Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Спонтанная и активированная биохемилюминесценция и некоторые показатели липидного обмена крови свиноматок и крыс при ожирении

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Спонтанная и активированная биохемилюминесценция и некоторые показатели липидного обмена крови свиноматок и крыс при ожирении"

- я тл<\? В37

МИНЕСТЕРСТБО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА К ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ

МЕДИЦИНЫ К БИОТЕХНОЛОГИИ имени К.И.СКРЯБИНА

На правах рукописи

ЯРОШ ОЛЕГ ГЕННАДЬЕВИЧ

СПОНТАННАЯ И АКТИВИРОВАННАЯ ЕИОлЕМКЛКШНБСПБНЦТК И НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛЯ ЛИПИДНСГО ОБМЕНА КРОВИ СВИНО.МАТОК И КИЕ ПРИ СЖГЕНЕК.

0^.00.04. - биохимик 03.00.02.- биофизика

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ

Г-нпдзедА 1А ^Чьогл,. п«»- г.

МОСКВА - 1996 г.

Работа выполнялась в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

Научные руководители: Заслуженный деятель науки Российской Федерации доктор биологических наук, профессор Малахов А.Г.

доктор биологических наук, профессор Журавлев А.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Науменко П.А.

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Пальмина Н.П.

Ведущая организация:Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко

Защита состоится

»Ж _" ¿^•■¡е^й^г? 1997 г. в ^ часов на заседании диссертационного совета Д 120.36.05 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им.К.И.Скрябина (109472,Москва,ул.Академика Скрябина 23, тел.377-93-83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академи.

Автореферат разослан " &" _ л*? 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Сафонов Н.А.

Подписано в печать Заказ

Формат Тираж

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы.распространение ряда патологий в у олсзляк современного животноводства показывает,что наших знаний пока недостаточна для их успешного лечения.Достижения биофизики наглядно демонстрируя? это положения. Так на сельскохозяйственных животных мало исследовано таксе явление как овободнсрндикальное окисление (Б.Н.Тарусов 1954),и совершенно не неучено такое универсальное квантовое явление как спонтанное свечение - спонтанна;-, биачемиас-мкнесценция (Б.К.Тарусов 1961).

Большинстве неглавных и инфекционных патолог::;: развивается на фоне длительно протекающих предпатологичеекпх состояний - хронический эмоцианальный стресс, атеросклероз, канцерогенез, ожирение, воспаление.Эти предпатолегичеокие состояния приводят к общему ослаблению организма с последующи},! поражением по принципу - поражения наиболее слабого эвена в организме.

В связи с изложенным возникает необходимость:1)ивучения первичных физико-химических механизмов патогнеза педпатологичеоких состояний; 2) о целью дальнейшей разработки средств профилактики предпа-тологических состояний и исключения возможности развития патологии. Мы ивучиди биохемшзминесиенцию и активность свободнорэди-кальксгс окисления при одном из предпзтслогпческих состояний -ожирении.

Развитие биофизики привело обнаружение новы;-: свойств живых тканей и клеток в норме ,таких как свсСсднорадикальное окисление ■'СРО; (Б.Н.Тарусов 1954).Сопровождающее 0Р0 непрерывное спонтанное свечение тканей и клеток организма б норме и индивидуальной для каждой ткани и биологической жидкости иктенсизности.является одной из кемпенет гомеостаза и показывает участие е метаболизме не только свободных радикалов но и электронно-возбужденных состояний (ЭВО) (Журавлев А.И..Журавлева А.И. 1975.Журавлев А.И. 1954,1958,1993,1996,Владимиров Ю. А. .Шеротнез М.П. 1089';. Широкое клиническое применение бшхешшоминесценцип сталс возможным после обнаружения длительного непрерывного свечения на воздухе при температуре 2и-4СГ С сыворотки крови (Закарян А.Е. Дарусов В.Н. 156?.Митрофанов А.И. .Журавлев А.К. 1967) и мочи (Аоанов М.А.:378,Журавлев А.К.1372).5 организме связь бнохемилюминесцен-ции с метаболизмом подтверждает влияние систем контроля гом?еста-еа в первую очередь неирогуморальной системы (Журзглез А,;:. ,Мяр-гулис Г.В.1972 Перелкгин Б.В.,Таруссв В.Н.196м).Это проявляется в повышении интенсивности спонтанной ВХЛ сыворотки крови к кечи при всех исследованных типах стресса (Журавлев А.И. »Журавлева А.И. 1975).В тканях и клетках все типы биохешшзмкнесценции.даже у светляков,связаны с липидами и определяются липидами. В связи с этим липидный обмен и его нарушение являются удобной моделью для изучения биохемшшминесценции.Наиболее адекватной моделью,очевидно может быть ожирение.

Па данным ряда авторов (Баранов В.Г.1977,Вознесенская Т.Г.1981,Сейленс Л.Б. 1985) ожирение может возникать в рузельтате различных воздействий,среди которых ведущим является стрессирув-

щие факторы, именно стресс усиливает и биохемшмминеаценцию. био-хемилюминесценцию. Животные на крупных комплексах подвергаются сразу целому набору стрессовых факторов,следовательно активации и свобаднорадикального окисления и ускорению ожирения.

