимодействие мелиттина пчелиного яда с альбумином крови человека // Украинский биохимический журнал. - 1995. - Т. 67, №4. - С. 54-62.

2. Артемов Н.М. Физиологические основы действия на организм пчелиного яда. Автореф. дисс. д-ра биол. наук. Горький, 1969. - 55 с.

3. Артемов Н.М., Зевеке А.В. Физиологический анализ гипотензивного действия пчелиного яда // Яды пчел и змей в биологии и медицине : Уч. зап. Горьк. ун-та. Сер. биол. — Горький, 1967. Вып. 82. — С. 25-47.

4. Артемов Н.М., Конькова Л.Г. Влияние пчелиного яда на функцию половой системы самок крыс // Матер. Межд. симпоз. по применению продуктов пчеловодства в медицине и ветеринарии в Москве. Бухарест: Апимондия, 1972. - С. 27-30.

5. Артемов Н.М., Корнева Н.В., Крылов В.Н. К вопросу о действии пчелиного яда на функциональное состояние сердечно-сосудистой системы // Уч. зап. Горьк. ун-та. — Горький, 1974. Вып. 175. - С. 65-71.

6. Ашмарин И.П. Нейрохимия. М.: Изд-во Института Биомедицинской химии РАМН, 1996. - 470с.

7. Байдан А.В., Жолос А.В. Апамин — высокоспецифичный и эффективный блокатор некоторых кальцийзависимых и калиевых проводимостей // Нейрофизиология. 1988. - Т.20, №6. - С. 843-846.

8. Барабой В.А. Стресс: природа, биологическая роль, механизмы, исходы. — Киев: Фитосоциоцентр, 2006. —424 с.

9. Баркаган JI.3. Нарушение гемостаза у детей. — М.: Медицина, 1993. —176

10. Барсукова Л.П., Котляревская Е.С., Марьяновская Г.Я. К вопросу об энергетическом гомеостазе организма при развитии различных адаптационных реакций // Гомеостатика живых и технических систем. —Иркутск, 1987.-С.49-50

11. Белоусов Ю. Б., Леонов М. В. Антогонисты кальция пролонгорованного действия и сердечно-сосудистая заболеваемость// Кардиология. 2001. - № 4. — С. 87-93.

12. Бельченко Л.А. Адаптация человека и животных к гипоксии разного происхождения // Соросовский образовательный журнал. 2001. — Т. 7, №7. — С. 33-39.

13. Брехман ИИ. Валеология наука о здоровье // Новые данные об элеутерококке и других адаптогенах. - Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1981. — С. 7-11.

14. Вальдман А.В. Нервная система и гомеостаз // Гомеостаз. М., 1981. -С.29-44.

15. Ванеева О.Ю. Влияние ядов пчелы, жабы и саламандры на систему крови при фракционированном гамма-облучении крыс. Автореф. дис. .канд. биол. наук. Н.Новгород, 2006. -20 с.

16. Васильев Н.В., Захаров Ю.М., Коляда Т.И. Система крови и неспецифическая резистентность в экстремальных климатических условиях. -Новосибирск: ВО «Наука». Сибирская издательская фирма, 1992.-257 с.

17. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. — М.: Наука, 1972. 252 с.

18. Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лифшиц Р.И. Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного

19. Гаврилов O.K., Козинец Г.И., Черняк Н.Б. Клетки костного мозга и периферической крови. -М.: Медицина, 1985. -288с.

20. Гальбрайх JI.C. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение // Соросовский образовательный журнал. — 2001. — Т.7, №1. С. 51-56.

21. Гамова О.Н Механизмы радиопротекторного действия некоторых зоотоксинов на систему кроветворения крыс при однократном и фракционированном гамма-облучении. Автореф. дис. .канд. биол. наук. -Н.Новгород, 2007. -24 с.

22. Гаркави JI.X. Адаптационная «реакция активации» и ее роль в механизме противоопухолевого влияния раздражителей гипоталамуса. Автореф. дисс . д-ра мед. наук. -Донецк, 1969. -30 с.

23. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Уколова М.А. Адаптационные реакции и резистентность организма. Ростов-на-Дону: Изд-во Ростовского ун-та, 1990. -375 с.

24. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б. О критериях оценки неспецифической резистентности организма при действии различных биологически активных факторов с позиции теории адаптационных реакций // Миллиметровые волны в биологии и медицине. 1995. -№ 6. -С. 11-21.

25. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Кузьменко Т.С. Антистрессорные реакции и активационная терапия. Реакция активации как путь к здоровью через процессы самоорганизации. -М.: ИМЕДИС, 1998. 656 с.

26. Гиниятуллин М. Г., Салихов С. С. Технология получения пчелиного яда. Рекомендации. Рига, 1991. - 40с.

27. Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. Под ред. Ю.Л. Шевченко. -СПб.: ООО «Элби-СПб», 2000. 384 с.

28. Голиков А.П., Бойцов С.А., Михин В.П., Полумисков В.Ю. Свободнорадикальное окисление и сердечно-сосудистая патология: коррекция антиоксидантами // Лечащий врач. 2003. - №4. - С.70-74.

29. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шерстобоев Е.Д. Механизмы локальной регуляции кроветворения. — Томск: STT., 2000. 148 с.

30. Горизонтов П.Д., Белоусова О.Н., Федотова М.И. Стресс и система крови. -М.: Медицина, 1983. 240 с.

31. Громова И.А., Молотковсгсий Ю.Г., Бергельсон Л.Д. Изучение взаимодействие мелиттина с многокомпонентными смесями с помощью липидспецифических флуоресцентных зондов // Биологические мембраны. — 1990.-№9.-С. 986-1000.

32. Демченко А.Н., Костаржевская Е.Г. Мелиттин: структура, свойства, взаимодействие с мембраной // Украинский биохимический журнал. 1986. - Т. 58,№5.-С. 74-90.

33. Дудченко A.M., Лукьянова Л.Д. Триггерная роль энергетического обмена в каскаде функционально-метаболитических нарушений при гипоксии // Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. -М., 2004.-С. 51-84.

34. Ещенко Н.Д., Вольский Г.Г. Определение активности сукцинатдегидрогеназы // Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). Под ред. М.И. Прохоровой. — Л.: ЛГУ, 1982. -С. 210212.

35. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. — М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001.-243 с.

36. Капелько В. И. Активные формы кислорода, антиоксиданты и профилактика заболеваний сердца // Русский медицинский журнал. — 2003. — Т.11, № 21. — С. 1185-1188.

37. Козинец Г.И. Общие вопросы кроветворения // Исследование системы крови в клинической практике. М.: Триада-Х, 1998. - 480 с.

38. Колб В.Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия (Пособие для врачей-лаборантов). Минск: Беларусь, 1976. 312 с.

39. Корнева Н.В. Фармакологический анализ рефлекторного действия некоторых животных ядов. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Горький, 1970. -20 с.

40. Корягин А.С. Эколого-физиологическая характеристика адаптогенных свойств зоотоксинов при повреждающем действии гамма-облучения на организм экспериментальных животных. Автореф. дисс. д-ра биол. наук. — Нижний Новгород, 2007. 44с.

41. Корягин А.С., Ерофеева Е.А. Исследование адаптогенных свойств животных ядов к действию повреждающих факторов (на примере ионизирующей радиации) // Поволжский экологический журнал. — 2004. №2. -С. 52-58.

42. Корягин А.С., Ерофеева Е.А., Якимович Н.О., Александрова Е.А., Смирнова Л.А., Мальков А.В. Анализ антиоксидантных свойств хитозана и его

43. Котляревская Е.С. Исследование функционального состояния гипоталамической области головного мозга при противоопухолевом действии магнитных полей. Автореф. дисс. канд. биол. наук. -Ростов-на-Дону, 1974. -24 с.

44. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. -М.: Высшая школа, 1971. С. 114-115.