Проблеме ожирения уделяется значительное внимание в области сельского хозяйства и в частности свиноводства (Данилевский 8.МЛ930,Дмитриченко А.П. и др. 1963,Кокорев А.БЛ938, Самохин В.Г.1981,Ноздрин М.Г Л9S1,Руденко К.П.1987,Малахов А.Г. 1989,Хе-нкнг А.1976).Данный вид предпатологического состояния является полиэтиологическим,и это затрудняет определение ожирения в начальный момент,и в большинстве случаев констатируется как факт (Баранов В.Г.19?7,Мегзтап H.J.,Hu С. Y. 1987,Campion D. .Retal 1988, Rule D.С. et al 1989).Нахождение новых ведущих диагностических критериев требует фундаментальных физико-химических и биофизических исследований. В связи с этим мы считаем перспективны},! применение некоторых физико-химических методов для расшифровки механизма патогенеза ожирения.

Цель и задачи исследований.В связи с выше изложенным была поставлена цель: выявить и изучить динамику биохешшсминесценции и свобаднорадикального окисления липидов в сыворотке крови крыс и свиноматок.В задачи исследования входило:

1.Зарегистрировать спонтанную биохемилюминесценцию сыворотки крови крыс и свиноматок при ожирении.

2.Найти способ усиления спонтанной биохемилюминесценции сыворотки крови,путем увеличения квантового выхода излучения без изменения ее кинетических закономерностей и квантового выхода возбуждения т.е. ее активации,при неизменной концентрации ЭВС.

3.Провести модельный опыт на лабораторных животных,изучить влияние синтетического антиоксиданта дилудина на степень свобаднорадикального окисления и биохеиидшинесценцию сыворотки крови крыс на ранней стадии ожирения.

4.Изучить динамику спонтанной и активированной биохемилюминесценции сыворотки крови свиноматок,проследить уровень содержания продуктов свобаднорадикального окисления в сыворотке крови,и содержание естественного антиоксиданта - токоферола в сыворотке крови свиноматок,в различные физиологические периоды (холостой, супоросный и лактирующий).

Научная новизна.Найден способ усиления спонтанной биохемилюминесценции сыворотки крови без изменения ее кинетических закономерностей путем увеличения квантового выхода излучения.Впервые исследовано влияние ожирения на антиоксидантную систему организма, показана возможность применения антиоксидантов.как профилактических препаратов.Впервые установлено повышение уровня свободно-радикального окисления в организме свиноматок при ожирении в холостой, супоросный и лактирующий периоды.Впервые проведены исследования ожирения с позиции свободнорадикальной патологии.

Теоретическая и практическая значимость работы.Полученные данные позволяют расширить представление о механизме влияния ожи-

рения на органкек животных (крысы,свиноматки) .Кроме того.результаты диссертации могу. быть использованы для решения прикладных задач по балансирован!® кермления свиноматок п по контролю клпни-кс-сиохимкческогс состояния их здоровья в различные физиологические периоды.Методы диссертационной работы внедрены в практику учебного процесса на кафедре биофизики. Материалы диссертационной Работы попользуются при чтении лекций по теме "Квантовая биология на кафедре биофизики МГАВМиБ.

На защиту выносятся.

1. Повьппенк0 чувствительности метода регистрации спонтанной биохемилюминесценции сыворотки крови путем увеличения квантового выхода излучения без изменения кинетических закономерностей при добавлении акридинового оранжевого.Выявление связи между интен-спвностями СРО и биохемилюминесценции.

2.Изменение активности овободнорадикального окисления на ранней стадии экспериментального ожирения у крыс.Влияние антиск-сиданта дилудина на степень овободнорадикального окисления и интенсивность биохемилюминесценции сыворотки крови.

3. Увеличение интенсивности бкохемилюмкнесценцип снвсрсткк крови свиноматок пси ожирении га счет изменения липидкого состава увеличения концентрации конечных продуктов гв0б0ДЕ0раг::кагьнэге окисления и снижения содержания токоферола.

Апробация результатсв.Материалы диссертационной работы докладывались г. обсуждались на Всесоюзной кксле-семинаре "Биз-тер-мо-хемилюмикесценция"(".Суздаль.1990 г);на отчетной научной конференции ША (1331 г);на заседании секции биофизики МиИП (1691, 1992 гг); материалы диссертации включены в учебное пособие "Виохе-милюминесценция и квантовая биология".

Публикация результатов исследований.По материалам диссертации опубликовано три научных статьи.

Объем и структура диссертации.Диссертация изложена на 144 страницах мзлшнсписнсгс текста и состоит из введения,обзора литературы, описания материалов и методов исследования,собственных исследований,обсуждения результатов,выводов,сведений о практическом использовании научных выводов. рекомендаций по кепелъзовагпзо научных выводов,списка литературы.Работа содержит 2? рисунков и графиков.11 таблиц.Описок литературы включает 1й1 источник, из которых 57 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы.Работа выполнена в 1990-1992 гг. на кафедре биофизики МВА ш.К.й.Скрябина.Первую серию экспериментальных исследований проводили в виварии Московской ветеринарной академии на лабораторных животных.Схема проведения эксперимента представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Схема проведения опыта на крысах линии Wistar

Г ■ - ■ ! ¡Группа! N 1 Рацион , ... j | Примечание | 1 |

г 1 ! 1 1 | ! 25 ( S Основной рацион (OP) i 1 1 j Контрольная j ( !

! 1 ! £ ! 1 ? 25 I .... I OP + дилудин ! I 1 Контрольная |

! ! 1 3 1 25 1 I OP + 50% жира i ! i j Опыт (ожирение) ! i i

| | 1 4 | t i 25 ) | OP + 50% жира + дилудин 1 ! 1 |0пыт (ожирение) | i i

где М - количество животных в группе.

Эксперимент проводили на 100 белых крысах (самках) линии Wistar,о начальным весом 100-120 грамм.Животные были разделены на две группы по 50 крыс в каждой группе.Одна группа содержалась на обычном рационе вивария.В рационе второй группы было увеличено содержание жира на 50%.Животные этой группы дополнительно получали жировую смесь (лярд и подсолнечное масло 1:1) из расчета 50 грамм жира на 100 грамм комбикорма. На этом рационе животные содержались 3 месяца.Наличие ожирения у крыс второй группы определяли вычислением индекса ЛИ (Bemardis,Patterson 1988),который служил точным математическим показателем степени ожирения у крыс:

вес тела (в граммах)

ли =-------------------------------------* 10

длинна от носа до анального отверстия

Величина коэффициента Ж более 300 свидетельствует о наличии ожирения. Далее животные были разделены на 4 группы по 25 крыс в каждой. Схема эксперимента представлена в таблице 1.

Материалом исследования служили плазма и эритроциты крови крыс.Кровь брали из сердца открытым способом.В качестве антикоагулянта использовали стандартный раствор гепарина. Животных забивали после 18-18 часов голодания.Исследования проводили на 7,14j21,28 дни.Плазму крови готовили по общепринятой методике. Суспензию эритроцитов получали путем 3-х кратного отмыва изотоническим раствором хлорида натрия.Дилудин животным 2-ой и 4-ой групп вводили путем дачи с кормом по 12-14мг/кг веса. Препарат вводили на протяжении всего периода исследований,28 дней.

Вторая серия эксперимента выполнена на базе совхоза Никоновский Московской области.Исследования проводили на тридцати свиноматках в возросте 2-х лет.Диагноз на ожирение ставили на основании клинических признаков (ослабленный сердечный толчок,учащенный пульс,затруднение дыхания з виде одышки,отеки конечностей, отмечается гипертермия и понижается резистентность организма,1/ самок плохая оплодотворяемость,снижение лактации) и результатов лабораторных исследований (микроскопия кала на наличие капель и

кристаллов жирных кислот,микроскопия осадка мочи на наличие зсгр-вьк кислот,активность липазы сыворотки крови,содержание связанного сплиру'пка) .Постановку диагноза огуществлял доцент кафедры незаразных болезней МВА к.в.к. Кондрахин Е.П.Схема проведения опыта на свиноматках представлена в таблице г.

Схема проведения опыта на свиноматках.

1 1 ! Группа ! 1 ( и 14 Физис ескнл период к дни исследования с начала каждого периода)

холостой 1 супоросный 1 1 г лактирующий

1 | I-группа 1 контроль 1 15 14 | 85,110 1 1 | 5,15,30

1 ! П-группа 15 14 1 1 I дд 1*1 г) | 5.15,30

где Н - количество животных в групп?.

Материалом исследования служила сывсрсткз крови.Кровь брал::

общ^зрнкятсй методике. регистрацию интенсивности споэтакнсй Сио-

хемялюминесцекции оывсроткк крови,осуществляли на собранной из стандартна: блоков установке,работающей в квантометрическом режиме и предназначено?"'

каров и Н. 1375).

Кислотную резистентность мембран эритроцитов определяли по методу Терского А.И..Гктельзана И.И.(1957,1960),в основе которого лежит регистрация устойчивости эритроцитов к действию гешлктика. Определение общих лтшндов проводили по методу _т.А.Клистп^!

Определение липспротеинов низкой плотности (Ж1НП) в сыворотке крови проводили по методу Алейниковой Т. Л..Рубаовсй Г. В.

(1988)

Содержание диековы конъюгатоз в плазме определяли спектрофо-тометрическим методом (Гаврилова В.Б..Мишкорудная М.И. 1983).

Количество малонового диальдегида в сыворотке крови определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой.

Содержание свободного токоферола в сыворотке крови определяли спектрофотометркческим методом по реакции с а, а-дшшридилом.

Определение активности суперокгащдисмутааы крови проводили по методу и Рг1^у1сЬ П971) в модификации О.С.Боуссва

(1975).

- б -

Все полученные данные Были обработаны на персональном компьютере IBM,с помощью пакета программ STAT GRAF 2.0.Достоверность результатов определяли по таблицам Стьюдента для малых выборок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1.Способ повышения чувствительности спонтанной биохемшпоминеоценции сыворотки крови.