45. Крылов В.Н. Пчелиный яд. Свойства, получение, применение: научно-справочное издание. — Н.Новгород: Изд-во ННГУ, 1995. 224 с.

46. Крылов В.Н., Агафонов А.В., Кривцов Н.И., Лебедев В.И., Бурмистрова Л.А., Ошевенский Л.В., Сокольский С.С. Теория и средства апитерапии, М.: ООО ПКФ «Комильфо», 2007. -296 с.

47. Крылов В.Н., Лукьянова Л.Д. Антигипоксическое действие экзогенного убихинона (коэнзима Q) // Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. — М., 2004. С. 488-514.

48. Крылов В.Н., Корягин А.С., Ерофеева Е.А. Сравнительный анализ противолучевых свойств некоторых зоотоксинов // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. -2008. Т. 44, №4. С. 424-429.

49. Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. Применение индуцированной ХЛ для оценки свободнорадикальных реакций в биологических субстратах // Межвузовский сборник. Биохимия и биофизика микроорганизмов. Горький, 1983. —С. 179-183.

50. Лосев Н.И., Хитров Н.К., Грачев С.В. Патофизиология гипоксических состояний и адаптации организма к гипоксии. — М., 1982. 256 с.

51. Лукьянова Л. Д. Современные проблемы гипоксии // Вестник РАМН. — 2000. —№9. —С. 3- 12.

52. Лукьянова Л.Д. Митохондриальная дисфункция типовой процесс, молекулярный механизм гипоксии // Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. - М., 2004. - С. 8-51.

53. Лукьянова Л.Д. Фармакологическая коррекция митохондриальной дисфункции при гипоксии // Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. -М., 2004. — С. 456-488.

54. Лукьянова Л. Д., Балмуханов Б. С., Уголев А. Т. Кислород — зависимые процессы в клетке и её функциональное состояние. — М.: Наука, 1982. — 301 с.

55. Лыско А.И., Лукьянова Л.Д., Арутюнян A.M., Журавлева Д.В. Антигипоксический эффект и пероксидазная активность гем-протеидов цитохрома с // Гипоксия и окислительные процессы. — Нижний Новгород, 1992. С. 60-72

56. Меерсон Ф. 3. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. — М.: Медицина, 1984. — 268 с.

57. Меерсон Ф.З. Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца // Кардиология. 1990. - №3. - С. 3-12.

58. Меерсон Ф.З. Адаптационная медицина: механизмы и защитные эффекты адаптации. -М: Издание Hypoxia Medical LTD, 1992, 331 с.

59. Меерсон Ф.З., Малышева И.Ю. Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца.-М.: Наука, 1993. 159 с.

60. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др. Лабораторные методы исследования в клинике. — М.: Медицина, 1987. — 368 с.

61. Мищенко В.П. Перекисное окисление липидов, антиоксиданты и свертываемость крови // Актуальные проблемы гемостазиологии. Молекулярно-биологические и физиологические аспекты. 2-е доп. изд. М.: Наука, 1981. — 504 с.

62. Молчанова Л.В., Пылова С.И., Закс И.О. Поврежедение мембран субклеточных структур головного мозга // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1983. - Вып.5. — С. 17-19.

63. Мошкова А. Н. Исследование зависимости скорости фосфорилирования АДФ от концентрации экзогенногоАДФ при гипоксии разной тяжести и продолжительности // Гипоксия и окислительные процессы. Нижний Новгород, 1992. - С. 79-83.

64. Мулатова А.К. Морфофункциональная характеристика лимфоидных органов крыс при адаптационных реакциях // Функциональная морфология лимфузлов и других органов иммунной системы. -М., 1983. С. 120.

65. Оковитый С.В. Клиническая фармакология антигипоксантов (часть I) // ФАРМиндекс-Практик. -2004. Вып. 6. -С. 30-39.

66. Оковитый С.В. Клиническая фармакология антигипоксантов (часть П) // ФАРМиндекс-Практик. -2005. Вып. 7. -С. 48-63.