В первой серии опытов на лабораторных животных мы зарегистрировали спонтанную биохеыилюминесценцию сыворотки крови крыс интенсивность которой составила 22,4имп/10с в контрольной группе и 62,7имп/10с в опытной группе (при ожирении) в конце эксперимента ,при этом темновой фон установки составил порядка 16 имп/10с.Спонтанная биохемилюминесценция сыворотки крови свиноматок имела практически такую же тенденцию.Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Значение интенсивности ( имп/10с) спонтанной биохемилюминесценцш сыворотки крови свиноматок.

I ! I ! Группа i N j | L i Физиологический период и дни исследования | (о начала каждого периода) !

1 Г 1 1 холостой оупороныи 1 лактирующий j 1

1 1 1 i 1 1 14 85 1 1 110 1 ! 1 5 | 15 ! 30 | j j j

1 l I-группа! | контроль! 15 ! i 1 18,2+0,7 23.9 ± 1,8 ¡24,6 ± | 2,1 37,8±j35,2+|34,8±| 4,6| 2,71 2,11

! 1 I Irpynna! \ ожирение j 15 | i i 21,8±3,6 45,6 ± 7,8 152.4 ± "I 5,2 I j j i 71,8±|67,4+165,5±i 8,2! 4,3| 7,3| i i i

При этом достоверные различия наблюдались между группами в период супороснооти и лактации.

Активация хемилюминесценции сыворотки крови различными люминофорами.

При исследовании собственного свечения сыворотки крови на практике мы столкнулись с необходимостью получить представление об истинной концентрации ЭВС.Для этого регистрировали спонтанную хемилюминесцецию (ХЛ)сыворотки крови и активированная различными флуоресцентными красителями с целью повышения чувствительности метода, за счет увеличения квантового выхода излучения.В качестве активаторов были использованы:ализариновый красный,конго красный, фуксин кислый,родамин Ж.метиленовый голубой,натриевая соль 9,10-ди-Бг 2-антрацен-сульфокиолоты (ДВАС),акридиновый оранжевый (АО).Во всех приведенных выше случаях данные флуорохромы не ока-

зывали активирующего действия на интенсивность УЛ сыворотки крови, а при высоких концентрациях являлись тушителями Е'ХЛ в исследуемом спектральном диапазоне..зтс можно объяснить тем,что данные флусрохромы ослабляют излучение первичных возбужденных продуктов, перехватывая энергию их электронного возбуждения,а максимум их собственной флуоресценции лежит вне области чувствительности ■!ЭУ-140.с другой стороны,возможно,что они выступают как классические тушители СБХЛ. .Применение ДБАС в качестве активатора СБХЛ сызсрзткв крови привело к увеличению интенсивности свечения в 1,? раза по отношению к собственному свечению сыворотки крови.Введение родамина Я в качестве -акцептора энергии было более оправданным, так как он является липидным зондом. Увеличение сигнала было 3,2 раза по сравнен!® со спонтанным свечением. Однако в дальнейшем мы отказались ст использования данного флусрохрома в связи ее слабой степенью усиления сигнала и высокой специфичностью родамина Ж,как липидного зонда.Наибольшее усиление давал акридиновый оранжевый с которым мы проводили всю дальнейшую работу.Максимум интенсивности наступал через 5-7 минут пссле введения активатора в сыворотку крсьи и превышал спонтаннее свечение в 18.6 раза.О увеличением концентрации до до ЮМ линейно увеличивалась интенсивность свечения.В результате проведенных экспериментов мы обнаружили, что линейная зависимость максимальных значении спонтанной Е<Л сыворотки крови от концентрации АС сохраняется в диапазоне температур от 55^45° С.Этот эффект подтверждает возможность ис-аэльгезания максимальной амплитуды как одного яз критериев степени усиления ОЕХЛ активаторами. При температуре свыше 45°0 и более высоких концентрациях АС наблюдается прекращение усиление интенсивности БХД, т.е. наступали клаооичеокие температурное и концентрационное тушение. В дальнейшем мы использовали акридиновый оранжевый в концентрации 101М при 1=35°

Влияние акридинового оранжевого на кинетику реакции спонтанной биохемилюминесценции.

Применение АО как активатора,увеличивающего абсолютное значение спонтанной биохемилюмкнесценции без изменения ее кинетических закономерностей,пллягстряруетоя тем,что более высоким значениям собственной спонтанной XI сыворотки крови соответствует :: более высокое значение уровня свечения активированного АО.Зависимость носит линейный характер .Механизм влияния акридинового оранжевого на кинетику реакции спонтанного свечений мы попытались определить путем регистрации промежуточных продуктов реакции 0Р0 - диеновых конъюгатов. Данные продукты в электронно-возбужденном состоянии являются одними из эмитеров.Исследования показали,что содержание диеновых конъвгатсв в образцах сыворотки крови с добавлением АО и без него, практически не изменялись и достоверно не различались по группам (Р<0,05) .При этом сохранялись различия в уровнях свечения.Результаты исследований представлены в таблице 5.

Таблица б.

Содержание диеновых конъюгатав в сыворотке крови различных видов животных.

1 г I Вид животных | N ! I 1 ..... 1 ¡Содержание диеновых конъюгатов(ед.оп.пл./мл| I |

1 1 1 1 1 1 1 !сыворотка крови * 1 ¡сыворотка крови + АО |

1 ! ¡свиноматки {15 I ! 4,14 ± 0,61 I 4,21 1 ± 0,56 | 1

1 1 | крупный | ! рогатый скот | 5 ; I 1 ! ! 6,14 + 0,88 1 ! 1 5,74 ± 1 1 0,44 | I

1 1 |белые крысы |24 | * I 1 ! 2,56 + 0,69 | | 2,69 1 ,,,, + 1 0,53 |

В опыте была использована сыворотка крови трех видов животных: свиноматок, крупного рогатого скота,белых крыс.Проводили параллельное измерение диеновых конъюгатов в чистой сыворотке крови и после добавления акридинового оранжевого.Данный эксперимент еще одно подтверждение тому,что АО не оказывает влияния на кинетику реакций,т.е. не является катализатором и действует как физический активатор. Сравнение спонтанного и активированного свечения сыворотки крови при Т=45* С показало,что кинетика как первого так и второго процессов схожи.Они достоверно (Р<0,05) различаются лишь по интенсивности свечения.В модельных экспериментах регистрировали ХЛ сывороточного альбумина и олеиновой кислоты,исходя из тоге,что это компоненты сыворотки как многокомпонентной среды.Кинетика реакций альбумина и олеиновой кислоты так же была одинаковой и лишь различалась по интенсивности спонтанного и активированного свечения.Подученные результаты подтверждают наши предположения о том,что введение АО в сыворотку крови не изменяет кинетических закономерностей спонтанного свечения,т.е. не изменяет скорости химических реакций в которых образуются элегронно-возбужденные состояния и не меняет квантового выхода возбуждения. Акридиновый оранжевый не участвует в процессах окисления лкпи-дов,происходящих в сыворотке крови,а лишь является акцептором анергии,выделяющейся при данных реакциях и уже после этого обеспечивает увеличение интенсивности свечения биологического объекта (сыворотки).За счет высокого квантового выхода излучения (Фв) в соответствии с общей закономерностью интенсивности биохеыилюми-несценции (I) I = яг * Фв * Ф изл (Васильев Р.Ф.1986)

2.Влияние дилудина на степень свободкорадикального окисления при алиментарном ожирении.

Был проведен модельный опыт на лабораторных животных,белых крысах линии №1зЬаг. Коэффициент Ш служил давольно точным показателем степени ожирения у крыс.Зарегистрировали достоверные различия между опытными и контрольными группами,как спонтанного так и

- У -

активированного свечения плазмы крови. В контрольной группе интенсивность СБХЛ практически не изменялась на протяжении всего Бремени исследования:на 7-ой день - 12,7x1,4 5:;,:п/10с;на 28-сй день интенсивность составила 18,6±б,9 имп/10с. Активированное АО свечение имело похожую динамику и отличалось лишь по максимумам интенсивности.Коэффициент усиления был несколько меньше чем у КРС и составил 4,83 по отношению к СБХЛ плазмы.

Нами установлены достоверные различия интенсивности СБХЛ плазмы крови (F<0,ö5),a также активированного свечения III и IV групп. У животных Ш-ей группы с патологией ожирения наблюдается со временем линейное повышение уровня интенсивности 5ХЛ как спан-тзнного.так и активированного,и достигает максимального значения на 28-ой день - 62,7±2,бимп/10с для спонтанного и 415,5 + 19,28имп/10с для активированного.Максимальный коэффициент усиления при добавлении АО составил 6,68 раза по отношению к спонтанному свечению.

У животных IV-ой группы,получавших дилудин, отмечено снижение уровня интенсивности СБХЛ з 1,58 раза по отношению к IIJ-ей группе, применение дклудкна в отличие с- АО на ранних стадиях ожирения, процессы перегарного окисления лгапщсв и он ,действует как антиокислитель,снижая (w)■Полученные результаты показали,что динамика активированного свечения как контрольных,так и опытных групп имеет более четкие различия,!: при этом полностью отражает динамику спонтанного свечения.Отличается лига по мвкпаг/хви интенсивности, В данном случае происходит процесс перехвата энергии электронно-возбужденного состояния на молекулы акридинового оранжевого, который б результате и увеличивает квантовый выход излучения.

Влияние дидудина на содержание продуктов СРО в плазме крови крыс.при алиментарном ожирении.

Содержание диеновых кокъюгатов (ДК; в контрольных группах 1-ой и П-ой хотя и не имело достоверных различий (Р>0,05) между собой, ко в среднем во II группе по всем дням исследования их уровень понизился на 0,72 раза по отношению к 1-ой группе.Уровень содержание диеновых кскъвгзтоз у животных III-ей группе был значительно выше к имел достоверные различи? по всем дням исследования. Накопление ДК в плазме крови крыс Ш-ей группы (ожирение) имеет линейную зависимость от времени кормления комбикормом и составила на 7-ой день 3,26±1,4ед.оп.пл./мл;на 28-ой день 9,1+2,Зед.оп.пл./мл.Количество ДК в последний день исследования увеличилось в 3,5 раза по отношению к контрольной группе (I) .