67. Ольбинская JI. И., Литвицкий П. Ф. Коронарная и миокардиальная недостаточность. — М.: Медицина, 1986. — 272 с.

68. Орлов Б.Н., Гелашвили Д.Б. Зоотоксинология (ядовитые животные и их яды): Учеб. пос. для студ. вузов по спец: «Биология». — М. Высшая школа, 1985. -280 с.

69. Пигулевский С.В. Ядовитые животные. Токсикология беспозвоночных. -Л.: Медицина, 1975. -376 с.

70. Помогайло А.Д. Металлополимерные нанокомпозиты с контролируемой молекулярной архитектурой // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. Хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2002. - Т. XLVI, №5. С. 64-73.

71. Розанов А. Я., Терщинский А. И., Хмелевский Ю. В. Ферментативные процессы и их коррекция при экстремальных состояниях. — Киев: Здоров'я, 1985. —208 с.

72. Сазонтова Т.Г., Архипенко ЮВ. Роль свободнорадикальных процессов в адаптации организма к изменению уровня кислорода // Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. — М., 2004. С. 112138.

73. Сапронов Н.С. Фармакология гипофизарно-надпочечниковой системы. -СПб.: Специальная Литература, 1998. 336 с.

74. Селье Г. На уровне целого организма. М.: Наука, 1972. - 121 с.

75. Селье Г. Концепция стресса как мы ее представляем в 1976 году // Новое о гормонах и механизме из действия. — Киев: Наукова Думка, 1977. -С. 27-51.

76. Сергеев Г.Б. Нанохимия. 2-е изд., испр. и доп. - М.: Изд-во МГУ,2007.-336 с.

77. Скулачев В.П. Эволюция, митохондрии и кислород // Соросовский образовательный журнал. 1999. - №9. - С.4-10.

78. Смирнов А.В., Зарубина И.В., Криворучко Б.И., Миронова О.П. Влияние триметазидина на метаболизм мозга при острой ишемии, осложненной гипоксией // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000. -Т. 129, Вып.2.-С. 142-144.

79. Смирнов А.В., Криворучко Б.И. Гипоксия и ее фармакологическая коррекция одна из ключевых проблем анестезиологии и интенсивной терапии // Анестезиология и Реаниматология. - 1997. — Вып.З. - С.97-98.

80. Стальная И. Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Современные методы в биохимии. — М., 1977. —С. 63-64.

81. Физиология человека. В 3-х томах. Т. 3. Пер. с англ./Под ред. Р.Шмидта и Г.Тевса. -М.: Мир, 1996. 198 с.

82. Филаретов А.А., Подвигина Т.Т., Филаретова Л.П. Адаптация как функция гипофизарно- адренокортикальной системы. -СПб.: Наука, 1994. -131 с.

83. Хватова Е.М., Мартынов Н.В. Метаболизм острой гипоксии. —Горький: Волго-Вятское книжное изд-во, 1977. 160с.

84. Хватова Е.М., Сидоркина А.Н., Миронова В.Г. Нуклеотиды мозга. (Метаболизм и оценка при кислородном голодании). — М., 1987. 208 с.

85. Хватова Е.М. Этимологическая концепция регуляции энергетического обмена мозга при гипоксии и повышении устойчивости к кислородному голоданию // Гипоксия и окислительные процессы. — Нижний Новгород, 1992. — С. 121-126.

86. Хаитов P.M., Лесков В.П. Иммунитет и стресс // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. — 2001. Т. 87, №8, — С. 10601072.

87. Хомутов А.Е., Гиноян Р.В., Ягин В.В. Термоадаптивные свойства зоотоксинов. Монография. Н.Новгород: Изд-во ННГУ, 2005.-225 с.

88. Хубецова Р.Д., Хетагурова Л.Г. Свертываемость крови у собак приiоднократно введеных и повторных инъекциях адренокортикотропина // Проблемы эндокринологии. 1971. -№3. — С. 85-94.