В IV-ой группе уровень ДК составил:5,55±1,7ед.оп.пл./мл на 7-ой день;4,08±1,39 ед.оп.пл./мл на 28-ой день и превышал значение контрольной группы всего в 1,58 раза.

Второй продукт свободнорадикального окисления который мы определяли - был малоновый диальдэгид (УДА).Содержание МДА в плазме крови животных 1-ой и П-ой групп находятся практически на посто-

янном уровне и незначительно изменяется в пределах от 1,9±0,84 нмоль/мл до 2,24±0,38 нмоль/мл.Между 1-ой и П-ой группами нами небыли установлены достоверные различия в содержании МДА.Уровень ЩА в III-ей группе увеличился по отношению к контролю в 2,42 раза. Обратная зависимость наблюдалась в IV-ай группе,когда под влиянием дилудина уровень ЩА снижается.Если на 7-ой день уровень ЭДДА в П-ой группе превышал контрольные значения в 1,54 раза, то уже на 28-ой день превышение составило 1,1 раза.

Динамика изменения уровня токоферола в плазме крови крыс при алиментарном ожирении.

В 1-ой группе уровень токоферола имел незначительные колебания и в среднем укладывался в диапазоне от 3,36+0,31 мкмоль/л до 4,2+0,18 мкмоль/л.Во П-ой группе было отмечено некоторое увеличение токоферола от 7-го к 28-му дню исследования. На 21-ый и 28-ой дни были установлены достоверные различия между 1-ой и П-ой группами по данному показателю.Резкое снижение уровня токоферола в плазме крови крыс III-ей группы взавиоимости от Бремени кормления комбикормом носит линейный характер.На 7-ой день уровень токоферола составил 2,97+0,7 мкмоль/л; на 21-ый и 28-ой дни он был равен 1,82±0,53 мкмоль/л и 1,59±0,28 мкмоль/л,соответственно.На 28-ой день уровень токоферола был в 2,38 раза ниже контроля.

Результаты полученные в IV-ой группе у крыс с ожирением, но получавших с кормом дилудин,были близки по значению к контролю и изменялись в пределах от 2,85+0,34 мкмоль/л до 3,04±0,27 мкмоль/л.

Активность оуперокоиддисмутазы (СОД) цельной крови крыс при алиментарном ожирении.

Исследование активности СОД крови в данном случае мы провели с целью изучения влиянию ожирения на одну из основных ферментативных антиокислительных систем организма, а также проследить динамику активности СОД при применении дилудина.В контрольных группах I и II активность СОД не тлела достоверных различий между собой. В 1-ой группе активность СОД находится в пределах от 2,0б±1,1 до 4,08+2,14 усл.ед./мг.белка.В тоже время во П-ой группе разброс уменьшается и активность меняется от 3,17±2,2 до 3,8+2,3 усл. ед./мг.белка.Противоположную картину наблюдали в III-ей и 1У-ой группах.Установлено достоверное различие между контрольными и опытными группами.В Ш-ей группе наблюдается постепенное повышение активности СОД с 9,34*2,03 усл.ед./мг.белка на 7-ой день до 18,9±5,15 усл.ед./мг.белка на 21-ый день,а в последний 28-ой день наблюдается очень резкий скачок активности до 45,6±16,3 усл.ед./ мг.белка.Активность СОД на 28-ой день увеличилась в 11,28 раза по сравнению с контролем (I).

Динамика изменения активности СОД в 1\'-сй группе носила линейный характер ввависимостк от времени кормления комбикормом с тенденцией к снижению.

гемолитическая стойкость мембран эритроцитов крови

крыс,при алиментарном ожирении.

Полученные нами результаты показали,что при алиментарном ожи-рен::и у крыс происходит процесс повышения уровня СРО липидсв.Это в свою очередь вызывает постепенное накопление токсичных продукт ов (альдегидов,кетонов и др.) в организме,снижение активности различных антиоксидантных систем.Все эти процессы оказывают непосредственное влияние на клетки и в первую очередь на их мембраны, поскольку последние имеют липидно-белковую структуру и наиболее подвержены разрушительному действию свободны/, радикалов. Распределение яритроштов крови крыс по гемолитической стойкости (ГСЭ),проводили на пробах крови четырех групп крыс.В качестве регистрируемых показателей использовали время полного гемолиза Т100%,время половинного гемолиза Т50%,среднюю резистентность (М) и отнесение Т50/Т100,в качестве гемолитика использовали О,01К раствор уксусной кислоты. Анализ результатов времени полного гемолиза Т100% показал снижеки в 2 раза .Проведенные в дальнейшем исследования других показателей имели сходную динамику с временем полного гемолиза.Анализ показателей Т100Хи Т50Хо одной стороны и интенсивности Ю, содержанием токоферола и активности СОД показал наличие теснсй кэрреляционней связи.Так при снижении 110$. в III-ей группе в 1.3 раз по сравнению с контролем .происходит увеличение интенсивности активированной Ъ'/Л (г= -О,Э4;Р«.0,05; .Уменьшение токоферола в 111-ей группе так же соответствует снижению показателей ТЮСХп Т5й2Прн этом кезффиаиенты корреляции составили г= С,95;г= 0,97' (Р<С,0о)"

С.Процесс свобсднорадикаяьнсго окисления пси ожирении

свиноматок.

Регистрация спонтанной п активированной БХД оывероткл крови свиноматок при ожирении.

Исследование спонтанного свечения сыворотки крови мы проводили на двух группах животных С т-контроль.I1-ожкренпе). в различные периоды физиологического состояния:на 14-ык день холостого периода; на 85,110 дни в период глубокой оупоросности-,на 5Д5,30, дни лактации.Для животных 1-ой группы интенсивность спонтанной ВХЛ находится в пределах от 18,17 имп/10о до 37,8 имп/10о.При ис-пельзевании акридинового оранжевого в качестве активатора получили усиление спонтанного свечения в 4,7 раза.Спонтаннее свечение во 2-ой группе (ожирение) было несколько выше и находилось в пределах от 21,3 имп/Юс до 71,8 ими/Юс.Однако достоверных различий между опытом и .контролем в холостой период зарегистрировать не было.

Активированная БХЛ сыворотки крови ожиревших свиноматок имела схожую динамику со спонтанным свечением.Коэффициент усиления при зтом составил 5,1. Уровень активированной БХЛ при ожирении в периоды напряжения метаболизма,оказался в 2 раза выше,чем уровень активированной БХЛ в контрольной группе.При этом были установлены достоверные различия между 1-ой и П-ой группами по всем дням

исследования.

Содержание общих липидов и липопрстеинов нивкой плотности (ЛПНП).

Поскольку ожирение есть процесс нарушения липидного обмена, то определение данных параметров является одним из основных факторов ,характеризующих данную патологию.В 1-ой группе содержание общих липидов колебалось в пределах нормы от 4,2 г/л до 6,8 г/л. Во П-ой группе количество общих липидов составило 9,2 г/л и повышалось до 12,9 г/л.Между повышением уровня общих липидов и спонтанной БХЛ сыворотки крови была установлена низкая степень корреляции в контрольной группе животных (г= 0,65;Р<0,05).В то же время между активированным свечением сыворотки и содержанием общих липидов в этой же группе животных,коэффициент корреляции составил г= 0,91.Содержание ЛПНП в 1-ой группе находилось в норме и составило 2,3 - 4 г/л.У животных П-ой группы уровень ЛПНП составил 3,2 - 4,6 г/л и имел незначительное превышение.Выявили положительную корреляцию между содержанием ЛПНП и СБХЛ у животных П-ой группы (г= 0,94;Р<0,05).

Динамика содержания продуктов овободнорадикального окисления.

Уровень диеновых конъюгатов в сыворотке крови свиноматок контрольной группы составил 3,27 - 3,42 ед.оп.пл./мл.Во второй группе наблюдается повышение уровня ДК от 8,18 ед.оп.пл./мл до 11,6 ед.оп.пл./мл.Установлены достоверные различия между 1-ой и П-ой группа?,® (Р<0,05).В контрольной группе содержание МДа в сыворотке крови составило 2,43 нмоль/мл в холостой период;3,41 и 3,8 нмоль/мл в период глубокой супоросности;на 5-ый день лактации 4,79 нмоль/мл;на 15-ый день - 4,09 нмоль/мл;на 30-ый день - 5,27 нмоль/мл.Во второй группе содержание МДА превысило значения контрольной группы в 2 раза за исключением холостого периода.Повышенное содержание этих продуктов в сыворотке крови свиноматок оказывает прямое влияние на интенсивность как спонтанной так и активированной БХЛ.

Содержание токоферола в организме свиноматок при ожирении.

Полученные результаты показали достоверные различие в содержание токоферола между первой и второй группами животных.В контрольной группе уровень составил от 19,2 мкмоль/л до 15,2 мкмоль/л В опытной группе было зарегистрированно снижение содержания токоферола в 1,4 раза по всем периодам исследования,

ВЫВОДЫ.

1.Зарегистрированная спонтанная биохемилюминесценцин сыворотки крови крыс и свиноматок при ожирении.Ее уровень превысил контрольные значения в 3,3 раза для крыс,и в 1,8 раза для свиноматок.

¿.Разработан способ усиления спонтанной биохемилюминесценции

•-.ьгср-'TiCi кроеи,путем увеличения квантового выхода излучения £¿5 изменения ее кинетических закономерностей т.е.путем ее акт::ва-цгп:,лр:: г:баЕЛён:::1 акрилинового оранжевого.Настла-ы увеличение интенсивности свечения е 1S,6 pass, по отношению к, спонтанному свечения тег: же ссгазда сыворотки.