89. Чевари С., Чаба И, Сокей Й. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод её определения в биологических материалах // Лабораторное дело. — 1985. — № 11. — С. 678 — 681.

90. Шилов Ю.И., Орлова Е.Г. Адренергические механизмы регуляции фагоцитарной активности нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов периферической крови крыс при остром стрессе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2000. Т. 129, №5. — С. 563-565.

91. Шкендеров С. Фракционирование пчелиного яда и исследование его компонентов в качестве стимуляторов коры надпочечных желез и анафилотогенности //Сб.: Пчелиный яд — ценное естественное терапевтическое средство. — Бухарест: Апимондия, 1983. С. 87-88.

92. Шкендеров С., Иванов Ц. Пчелиные продукты. София: Земиздат, 1985.-456 с.

93. Шуматова Е.Н., Савельева С.Н. Влияние кратковременной барометрической гипоксии на каталитические свойства митохондриальной креатинкиназы мозга // Гипоксия и окислительные процессы. Нижний Новгород, 1992.-С. 126-131.

94. Шурлыгина А.В., Обут Т.А., Шварц Я.Ш., Труфакин В.А. Влияние гидрокортизона и их совместного применения на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов крови крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1995. - №2. - С. 179-180.

95. Якобсон Л.И., Семенова Т.С., Рубанова Н.А. Влияние кратковременной гипоксии на каталитические и кинетические свойства митохондриальных ферментов // Гипоксия и окислительные процессы. Нижний Новгород, 1992. -С. 131-136.

96. Яременко К.В. Оптимальное состояние организма и адаптогены. —СПб.: Изд-во «ЭЛБИ-СПб», 2007. 132 с.

97. Alder G.M., Arnold W.M, Bashford C.L. et al. Divalent cation-sensitive pores formed by natural and synthetic melittin and by Triton X-100 // Biochim. Biophys. Acta. -1991. Vol. 1061, №1. - P.l 11-120

98. Banks B.E.C., Shipolini A.R. Chemistry and pharmacology of Honey-bee venom // In Venoms of Hymenoptera. London: Academic Press, 1986. - P. 329416.

99. Bollinger J. G, Diraviyam K., Ghomashchi F., Murray D., Gelb M. H. Interfacial Binding of Bee Venom Secreted Phospholipase A2 to Membranes Occurs Predominantly by a Nonelectrostatic Mechanism // Biochemistry. 2004. — 43. — 13293-13304.

100. Cuppoletti J., Abbott A.J. Interaction of melittin with the (Na+- K+) ATPase: evidence for a melittin-induced conformational chage // Arch. Biochem. Biophys. — 1990. -Vol. 283, №2. -P.249-257.

101. Cuppoletti J., Blumenthal K.M., Malinovska D.H. Melittin inhibition of the gastric ATPase and photoaffmity labeling with azidosalicylyl melittin // Arch. Biochem. Biophys. 1989. - Vol.275, №1. -P.263-270.

102. Esumi K., Takei N., Yoshimura T. Antioxidant-potentiality of gold-chitosan nanocomposites // Colloids and surfaces B: Biointerfaces. 2003. - 32. - P. 117-123.

103. Habermann E. Bee and Wasp venoms // Science. 1972. - V. 177, № 4046. -P. 314-322.

104. Habermann E. Apamin // Pharmacol. Ther. 1984. - V. 25, №2. - P. 255270.

105. Hoet P. HM., Briiske-Hohlfeld I., Salata O.V. Nanoparticles known and unknown health risk // Journal of nanobiotechnology. - 2004, 2: 12, P. 1-15.

106. Juwadi P., Vunnam S., Yoo В., Merrifield R.B. Structure-activity studies of normal and retro pig cecropin-melittin hybrids // J. Pept. Res. -1999. Vol. 53, №3. -P. 244-251.

107. Kaijita S., Iizuka H. Melittin-induced alteration of epidemiam adenilate cyclase responses II Acta. Demi. Venereol. -1987. Vol. 67, №4. -P.295-300.