3.Изучено елилние синтетического антксьх-игзнгз дилудина ка. степень своосдкорадпкалького окисления и оиохемклюминесцекцшо сыворотки крови крыс на ранней стадии ожирения. При ожирении прпис-л«"1лит: увеличение интенсивности ЕХЛ в 1,5 раза; содержание прояук-тоь CFG (диеновых конмзгатов,малонового дизльдэгвда) превышало контрольные значения в 3,5 раза;уровень токоферола в 2,38 раза ниже контроля;активность ОСЛ увеличилась в 11, 28 раза; гемолитическая стойкость эритроцитов снизилась в 2 раза. Применение дилудина позволило привести все показатели значениями близкими к значениям контрольной группы.

4.Показано влияние ожирения свиноматок на динамику спонтанной и активированной бггахемклюминесценщш сыворотки крови, проследил:: уровень содержание продуктов свс5сзксраг;г-:зл1.ксгг окисления

крови свиноматок г рзо-л;:чнь:е ;неп:логпческИ" периоды : холосто::, супоросный и лакспрунюп::), Отмечено увеличение интенсивнее":: ЕУЛ в £ раза;поЕылен урезень cos::;: липплсв £_.:-: раза,уровень лихспреге::-нов низкой плотности в 0.8 раоа;оодер;*анн- UKJ.CA превышало контрольные енеченин в с. с раза: уровень соксоерола ~нпснлсл о . - р".-за,

Е..Гу:а.:а наученных нами изменений показывает велулун роль первичных огсОодкорадпкальнкх процессов а развитии ожирения и определяет антиокислительные агенты как необходимые профилактические средства.

■ГБ?!ДЕл5ТЧ С JI?AKTJi4E'OKCM ИСЛоЛгЛ"РАКЛ/Г -сЗУЛЬТАТСБ V.ZZZEJ, С5АЙ1Я.

Полученные данные о повышении чувствительности спонтанной биохемилюмкнеоцекции сыворотки крови путем введения акридинового оранжевого и результаты :: влиянии сеосолнтрадпыалънссс -кпеленпя лнпидоа в организме свк-оматск ори ожирении,к возможности :::-' ранней проф:1лактяки с помощью синтетических антиоксипактов (диду-цнн).иопелъзуытгн в учебное пртцессе и лабораторной практике на хадедое биофизики,на кафедре биохимии Московской вет-рннарнои академии им.К.И.Скрябина.

Материалы диссертации вспли отдельны.! параграфом в учебное юссбие:Журавлев А.И.Квантовая биология животных:Уч.пос.-М. :Моск. вет.академия им.К.И.Скрябина.-1993.-83 С.

РЕКОМЕНДАЦИЙ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫК ВЫВОДОВ.

Результаты биофизических исследований по повышен™ чувствительности спонтанной биохемилюминесценции сыворотки крови с помощью акридинового оранжевого могут быть использованы:для создания установок, регистрирующих спонтанную биохемилюминесценцию;для лабораторной диагностики различного рода патологий связанных с механизмом электронно-возбужденных состояний.

Результаты биохимических и биофизических исследований сыворотки крови свиноматок при ожирении в различные физиологические периоды (холостой,супоросный,лактационный) могут быть использованы: в клинике- лабораторной практике для диагностики ожирения ; для лабораторной диагностики нарушения липидного обмена;для определения состояния антиокоидантных систем организма при ожирении;в научно-исследовательской практике и учебном процессе на кафедрах биохимии и биофизики.

Для профилактики алиментарного ожирения, связанного с увеличением интенсивности СЕОбоднорадикальных процессов,особенно в периоды напряженного метаболизма рекомендуем увеличить дачу биоантиокислителей, а также применять различные синтетические пищевые антиоксиданты (дилудин.сантохин и др) для стабилизации процессов окисления.Особое внимание обратить на периоды глубокой супорос-ности и лактации.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1.ЖуравлевА.И.,Ярой O.P. Типы процессов изменяющих интенсивность спонтанной биохемилюминесценции.-Всесоюзная школа семинар по био-термо-хемилюминесценции.-Суздаль 19-29 ноября 1990г Тезисы доклада.

2.Ярош 0.Г.Возможность усиления спонтанного свечения сыворотки крови активаторами//Вопросы ветеринарной биологии:Сб.науч. тр./Моск.вет.академия имени К.И.Скрябина.-1992.-С.90-94.

3.Ярош O.P.Использование акридинового оранжевого для усиления биохемилюминесценции сыворотки крови свиноматок при ожирении// Вопросы ветеринарной биологии:Сб.науч. тр./Моск.вет.академия имени К.К.Скрябина.-1992.-С.94-97.

4.0.G.Yarosh Methods of measuring spontaneous biochemiluminescence of blood serum//International Conference CLINICAL CHEMI-LUMINESCENCE ICCC.-Berlin,April 25-28,1994.-P.-M10

О.Г.Ярош Методы измерения спонтанной биохемилюминесценции сыворотки крови//Международная Конференция по Клинической Хемила-минесценции МККХ.-Берлин,Апрель 25-28,1994.-Р.-М10