108. Kaneko M., Beamish R. E., Dhalla N. S. Depression of heart sarcolemmal Ca2+-pump activity by oxygene free radicals // Amer. J. Physiol. 1989. - Vol. 256, №2.-P. 368-375.

109. Kaplinsky E., Iskay J., Gitter S. Oriental honey venom: effects on cardiovascular dynamics // Toxikon. 1977. -V. 12. № 1. - P. 69-73.

110. Kim S.K., Rajapakse N. Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS). A review // Carbohydrate Polymers.n 2005. 62. -P. 357-368.

111. Kreil G., Backmayer H. Biosyntesis of melittin, a toxic peptide from bee venom. Detection of a possible precursor // Eur. J. Biochem. 1971. - V. 20. № 3. — P. 344-350.

112. Mahaney J. E., Kleinschmidt J., Marsh D., Thomas D. D. Effects of melittin on lipid-protein interactions in sarcoplasmic reticulum membranes // Biophysical Journal. 1992. -V. 6633, Dec. -P. 1513-1522.

113. Malencik D. A., Anderson S. R. Association of melittin with the isolatedmyosin light chain // Biochemistry. 1988. - 27. - P. 1941-1949.• •• • • th

114. Nishija T. Mechanistic study on membrane basis by bee venom-12 Int.

115. Ohki S., Marcus E., Sukumaran D.K., Arnold K. Interaction of melittin with lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1994. - Vol. 1194. -P. 223-232.

116. Phillips K. The hypoxic brain // Journal of Experimental Biology. 2004. -207 (18). - P. i - iii.

117. Rao N.M. Differential suscetibility of phosphotidylcholine small unilamellar vesicles to phospholipases A2, С and D in the presence of membrane active peptides. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - Vol. 182, № 2. -P. 682-688.

118. Sharon M Oren., Z., Shai Y., Anglister J. 2D-NMR and ATR-FTIR Study of the Structure of a Cell-Selective Diastereomer of Melittin and Its Orientation in Phospholipids //Biochemistry. 1999. -38. - P. 15305-15316.

119. Steiner R.F., Norris L. The interactin of melittin with troponin C. // Arch. Biochem. Biophys. 1987. - Vol.254, №1. - P. 342-352.

120. Subbalakshmi C., Nagarai R., Sitram N. Biological activities of C-terminal 15-residue synthetic fragment of melittin: design of an analog with improved antibacterial activity//FEBS Lett. 1999. - Vol. 448, №1. - P. 62-66.

121. Vannucci S. J., Seaman L. B. Vannucci R. C. Effects of Hypoxia-Ischemia on GLUT1 and GLUT3 Glucose Transporters in Immature Rat Brain // Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1996. - 16. - P. 77-81.

122. Vento, R., D'Alessandro, N., Giuliano, M., Lauricella, M., Carabillo\ M., Tesoriere, G. Induction of apoptosis by arachidonic acid in human retinoblastoma Y79 cells: involvement of oxidative stress // Exp. Eye Res. 2000. - 70. - P. 503517.

123. Vogel H , Jahnig F The structure of melittin in membranes. // Biophys. J. -1986. -Oct., 50(4). P. 573-582.

124. Voss J., Birmachu W., Hussey D.M., Thomas D.D. Effects of melittin on molecular dynamics and Ca- ATPase activity in sarcoplasmic reticulum membranes: time-resolved optical anisotropy // Biocemistry. 1991. - Vol.30, №30. - P. 74987506.

125. Winder, D., Gunzburg, W.H., Erfle, V., Salmons, B. Expression ofantimicrobial peptides has an antitumour effect in human cells. Biochem. Biophys.i

126. Res. Commun. 1998. - 242. - P. 608-612.

127. Yin C. S., Leeb H. J., Hongc S.-J., Chungb J.-H., Koha H.-G. Microarray analysis of gene expression in chondrosarcoma cells treated with bee venom // Toxicon. -2005. 45. - P. 81-91.120